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1 The Korean Journal of Microbiology (2011) Vol. 47, No. 3, pp Copyright c 2011, The Microbiological Society of Korea 갓김치에서분리된 Pediococcus pentosaceus MLK67 의담즙산분해능및콜레스테롤동화능 임성미 * 동명대학교식품공학과 Bile Salts Degradation and Cholesterol Assimilation Ability of Pediococcus pentosaceus MLK67 Isolated from Mustard Leaf Kimchi Sung-Mee Lim 1 Department of Food Science & Technology, Tongmyong University, Busan , Republic of Korea (Received September 1, 2011 / Accepted September 22, 2011) The objective of this study was to evaluate the acid and bile tolerance, bile salt hydrolase (BSH) activity, and cholesterol assimilation ability of lactic acid bacteria isolated from mustard leaf kimchi. MLK11, MLK22, MLK27, MLK41, and MLK67 were relatively acid- and bile-tolerant strains, with more than 10 5 CFU/ml after incubation in simulated gastric juice and intestinal fluid, while MLK53 was the most sensitive strain to acid and bile. Strains MLK22 and MLK67 deconjugated the highest level of sodium glycocholate with more than 3.5 mm of cholic acid released, while deconjugation was lowest by strains MLK13 and MLK41 which released only 1.35 mm and 1.16 mm, respectively. Specially, strains MLK22 and MLK67 showed higher deconjugation of sodium glycocholate compared to sodium taurocholate and conjugated bile mixture. Although strains MLK22 and MLK67 exhibited maximal BSH activity at the stationary phase, MLK22 had somewhat higher total BSH activity compared to MLK67 towards both sodium glycocholate and sodium taurocholate. Meanwhile, cholesterol removal varied among tested strains (p<0.05) and ranged from 5.22 to μg/ml. Especially, MLK67 strain assimilated the highest level of cholesterol in media supplemented with 0.3% oxgall, cholic acid, and taurocholic acid (p<0.05). According to physiological and biological characteristics, pattern of carbohydrate fermentation, and 16S rdna sequence, strain MLK67 that may be considered as probiotic strain due to acid and bile tolerance and cholesterol-lowering effects was identified as Pediococcus pentosaceus MLK67. Keywords: Pediococcus pentosaceus, acid and bile tolerance, bile salt deconjugation, bile salt hydrolase, cholesterol assimilation 오늘날급변하는사회환경의적응과더불어바쁜일상생활을살아가는현대인들의신체활동량은감소하고잦은인스턴트식품섭취와함께식사패턴이점점서구식으로변해가면서야채나곡류의섭취량은줄어드는반면육류및지방섭취량이날로증가함에따라영양불균형으로인한비만, 당뇨, 암, 뇌졸중및동맥경화등각종성인병의발병률이두드러지게증가하여우리의건강을위협하고있다. 특히심혈관계질환의주요원인은동물성지방의과다한섭취에기인하며입자 * For correspondence. limsm020@tu.ac.kr; Tel.: ; Fax: 가커서동맥외부로빠져나오기어려운 low density lipoprotein (LDL)-cholesterol이관상동맥내부에침착되어혈류를방해하게되고그결과동맥경화, 협심증및심근경색등을유발하는것으로알려져있다. 물론콜레스테롤은세포막의주요구성성분이며, 지방의유화와흡수를담당하는담즙산이나스테로이드호르몬및비타민 D의전구체이므로체내에서필수적인물질이긴하나적정량을초과했을땐인체에유해물질로서그수치가 1 mg/dl 상승할때마다심장병발생률은 2-3% 증가되는것으로보고되고있다 (3, 24). 체내콜레스테롤수치를낮추기위해사용되는약물로는

2 232 Sung-Mee Lim 간에서콜레스테롤을합성하는과정에서 3-hydroxy-3-methylglutaryl (HMG)-CoA reductase를부분적으로억제하여간세포막의 LDL-수용체를증가시켜 LDL, intermediated density lipoprotein (IDL), 및 VLDL (very low density lipoprotein) 을제거하여혈중콜레스테롤을감소시키는 statin이있다. 또한간에서지방산합성을억제하고지방산의산화를촉진함으로써중성지방생성을억제하고 lipoprotein transfer rate를높여중성지방농도를낮춰주는 fibrate와담즙산의장내재흡수를감소시켜간세포내의콜레스테롤을감소시키고 LDL-수용체의활성도를증가시켜혈중콜레스테롤을감소시키는 bile acid sequestrant 등이있다 (11). 하지만이러한약물들을장기간복용시바람직하지못한부작용을초래할수있으므로평소에콜레스테롤함량이적은식품이나저지방식품및식이섬유섭취를권장하고있다 (39). 한편육류를많이섭취함에도불구하고심장질환에잘걸리지않는아프리카 Masai족들을대상으로조사한결과꾸준하게발효유를복용하기때문인것으로발효유제조시생산된 uric acid, orotic acid 및 hydroxymethylglutaric acid와같은유산균의발효산물들이혈중콜레스테롤수치를낮춰준다고알려져있다 (1, 13, 33). 콜레스테롤의수용성대사산물인담즙산은장간순환 (enterohepatic circulation) 하는동안장내세균의 bile salt hydrolase (BSH, cholyglycine hydrolase; EC ) 의작용에의해담즙산을가수분해시켜 steroid의일부분에서 glycine이나 taurine을유리시키고유리담즙산을생성하는데이러한 BSH 활성은 Lactobacillus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium longum, Clostridium perfringens 및 Bacteroides fragilis 등의세균에서보고되고있다 (15). 복합담즙산에비해재흡수되는양이적은유리담즙산은분변을통해배설되므로새로운담즙산을생합성하기위해선전구체인콜레스테롤의요구량이증가되어체내콜레스테롤의수치는낮아지게된다 (8). Klaver와 van der Meer (21) 에따르면, L. acidophilus와 B. bifidum에의해복합담즙산이분해되면서생성된유리담즙산에의해 ph가낮아지고 (ph 5.5 이하 ) 이에따라콜레스테롤교질입자 (micelle) 가불안정해지며, 용해도가감소하여탈포합 (deconjugation) 된담즙산과함께콜레스테롤이침전되므로콜레스테롤농도가낮아지는것이라고보고하였다. 또다른메커니즘으로는 L. acidophilus가배양되는동안배지내에있는콜레스테롤이세균의세포막에흡착되거나세포막의구성성분으로이용됨으로써콜레스테롤양이감소되었다고보고된바있다 (29). Dambekodi와 Gilliland (7) 에의하면 lactobacilli 균주가콜레스테롤을동화 (assimilation) 하여 in vivo 상에서혈중콜레스테롤의농도를감소시켰는데이들에의한콜레스테롤동화는담즙산의존재하에나타났고담즙산의농도가증가함에따라콜레스테롤의저하효과도높게나타났다고하였으며, 복합담즙산을분해시키는능력과담즙산에대한내성이뛰어날수록동화능이높고, 특히세균의배양과정중대수증식기말기내지는정지기초기에동화활성이최대로나타난다고보고하였다 (32). 따라서본연구에서는숙성된갓김치로부터분리된유산균들의내산성및내담즙성을확인하고 in vitro 상에서콜레스테롤저하메커니즘을이해하기위해복합담즙산의탈포합능과 sodium glycocholate와 sodium taurocholate가첨가된배지하에서 BSH의활성및콜레스테롤동화능을측정하여콜레스테롤저하효과가뛰어난균주를분리, 선발및동정하여 probiotic ( 생균제 ) 로서의이용가능성을확인해보고자한다. 재료및방법실험균주분리및배양조건갓을손질한다음각종재료 ( 고춧가루, 새우젓, 찹쌀풀, 다진마늘, 생강및양파 ) 를혼합하여담근후약 3개월간숙성시킨갓김치 11종을수집하였다. 시료 50 g과멸균된 0.85% NaCl 용액 450 ml을혼합한후약 2분간마쇄하여시료용액을준비하였다. 시료용액 1 ml를무균적으로취하여 1% CaCO 3 가첨가된 Lactobacilli MRS agar (Difco Co., USA) 배지에접종한다음혐기적조건 (WC-8080, MART Co., Netherlands) 하에서 37 C, 24-48시간배양한후집락주위에투명한환을생성하는균주만을선택하여이들의액체배양액을 40% glycerol에넣어 -80 C 하에서보관하였고, 실험직전에 MRS agar 사면배지에서 3회계대배양한후사용하였다. 인공위액및담즙산에대한내성유산균들의내산성및내담즙산성조사는 Lim과 Im (22) 의방법에따라인공위액및담즙액하에서의실시하였다. 우선분리된균주는 MRS broth 내에서 37 C, 24시간배양한후 4 C에서 10분간 10,000 g의속도로원심분리 (Micro17R, Hanil, Korea) 하여세포를회수하고멸균된 phosphate buffer solution (PBS, ph 7.2) 로 2회세척한다음 125 mm NaCl, 7 mm KCl, 45 mm NaHCO 3 및 1 mg/ml pepsin (Sigma Co., USA) 을첨가하여 ph 2.5로조정하여인공위액조건에맞춘 MRS broth에접종 ( CFU/ml) 하였다. 혐기적조건하에서 37 C, 2시간배양한후원심분리 (10,000 g, 10분간, 4 C) 하여세포를모으고다시 PBS로세척한다음 buffer에현탁시킨세포부유액은십진희석법으로희석하여 MRS agar상에서생균수를측정하였다. 또한인공위액조건에서처리된세포현탁액은 1 mg/ml pancreatine과 0.3% (w/v) oxgall (Sigma Co.) 을첨가하여 ph 8.0로조정한 MRS broth에접종한후 37 C, 3시간배양한다음표준한천평판배양법으로잔존하는균수를측정하였다. 복합담즙산의탈포합효과실험균주에의한복합담즙산의탈포합능은 Irwin 등 (17) 의방법에따라각균주로부터유리된 cholic acid의양을측정하여평가하였다. MRS broth에 6 mm sodium glycocholate (Sigma Co.), 6 mm sodium taurocholate (Sigma Co.), 혹은 2.8 mm sodium glycocholate와 1.2 mm sodium taurocholate 의혼합물을첨가하여제조한배지에실험균주의배양액 (1%,

3 유산균에의한콜레스테롤저하효과 233 v/v) 을접종하여 37 C에서 24시간혐기적조건에서배양시켰다. 배양액을원심분리 (10,000 g, 10분간, 4 C) 하여얻은상등액을모아 10 M HCl로 ph 1.0으로조정한뒤 1 ml의상등액에 ethyl acetate (2 ml) 을첨가하고약 1분간 vortex (KMC-1300V, Vision Scientific, Korea) 로진탕한뒤 ethyl acetate층을옮겨질소가스 (60 C) 하에서증발시켰다. 남은잔류물은 0.01 M NaOH에용해시킨다음 1% (v/v) furaldehyde (1 ml) 와 8 M H 2SO 4 (1 ml) 를첨가하여다시진탕시킨후 65 C에서 10분간가열처리하였다. 냉각시킨다음빙초산을첨가하고 1분간진탕한후 cholic acid 농도는 spectrophotometer (Spectrocount, Packard Instruments, Meriden, USA) 로흡광도 (600 nm) 를측정하여표준물질로사용된 cholic acid (Sigma Co.) 의농도와비교하였다. BSH 활성측정 Bile salt hydrolase (BSH) 활성은 Tanaka 등 (37) 의방법을사용하여포합된담즙산으로부터유리된아미노산의양을측정하여확인하였다. 즉, 실험균주를 MRS broth에서배양후정해진시간에배양액을회수하여원심분리 (10,000 g, 10분간, 4 C) 해서얻은세포는 PBS (0.1 M, ph 7.0) 에현탁시켜 600 nm에서흡광도약 2.0로조정한후 3분간초음파 (Q125, Qsonica, USA) 처리한다음다시원심분리 (10,000 g, 10분간, 4 C) 하였다. 얻어진상등액 (0.1 ml) 에 PBS (ph 6.0, 1.8 ml) 와담즙산 (6 mm sodium glycocholate 혹은 6 mm sodium taruocholate, 0.1 ml) 을첨가하였다. 혼합물은 37 C에서 30분간배양한후효소반응을정지시키기위해혼합물 0.5 ml에 15%(w/v) trichloroacetic acid (0.5 ml, Junsei Chemical Co., Japan) 을첨가하고난후원심분리 (10,000 g, 10분간, 4 C) 하여얻은상등액 (0.2 ml) 에증류수 1 ml와 ninhydrin reagent [0.5 M citrate buffer (ph 5.5) 에용해시킨 1% (w/v) ninhydrin (Sigma Co.) 0.5 ml, 30% (v/v) glycerol 1.2 ml, 0.5 M citrate buffer (ph 5.5) 0.2 ml] 을첨가하였다. 그런다음진탕시킨후 100 C에서 14분간가열하고난뒤 25 C로냉각시켜 570 nm에서흡광도를측정하였다. 유리된아미노산의양은 glycine 혹은 taurine (Sigma Co.) 의표준곡선으로부터측정하였고, BSH 활성 (U/ml) 의 1 U는 1분당기질로부터 1 μm의아미노산을유리시킨효소의양으로정의하였다. 또한 BSH 활성측정과동시에배양시간별배양액의 ph (ph210, HANNA instruments, Sarmeola de Rubano, Italy) 및표준한천평판배양법에따라 MRS agar 상에서생균수를측정하였다. 콜레스테롤동화능측정 Rudel과 Morris (34) 의방법에따라콜레스테롤의동화능력을측정하였다. 실험균주는 MRS broth 내에서대수기말기까지배양한후원심분리 (10,000 g, 10분간, 4 C) 하여세포를 PBS (ph 7.2) 로세척한다음 0.1% (w/v) pancreatin과 0.3% (w/v) 담즙산 (oxgall, taurocholic acid 혹은 cholic acid) 및콜레스테롤 (100 μg/ml, Sigma Co.) 이함유된 MRS broth 에접종 ( CFU/ml) 하고 37 C에서 24시간배양하였다. 배양후원심분리 (10,000 g, 10분간, 4 C) 하여얻은상등액에 KOH (33%, w/v) 와 96% ethanol을첨가하고 vortex로강하게혼합한후 37 C에서 15분간가온한후 25 C로냉각하였다. Hexane을첨가하여층분리한후 hexane층을회수하여질소가스하에서증발시킨다음잔유물에 ο-phthalaldehyde reagent (Sigma Co., 4 ml) 를첨가하여용해시키고진한황산 (2 ml) 을가하여 10분간방치한다음 550 nm에서흡광도를측정하여콜레스테롤의양을계산하였다. 유산균동정실험균주중내산성과내담즙성, 콜레스테롤동화능및담즙산분해능이뛰어난균주를선택하여형태학적, 배양학적및생화학적특성을조사하였고, 또한 16S rdna sequencing 을통해염기서열을분석하여동정하였다. Bergey s Manual of Determinative Bacteriology (20) 에준하여그람및포자염색, 운동성, 용혈능, catalase, oxidase 및 urease 등의효소생성능, 생육가능한온도, ph 범위및염농도등을조사하였다. 또한 API 50 CHL kit (biomérieux, France) 를사용하여당발효능을알아보았다. 한편, 염기서열분석을위해 16S rdna는 518F (5 -CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3 ) 과 800R (5 -TACCAGGGTATCTAATCC-3 ) primer를사용하여 polymerase chain reaction (PCR, Biorad Laboratories Ltd., Canada) 로증폭시켰다. PCR 산물은 QIA quick PCR kit (QIAGEN, USA) 로정제하고 Macrogen Co. (Korea) 사에의뢰하여 DNA sequcencing 하였다. 분석된염기서열은 GenBank ( 의 database와비교한후 BLASTN program으로상동성을검색하였다. Sequence alignment는 CLUSTER W 알고리즘으로정렬한후 MEGA 5.05 program 으로 Neighbor-joining tree에의해계통도를작성하여유전적유사성을검토하였다. 통계처리실험결과로부터얻은값은 SPSS (version 12.0) 프로그램을사용하여통계처리하였다. 일원배치분산분석법 (one-way ANOVA) 의 Tukey s test로유의수준 p<0.05에서평균값들간의유의적인차이를분석하였다. 결과및고찰인공위액및담즙산에대한내성인공위액및담즙산존재하에서갓김치로부터분리된유산균 14종의내산성및내담즙성을조사한결과는 Fig. 1과같다. Pepsin을첨가하여 ph 2.5로맞춰인공위액환경하에서실험균주를 2시간배양시킨결과, MLK11과 MLK73 균주는다른실험균주에비해매우높은저항성을나타내어 1 log cycle 이하정도만균수가감소되었다. 반면 MLK53과 MLK78 균주는 3 log cycle 이상의균수가감소되어낮은 ph 하에서비교적낮은저항성을보였다. 한편, 인공위액에반응시킨후곧바로 0.3% oxgall을함유한배지상에서 3시간동

4 234 Sung-Mee Lim Dead cell counts (Log CFU/ml) Gastric juice Intestinal fluid MLK06 MLK11 MLK13 MLK22 MLK27 MLK36 MLK41 MLK53 MLK67 MLK73 MLK78 MLK81 MLK84 MLK96 Strains Fig. 1. Tolerance against simulated gastric juice and intestinal fluid of the lactic acid bacteria isolated from mustard leaf kimchi. Initial LAB cells ( CFU/ml) were incubated in artificial gastric juice (ph 2.5) added pepsin (1 mg/ml) at 37 C for 2 h, and then maintained in artificial intestinal fluid added oxgall (0.3%) at 37 C for 3 h. Each values represents mean of three trials. 안실험균주를배양시킨결과, 인공담즙산에대한내성은 MLK22, MLK27, MLK41, MLK67 및 MLK81균주들에의해높게나타나 1 log cycle 이하의균수정도만감소된반면, MLK53과 MLK73 균주는담즙산에민감하여 3 log cycle 이상감소되었다. 따라서 MLK11, MLK22, MLK27, MLK41 및 MLK67 균주는인체내에들어왔을때위산과담즙산하에서도비교적많은균수 (10 5 CFU/ml 이상 ) 가생존하여소장에도달할수있을것으로여겨진다. Erkkilä와 Petäjä (12) 에의하면육발효스타터배양액으로부터분리한균주중 Pediococcus acidilactici P2와 L. curvatus RM10 및 P. pentosaceus FF가가장내산성이강했으며, 이들은 ph 6.0에서 0.3% 담즙산에대한내성도강한것으로밝혀졌다. 유산균이낮은 ph 하에서도견딜수있는내산성메커니즘은아직완전하게밝혀지진않았지만, 다만세포의원형질막에결합되어있는 H + -ATPase의활성과관련있는것으로알려져있다. 배양과정중유산균이생산하는유기산에의해배양액의 ph가낮아지면세포내부로다량의양성자가유입되는데이때 H + -ATPase의활성이높을수록양성자를효과적으로방출하여세포내부의 ph를일정한수준으로유지시켜산에대한내성을나타낸다 (6). 게다가아미노산탈탄산효소는세균세포내의 ph유지에중요한역할을하는것으로밝혀졌는데 lysine decarboxylase는 lysine을 cadaverine 으로전환시켜세포내 ph를높여준다. 또한산성조건에서받는스트레스로유발되는거대분자 ( 단백질이나핵산 ) 들의손상을막아주거나회복하기위해 acid shock protein (ASPs) 을합성하기도하며, 세포막을구성하는지방산성분의변화를유도하는데즉, 불포화지방산을감소시키거나환상지방산의함량을증가시키는등지방산함량을변화시켜세균세포막의 유동성을감소시키면산에대한치사율을낮춰생존율이높아진다 (2). 한편, 담즙산존재하에서유산균의생존메커니즘은포합담즙산의 steroid 구조에결합된아미노산을가수분해하는 BSH의발현능력에의한것으로알려져있다. 이효소의작용에의해아미노산이제거된 steroid기는포합된형태보다세균에독성이적은물리적특성을지니게되는것으로보고되었으며, 그리고 B. animalis의경우세포내 ATP 양을증가시키고 F 1F 0-ATPase에의해양성자펌프를가동시킴으로써담즙산에대한내성을가지게된다고알려져있다 (27, 35). 본실험의결과뿐만아니라이미보고된연구결과에서도유산균의종류에따라인체소화액에대한저항성이다양하였다. Liong과 Shah (23) 에의하면, 같은균종이라할지라도산에대한내성이다르게나타났는데, L. acidophilus ATCC4962, L. casei ASCC290 및 L. casei ASCC292는 ph 2.0에서 2시간동안배양해도 10 7 CFU/ml 이상의균수를유지한반면, L. casei ASCC1520, L. casei ASCC152, L. casei ASCC279, L. casei ATCC15820 및 L. casei CSCC2607은산에매우민감하다고하였으며, 담즙산에대한내성도균주별로상이하게나타났다고하였다. 게다가일부 lactobacilli는탈포합담즙산인 cholic acid이나 oxgall 보다는포합담즙산인 taurocholic acid에의해더많이저해되었는데이는포합된담즙산의높은용해성과계면활성때문에이들의독성이더크게나타나는것으로보고하였다. 하지만 Tannock 등 (38) 은탈포합된 sodioum taurocholate에의해세균의증식저해가뚜렷하게나타났다고하였다. Corcoran 등 (4) 에의하면 L. rhamnosus GG를낮은 ph에노출시켰을때세포수가급격히감소하는것은해당작용에관여하는효소가불활성화되어세포성장과생명유지에필요한대사에너지를얻을수없기때문인것으로보고하였다. 하지만실제음식물과함께유산균을섭취함으로써완충작용에의해위액의 ph가다소상승하여유산균의생존율은좀더높아질수있고, 유산균을 microencapsule화하여장관내에안전하게도달할수있도록하는방법으로개발되어 Kim 등 (19) 의보고에따르면, capsule처리한 L. acidophilus ATCC43121 는대조구에비해 ph 의강산하에서사멸율이유의하게낮았고담즙산존재하에서도생존율이월등히높았다고보고하였다. 복합담즙산의탈포합능 Sodium glycocholate, sodium taurocholate 혹은 sodium glycocholate와 sodium taurocholate의혼합물의존재하에서실험균주에의해유리된 cholic acid 양을측정하여담즙산의탈포합능을측정한결과는 Table 1과같다. 실험에사용된총 14균주중 6균주에서만담즙산의탈포합능이나타났다. MLK22 와 MLK67 균주는 sodium glycoholate로부터각각 3.97±0.20 과 3.68±0.51 mm의 cholic acid을유리시킨반면, MLK13와 MLK41 균주는비교적적은양을생산하였다. 또한 sodium taurocholate로부터생산된 cholic acid의양도 MLK22 (3.06±

5 유산균에의한콜레스테롤저하효과 235 (A) 10 (A) (B) 10 (B) Viable cell counts (Log CFU/ml) ph BSH activity (U/ml) Viable cell counts (Log CFU/ml) ph BSH activity (U/ml) Incubation time (h) Incubation time (h) Fig. 2. Changes in cell numbers ( ), ph ( ), and BSH activity of the MLK22 (A) and MLK67 (B) strain in the presence of sodium glycocholate ( ) or sodium taurocholate ( ). BSH activity was determined by measuring the amount of amino acids (glycine or taurine) released from conjugated bile (6 mm). Results are expressed as Means±SD of three experiments mm) 및 MLK67 (2.93±0.36 mm) 에의해유의하게높게나타났지만 (p<0.05), 나머지균주들은이들보다낮은약 1.0 mm 내외정도생산하였다. 또한 sodium glycoholate와 sodium taurocholate의혼합물에서도 MLK67 균주가가장많은양 (3.11±0.29 mm) 의 cholic acid를유리시켰다. 한편, 담즙산종류별탈포합능을조사한결과, MLK13은포합담즙산의혼합물로부터유의하게높은 cholic acid를유리시켰고, MLK22와 MLK84는 sodium glycocholate에서더많은유리담즙산을생산하였으며, MLK27, MLK41 및 MLK67이생산한 cholic acid의양은포합담즙산의종류에따라유의적인 (p>0.05) 차이가없었다. 여러연구결과에서미루어볼때, 유산균의탈포합능은균종, 배양조건, 담즙산의종류및탈포합능측정방법에따라다소차이가있으며, 담즙산에대한내성이강할수록탈포합능이큰것으로알려져있는데본결과에서도담즙산에대한내성이강한 MLK22, MLK27, MLK41, MLK67 및 MLK84 균주들은탈포합능도강한것으로확인되었다. Table 1. Deconjugation of sodium glycocholate and sodium taurocholate by the lactic acid bacteria isolated from mustard leaf kimchi Strains Sodium glycocholate Cholic acid released (mm) Sodium taurocholate Sodium glycocholate + sodium taurocholate MLK ±0.19 abab 0.97±0.17 aa 1.51±0.26 ba MLK ±0.20 ad 3.06±0.39 bb 2.68±0.23 bbc MLK ±0.31 abc 1.67±0.49 aa 1.94±0.51 aab MLK ±0.38 aa 0.84±0.30 aa 1.07±0.28 aa MLK ±0.51 ad 2.93±0.36 ab 3.11±0.29 ac MLK ±0.33 ac 0.85±0.15 ba 1.25±0.42 ba Bile salt deconjugation ability was determined as the amount of cholic acid released from conjugated bile salt. Results are expressed as Means±SD of three experiments. Means with different lowercase superscript letters in the same row and with different uppercase superscript letters in the same column are significantly different (p<0.05) by Turkey s multiple range test. Lye 등 (26) 에따르면, L. acidophilus, L. bulgaricus 및 L. casei가 sodium taurocholate와 sodium glycocholate의단독및혼합물과 oxgall을탈포합시켜유리시킨 cholic acid의양은 mm로서 sodium glychcholate의탈포합능이가장높은반면, sodium taurocholate의탈포합능이가장낮아본실험의결과와일부일치하였는데이는 glycine으로포합된담즙산이 taurin으로포합된담즙산보다더독성이강하기때문이라하였다. Moser와 Savage (27) 도포합담즙산에대한 lactobacilli 세포자신을보호하기위해담즙산을탈포합시키는것이라고하였다. Gilliland와 Speck (15) 의결과에따르면, L. acidophilus NCFM4962는 sodium taurocholate를탈포합시킬수있었으며, 배양하는동안포합된담즙산이감소됨에따라유리담즙산의농도가증가하였고, 탈포합활성을높이기위해선낮은산화환원전위를요구하였을뿐만아니라호기적조건에서는유리담즙산이검출되지않았다고보고하였다. 담즙산은콜레스테롤의대사산물로체내에서콜레스테롤을제거하는주경로로서, 체내콜레스테롤대사를조절하는중요한수단이다. 유산균을비롯한장내세균들은복합담즙산을유리담즙산으로분해하고장내콜레스테롤흡수에필요한복합 micelle 형성을방해한다. 즉, 생성된유리담즙산은복합담즙산보다용해도가낮아서장에흡수되지않고분변으로배출되고그에따라간에서는분변으로배출된양만큼의부족한복합담즙산을보충하기위해콜레스테롤을이용하여새로운복합담즙산을생성하기때문에결국은체내의혈중콜레스테롤농도는낮아지게된다 (36). BSH 활성 Sodium glycocholate와 sodium taurocholate에대해 MLK22 와 MLK67균주가유의하게높은탈포합능을나타내었으므로배양하는동안이들이생산하는 BSH의활성과배양액의 ph 및생균수를조사한결과는 Fig. 2와같다. MLK22 균주는시간이경과함에따라균수는서서히증가하여배양 24시간후최고균수 (9.42±0.20 CFU/ml) 에이르렀고이때배양액의 ph

6 236 Sung-Mee Lim 는생성된유산에의해 3.27±0.05로나타났다. BSH의활성도시간이경과함에따라급격하게증가하여 24시간배양후 sodium glycocholate와 sodium taurocholate에대한 BSH의활성은각각 1.71±0.03 및 1.34±0.05 U/ml로나타났다. MLK67 균주도 sodium glycocholate을분해하는 BSH 활성은배양 18 시간만에최대값 (1.42±0.08 U/ml) 에이르렀으나, 24시간후에는이보다낮은값을나타내었다. 또한기질이 sodium taurocholate 일때효소의활성은배양시간이지날수록점진적으로증가하여 24시간후에최대값 (1.10±0.03 U/ml) 에도달하였다. Cholic acid 및 chenodeoxycholic acid와같은 1차담즙산은 glycine이나 taurine과같은아미노산과결합하여복합담즙산을형성하는데이들복합담즙산을분해시켜아미노산을유리시키는효소가바로 BSH이다. BSH는다양한장내세균들의세포내효소로서생물학적기능은명확하게밝혀지진않았지만 BSH가혈중콜레스테롤을감소시키는효과가보고됨에따라최근이에관한연구가활발하게진행되고있다. De Smet 등 (9) 은 Lactobacillus sp. 가생산한 BSH가혈중콜레스테롤농도를낮춰주고이효소의활성으로인해담즙산하에서도생존하여소장하부에서집락을형성하면서여러기능을발휘한다고설명하였다. 일반적으로 BSH 활성은산성조건하에서 ethyl acetate로추출한후생성물인 cholic acid 양을측정하거나 taurocholic acid의기질을사용하여방사화학분석 (radiochemical assay) 하거나혹은포합담즙산으로부터유리된 taurine과 glycine을정량함으로써측정한다 (25). Lye 등 (26) 에따르면, L. acidophilus, L. bulgaricus 및 L. casei가생산한 BSH 활성은 U/ml로서 sodium taurocholate가함유된배지에서 BSH 활성이가장낮은반면가장높은활성은 sodium glycocholate와 oxgall 존재하에서나타났으며, BSH 활성은담즙산의혼합물보다는포합담즙산단독으로존재할때더높게관찰되었다고하였다. BSH 활성은 L. acidophilus (5), L. johnsonnii (10), L. gasseri (16) 및 L. plantarum (9) 등다양한유산균에서보고되고있으며, Sridevi 등 (12) 에따르면 L. buchneri의 BSH는 sucrose를첨가한 MRS broth에서대조구에비해활성이거의 2배가량증가하였고, 질소원으로서는 peptone (1.25%) 과동량의 yeast extract가첨가된배지상에서활성이약 2.9배증가되었으며, ph 7.0 및 37 C에서정지기에도달했을때최대의활성을나타내었다고보고하였다. L. plantarum PH04의 BSH 활성도대수증식기보다정지기에서 9배더높았으며, 그들의활성은포합담즙산이없을때보다이들이함유된배지에서더높았고, taurine으로포합된담즙산보다 glycine으로포합된담즙산에서더높았다고하여본결과와일치하였다 (28). 콜레스테롤동화능담즙산의탈포합능을나타낸 6균주들의콜레스테롤동화능을측정한결과는 Table 2와같다. 0.3%(w/v) oxgall을첨가 한배지상에서콜레스테롤동화능은균주마다현저한차이를나타냈으며, 이중에서 MLK67 (39.16±0.77 μg/ml) 의동화능이가장높은반면, MLK13 (9.26±0.27 μg/ml) 는가장낮은값을나타내었다. Cholic acid가첨가된배지상에서도 MLK67 에의해서유의하게 (p<0.05) 높은값 (28.12±0.37 μg/ml) 이나타난반면 MLK13 (5.22±0.89 μg/ml) 의동화능은낮았다. 또한 taurocholic acid가함유된 MRS broth 상에서콜레스테롤동화능은균주마다유의적인 (p<0.05) 차이가있었으며, MLK67 균주 (33.06±0.41 μg/ml) 가가장높은동화능을보였다. 담즙산의종류별로보면 MLK22, MLK41 및 MLK84는 oxgall과 taurocholic acid에서동화능이높았고, MLK27과 MLK67은 oxgall 존재하에서다른담즙산에비해동화능이유의적으로 (p<0.05) 더높게나타났다. 따라서콜레스테롤의동화능은균종과담즙산의종류에따라다소차이가있음을알수있었다. Dambekodi와 Gilliland (7) 은콜레스테롤제거효과는담즙산의탈포합에의한것이아니라, 콜레스테롤의동화와관련있다고보고하였으며, 콜레스테롤동화는담즙산의존재와관계있으며담즙산의농도가높을수록콜레스테롤제거효과가높아진다고하였다. Gilliland (14) 에의하면 bifidobacteria 와 L. acidophilus는산성조건하에서담즙산으로부터콜레스테롤을동화하거나침전시킴으로써혈관내로콜레스테롤이흡수되는것을막아준다고하였다. Liong과 Shah (23) 에따르면, 콜레스테롤동화능은 lactobacilli 균종에따라유의적으로 (p<0.05) 차이가있었으며 oxgall 존재시 μg/ml 로다양하게나타났다. 특히 L. acidophilus와 L. casei는 cholic acid 존재시더높은동화활성을보였으며배지내에있던콜레스테롤은세포막합성에이용되므로그농도가낮아지는것으로보고하였다. 또한성장이왕성한세포의콜레스테롤제거능은 mg/g인반면, 가열처리에의해사멸된세포나휴지기세포 (resting cell) 의제거능은 mg/g에불과하다고하였다. Pereira와 Gibson (30) 도콜레스테롤동화능은세균의성장에의존하여세균의활성이왕성할수록동화능은높아졌다고하였다. Table 2. Assimilation of cholesterol by the selected lactic acid bacteria in the presence of different bile acid Cholesterol assimilated (μg/ml) Strains MRS+oxgall MRS+ cholic acid MRS+ taurocholic acid MLK ±0.27 aa 5.22±0.89 ba 8.21±0.67 aa MLK ±0.56 ab 15.03±0.32 bb 22.19±0.35 ab MLK ±0.60 ac 20.37±0.64 bcd 15.07±0.55 cc MLK ±0.33 ad 19.52±0.49 bc 26.28±0.60 ad MLK ±0.77 ae 28.12±0.37 be 33.06±0.41 ce MLK ±0.43 af 21.09±0.50 bd 27.03±0.91 ad Individual strains were inoculated ( CFU/ml) in different media containing 0.1% pancreatin, 0.3% a bile salt, and cholesterol (100 μg/ml) and then incubated at 37 C for 24 h. Results are expressed as Means±SD of three experiments. Means with different lowercase superscript letters in the same row and with different uppercase superscript letters in the same column are significantly different (p<0.05) by Turkey s multiple range test.

7 유산균에의한콜레스테롤저하효과 237 분리유산균의동정내산성및내담즙성을나타내고담즙산에탈포합능과콜레스테롤동화능및 BSH 활성이가장높은 MLK67 균주의형태학적및생화학적특성을조사한결과는 Table 3과같다. MLK67 균주는그람양성의구균, 포자를형성하지않고운동성은없으며포도당으로부터가스를생성하고황화수소생성능은없었다. D형의유산을생성하고질산염환원력은없었으며포도당으로부터산을생성하므로 methyl red 양성인반면, acetoin을생성하지않아 Voges-Proskauer 음성을나타내었다. 적혈구용혈능은전혀나타내지않았고 catalase를생성하는반면, oxidase와 urease는생성하지않았다. Arginine과 ornithine 은가수분해하였으나, lysine 가수분해능력은없었으며통성혐기성균이고 C의온도와 ph 및염농도 20% 범위에도생육가능하였다. 한편 MLK67 균주는 arabinose, ribose, β-methyl-xyloside, amygdaline, esculine, cellobiose, salicine 및 saccharose 등의당을분해할수있었으나, erythritol, rhamnose, inositol, maltose, lactose, inuline 및 gluconate 등은분해할수없었다. API kit에의한당분해능조사결과 P. pentosaceus MLK67로동정되었다 (ID=96.1%, T-index=0.59). 게다가계통학적위치를검토하기위하여 16S rdna 유전자염기서열 (1,240 bp) 을분석하여 GenBank의 database와비교 한다음 BLASTN program으로상동성을검색한후 Neighborjoining tree에의해계통도를작성한결과는 Fig. 3과같다. 그결과 P. pentosaceus MLK67로동정되었으며, P. pentosaceus DSM20336T (AJ305321) 와 98.7%, P. claussenii DSM14800T (AJ621555) 와 98.1%, P. stilesii LMG23082T (AJ973157) 와 97.8% 및 P. acidilactici DSM20284T (GL397069) 와 97.7% 의상동성을나타내었다. Raghavendra 등 (31) 도 P. pentosaceus CFR R123 균주가 ph 2.0와 ph 2.5에서각각 53% 와 62% 의생존율을보였고, 0.3% oxgall에서도견딜수있었으며, 콜레스테롤감소능도뛰어나다고보고한바있다. 또한 P. pentosaceus NB-17는인공위액에상당량생존하고면역기능을활성화하며알레르기저해효과가확인되어 probiotic 균주로서의가능성을보여주었다 (18). 갓김치에서분리된 P. pentosaceus MLK67은 in vitro 상에서위산과담즙산에도비교적생존율이높아소장에도달하여높은 BSH 활성에의해담즙산을탈포합하고콜레스테롤을동화하여콜레스테롤농도를낮춰줌으로써심혈관계질환에대한위험을감소시킬수있을것으로기대된다. 향후에는 P. pentosaceus MLK67 균주가생산하는 BSH 효소를정제하여효소의특성을파악하고, in vivo 상에서콜레스테롤저하메 Table 3. Physiological and biological characteristics and pattern of carbohydrate fermentation of the MLK67 Contents Results Sugar Results Sugar Results Cell shape Cocci Glycerol Salicine + Gram staining + Erythritol Cellobiose + Spores staining D Arabinose + Maltose Acid fast staining L Arabinose + Lactose Motility Ribose + Melibiose Gas from glucose + D Xylose Saccharose + H 2S production L Xylose Trehalose Lactic acid D Adonitol Inuline Nitrate reduction β Methyl xyloside + Melezitose Methyl red + Galactose + D Raffinose Voges Proskauer D Glucose + Amidon Horse blood hemolysis D Fructose + Glycogene Sheep blood hemolysis D Mannose Xylitol Catalase + L Sorbose β Gentiobiose Oxidase Rhamnose D Turanose Urease Dulcitol D Lyxose + Arginine hydrolysis + Inositol D Tagatose Ornithine hydrolysis + Mannitol D Fucose Lysine hydrolysis Sorbitol L Fucose Growth in aerobic condition + α Methyl D Mannoside D Arabitol anaerobic + α Methyl D glucoside + L Arabitol Growth at C + N Acetyl glucosamine + Gluconate Growth at ph Amygdaline + 2 Ceto gluconate Growth in 1 10% NaCl + Arbutine 5 Ceto gluconate 20% NaCl + Esculine + +, positive reaction;, negative reaction; D, configuration of lactic acid produced from glucose.

8 238 Sung-Mee Lim Pediococcus pentosaceus DSM 20336T(AJ305321) MLK67 Pediococcus lolii NGRI 0510QT(AB362985) 98 Pediococcus acidilactici DSM 20284T(GL397069) Pediococcus claussenii DSM 14800T(AJ621555) Pediococcus stilesii LMG 23082T(AJ973157) Pediococcus argentinicus CRL 776T(AM709786) Pediococcus parvulus JCM 5889T(D88528) 98 Pediococcus inopinatus DSM 20285T(AJ271383) 97 Pediococcus damnosus JCM 5886T(D87678) 73 Pediococcus ethanolidurans Z-9T(AY956789) 99 Pediococcus cellicola Z-8T(AY956788) Lactobacillus saniviri YIT 12363T(AB602569) Lactobacillus manihotivorans OND 32T(AF000162) Lactobacillus graminis DSM 20719T(AM113778) Lactobacillus composti NRIC 0689T(AB268118) Lactobacillus cacaonum DSM 21116T(AM905389) Lactobacillus capillatus YIT 11306T(AB365976) 98 Lactobacillus sucicola NRIC 0736T(AB433982) Lactobacillus aquaticus IMCC1736T(DQ664203) Lactobacillus pentosus JCM 1558T(D79211) 100 Lactobacillus paraplantarum DSM 10667T(AJ306297) Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ATCC 14917T(ACGZ ) Lactobacillus suebicus DSM 5007T(AM113785) Lactobacillus malefermentans DSM 5705T(AM113783) 76 Lactobacillus kisonensis YIT 11168T(AB366388) 100 Lactobacillus buchneri JCM 1115T(AB205055) Lactobacillus rapi YIT 11204T(AB366389) Lactobacillus spicheri LTH 5753T(AJ534844) Lactobacillus namurensis LMG 23584T(AM259119) Lactobacillus zymae LMG 22198T(AJ632157) 37 Lactobacillus acidifarinae LMG 22200T(AJ632158) 56 Lactobacillus brevis ATCC 367(CP000416) 96 Lactobacillus brevis ATCC 14687T(EF120367) Fig. 3. Neighbor joining tree based on 16S rdna gene sequences, showing relationships between MLK67 and the strains having high homogeny with the selected bacteria. Bar, nucleotide substitutions per position. 커니즘을규명하여 probiotic으로서의가치를평가하고선발균주를이용한발효식품, 건강보조식품및유산균제제제조등산업적으로의적용가능성을연구해볼필요가있다. 적요 숙성된갓김치에서분리된유산균을 ph 2.5에서 2시간반응시킨후 0.3% oxgall 존재하에서 3시간배양시킨결과 MLK11, MLK22, MLK27, MLK41 및 MLK67 균주들은 10 5 CFU/ml 이상의균수를유지하여높은저항성을보인반면, MLK53 균주는대부분의균수가사멸되어매우민감한것으 로나타났다. 담즙산에대한내성이강한균주들대부분은복합담즙산의탈포합능이있었으며, MLK22와 MLK67 균주는 sodium glycocholate로부터 3.5 mm 이상의 cholic acid을유리시켜가장높은탈포합능을보인반면, MLK13과 MLK41 은각각 1.35와 1.16 mm 정도낮은양의 cholic acid를유리시켰다. 특히, MLK22와 MLK67의탈포합능은 sodium taurocholate 혹은포합담즙산혼합물보다는 sodium glycoholate 존재하에서더높게나타났다. 게다가 sodium glycocholate 와 sodium taurocholate으로부터 MLK22와 MLK67이생산하는 bile salt hydrolase (BSH) 의활성은정지기초기에최대를이르렀고 MLK67 보다는 MLK22의 BSH 활성이다소높았

9 유산균에의한콜레스테롤저하효과 239 다. 한편, 실험균주들의콜레스테롤제거능은 μ g/ml로균주별유의적인차이가있었으며 (p<0.05), 그중에서 MLK67 균주는 0.3% oxgall, cholic acid 및 taurocholic acid 로부터가장높은콜레스테롤동화능을나타내었다. 따라서실험균주중높은내산성과내담즙성을가지며, 담즙산탈포합능및콜레스테롤동화능이유의하게높은 MLK67 균주는 probiotic 균주로서의가능성이있는것으로간주되어이를생화학적특성과당분해능및염기서열분석에의해동정한결과 Pediococcus pentosaceus MLK67로확인되었다. 참고문헌 1. Akalin, A.S., S. Gonc, and S. Duzel Influence of yogurt and acidophilus yogurt on serum cholesterol levels in mice. J. Dairy Sci. 80, Alvarez-Ordonez, A., A. Fernandez, A. Bernardo, and M. Lopez Acid tolerance in Salmonella typhimurium induced by culturing in the presence of organic acids at different growth temperatures. Food Microbiol. 27, Brown, M.S. and J.L. Goldstein How LDL receptors influence cholesterol and atherosclerosis. Sci. Am. 251, Corcoran, B.M., C. Stanton, G.F. Fitzgerald, and R.P. Ross Survival of probiotic lactobacilli in acidic environments is enhanced in the presence of metabolizable sugars. Appl. Environ. Microbiol. 71, Corzo, G. and S.E. 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