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두삼 이
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1 Kor J Oral Maxillofac Pathol 2010;34(1):27-36 CDK4 와 htert 를도입한 HPV16 E6/E7 불멸화세포의확립 박영진, 홍두표, 김은철 1), 오봉경 2), 김진 * 연세대학교치과대학구강병리학교실, 구강종양연구소, BK21 치의과학사업단, 원광대학교치과대학구강병리학교실 1) 연세암센터 2) ABSTRACT Establishment of CDK4/hTERT - Transfected HPV16 E6/E7 Immortalized Cell Lines Young Jin Park, Doo Pyo Hong, Eun Cheol Kim 1), Bong Kyeong Oh 2), Jin Kim * Oral Cancer Research Institute, Department of Oral Pathology, Yonsei University College of Dentistry, Brain Korea 21 Project, Wonkang Univ 1), Yonsei Cancer Center 2) Human papillomavirus (HPV) has been classified as one of the causing factors of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). However, little is known about HPV-related carcinogenesis in HNSCC. The purpose of this study is to characterize immortalized human oral keratinocyte (IHOK) transfected by HPV16 E6/E7, IHOK/hcdk4 (IHOK transfected by plxrn-hcdk4) and IHOK/hcdk4/hTERT (IHOK transfected by plpc-htert-hcdk4) to reconstitute HNSCC in vitro. Conclusively, we established a new immortalized cell lines, IHOK/hcdk4 and IHOK/hcdk4/hTERT, to understand multistep carcinogenic process of oncogenic HPV16 E6/E7 in HNSCC. Key words : hcdk4, HPV16 E6/E7, htert, Immortalization I. 서론 구강암은인체에발생되는전체악성종양의 2 3% 를차지하며, 이중 90% 이상은구강편평세포암종이다 1). 구강편평세포의종양화는다단계발생과정을통하여진행된다고알려져왔다 2,3). 즉구강편평세포암종의경우정상조직으로부터세포의증식에이어이형성의조직학적특징을보이다가상피내암을거쳐침윤성성장을하는악성종양으로진행된다. 사람유두종바이러스 (human papillomavirus, 이하 HPV) 는두경부편평세포암종 (head and neck squamous cell carcinoma, 이 * Correspondence : Jin Kim, Department of Oral Pathology, Yonsei University College of Dentistry, Sinchondong 134, Seodaemungu, Seoul , Tel : , jink@yuhs.ac * 이논문은 2009 년도정부 ( 교육과학기술부 ) 의재원으로한국연구재단의대학중점연구소지원사업 ( ) 과중견연구자사업 (No ) 지원을받아수행된연구임 하 HNSCC) 의암발생요소중하나로분류되고있다 4). HPV 는현재까지 70 여종이상이발견되었고특히 HPV16 과 18은고위험바이러스로서자궁경부세포의악성변형, 불멸화를유발하여전구암상태인상피이형증과상피내암까지유도한다는것이국내외많은연구로과학적으로증명되었다 5). 바이러스증식과관련된단백질을형성하는여러부위 (open reading frames, ORF) 가운데 E6 와 E7 단백질은종양으로의변환을유도하는데주요하게관여한다. HPV 의 E6 단백질은종양억제자인 p53 단백질과결합하여 p53 을분해시키고, HPV 의 E7 단백질은 Retinoblastoma(Rb) 단백질에결합하여분해시켜정상적인세포주기를변화시킴으로암종을일으키게된다 6). 대부분의구강편평세포의종양화에흡연과음주가중요한요소로생각되고있으나 HPV16 양성암의경우에는그관련성이적은것으로미루어고위험바이러스 HPV16 과관련된종양화는다른구강암과는다른기전을통해서진행된다고생각된다 4). 따라서 HPV16 가원인이된구강암

2 모델의구축은 HPV16 에의한암의치료및예방하는연구에유용한도구로활용될것이다. 정상적인환경에서세포주기조절시스템은 Cdk 와 cyclin 이주기적으로결합하여활성화되면서조절하는데, Cdk4(cyclin dependent kinase 4) 는 cyclin D와결합하여세포주기를 G1 기에서 S기로들어가게한다. 세포가부적절한환경에노출되면 Cyclin-dependent kinase inhibitor 인 p16 의과발현에의해세포의조기성장억제가일어난다. 이때과발현된 p16 은 Cdk4 와결합하여 Cdk4/cyclin D 복합체형성을방해하여세포의조기성장억제를유도한다 7). 만약 Cdk4 가과발현되면부적절한환경에서도 p16 의작용을우회하여세포의수명을연장할수있다는연구보고와 8) 증가된 Cdk4 의발현은더공격적인종양을형성한다는보고가있다 9). 본연구에서는 Cdk4 의과발현에의해세포수명이연장됨과동시에세포에변이를축적할수있는기회를제공하여결국암의진행을촉진시킬것이라는가설을세우고 human cdk4(hcdk4) 를과발현시킨 IHOK/hcdk4 세포를구축하였다. htert(human telomerase reverse transcriptase) 는 template RNA(hTR) 와함께 telomeres 의길이를유지하면서세포의노화를극복하고세포의불멸화를유도한다 8). 인체에발생되는암의 80 90% 에서 telomerase 활성을보인다는보고를통해서 telomerase 활성은암세포로의변형에필수적인요소이며 htert 는 telomerase 활성을유도할뿐만아니라암화과정에관여하는여러가지의역할이있을것을기대하고 IHOK 에 hcdk4 와함께 htert 를도입하였다. 본연구의목적은 HPV16 E6 와 E7 로불멸화시킨세포주 immortalized human oral karatinocyte(ihok) 10) 를이용하여 IHOK 에 hcdk4 를도입시킨 IHOK/hcdk4 와 IHOK 에 hcdk4 와 htert 를도입시킨 IHOK/hcdk4/hTERT 를추가로구축하여세포의특징을분석함으로써구강암발생의다단계과정을분석하는세포주로활용하고자한다. II. 재료및방법 1. 세포배양가. 사람구강각화세포 (normal human oral keratinocyte: NHOK) 배양 미맹출사랑니발치를목적으로발거한염증이보이지않은제 3 대구치의치은조직을취하여멸균된 phosphate-buffered saline(pbs) 과 5% betadin 으로 3회세척하였다. 채취된조직은 500 μl 의 0.25% collagenase 과 500 μl 의 4 unit/ml dispase II로한시간동안 5% CO 2 가포함된 37 배양기에넣어하방결체조직으로부터상피를물리적으로분리하였다. 단일세포로용해하기위해서 0.25% Trypsin/2.65 mm EDTA l ml 와 versene solution 1 ml 로 30분동안처리하고원심분리하여세포를모은후에 keratinocyte growth medium-2(kbm-2, Lonza, Walkersville, MD,USA) 에부유해 60 mm collagen coated dish 에배양하였다. 3일후에 10 ng/ml Epidermal Growth Factor(EGF) 를첨가해주고 2~3 일마다배양액을교체해주었다. 나. IHOK/hcdk4와 IHOK/hcdk4/hTERT 구축과배양 HPV16 E6/E7 으로불멸화된 IHOK 세포는원광대학교김은철교수로부터제공받았으며, 이세포에 plxrn-neohcdk4 와 plpc-puro-hcdk4-htert 의 vector 를이용하여순차적으로 transfection 시켰다. hcdk4 확보를위하여 HUVEC(human umbilical vascular epithelial cell) 을주형으로하여 PCR 을통해 hcdk4 를증폭시켰다. 준비된 hcdk4 는 plxrn vector 에 BamHⅠ 과 SalⅠ 부위에삽입하였다. 또한 hcdk4 와 htert 의도입을위하여 plpc-puro-htert vector 를이용하여 Hind Ⅲ 부위에 hcdk4 를삽입하였다. 준비된 vector 를가지고 GP2 293-leu package cell line 에 transfection 시켰으며 72 시간후에 viral soup 을 50,000 g, 4 의조건으로 3시간원심분리하여바이러스를모은후에 ploybrene(6 μg/ml) 과함께 IHOK 세포에뿌려서 infection 시켰다. 24 시간후에 PLXRN-neo-hcdk4 에대하여는 700 μg/ml 의 G418 그리고 PLPC-puro-hcdk4-hTERT 에대하여는 2.5 μg/ml puromycine 을이용하여 selection 하였다. 구축된세포주 IHOK/hcdk4 와 IHOK/hcdk4/hTERT 는 keratinocyte growth medium-2(kbm-2, Lonza, Walkersville, MD,USA) 에배양하였으며 6개월이상 selection 하였다. 다. 암종세포주와섬유모세포의배양한국세포주은행에등록된 YD-10B 세포 10) 는 Dulbecco's Modified Dagles Medium(DMEM: Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 과 Ham's nutrient mixture F12(Gibco 28

3 BRL, Grand Island, NY, USA) 를 3:1 의비율로혼합하고 100 IU/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin, 0.6 mg/ml L-glutamine 과함께 10% fetal bovine serum (FBS: hyclone, Logan, UT, USA), 0.1 μg /ml cholera toxin, 0.4 μg/ml hudrocortisone, 5 μg/ml insulin, 5 μg /ml apotransferrin, 2 μg/ml 3'-5-triodo-1-thyronine (all purchased from Sigma St, Louis, MO, USA) 이포함된배지를사용하여 5% CO₂, 37 에서배양하였다. 2. PD(population doublings) 측정불멸화된세포주의 PD 값을계산하기위하여 100 mm 세포배양용접시에 30% 정도가되도록세포를접종한후에 80~85% 정도로세포가증식되었을때계대배양하였다. PD 값의계산은 n=log(nh/ni)/log2 이다. 여기서 n은 PD 값, NH(the number of cells harvested) 는수확된세포의수, 그리고 NI (the number of cells inoculated) 는접종된세포의수를지칭한다. 3. PCR과 RT-PCR 의세포를원심분리하여 proteinase-k 로처리한후 QIAamp DNA minikit(qiagen, Hilden, Germany) 를이용하여 DNA 를추출하였다. RNA 를추출하기위해서 RNeasy plus mini kit(qiagen, Hilden, Germany) 를이용하였다. I-Max tm (Ⅱ) DNA polymerase 2.5 U와 dntps 2.5 mm 이들어있는 Maxime PCR premix kit(intron, Seongnam, Kor) tube 에 DNA 200 ng 그리고 forward 와 reverse primer 를각 10 pmole 을첨가하고 DW로최종용적이 20 μl 되도록하였다. PCR 조건은 94 5분 ; 94 30초, 60 1분, 72 1분 ; 분으로 30 cycle 이되게하였다. primer 염기서열은 HPV16 E6: forward ATG TTT CAG GAC CCG CAG GAG CGA, reverse TTA CAG CTG GGT TTC TCT ACG TG; HPV16 E7 forward TGT TAG ATT TGC AAC CAG AGA CA, reverse TTA TGG TTT CTG AGA ACA GAT GGG; p53 exon 4 forward TTT TCA CCC ATC TAC AGT CC, reverse TTA TGG TTT CTG AGA ACA GAT GGG; p53 exon 5 forward TGT TCA CTT GTG CCC TGA CT, reverse CAG CCC TGT CGT CTC TCC AG; p53 exon 6 forward GCC TCT GAT TCC TCA CTG AT, reverse TTA ACC CCT CCT CCC AGA GA; p53 exon 7 forward GTG TTG TCT CCT AGG TTG GC, reverse GTC AGA GGC AAG CAG AGG CT; p53 exon 8 forward TAT CCT GAG TAG TGG TAA TC, reverse AAG TGA ATC TGA GGC ATA AC이다. 증폭된 PCR 산물은 1% polyacrylamide gel 에서 30 분동안전기영동하였다. UV transfer illuminator(atlas, California, USA) 를이용하여 band 를확인하였다. 4. TRAP(Telomeric repeat amplification protocol) assay Telomerase 활성은 TRAPeze ELISA telomerase detection kit 를이용하여관찰하였다. 수집된세포는 DNAse-, RNAse-free 1.5 ml microfuge tube 에담아 tabletop centrifuge 5415D(Eppendorf) 를이용하여 6000 rpm 에서 6분동안원심분리하여상층부분은제거하고나머지세포는 -80 deep freezer에보관하였다. 총 세포가사용되었다. 5 TRAP Reaction Mix, Taq DNA polymerase, ddh 2 O와세포 (0.5 μg /ml과 1.0 μg /ml) 를섞어 Reaction mixture를준비하였다. heat-inactiveated control을준비하기위해 10 분동안 85 에서인큐베이션시켰으며 Hela 세포는 positive control 로사용되었다. TSR and CHAPS Lysis buffer 는각각 PCR positive control 와 PCR contamination control 을위해사용되었다. PCR 증폭에적용된조건은다음과같다 : 30 / 30분, 94 /3분, 94 /3초, 55 /30초, 33cycle. ELISA detection 을위해서 Blocking/Dilution buffer 를 the microtiter plate (MTP) 에전처리하고 30 분간유지시켰다. TRAP reaction product 는전처리된 well에넣고 37 에서 1시간유지시켰다. Ab solution 과 anti-dnp antibody-hrp conjugate 를첨가하여빛을차단한상태에서 30 분간유지시키고 stop solution 으로반응을중지시켜 microtiter plate reader 기를이용하여 450 nm와 690 nm 값을측정하였다. 5. 단백질발현 (Western blotting) 세포가 100 mm 배양접시에약 80% 정도성장했을때 PBS 로수세하고 protease inhibitor cocktail tablet (Boehringer Mannhein, Mannheim, Germany) 을첨가한 RIPA buffer (Cell signaling, Beverly, MA, USA) 로용해시킨후 4, 12,000 rpm 에서 10분간원심분리하여단백 29

질을얻었으며 BSA(Bovine serum albumin; Sigma, St. Louis, MO, USA) 로정량분석하였다. 5 SDS sample buffer(60 mm Tris-HCl, ph 6.8, 4% SDS, 25% glycerol, 14.4 mm 2-mercaptoethanol, 0.

Membrane 은 5% fat-free dry milk-pbst buffer (PBS, 0.2% Tween-20) 에서 2시간동안 blocking 하였으며, 1 PBST buffer로 10분간 3회수세하였다.

(Ser780, polyclonal, Cellsignaling) 를이용해 3시간혹은 4 에서 16시간반응시켰다. 반응이끝나면 1 PBST buffer로 10분간 3회수세하였다.

그후 ECL (Enhanced chemi luminescence: Amersham Pharmacia biotech, Piscataway, NJ, USA) 로반응시킨후, 카세트에넣어 nitrocellulose membrane 위에 x-ray 필름을놓고노출시킨후, 현상하여단백질의발현정도를관찰하였다. III. 결과 1.

4 질을얻었으며 BSA(Bovine serum albumin; Sigma, St. Louis, MO, USA) 로정량분석하였다. 5 SDS sample buffer(60 mm Tris-HCl, ph 6.8, 4% SDS, 25% glycerol, 14.4 mm 2-mercaptoethanol, 0.1% Bromophenol blue) 에넣고 10분간 100 에서 denaturation 시켜 8% SDS-polyacrylamide gel에서 80V로 1시간, 120V 로 2시간동안전기영동한후, nitrocellulose membrane (Amersham Pharmacia biotech, Piscataway, NJ, USA) 에옮겼다. Membrane 은 5% fat-free dry milk-pbst buffer (PBS, 0.2% Tween-20) 에서 2시간동안 blocking 하였으며, 1 PBST buffer로 10분간 3회수세하였다. 일차항체는 TERT (H-231,rabbit polyclonal, Santa Cruz), p53 (DO-1, mousemonoclonal, Calbiochem), hcdk4 (DCS156, mouse monoclonal, Cell Signaling), Rb (4H1, mouse monoclonal, Cell Signaling), phospho-rb (Ser780, polyclonal, Cellsignaling) 를이용해 3시간혹은 4 에서 16시간반응시켰다. 반응이끝나면 1 PBST buffer로 10분간 3회수세하였다. 이차항체는 1:2000의비율로 anti-rabbit 또는 anti-mouse antibody (Cell Signaling, Beverly, MA, USA) 를사용하여상온에서한시간반응시킨뒤 1 PBST buffer 로 10분간 3회세척하였다. 그후 ECL (Enhanced chemi luminescence: Amersham Pharmacia biotech, Piscataway, NJ, USA) 로반응시킨후, 카세트에넣어 nitrocellulose membrane 위에 x-ray 필름을놓고노출시킨후, 현상하여단백질의발현정도를관찰하였다. III. 결과 1. 불멸화세포주의형태학적인특징과성장속도사람정상구강상피 (normal human oral keratinocyte, 이하 NHOK) 는형태학적으로입방형이다. 5번의계대배양후에 NHOK 는불규칙적으로납작해지는분화된형태의세포의모양을유지하다가 population doublings (PD) 을다섯번이상넘기지못하고사멸하였다 (Fig. 1A). 이에반해 HPV16 E6/E7 으로불멸화시킨 IHOK 와 IHOK 에 hcdk4 를도입한 IHOK/hcdk4 세포주그리고 IHOK 에 hcdk4 와 htert 를함께도입한 IHOK/hcdk4/hTERT 세포주는 50 번의계대배양후에도입방형태를지속적으로유지하며불멸화되었다 (Fig. 1). 초기에 NHOK 는불멸화세포와거의같은속도로성장하다가성장속도가급격히감소하면서더이상성장하지않는세포노화를겪었다. HPV16 E6/E7 으로불멸화된세포주인 IHOK, IHOK/hcdk4 그리고 IHOK/hcdk4/hTERT 는일정한속도를유지하며계속적인성장을보였다 (Fig. 2). 2. PCR 을이용한 HPV16 E6와 E7의존재와변이여부 HPV16 E6/E7 으로불멸화된세가지종류의세포주 IHOK, IHOK/hcdk4 그리고 IHOK/hcdk4/hTERT 의 HPV16, HPV16 E6 그리고 HPV16 E7 의존재유무를확인한결과실험에사용된불멸화세포모두에서 HPV 바이러스를비롯하여, E6와 E7의 DNA가존재함을확인하였고 (Fig. 3A), 염기서열 (sequence) 분석을통하여변이 (mutation) 가 A B C D Fig. 1. Morphology of cell lines. A: NHOK, B: IHOK, C: IHOK/hcdk4, D: IHOK/hcdk 4/hTERT. Primary cultured NHOK was mixed with basal, suprabasal and cornified cells. Cell populations of NHOK were completely senescent after several population doublings. whereas all of HPV16 E6/E7 immortalized cell lines (IHOK, IHOK/hcdk4 and IHOK/hcdk4/hTERT) were almost consisted with basal cells and showed stable growth. 30

Growth curve Population Doublings IHOK IHOK/hcdk4 IHOK/hcdk4/hTERT NHOK 2 5 8 11 14 17 20 23 26 29 32 35 38 41 44 47 50 53 56 59 62 65 68 71 74 77 80 83 Fig. 2. Growth curve of NHOK and HPV16 E6/E7-immortalized cell lines.

* indicates the PD level at which cell populations were senescent, whereas HPV16 E6/E7 immortalized cell lines IHOK, IHOK/hcdk4 and IHOK/hcdk4/hTERT showed stable population growth rate.

5 Growth curve Population Doublings IHOK IHOK/hcdk4 IHOK/hcdk4/hTERT NHOK Fig. 2. Growth curve of NHOK and HPV16 E6/E7-immortalized cell lines. NHOK were completely senescent. PD were calculated as follows: n=log(nh/ni)/log2 where n is the number of PD, NH is the number of cells harvested, and NI is the number of cells inoculated. * indicates the PD level at which cell populations were senescent, whereas HPV16 E6/E7 immortalized cell lines IHOK, IHOK/hcdk4 and IHOK/hcdk4/hTERT showed stable population growth rate. Days A B P53 exon 4(263 bp) P53 exon 5(269 bp) E6(456 bp) P53 exon 6(181 bp) E7(266 bp) P53 exon 7(188 bp) GAPDH P53 exon 8(213 bp) GAPDH Fig. 3. E6/E7 expression and p53 analysed by PCR Total DNA was extracted from cells. Products were run on 1% ethidium bromide stained agarose gels. All three kinds of immortal cell lines have E6 and E7. Mutations of p53 and E6 were not detected in all three. 존재하지않음도확인하였다. p53 의변이여부를확인하기위해서 p53 에서변이가빈번한 exon 4 9까지를중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, 이하 PCR) 하여 DNA를확인하였다 (Fig. 3B). 관찰된 DNA 의변이존재유 무를확인하기위해 agarose gel 에서추출한 DNA 의염기서열을분석한결과 p53 exon 4부터 9까지변이가관찰되지않았다. 31

(A) There is a significant expression of p53 in HPV16 E6/E7 immortalized cell lines (IHOK, IHOK/hcdk4 and IHOK/hcdk4/hTERT). YD-10B of lane 4 is negative control of p53.

6 A B p53 β-actin hcdk4(30kda) β-actin(452kda) C D p-rb pp-rb β-actin cyclind1 GAPDH Fig. 4. Western blot analysis of p53, Rb, phosphorylated Rb (prb) and hcdk4 and RT-PCR of cyclin D in three kinds of immortal cell lines. (A) There is a significant expression of p53 in HPV16 E6/E7 immortalized cell lines (IHOK, IHOK/hcdk4 and IHOK/hcdk4/hTERT). YD-10B of lane 4 is negative control of p53. MCF-7 of lane 5 is positive control of p53. (B) Overexpression of hcdk4 in both IHOK/hcdk4 and IHOK/hcdk4/hTERT. (C) Both IHOK/hcdk4 and IHOK/hcdk4/hTERT show more downregulated prb and phosphorylated Rb than IHOK. (D) Expression of cyclin D by RT-PCR in three immortal cell lines. A C htert Actin B htert GAPDH Fig. 5. Western blotting and RT-PCR of htert and TRAP assay (A)(B) IHOK/hcdk4 and IHOK/hcdk4/hTERT cell lines showed upregulated htert expression. (C)All three immortal cell lines showed positive telomerase activity. If sample-hi ( A) is more than 0.15 ( A 0.15), telomerase activity is positive. Not only in IHOK/hcdk4/hTERT but also in IHOK and IHOK/hcdk4, high level of telomerase activitiy was detected. 3. p53, hcdk4, Rb 그리고 prb의단백질발현 E6 에의해 p53 단백질발현이억제되었는지확인하기위하여 p53 단백질발현을관찰한결과 p53 은높은수준으로 발현되고있음을관찰했다 (Fig. 4A). p53 의 positive control 으로는 MCF-7 세포가사용되었으며, negative control 로는 YD-10B 가사용되었다. YD-10B 는 p53 유전자가 stop 32

7 codon (TAC TAA) 으로변이를일으킨세포주로서 p53 단백질을발현하지못한다 10). hcdk4 를과발현시키므로세포의암화가능성을증대시킬것을기대하고구축한세포주 IHOK/hcdk4 와 IHOK/ hcdk4/htert 에서 hcdk4 의발현이증가하는지를확인하였다. 구축된 IHOK/hcdk4 와 IHOK/hcdk4/hTERT 의두세포주에서모세포 (parent cell) 인 IHOK 보다더높은 hcdk4 발현양을확인할수있었다 (Fig. 4B). hcdk4 과발현에따라 cyclin D의과발현역시확인하였다. 다음으로 hcdk4 와 cyclind 의복합체가기능을하는지를알아보기위해표적단백질인 Rb 의발현양과인산화된 Rb 단백질 (prb) 의발현양을관찰하였다. hcdk4 는 Rb protein 을표적으로하여 Rb 를인산화시켜서전사인자인 E2F 의활성을유도하게한다. Rb 의발현양은 IHOK 세포주에비해서 IHOK/hcdk4 그리고 IHOK/hcdk4/hTERT 에서감소되었으며, prb 의발현양역시감소되었다 (Fig. 4C). 이결과는 hcdk4 가과발현되었음에도표적단백질인 Rb 에작용하지않고있음을시사한다. 4. Telomerase activity와 htert의발현 htert 를과발현시킨세포주 IHOK/hcdk4/hTERT 에서 htert 의발현양이증가되었는지를확인하기위하여 RT-PCR 과 western blotting 을시행하였다. 또한 telomerase activity 의차이가있는지를확인하기위하여 TRAP assay 를시행하였다. HPV16 E6/E7 으로불멸화된 IHOK 를비롯하여 IHOK/hcdk4 그리고 IHOK/hcdk4/hTERT 세포주에서높은 telomerase 활성을보였다 (Fig. 5C). htert 의단백질발현양과 RNA 발현양은 IHOK/hcdk4 와 IHOK/hcdk4/ htert 에서증가되었다 (Fig. 5A-B). IV. 고찰 High-risk human papillomavirus(hpv) 는자궁경부에서인체에종양을일으키는주요한원인이된다는많은연구보고가있다. 구강편평세포암종의경우 HPV 의발현빈도가자궁경부암에비해낮지만 HPV 와 HNSCC 의연관성이받아들여지고있다 11,12). 본연구는 HPV16 E6 와 E7 로불멸화시킨세포주 IHOK 의특성을분석함과동시에 IHOK/ hcdk4 와 IHOK/hcdk4/hTERT 를구축하여세포의특징을 분석하여, 암의진행단계모델에적용하고자하였다. HPV 의두개의 viral oncogene products 인 E6와 E7은암의진행에서필수적인역할을한다 13). 따라서실험에서사용된세포주 IHOK 를비롯하여구축된 IHOK/hcdk4 와 IHOK/hcdk4/hTERT 의 HPV 의존재유무와 E6 와 E7 의발현여부를 PCR 을통해서검증하였다 (Fig. 3). 실험에사용된불멸화세포주에서 E6 가기대되는역할을하고있는지, 즉 p53 의단백질발현이감소되고있는지를확인하고자 Western blotting 을하였다. 그결과세종류의불멸화세포주에서 p53 의강한단백질발현이있었다 (Fig. 4A). 이결과는두가지의의문을제기하였다. 첫째는발현된 E6 유전자가타겟세포에감염되어유전체내로삽입되는과정에서 E6 유전자의변이에의해 p53 의발현억제기능을상실했을가능성과, 둘째는 E6 는정상적인기능을하고있지만발현된 p53 의변이또는기능적인불활성의가능성이다. p53 에대한 E6 의기능을확증하기위해서는 HPV16 E6/E7 으로불멸화시키기전의모세포를대조군로하여 p53 의단백질발현감소를보이는것이가장합당하지만모세포를획득하기어려운상황에서 E6 의유전자염기서열을분석하는것이차선책이라고판단되어, E6 의변이여부를확인한결과유전자변이는관찰할수없었다. 다음으로발현된 p53 유전자에변이가있는지그리고단백질이정상적인기능을하고있는지를알아보기위하여 p53 exon 4에서 9까지염기서열을분석한결과변이를찾을수없었고, 세포에손상을가져오는상황에서 p53 단백질의과발현을확인함으로써 p53 유도기능에도문제가없음을확인했다. HNSCC 에서 HPV16 이발현되는경우 p53 의변이가거의없음을보고한연구가우리의결과를뒷받침해주고있다 14). 이로써 E6 가세포내에정상적으로존재하면서동시에 p53 이정상적인기능을할수있음을밝혔다. HPV E6 와 E7 을도입시킨 cottontail rabbit 세포에서 E6 가 p53 에결합하지못하므로 p53 을분해할수없음을보고한연구는우리의결과를일부설명할수있으며 15), E6 에의한 p53 이분해되어지는기전을우회할수있는가능성을제기할수있다. 이를설명하기위해서추후더연구되어져야할것으로생각된다. HPV 의 E7 역시종양억제유전자들중하나인 Retinoblastoma(Rb) 유전자를타겟으로한다. Rb 단백질은 E2F 라는전사인자와결합하여활성을억제함으로세포주기를조절하는중요한역할을한다. E7 단백질은 Rb 와결합 33

8 하여단백질을분해시키는데, 이과정에서 E2F 전사인자가통제되지않고활성화되면서세포주기를무절제하게진행시킨다. E7 에의해 Rb 단백질의발현이감소되었는지를확증하기위해 Western blotting 을시행한결과 IHOK 의 Rb 는구강암세포인 YD-10B 의 Rb 에비해발현양이적었다. 흥미롭게도, IHOK/hcdk4 와 IHOK/ hcdk4/htert 에서는 Rb 단백질이 IHOK 보다감소되었다 (Fig. 4). 또한인산화된 Rb(pRb) 단백질도 Rb 와같은경향으로감소되었다. Rb 의단백질감소는 E2F 의활성을간접적으로보여줄수있으며, Rb 의단백질감소는 Rb 의인산화에의한것이아니라분해에의한것이라생각된다. 이결과를토대로 HPV16 E6/E7 으로불멸화시킨세포주에서 Rb 단백질은 hcdk4 또는 htert 의발현에의해서조절될수있음을시사한다. htert 의과발현이 Rb/E2F 경위를매개로세포성장속도를증가시킨다는보고와 htert 의과발현과 Rb 의분해를통하여세포를불멸화시킬수있다는보고가있다 16,17). 이보고는 htert 에의해 Rb 의단백질이감소된결과를일부설명할수있다. 최근에암의진행과정에관련된 htert 의또다른역할들과기전에대한보고가있다 18). 이러한보고들을바탕으로 htert 가암의발생과진행에어떻게관련되어있는지에대한추가적인연구가필요하다. Cdk4 가과발현되면부적절한환경에서도 p16 의작용을우회하여세포의수명을연장할수있다 8) 는연구보고와함께증가된 Cdk4 의발현은더공격적인종양을형성한다는보고를바탕으로본연구에서는 hcdk4 를과발현시키므로세포의암화가능성을증대시킬것을기대하고구축한세포주 IHOK/hcdk4 와 IHOK/hcdk4/hTERT 에서 hcdk4 의발현이증가하는지를확인하였다. IHOK 에서도상당한 hcdk4 발현이있었고, IHOK/hcdk4 와 IHOK/hcdk4/hTERT 에서 hcdk4 의발현이증가되었다. hcdk4 는 Rb 단백질을표적으로하여인산화시켜서전사인자인 E2F 의활성을유도하게된다. 앞에서언급한것처럼 Rb 의발현양은 IHOK 세포주에비해서 IHOK/hcdk4 그리고 IHOK/hcdk4/hTERT 에서순차적으로감소되었으며, prb 의발현양역시감소되었다 (Fig. 4). 이결과는 hcdk4 가과발현되었음에도표적단백질인 Rb 에작용하지않고있음을보여주었다. 다음으로세가지불멸화세포의 telomerase 활성을알아보기위하여 TRAP assay 를진행한결과모두강한 telomerase 활성을보였다. HPV E6 에의해서 htert 와 telomerase 가유도된다는연구보고 19) 와상응하는결과였으며, E6 에의해서유도된 telomerase 활성은높은수준이었기때문에불멸화된세포임을입증할수있었다. Ectopic htert 의도입에의해 telomerase 활성이증가되지는않았지만 htert 의발현양은 IHOK/hcdk4 와 IHOK/hcdk4/hTERT 에서증가되었다. 따라서증가된 htert 의역할을분석하기위한연구가추후진행되어야하겠다. 본연구는 HPV16 E6 와 E7 로불멸화시킨세포주 immortalized human oral karatinocyte 를이용하여 IHOK 에 hcdk4 를도입시킨 IHOK/hcdk4 와 IHOK 에 hcdk4 와 htert 를도입시킨 IHOK/hcdk4/hTERT 를추가로구축하여세포의특징을 in vitro 에서확인하였으며, HPV16 가원인이된다단계구강암을이해하고더나아가암의치료와예방에유용한도구로활용될것이다. V. 참고문헌 1. Paterson IC, Matthews JB, Huntley S, et al: Decreased expression of TGF-beta cell surface receptors during progression of human oral squamous cell carcinoma. J Pathol 2001; 193: Califano J, van der Riet P, Westra W, et al: Genetic progression model for head and neck cancer: implications for field cancerization. Cancer Res 1996; 56: Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B: Nature. Genetic instabilities in human cancers 1998; 396: van Houten VM, Snijders PJ, van den Brekel MW, et al: Biological evidence that human papillomaviruses are etiologically involved in a subgroup of head and neck squamous cell carcinomas. Int J Cancer 2001;93: Oda D, Bigler L, Lee P, Blanton R: HPV immortalization of human oral epithelial cells: a model for carcinogenesis. Exp Cell Res 1996; 226: Narisawa-Saito M, Kiyono T: Basic mechanisms of high-risk human papillomavirus-induced carcinogenesis: roles of E6 and E7 proteins. Cancer Sci 2007; 98:

9 7. Serrano M, Hannon GJ, Beach D: A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature 1993; 366: Ramirez RD, Herbert BS, Vaughan MB, et al: Bypass of telomere-dependent replicative senescence (M1) upon overexpression of Cdk4 in normal human epithelial cells. Oncogene 2003; 22: Koontongkaew S, Chareonkitkajorn L, Chanvitan A, et al: Alterations of p53, prb, cyclin D(1) and cdk4 in human oral and pharyngeal squamous cell carcinomas. Oral Oncol 2000; 36: Lee EJ, Kim J, Lee SA, et al: Characterization of newly established oral cancer cell lines derived from six squamous cell carcinoma and two mucoepidermoid carcinoma cells. Exp Mol Med 2005; 37: Psyrri A, DiMaio D: Human papillomavirus in cervical and head-and-neck cancer. Nat Clin Pract Oncol 2008; 5: Hoffmann M, Lohrey C, Hunziker A, Kahn T, Schwarz E: Human papillomavirus type 16 E6 and E7 genotypes in head-and-neck carcinomas. Oral Oncol 2004; 40: Wiest T, Schwarz E, Enders C, Flechtenmacher C, Bosch FX: Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed prb cell cycle control. Oncogene 2002; 21: Westra WH, Taube JM, Poeta ML, Begum S, Sidransky D, Koch WM: Inverse relationship between human papillomavirus-16 infection and disruptive p53 gene mutations in squamous cell carcinoma of the head and neck. Clin Cancer Res 2008; 14: Ganzenmueller T, Matthaei M, Muench P: The E7 protein of the cottontail rabbit papillomavirus immortalizes normal rabbit keratinocytes and reduces prb levels, while E6 cooperates in immortalization but neither degrades p53 nor binds E6AP. Virology 2008; 372: Xiang H, Wang J, Mao Y, Liu M, Reddy VN, Li DW: Human telomerase accelerates growth of lens epithelial cells through regulation of the genes mediating RB/E2F pathway. Oncogene. 2002; 21: Yang G, Rosen DG, Colacino JA, Mercado-Uribe I, Liu J: Disruption of the retinoblastoma pathway by small interfering RNA and ectopic expression of the catalytic subunit of telomerase lead to immortalization of human ovarian surface epithelial cells. Oncogene 2007; 26: Massard C, Zermati Y, Pauleau AL: htert: a novel endogenous inhibitor of the mitochondrial cell death pathway. Oncogene 2006; 25:

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Technical/Specs Sequencing 서비스안내 Standard Sequencing Plasmid/PCR product 를 primer 를이용하여고객이원하는 region 을분석하는서비스이며, 대부분의 normal 샘플에대해 최적화되어있습니다. Full Length Sequencing (Primer walking) 길이가긴 insert 를포함한 plasmid