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1 J Koren Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 44(8), 1241~1247(15) LPS 로자극한 RAW264.7 세포에서크랜베리폴리페놀분획물의항산화효과 연구노트 정하나 1 이기욱 1 황금택 1 곽호경 2 1 서울대학교식품영양학과, 생활과학연구소 2 한국방송통신대학교가정학과 Antioxidnt Properties of Polyphenol Frctions from Crnerry Powder in LPS-Stimulted RAW264.7 Cells Hn Jung 1, Kiuk Lee 1, Keum Tek Hwng 1, nd Ho-Kyung Kwk 2 1 Deprtment of Food nd Nutrition, nd Reserch Institute of Humn Ecology, Seoul Ntionl University 2 Deprtment of Home Economics, Kore Ntionl Open University ABSTRACT The ojective of this study ws to determine ntioxidnt properties of polyphenol frctions of crnerry powder employing lipopolyscchrides (LPS)-stimulted RAW264.7 mcrophge cells. Ethyl cette frction (EF) nd methnol frction (MF) of crnerry powder were prepred using C18 Sep-Pk crtridge. When cells were treted with LPS for h, intrcellulr rective oxygen species (ROS) nd DNA dmge significntly incresed. In cells pre-treted with EF, MF, nd totl frction (TF: comining EF nd MF), significnt reductions of intrcellulr ROS were oserved. The tested frctions reduced LPS-induced DNA dmge mesured y Hoechst stining. In ddition, LPS-induced DNA oxidtion ws ttenuted when cells were pre-treted with TF nd MF. However, there ws no significnt difference in LPS-induced superoxide dismutse ctivity. Key words: crnerry, polyphenol, ntioxidnt, inflmmtion 서 염증반응은박테리아나바이러스같은외부물질이체내로유입되었을때일어나는생체방어반응으로각종조직세포와면역세포가이과정에서염증매개물질을분비하는작용을한다. 하지만염증관련세포에서염증매개물질이과도하게생성되면이는만성염증성질환의원인이된다 (1,2). 특히 lipopolyscchride(lps) 나면역세포들이분비하는사이토카인에의하여활성화된대식세포는 nucler fctor kpp B의활성화로부터이어지는강한염증반응을일으키며, 과도한 inflmmtory cytokine, nitric oxide, prostglndin E 2 를생성함으로써만성적인염증반응을유도하는것으로알려져있다 (2-4). 또한염증반응은체내에서산화적스트레스를유발하기도하는데, LPS로활성화된대식세포는염증성물질뿐만아니라활성산소종 (rective oxygen species, ROS) 을과잉생성하여염증반응으로인한산화적스트레스도증가시킨다 (5). 이러한산화적스트레스의증가는세포내의항산화방어체계와 ROS 간의불균형을초래하며세포와조직의 Received 28 April 15; Accepted 7 July 15 Corresponding uthor: Ho-Kyung Kwk, Deprtment of Home Economics, Kore Ntionl Open University, Seoul , Kore E-mil: hkkwk@knou.c.kr, Phone: 론 단백질, 지질, DNA를산화적으로손상시켜만성염증성질환의중요한요인이되는것으로알려져있다 (1,6). 또한 ROS는단순한산화적손상을유발할뿐만아니라세포내의필수적인 2차신호전달물질로써특정 inflmmtory cytokine이나염증반응의신호전달에중요한역할을수행한다 (5). 이것은 LPS나 tumor necrosis fctor-α를처리했을때세포내의 ROS가증가하고, 항산화물질을처리하였을때이러한염증반응에의한세포자멸사가감소하는반응을통해서확인되었다. 그리고염증반응으로세포내에서발생한 ROS가단백질의산화환원반응을변화시킴으로써산화적스트레스를증가시키는것도확인되었다 (1,5,6). 따라서 ROS를제거할수있는항산화제의섭취는산화적스트레스를감소시켜만성적인염증반응을억제할수있는것으로보고되고있으며 (1,7), 플라보노이드와폴리페놀은 LPS로자극한대식세포가생성한 ROS를제거할뿐만아니라 ROS 의발생또한조절하여산화적스트레스를효과적으로억제할수있음이보고되었다 (8-1). 크랜베리는요로감염을포함한감염성질환의예방에도움을주며심혈관계질환과같은만성염증성질환을완화하는등의다양한생리활성을가졌으며, nthocynidin, pronthocynidins, quercetin과같은항산화제를많이함유하고있어높은항산화및항염증효과가있다 (11-13). 특히크랜베리가함유하고있는폴리페놀은 LPS로자극한

2 1242 정하나 이기욱 황금택 곽호경 대식세포와단핵구에서 proinflmmtory cytokine의생성을효과적으로억제했으며 (3,4,14), 그중에서도 pronthocynidin은다양한종류의균에서분리한 LPS로자극한대식세포에서 nitric oxide와 ROS 생성을억제하여크랜베리가염증으로인한산화적스트레스를감소시킬수있음을보고했다 (15). 반면 Kim 등 (16) 의연구에서는 LPS를처리하고고지방식이를섭취한동물모델에서크랜베리분말의보충이혈중 interleukin-1β는유의적으로감소시키지만 nitric oxide에는영향을주지않았다. 이처럼크랜베리의항염증활성에관한다양한연구가진행되어있으나염증반응으로유발되는산화적스트레스억제효과에대한연구는미흡한실정이다. 따라서본연구에서는 LPS로자극된 RAW264.7 mcrophge cell line을이용하여크랜베리분말에서분리한폴리페놀분획물의산화적스트레스및 DNA 손상억제효과를분석하였다. 재료및방법 실험재료및시료제조크랜베리분말은 Kintm Oy(Suomusslmi, Finlnd) 에서구입하여실험에사용하였으며, 폴리페놀분획물은 Lcome 등 (17) 과 Klt 등 (18) 의방법을변형하여분리하였다 (Fig. 1). 크랜베리분말 5 g을취하여 5 ml의증류수에녹인후 5, g에서 5분간원심분리하여상층부를 Whtmn No. 1 여과지 (Whtmn Interntionl Ltd., Midstone, UK) 로여과하였다. 여과액 3 ml 를.1% HCl(v/v) 메탄올용액 3 ml 와.1 N HCl 수용액 3 ml 로 Fig. 1. Flowchrt of frctiontion. EF, ethyl cette frction; MF, methnolic frction; TF, totl frction. 활성화시킨 C18 Sep-Pk crtridge(6 cc, Wters Assoc., Milford, MA, USA) 에주입하였다. 먼저 3 ml의.1 N HCl 수용액으로당과산을제거하고 6 ml의 ethyl cette 를흘려주어 phenolic cids를함유한 ethyl cette frction(ef) 을얻었으며,.1% HCl 메탄올용액 6 ml를흘려주어 nthocynin과 pronthocynidin을함유한 methnolic frction(mf) 을얻었다. 위의과정을반복하여분획물을얻어낸후 EF와 MF를.5 ml씩취해.2 μm memrne filter로여과하여 high performnce liquid chromtogrphy(hplc) 분석에사용하고, 나머지분획물은 speed vcuum concentrtor(scnspeed 4, LoGene Aps, Lynge, Denmrk) 를이용하여 5 rpm, -11 C trp에서건조한후 - C에보관하였다가세포실험에사용하였다. HPLC는 Nov-pk C18 column(3.9 3 mm, 4 µm, Wters Assoc.) 과 diode rry detector가장착된 Wters 2695 HPLC system(wters Assoc.) 을사용하였다. 이동상은 5% formic cid( 용매 A, HPLC grde, J.T. Bker, Phillipsurg, NJ, USA) 와 cetonitrile( 용매 B, HPLC grde, J.T. Bker) 을사용하였다. 용매의 grdient는 ~1 min, 2~1% 용매 B(liner); 1~15 min, 1~12.5% 용매 B; 15~ min, 12.5~6% 용매 B; ~25 min, 6~2% 용매 B; 25~3 min, 2% 용매 B로하였다. 유속은 1 ml/ min으로유지하였고시료주입량은 μl였으며, DAD 스펙트럼에서최대파장을확인한후두종류의분획물을모두 36 nm와 5 nm에서측정하였다. 세포배양및 MTT ssy 본실험에사용한 RAW264.7 세포는 DMEM(Gico BRL, Grnd Islnd, NY, USA) 배지를사용하였으며, 5% fetl ovine serum(gico BRL) 과 1% penicillin/ streptomycin(gico BRL) 을첨가하여 37 C의 CO 2 인큐베이터에서배양하였다. 세포가 8% 정도증식하면 phosphte uffer sline(pbs, ph 7.4; Sigm-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 으로씻어낸후, scrper를사용하여계대배양하였다. 본실험에사용한 MTT ssy는 Mosmnn(19) 의방법에따라배양한 RAW264.7 세포를 96 well plte에각각 cells/well로분주하고 24시간동안배양한후에각 well의배양액을 suction 하고, EF, MF, totl frction(tf, EF+MF) 을.1~1 mg/ml 농도로녹인무혈청 DMEM-F12(Gico BRL) 배지를처리하고 24시간동안배양하였다. 배양후배지를제거하고 tetrzolium slt 3- (4,5-dimethyl-2-thizolyl)-2,5-diphenyltetrzolium romide(mtt; Sigm-Aldrich Co.) 용액 1 μl와무혈청 DMEM-F12 배지 1 μl를넣어 2시간동안배양한다음기존배지를제거하고각 well에 dimethyl sulfoxide(dmso; Sigm-Aldrich Co.) 를 1 μl씩넣고 분간상온에서반응시켰다. 반응시킨 96 well plte를충분히교반하고 microplte reder(spectr Mx 25, Moleculr Devices, Sunnyvle, CA, USA) 를이용하여 54 nm에서흡광도를측정하였다. 세포독성은대조군세포를 1% 로하였을때와비교하여상대적인세포성장억제율로나타내었다. LPS 를처리한 RAW264.7 세포의독성은위와같은 MTT ssy 를이용하였고, EF, MF, TF를 1~ μg/ml의농도로처리

3 LPS 로자극한 RAW264.7 세포에서크랜베리폴리페놀분획물의항산화효과 1243 하여 4시간배양한다음.1 μg/ml의 LPS를주입하고 시간배양하여분석하였다. Intrcellulr ROS 측정 Blck 96 well plte에 cells/well의 RAW264.7 세포를분주한후 MTT ssy와같은방법으로배양하고, EF, MF, TF를 μg/ml로처리하여 4시간배양한다음.1 μg/ml의 LPS를주입하고 시간배양하였다. DMEM- F12로배양이끝난세포를씻어낸후 5 μg/ml 2',7'-dichlorofluorescein dicette(dcf-da, Sigm-Aldrich Co.) 를배지에첨가하여인큐베이터에서 3분동안배양하였다. 배양후 4 C의 PBS로씻어낸세포를형광현미경 (FSX 1, Olympus, Tokyo, Jpn) 으로관찰및촬영하고 fluorescence microplte reder(fluostr Optim, BMG Ltechnologies, Offenurg, Germny) 를이용하여 excittion 485 nm, emission 535 nm에서 ROS 생성량을측정하였다. Flow cytometry를이용한 ROS 측정실험은 lck 12 well plte에 cells/well의 RAW264.7 세포를분주한후위와같은방법으로수행하였으며, PBS(pH 7.4) 로세척한세포는 scrper를이용하여수확한후 BD Accuri C6 flow cytometer(bd Biosciences, Sn Jose, CA, USA) 를이용하여 1,개의세포를기준으로 FL-1 로분석하였다. DNA 손상실험 cells/well의 RAW264.7 세포를분주한다음위와같은방법으로배양하고, DMEM-F12로세포를씻어낸후 3분동안 Hoechst 33258(5 µg/ml, Sigm-Aldrich Co.) 을넣어인큐베이터에서배양하고, 다시 DMEM-F12 로 Hoechst를씻어낸후 fluorescence microscope(fsx 1, Olympus) 로 DNA 손상상태를확인하였다. 단세포전기영동법 (Comet ssy) 도위와같은방법으로세포를배양하였으며, PBS로세척한세포는 scrper를이용하여수확하였다. 수확한 cells/ml의세포를 37 C의.5% low melting grose와 1:1(v/v) 의비율로혼합한후 5 µl를취하여 comet slide(trevigen, Githersurg, MD, USA) 에분주하고 4 C의암소에서 1분간응고시켰다. 그리고슬라이드를 4 C에서 3분간 comet lysis solution에담가세포를용해시킨후, 상온에서 분동안 electrophoresis uffer(3 mm NOH; 1 mm EDTA, ph 13) 에담가 DNA를 unwinding 시켰다. 4 C의전기영동 chmer 에슬라이드를넣고 21 V에서 3분동안전기영동한후, 증류수와 7% ethnol로 5분씩헹궜다. 슬라이드를건조한후 1 µl의 SYBR Gold(.5 µg/ml, Trevigen) 용액으로 3분간염색하고, 슬라이드를증류수로씻었다. 염색된슬라이드는건조한후형광현미경 (FSX1, IX71, Olympus) 으로 DNA 손상을관찰하고, Comet Imge Anlysis System(version 5.5, Kinetic Imging, Nottinghm, UK) 을이용하여 DNA 손상에의한 comet 형성을측정하였다. SOD 활성측정 SOD 활성은 SOD ssy kit(cymn Chemicl Co., Ann Aror, MI, USA) 을사용하여수행하였다. Comet ssy와같은방법으로수확한세포를 RIPA uffer로 lysis 하였다. 세포 lyste를 96 well plte에 1 µl씩분주한후 WST working solution을 µl 넣고혼합한다음 enzyme working solution을 µl를첨가하여 37 C에서 분간 incution 한후 45 nm에서 ELISA reder를이용하여흡광도를측정하였다. 대조구실험은효소대신 1 µl dilution uffer를넣었으며, SOD 활성은시료군과대조군사이의흡광도차이를백분율 (%) 로나타내었다. SOD ctivity (%)= ( 1- 시료군의흡광도 ) 1 대조군의흡광도 통계분석 실험결과의통계처리는 SPSS progrm(version 12., SPSS, Chicgo, IL, USA) 을이용하여 one-wy ANOVA test 및 Duncn's multiple rnge test를하였다. 결과및고찰 크랜베리분말분획성분크랜베리분말에서분리한 EF와 MF를 HPLC-DAD의 UV 스펙트럼으로분석한결과 EF와 MF는각각 36 nm와 5 nm에서최대피크를보였고, 두분획물을각파장으로분석한크로마토그램은 Fig. 2에나타냈다. EF는 5 nm 파장에서아무것도검출되지않은것으로보아 nthocynin과 pronthocynidin이제거된 phenolic cid 분획이고, MF는 5 nm 파장에서주요피크가모두검출되어 nthocynin과 pronthocynidin을함유하고있는분획임을확인했다. 이것은 C18 crtridge를이용하여크랜베리와다른과일에서폴리페놀분획을분리한 Klt 등 (18) 과 Lcome 등 (17) 의연구와도유사한결과였다. Lcome 등 (17) 은본연구와유사한방법으로분리한크랜베리를포함한 12종의과일의 phenolic 성분을 28 nm(totl phenolics), 3 nm(hydroxycinnmtes), 365 nm(flvonols), 5 nm (nthocynins) 에서분석하였고, 크랜베리폴리페놀분획의최대흡수파장은 365 nm이며, 특히 trimer와 tetrmer 와같은 oligomer 형태의프로안토시아니딘이많이함유되어있다고보고했다. 또한선행연구들은크랜베리가 nthocynins, flvonols(quercetin-3-β-glctoside, quercetin-3-rhmnopyrnoside, myricetin-3-β-glctoside), pronthocynidins(epictechin, epictechin-(4β 8, 2β O 7)-epictechin, epictechin-(4β 8)-epictechin-(4β 8, 2β O 7)-epictechin, hydroxycin-

4 1244 정하나 이기욱 황금택 곽호경 Fig. 2. HPLC chromtogrms of polyphenol frctions of crnerry powder. EF, ethyl cette frction; MF, methnolic frction. nmtes를주요 flvonoids로함유하고있는것으로보고했다 (11-13). 본연구에서는크랜베리분말에서분리된 EF, MF, TF를 DMEM-F12 배지에녹여세포실험에사용하였다. 크랜베리분말분획의세포독성크랜베리분말에서분리한분획물의세포독성을알아보기위하여 MTT ssy를수행하였으며 (19), 세가지분획물모두.5 mg/ml 이하의농도에서는세포독성이없는것으로나타났다 (Fig. 3, P>.5). 또한 LPS를처리한세포로 MTT ssy를수행하여.1 μg/ml의농도에의한세포독성이없는것을확인하였고, 세가지분획물을 1, 5, 1, μg/ml 농도로처리한 RAW264.7 세포에.1 μg/ml의 LPS를사용하여염증을유발시키고세포독성이없음을확인하였다. Intrcellulr ROS DCF-DA는세포안으로쉽게들어가고세포막을통과하여세포내의 ROS와반응하여형광을띠는 DCF를생성한 C Cell viility (%) μg/ml 5 μg/ml μg/ml 1 μg/ml c TF EF MF Fig. 3. Cell viility in RAW264.7 cells treted with polyphenol frctions of crnerry powder. Vlues re the men±stndrd devition of three mesurements. Vlues with different letters (-c) within the sme concentrtions differ significntly (P<.5 y one-wy ANOVA nd Duncn's multiple rnge test). EF, ethyl cette frction; MF, methnolic frction; TF, totl frction. c 다. LPS로자극된 RAW264.7 세포에서크랜베리분획물이염증반응으로증가되는 ROS를저하할수있는지확인하고자세포내의 DCF를다양한방법으로측정하여비교하였다 (Fig. 4). 먼저세포의 ROS 생성을확인하였을때 LPS를처리하지않은세포는 DCF로염색된세포가적었고, LPS로자극한세포는 DCF로염색된세포가많은것으로보아염증반응으로인한 ROS 생성이활발한것을알수있었다. 또한 flow cytometry를이용하여 DCF-DA로염색한세포를분석한결과처리한 LPS의농도가증가함에따라 DCF-DA로염색된세포가점차증가하였다. Flow cytometry와 fluorescence microplte reder를이용하여분석한결과 μg/ml의 EF, MF, TF를처리하고.1 μg/ml의 LPS로자극한세포의 ROS 생성량은 LPS만처리한세포보다유의적으로낮았고, 이것은염증을유발하지않은세포의 ROS 생성수준과비슷한정도였다 (P<.5). 이러한결과는크랜베리폴리페놀분획물의항산화활성이염증을유발한세포내에서도유효하며, 염증반응으로인해발생하는 ROS 생성을감소시켜과도한염증반응을감소시킬수있음을나타낸다. 이것은크랜베리에서분리한 pronthocynidin 분획물이균에서분리한세포벽과 LPS 로자극한대식세포의세포독성을감소시켰으며, 이것은크랜베리가염증으로인한 nitric oxide와 ROS 생성을감소시켜서나타난보호효과일수있음을보고한연구와도유사한결과이다 (15). 또한 Kim 등 (8) 은플라보노이드와폴리페놀을많이함유하고있는과일추출물이 LPS로자극한 RAW 세포의 ROS를포착하고제거할뿐만아니라 trnscription fctor의발현을조절하여 ROS 발생을미연에방지함으로써산화적스트레스를효과적으로억제할수있다고하였다. DNA 손상 LPS로자극된 RAW264.7 세포에서크랜베리분획물이염증반응으로인한 DNA 손상을저하할수있는지확인하고자세포내의 DNA를 Hoechst 염색과 Comet ssy로분석하였다 (Fig. 5). 형광현미경으로 Hoechst로염색한세포핵

5 LPS 로자극한 RAW264.7 세포에서크랜베리폴리페놀분획물의항산화효과 FI (%) FITC-1 (men) Fig. 4. Intrcellulr ROS genertion in LPS (.1 μg/ml)-stimulted RAW264.7 cells pretreted with polyphenol frctions ( μg/ml) of crnerry powder. Vlues re the men±stndrd devition of three mesurements. Vlues with different letters (,) ove rs differ significntly t P<.5 y one-wy ANOVA nd Duncn's multiple rnge test. USLC, unstined LPS control; C, control; LC, LPS (.1 μg/ml)-stimulted control; HLC, high LPS (1 μg/ml)-stimulted control; TF, totl frction; EF, ethyl cette frction; MF, methnolic frction. 의형태를확인하였을때 LPS로자극한세포는핵의 DNA 응축과분절이많은것으로보아염증반응으로인하여 DNA 가손상된것을알수있었다. μg/ml의 EF, MF, TF를처리하고.1 μg/ml의 LPS로자극한세포의핵은 LPS만처리한것보다 DNA 손상이적은것으로관찰되었다. 본연구에서이용한 Comet ssy는 DNA 손상에관련된다양한연구에응용되는기법으로세포수준에서의 DNA 손상정도를민감하게감지해낼수있으며, 염색된 DNA의 hed와손상된 DNA가전기영동으로이동된형태가혜성의모습을닮아 Comet ssy라고불린다. 따라서 DNA의손상도는 til의길이및양에따라결정된다 (6). 5개세포의 DNA 손상도를측정하여그평균값을 til moment로나타내며, olive til moment는 til에존재하는 DNA의양을말한다. LPS를처리한세포에서 Comet ssy를실시한결과 DNA의손상정도에따라다양한형태의핵모양을관찰할수있었으며, LPS를처리한세포는 DNA가손상되어파괴된 DNA 조각이전기영동에의해긴꼬리를가진혜성모양을형성하였다. 또한 Comet Imge Anlysis System을이용하여 DNA의손상을분석한결과 LPS로자극한세포의 olive til moment와 til length가증가되었으며, TF와 MF 분획물을처리했을때세포의 DNA 손상이감소되는경향을확인할수있었으나유의적인차이는없었다. 이결과는 nthocynin과 pronthocynidin을많이함유하고있는 MF 가염증반응에의한산화적 DNA 손상을억제할수있을것임을나타내며, 블랙라즈베리에서분리한안토시아닌분획과 cynidin-3-glucoside가 H 2O 2 로자극한 RAW264.7 세포의 DNA 손상을억제했다는선행연구결과와도유사한결과이다 (,21). 또한 Yen 등 (22) 은허브뿌리에서분리한폴리페놀분획이 sodium nitroprusside로자극한 RAW 264.7의 DNA 손상을감소시켰으며, 이를폴리페놀의항산화능과 nitric oxide 소거능에의한것으로보고했다. SOD 활성 LPS로자극한 RAW264.7 세포에서크랜베리분획물이염증반응으로인한항산화효소활성에미치는영향을확인하고자세포내의 SOD 활성을분석하였고, LPS를처리하지않은세포의 SOD 활성 (7.2±3.7 U/mg protein) 보다 LPS를처리한세포의 SOD의활성 (13.8±8. U/mg protein) 이증가했다. 이결과로 LPS로인한산화적인스트레스에대한반응으로 SOD 활성이증가함을확인했다. 하지만 μg/ ml의 EF, MF, TF를처리하고.1 μg/ml의 LPS로자극한세포의 SOD 활성은각각 11.8±8.6, 14.6±8.4, 12.7±7.3 U/mg protein으로 LPS만처리한세포와유의적인차이가없었다 (P>.5). Sngh(23) 는크랜베리에서분리한폴리페놀분획이 LPS(1~ μg/ml) 로자극한 THP-1 세포의산화적인스

1246 정하나 이기욱 황금택 곽호경 A B 25 3 Til DNA (%). 15 1 Til Length (%). 25 15 1 5 5 5 25 Til Moment. 4 3 1 Olive Til Moment. 15 1 5 Fig. 5. Intrcellulr DNA frgmenttion (Hoechst, A) nd DNA oxidtion (comet ssy, B) in LPS (.

6 1246 정하나 이기욱 황금택 곽호경 A B 25 3 Til DNA (%) Til Length (%) Til Moment Olive Til Moment Fig. 5. Intrcellulr DNA frgmenttion (Hoechst, A) nd DNA oxidtion (comet ssy, B) in LPS (.1 μg/ml)-stimulted RAW264.7 cells pretreted with polyphenol frctions ( μg/ml) of crnerry powder. Vlues re the men±stndrd devition of three mesurements. Vlues with different letters (,) ove rs differ significntly t P<.5 y one-wy ANOVA nd Duncn's multiple rnge test. EF, ethyl cette frction; MF, methnolic frction; TF, totl frction. 트레스를감소시켜 SOD 활성을유의적으로감소시켰다고보고했다. 그러나본연구에서는 LPS(.1 μg/ml) 로자극한 RAW264.7 세포에 EF와 TF를처리했을때세포내의 ROS 는감소했으나 SOD 활성의유의적인감소는나타나지않았다. 이와유사한결과는 LPS를처리한 d/d 동물에서크랜베리건조물의섭취가간조직액의 SOD 활성에영향을주지않았다는 Kim 등 (24) 의연구에서도관찰된바있다. 이러한연구결과를통해크랜베리함유폴리페놀은 LPS 로자극한 RAW264.7 세포에서발생하는 ROS와 DNA 손상을억제할수있음을확인하였다. 그러므로본연구의결과 를배경으로크랜베리가염증반응으로발생한 ROS에의한단순한산화적손상뿐만아니라염증반응에서신호전달이나산화환원반응의변화에미치는영향에대한깊이있는연구가필요한것으로보인다. 요약본연구의목적은 LPS로자극한 RAW264.7 세포를이용하여크랜베리에서분리한폴리페놀분획물의항산화능을분석하는것이었다. 크랜베리분말의에틸아세테이트분획

7 LPS 로자극한 RAW264.7 세포에서크랜베리폴리페놀분획물의항산화효과 1247 (EF) 과메탄올분획 (MF) 은 C18-Sep-Pk 카트리지를사용하여분리했다. 시간동안 LPS로자극한 RAW264.7 세포는활성산소종 (ROS) 과 DNA 손상이유의하게증가하였으며, EF, MF 및 TF(EF+MF) 로전처리하고 LPS로자극한 RAW264.7 세포에서는 ROS와 DNA 손상이유의적으로감소했다. 그러나 superoxide dismutse의활성에는차이가없었다. 감사의글 이논문은 14년도한국방송통신대학교학술연구비지원을받아작성된것임. REFERENCES 1. Tk PP, Firestein GS. 1. NF-kppB: key role in inflmmtory diseses. J Clin Invest 17: Fujihr M, Muroi M, Tnmoto K, Suzuki T, Azum H, Iked H. 3. Moleculr mechnisms of mcrophge ctivtion nd dectivtion y lipopolyscchride: roles of the receptor complex. Phrmcol Ther 1: Bodet C, Chndd F, Grenier D. 6. Anti-inflmmtory ctivity of high-moleculr-weight crnerry frction on mcrophges stimulted y lipopolyscchrides from periodontopthogens. J Dent Res 85: Muller CE, Khoo C, Percivl SS. 1. Crnerry polyphenols down-regulte the toll-like receptor 4 pthwy nd NF-κB ctivtion, while still enhncing tumor necrosis fctor α secretion. FASEB J 24: Chpple IL Rective oxygen species nd ntioxidnts in inflmmtory diseses. J Clin Periodontol 24: Hemnni T, Prihr MS Rective oxygen species nd oxidtive DNA dmge. Indin J Physiol Phrmcol 42: Widén C, Ekholm A, Piwowr-Zil D, Rumpunen K. 1. Antioxidnt ctivity of polyphenol rich fruits on humn erythrocytes. Astrct No. 926 presented t ⅩⅩⅧ Interntionl Horticulturl Congress on Science nd Horticulture for People Interntionl Symposium, Lison, Portugl. 8. Kim YH, Lee MJ, Lee HS, Kim JG, Prk WH. 11. Suppressive effect of Euryle ferox slisury extrcts on inflmmtory response in LPS-stimulted RAW264.7 cells through the ntioxidtive mechnism. Koren J Orientl Physiology & Pthology 25: Cíz M, Pvelková M, Gllová L, Králová J, Kul L, Lojek A. 8. The influence of wine polyphenols on rective oxygen nd nitrogen species production y murine mcrophges RAW Physiol Res 57: Youdim KA, McDonld J, Klt W, Joseph JA. 2. Potentil role of dietry flvonoids in reducing microvsculr endothelium vulnerility to oxidtive nd inflmmtory insults. J Nutr Biochem 13: Singh AP, Wilson T, Klk AJ, Cheong J, Vors N. 9. Isoltion of specific crnerry flvonoids for iologicl ctivity ssessment. Food Chem 16: Reed J. 2. Crnerry flvonoids, therosclerosis nd crdiovsculr helth. Crit Rev Food Sci Nutr 42: Neto CC. 7. Crnerry nd lueerry: evidence for protective effects ginst cncer nd vsculr diseses. Mol Nutr Food Res 51: Bodet C, Chndd F, Grenier D. 7. Crnerry components inhiit interleukin-6, interleukin-8, nd prostglndin E2 production y lipopolyscchride-ctivted gingivl firolsts Eur J Orl Sci 115: L VD, Lrecque J, Grenier D. 9. Cytoprotective effect of pronthocynidin-rich crnerry frction ginst cteril cell wll-medited toxicity in mcrophges nd epithelil cells. Phytother Res 23: Kim MJ, Ohn J, Kim JH, Kwk HK. 11. Effects of freezedried crnerry powder on serum lipids nd inflmmtory mrkers in lipopolyscchride treted rts fed n therogenic diet. Nutr Res Prct 5: Lcome A, Wu VC, Tyler S, Edwrds K. 1. Antimicroil ction of the Americn crnerry constituents; phenolics, nthocynins, nd orgnic cids, ginst Escherichi coli O157:H7. Int J Food Microiol 139: Klt W, McKinnon S, McDonld JE, Vinqvist M, Crft CA, Howell A. 8. Phenolics of Vccinium erries nd other fruit crops. J Sci Food Agric 88: Mosmnn T Rpid colorimetric ssy for cellulr growth nd survivl: ppliction to prolifertion nd cytotoxicity ssys. J Immunol Methods 65: Li YS, Hsu WH, Hung JJ, Wu SC. 12. Antioxidnt nd nti-inflmmtory effects of pigeon pe (Cjnus cjn L.) extrcts on hydrogen peroxide- nd lipopolyscchridetreted RAW264.7 mcrophges. Food Funct 3: Jung H, Kwk HK, Hwng KT. 14. Antioxidnt nd ntiinflmmtory ctivities of cynidin-3-glucoside nd cynidin-3-rutinoside in hydrogen peroxide nd lipopolyscchridetreted RAW264.7 cells. Food Sci Biotechnol 23: Yen GC, Li HH, Chou HY. 1. Nitric oxide-scvenging nd ntioxidnt effects of Urri crinit root. Food Chem 74: Sngh V. 12. Pronthocynidin-rich crnerry-frctioninduced ltertion of periodontl pthogen lipopolyscchride functions. MS Thesis. The University of Tennessee, Knoxville, TN, USA. 24. Kim MJ, Chung JY, Kim JH, Kwk HK. 13. Effects of crnerry powder on iomrkers of oxidtive stress nd glucose control in d/d mice. Nutr Res Prct 7:

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,