대한진단검사의학회지제 29 권제 3 호 2009 Korean J Lab Med 2009;29: DOI /kjlm Original Article Diagnostic Genetics 비소세포폐암환자에서 Real-time PC

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서원 주
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1 대한진단검사의학회지제 29 권제 3 호 2009 Korean J Lab Med 2009;29: DOI /kjlm Original Article Diagnostic Genetics 비소세포폐암환자에서 Real-time PCR을이용한혈장 Heterogeneous Ribonucleoprotein B1 mrna 상대정량의유용성 김정만 1 황상현 2,3 송은주 2 이상률 4 김영대 5 이창훈 6 이민기 7 장철훈 2,3 이은엽 2,3 동아대학교의과대학진단검사의학교실 1, 부산대학교의학전문대학원진단검사의학교실 2, 부산대학교의학연구소 3, 부산대학교의학전문대학원생화학교실 4 흉부외과학교실 5 병리학교실 6 내과학교실 7 Comparative Quantification of Plasma hnrnp B1 mrna in Non-small Cell Lung Cancer Patients by Real-time PCR Jeong-Man Kim, M.D. 1, Sang Hyun Hwang, M.D. 2,3, Eun Ju Song 2, Lee Sang-Yull, Ph.D. 4, Yeong-Dae Kim, M.D. 5, Chang Hun Lee, M.D. 6, Min Ki Lee, M.D. 7, Chulhun L. Chang, M.D. 2,3, and Eun Yup Lee, M.D. 2,3 Department of Laboratory Medicine 1, Dong-A University College of Medicine, Busan; Department of Laboratory Medicine 2, Biochemistry 4, Thoracic and Cardiovascular Surgery 5, Pathology 6, Internal Medicine 7, School of Medicine, and Medical Research Institute 3, Pusan National University, Busan, Korea Background : Circulating cell-free nucleic acids are known to be a noninvasive diagnostic tool for cancer detection. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnrnp) B1, a nuclear core complex, is overexpressed in early stage lung cancer. We intended to evaluate the usefulness of plasma hn- RNP B1 mrna in differentiating non-small cell lung cancer (NSCLC) from other benign lung diseases, especially pulmonary tuberculosis, which is highly prevalent in Korea and often difficult to distinguish from lung cancer. Methods : Plasma RNA was extracted from 30 patients with NSCLC, 30 patients with benign lung diseases including pulmonary tuberculosis, and 10 healthy controls. Plasma hnrnp B1 mrna was measured by TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems, USA), and pre-developed betaactin (ACTB) mrna was used for normalization. We analyzed the relative gene expression data using the delta-delta Ct method. Results : Plasma hnrpn B1 mrna was measurable in 93.3% (28/30) of NSCLC patients. Normalized 2 - Ct of plasma hnrpn B1 mrna was 62.2 (95%Cl, ) in NSCLC patients and 2.7 (95% Cl, ) in benign lung disease patients (P<0.001, Mann-Whitney U test). Conclusions : Plasma hnrnp B1 mrna was significantly increased in patients with lung cancer compared with that in patients with other benign lung diseases. Plasma hnrnp B1 mrna may be useful as a potential marker for the detection of NSCLC. (Korean J Lab Med 2009;29:249-55) Key Words : Lung cancer; hnrnp B1; Plasma mrna; Cancer biomarker; Circulating nucleic acid Received : December 5, 2008 Manuscript No : KJLM2207 Revision received : March 12, 2009 Accepted : March 12, 2009 Corresponding author : Sang Hyun Hwang, M.D. Department of Laboratory Medicine, Pusan National University Hospital, 1-10 Ami-dong, Seo-gu, Busan , Korea Tel : , Fax : mindcatch@hanmail.net * 본논문은 2006 학년도동아대학교학술연구비 ( 공모과제 ) 에의하여연구되었음. 서론폐암은서양에서가장발생률이높은암이며, 암사망률 1위의원인으로알려져있다 [1]. 우리나라에서도폐암의발생이급격히증가하는추세에있으며, 2003년-2005년에위암에이어 2 위 (12.8%) 를차지한것으로알려져있는매우중요한암이다 [2]. 249

2 250 김정만 황상현 송은주외 6 인 뿐만아니라진단을위한적합한선별검사가없어전체폐암환자중단지 15% 만이조기에발견되기때문에, 완치율이 6-15% 로매우낮은것으로알려져있다. 이때문에암의발생률은 2위이지만, 조기사망률에있어서는 1위를차지하고있다. 결국폐암의조기발견만이완치를할수있는유일한방법이며, 따라서, 선별검사에이용할수있는적절한암표지자개발이절실하다고하겠다. 통상적으로시행하는객담세포도말검사와단순흉부방사선사진은폐암환자의생존율을높이지못하는것으로알려져있다 [3]. 암환자의혈장에서 mrna가검출됨에따라 [4], 암진단또는치료평가를위한혈장 mrna의유용성에대한연구들이시도되고있다. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 (HNRNPA2B1, NM_031243) 의 splicing variant인 hnrnp B1 mrna가폐암조직에서과발현되는것이밝혀지고 [5], Fleischhacker 등이폐암환자의혈장에서높은빈도로 hnrnp B1 mrna가검출되는것을보고하면서 [6], 폐암표지자로서의유용성에대한연구들이진행되고있다 [7-9]. hnrnp B1 단백은 RNA splicing과 mrna를핵에서세포질로이동시키는과정등 mrna 발현을조절하는기능을하는것으로알려져있으나 [10], 현재완전히기능이밝혀지지는않은상태이다. 본연구에서는혈장 hnrnp B1 mrna의검출이폐결핵과같은양성폐질환으로부터비소세포폐암환자를구별하는데유용한지알아보고자하였다. 았으며, 병원임상연구위원회의승인을받아연구를진행하였다. 2. 혈장 RNA의추출및cDNA의합성연구대상자로부터말초혈액 4-5 ml을 EDTA 채혈용기에담아즉시검사실로운송하였다. 혈액은 4 에서 3,500 rpm으로 15 분간원심분리하였으며, 세포가오염되지않도록주의하여혈장을분리하였고, 검사전까지영하 80 에보관하였다. RNA 추출은상품화된키트인 RNeasy Midi Kit (Qiagen, Chatsworth, CA, USA) 제조사의지침에따라혈장 200 μl 에서추출하였다. 추출된 RNA의양과질은 microspectrophotometry (Nanodrop, Rockland, DE, USA) 로확인하였다. 역전사반응은상품화된키트인 Sensiscript RT Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) 을이용하여제조사의지시대로 cdna 를합성하였다. 10 μl RNA를 2 μl 10 RT buffer, 500 μm dntp, 200 μm random hexamer primer, 10 units RNase inhibitor, 10 units Sensiscript Reverse Transcriptase (QI- AGEN GmbH, Hilden, Germany) 로혼합된 20 μl 를 37 에서 60 분간역전사반응을진행하였다. 반응이끝난후 reverse transcriptase를불활성화시킨후영하 20 에서보관하였다. 3. 정성 PCR을이용한혈장 mrna 및 hnrnp B1 검출예비연구 대상및방법 1. 대상 2006년 3월부터 2007년 2월까지일개대학병원에서폐암이의심되는환자를대상으로치료전말초혈액을채취하였으며, 이들중최종적으로진단된폐암환자 30명, 폐결핵을포함한양성폐질환자 30명, 정상인 10명을대상으로하였고, 선정기준은다음과같다 ; 1) 폐암환자는병리조직생검과영상의학적소견상폐암으로확진받은환자, 2) 폐결핵환자는항산성염색, 결핵배양, PCR, 단순흉부방사선소견, 폐결핵치료여부를종합하여폐결핵으로진단받은환자, 3) 양성폐질환자는조직소견또는영상의학적소견으로진단된환자이었고, 정상대조군은임상실습전건강검진을시행한의학전문대학원생들로특별한소견이없는정상인을대상으로하였다. 또한, 혈장에서의 hnrnp B1 mrna의검출률을평가하기위하여보관되어있던폐암조직을이용하여 real-time PCR을시행하였다. 문서화된동의서를받 Real-time PCR을시행하기에앞서, 정성 PCR을이용하여혈장에서 hnrnp B1 mrna 증폭여부를확인하는예비실험을진행하였다. 우선 mrna 검출을위해 5 U Taq Polymerase와 1x reaction buffer, 200 μm deoxynucleotides (dntps), 10 μm 의시발체를혼합하여 master mix를만든후 cdna template 2 μl 를첨가하여 PCR을시행하였고, PCR 조건은다음과같다. 95 에서 10분간 denaturation을시킨다음 초간 denaturation, 60 에서 30초간 annealing, 72 에서 30초간 extension을 40회반복한후최종적으로 72 에서 5 분간 post-extension을시행하였다. hnrnp B1 mrna를위한 primer sequence는 5 -CGCGATGGAGAAAACTTTAG- 3 ( 정방향시발체 ), 5 -TTTCCAGATTCCTCTCTTGCTA-3 ( 역방향시발체 ) 이고, housekeeping 유전자로는 human betaactin (ACTB) 유전자를이용하였고, 시발체는 5 -AGGCCTC- GCCTTTGCCGA-3 ( 정방향시발체 ), 5 -CTGGTGCCTGGG- GCG-3 ( 역방향시발체 ) 였다. 증폭된산물은 2% agarose gel 에전기영동하여결과를분석하였다 (Fig. 1A).

Plasma hnrnp B1 mrna in NSCLC 251 M 1 2 3 4 5 M Plasma hnrnp B1 mrna 4,830 4,430 4,030 Rn vs cycle Rn 3,630 3,230 hnrnp B1 (315 bp) 2,830 2,430 A 2,030 1 5 10 15 20 25 30 35 40 Cycle number B Fig. 1. (A) Amplified bands (315 bp) were identified on agarose gel electrophoresis after plasma hnrnp B1 mrna RT-PCR.

3 Plasma hnrnp B1 mrna in NSCLC 251 M M Plasma hnrnp B1 mrna 4,830 4,430 4,030 Rn vs cycle Rn 3,630 3,230 hnrnp B1 (315 bp) 2,830 2,430 A 2, Cycle number B Fig. 1. (A) Amplified bands (315 bp) were identified on agarose gel electrophoresis after plasma hnrnp B1 mrna RT-PCR. M, 100 bp ladder; 1-2 lane, normal; 3-5 lane, lung cancer. (B) hnrnp B1 mrna in the plasma of lung cancer patients was measured by real-time RT-PCR. 4. Real-time PCR 을이용한혈장 hnrnp B1 mrna 검출 는 10-5 배까지검출이가능하였다. hnrnp B1 (TaqMan Gene Expression Assay ID Hs _m1, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) mrna를특이적으로검출하도록디자인된시발체와탐색자 (probe) 는 Applied Biosystems사로부터구입하였다. ABI Prism 7,500 system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 장비를이용하여 PCR 동안실시간형광신호모니터링하였다. Real-time PCR 반응액 25 μl 에는 3 μl cdna, 12.5 μl 의 TaqMan 2X Universal PCR Master Mix, 1.25 μl 의각유전자의 cdna에특이적인시발체, 8.25 μl 의증류수로구성하였다. ABI Prism 7,500 system을사용하여 hnrnp B1 cdna를각각증폭하였고, PCR 조건은다음을따랐다. 95 에서 10분간 denaturation를시행한다음, 95 에서 15초간 denaturation, 60 에서 1분간 annealing과 extension을 40 회반복하였다. 각검체마다상대정량을위해서 housekeeping 유전자인 ACTB 유전자 cdna를마찬가지로증폭하였다. ACTB 유전자의정방향시발체는 5 -CCCCGCGAGCACAGA-3, 역방향시발체는 5 -CCACGATGGAGGGGAAGAC-3, 탐색자는 5 - FAM-CTTTGCCGATCCGC-MGB-3 였다. Real-time PCR 반응조건은위와동일하였다. 결과는 Sequence Detector Software version 2.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 소프트웨어를이용하여분석하였고, hnrnp B1 mrna의상대적인정량은 2 -ΔΔCt 방법을이용하여상대적으로정량하였다 [11]. 검출민감도를확인하기위해한국세포주은행에서폐암세포주를분양받았다 (KCLB No.71588) 개 /ml의폐암세포주에서 cdna를만들어 10배씩 5로그계대희석하였다 (10-5 배 ). 이를측정한결과, real-time PCR 검사법으로 hnrnp B1 mrna 5. Beta-actin (ACTB) mrna를이용한 hnrnp B1 mrna 의 normalization과 2 -ΔΔCt 상대정량 Housekeeping gene인 ACTB mrna를이용하여비소세포폐암환자및대조군의혈장에서 hnrnp B1 mrna를상대적으로정량하였다. 상대정량공식은 Livak KJ가제시한 2 -ΔΔCt 방법으로다음과같다 [11]. 비소세포폐암환자에서 hnrnp B1 mrna의 Ct값을 ACTB mrna Ct값으로 normalization (Ct lung cancer - Ct ACTB ) 하고이를ΔCt (hnrnp B1-ACTB) 라고하였다. 정상대조군 10명의 hnrnp B1 mrna의 Ct 값과 ACTB mrna Ct값의평균을구하여 Ct calibrator (mean hnrnp B1-mean ACTB) 를계산하였다. 이 ΔCt calibrator 로폐암환자의 ΔCt를다시 normalization하게되는데, 이를 ΔΔCt (ΔCt-ΔCt calibrator ) 라고하였다. 결핵환자를포함한양성폐질환자에서도마찬가지로 ΔΔCt를구하였다. 이 ΔΔCt를 2 -ΔΔCt 로최종적인상대적인정량값으로표현하여폐암환자군과양성폐질환군에서 hnrnp B1 mrna의혈장내발현정도를비교하였다. 본검사의 intra-cv 평가를위해 5일간하루에 1회씩, 매실시마다두번반복측정하여하였고, intra CV는 6.1% 이었다. 6. Real-time PCR을이용한폐암조직에서 hnrnp B1 mrna 검출 24명의폐암환자의폐암조직을대상으로혈장에서 hnrnp B1의검출률을검증하고자하였다. 폐암조직에서상품화된시약 (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 을이용하여제조

4 252 김정만 황상현 송은주외 6 인 사의지시대로 RNA를추출하였다. Real-time PCR의시발체, 탐색자와 PCR 조건은위에기술한바와같다. 7. 통계분석 비소세포폐암환자군와양성폐질환자군의혈장 hnrnp B1 mrna 발현의차이는 Mann-Whitney U로비교검정하였고, P<0.05를통계적으로유의한차이가있는것으로정의하였다. 통계처리는 SPSS version 14.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) 소프트웨어를이용하였다. 결 비소세포폐암환자는남자 23명 (65±8 세 ), 여자 7명 (54±8 세 ) 이었고, 양성폐질환군남자 21명 (44±18세), 여자9명 (41± 19세 ), 정상대조군은남자 6명 (29±1 세 ), 여자 4명 (29±1 세 ) 이 Table 1. Clinical characteristics of lung cancer group, benign lung diseases group and normal control group *Paragonimus westermani lung infection (1), non-tuberculosis mycobacteria (1), Bacterial pneumonia (1). 과 Lung Benign lung Normal cancer disease control group (n) group (n) group (n) Age Male 65±8 (23) 44±18 (21) 29±1 (6) (mean± Female 54±8 (7) 41±19 (9) 29±1 (4) 2SD) Pathology Adenocar- Active tubercinoma (12) culosis (20) Squamous cell Inactive tubercarcinoma (15) culosis (3) Adenosquamous Bronchieccell carcinoma (3) tasis (4) Others* (3) Stage Stage I (10) Stage II (5) Stage III (11) Stage IV (2) Unclassified (2) 었다. 연구대상환자들의임상적소견 Table 1과같다. 정성 RT-PCR을이용한혈장 hnrnp B1 mrna 측정결과, 비소세포폐암환자군및양성폐질환군의혈장에서 hnrnp B1 mrna가검출됨을확인하였다 (Fig. 1A). Real-time PCR을이용한혈장 hnrnp B1 mrna 측정결과, 비소세포폐암환자 93.3% (28/30) 에서혈장 hnrnp B1 m- RNA 가검출되었다 (Fig. 1B). 비소세포폐암환자들의 hnrnp B1 mrna의평균 ΔCt (hnrnp B1-ACTB) 는 -0.9±1.76이었고, 폐결핵을포함한양성폐질환자 30명중 28명에서혈장 hnrnp B1 mrna가측정되었으며, 평균 ΔCt (hnrnp B1- ACTB) 는 3.64±2.36이었다. 정상인의 hnrnp B1 mrna Ct calibrator (mean hnrnp B1-mean ACTB) 로보정한상대발현값인 2 -ΔΔCt 도양성폐질환자군에서 2.7 (95% 신뢰구간 ; ), 비소세포폐암환자군에서 62.2 (95% 신뢰구간 ; ) 로통계적으로유의하게높게발현되었다 (P<0.001, Mann-Whitney U test, Table 2, Fig. 2). 또한 24명의폐암환자조직에서 hnrnp B1 mrna가모두검출되었다. Fold change in gene expression Lung cancer group Fig. 2. Normalized plasma hnrnp B1 mrna in the patient group amount relative to that in normal control group. Fold change was expressed as 2 - Ct ( Ct [hnrnp B1-ACTB] of each case-average Ct [average hnrnp B1 Ct-average ACTB Ct] of normal control group). * * * Benign disease group Table 2. Relative quantitation using the comparative Ct method [11] Sample hnrnp B1 mrna ACTB mrna Ct Ct hnrnp B1 ratio average C t average Ct (hnrnp B1-ACTB*) ( Ct- Ct calibrator ) relative to normal Normal 29.39± ± ± ± ( ) Lung cancer 33.80± ± ± ± ( ) Benign lung disease 30.21± ± ± ± ( ) * Ct is determined by subtracting the average ACTB Ct from the average hnrnp B1 Ct; The calculation of Ct involves subtraction by the Ctcalibrator value; The range given for hnrnp B1 relative to normal was determined by 2 - Ct. with Ct+s and Ct-s, where s=the standard deviation of the Ct.

5 Plasma hnrnp B1 mrna in NSCLC 253 고찰본연구에서비소세포폐암환자혈장에서 hnrnp B1 mrna 가측정이되는것을확인하였고, 양성폐질환자에비해상대적으로매우높은양이검출되었음을확인하였다. 1970년대처음으로암환자의혈청에서 DNA를분리한이후 [12], 현재혈장내핵산의검출을이용하여암을조기선별하거나, 예후및치료반응표지자로이용하려는연구가활발하다. 폐암환자의혈액내에서 total circulating DNA [13], KRAS 돌연변이 [14], 그리고 p53 돌연변이 [15], 유전자 promoter 부위의메틸화 [16], microsatellite 변이 [17, 18] 등을측정하여폐암환자를진단또는예후를평가하려는연구들이진행되었다. 이러한 cell-free 유전자변이는대조군에서 9.9%, 폐암환자군에서는약 43% (0-78%) 정도로관찰되는것으로알려져있다 [19]. 하지만, 정량적연구 [13, 20] 와정성적연구 [16, 21] 에서폐암표지자로서유용성을확인하고자하였으나, 민감도와특이도가낮아현재의기술로폐암표지자로이용하기에는부적절한것으로판단된다 [22]. mrna 또한암에따라특정 mrna 발현이증가되기때문에암에서유래하는 mrna를혈장에서검출하여암선별또는모니터링에이용할수있다 [4]. hnrnp B1 mrna는정상세포에서는잘검출되지않고, 폐암에서과발현되는것으로알려져있어 [23, 24], 폐암을진단하거나예후를예측하는데유용할것으로판단된다. 2001년처음으로폐암환자의혈장에서 hnrnp B1 mrna가검출되는것이보고되었고 [6], 이후 2005년 Sueoka 등의연구에서 44명의폐암환자의혈장 hnrnp B1 mrna 의평균농도가 0.99±0.26 pg/μg plasma RNA로정상대조군 (0.23±0.07 pg/μg plasma RNA) 또는양성폐질환자 (0.30 ±0.11 pg/μg plasma RNA) 에비해유의하게높음을확인하였다 [7]. 하지만폐암환자에서혈장 hnrnp B1 mrna에관한연구들이모두측정단위가달라서로비교하기어려운점이있다 [8, 23]. 특히본연구와같이 hnrnp B1 mrna를 2 -ΔΔCt 법을이용하여정량한연구가아직없는실정으로상대정량법에대한추가연구가필요하다. 비소세포폐암환자에서병리소견간, 병기간 hnrnp B1 mrna 발현차이는통계적으로유의하지않았는데 Sueoka 등의연구에서도병기에따른양성률의차이가없었다 [7]. 아직이부분에대해충분한연구들이진행되지않았고, 본연구의대상수가비교적적어제한점이있지만, 조기폐암에서도 hnrnp B1 mrna 가과발현됨을의미하며, 폐암의조기선별표지자로서가능성을시사하는것으로판단된다. 본연구에서양성질환대조군으 로결핵환자를포함하였는데, 활동성결핵과비활동성결핵간혈장 hnrnp mrna의발현차이는통계적으로유의하지않았다. 양성폐질환대조군에서도 hnrnp mrna가검출되었지만폐암환자에비해매우낮은농도였음을알수있었다. 정량법으로이용한 2 -ΔΔCt 법은표준농도곡선을만들필요가없어측정이용이하고비용과노력이절감된다. 또한, 발현정도를 housekeeping 유전자로보정함으로써상대적인발현차이를쉽게비교할수있다. 하지만, 매번검사마다정상대조군과같은 calibrator가필요하고, 진단을위한 cut-off을정하기가어렵다. 향후상대정량이아니라, 절대정량법이확립된다면, 폐결핵등의기저질환이있는환자에서폐암진단또는영상의학적소견상폐암과양성폐질환의감별이어려운경우에혈장 hnrnp mrna 정량이도움이될것으로판단된다. 하지만, 표준화가되어야검사실간비교가가능할것이다. 2 -ΔΔCt 법은 housekeeping 유전자와표적유전자간의증폭효율이동등할경우에만적용이가능하다. 본연구에서도검사전 hnrnp B1와 ACTB 간증폭의효율이통계적으로차이가없음을확인하였다 (data not shown). 증폭효율에영향을미치는요인으로는증폭대상유전자의 %GC content, Tm, 이차구조, 증폭산물의크기등이것으로알려져있다 [25]. 또한, 혈장 mrna 측정시세포오염을완전히배제하기어렵기때문에반드시 housekeeping 유전자발현양으로표준화시키는것이필요하다. 본연구에서도이같은문제점을해결하기위해, 매측정시 housekeeping 유전자인 ACTB 유전자발현양을보정하였다. 한편, hnrnp B1 mrna는폐암뿐만아니라, 구강암, 식도암, 악성림프종등에서도발현이증가되는것으로알려져있어, 폐암외의다른암의진단또는예후표지자로이용할수있을것이다 [26]. 결론적으로, 본연구에서비소세포폐암환자의혈장에서 cellfree mrna를검출하는것이가능하였고, 이러한혈장내 hn- RNP B1 mrna는정상대조군또는양성폐질환군에비해비소세포폐암환자에서유의하게증가되어있었다. 폐결핵과도뚜렷한차이가있어감별이어려운상황에서유용할것으로판단되었다. 하지만, 혈장 hnrnp B1 mrna의진단정확도에대한검증이필요하며, 본연구는혈장 hnrnp B1 mrna가폐암진단또는치료반응, 예후등에암표지자로서의가능성에대한검증을위한기초자료가될것으로판단된다. 요약배경 : 혈장에서검출되는핵산 (cell-free nucleic acids) 이최근암의진단에있어비침습적표지자로유용한것으로알려

6 254 김정만 황상현 송은주외 6 인 져있다. Nuclear core complex의하나인, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnrnp) B1은폐암초기에과발현되는것으로알려져있다. 본연구에서는한국에서유병률이높고, 종종폐암과구별이어려운폐결핵을포함한양성폐질환으로부터비소세포폐암환자를확인하는데혈장 hnrnp B1 mrna가유용한지알아보고자하였다방법 : 비소세포폐암환자 30명, 폐결핵을포함한양성폐질환자 30명, 정상인 10명을대상으로혈장에서 RNA를추출하였다. 혈장 hnrnp B1 mrna를측정하기위해 predesigned, validated TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems, USA) 를이용하였고, 상대적인정량을위해 pre-developed beta-actin (ACTB) mrna을사용하였다. Delta-delta Ct 방법을이용하여상대적으로정량하였다. 결과 : 비소세포폐암환자 93.3% (28/30) 에서혈장 hnrnp B1 mrna가측정되었다. 정상인의 hnrnp B1 mrna로보정한상대발현값인2 -ΔΔCt 는비소세포폐암환자군에서 62.2 (95% 신뢰구간 ; ), 양성폐질환자군에서 2.7 (95% 신뢰구간 ; ) 로통계적으로유의하게높게발현되었다 (P<0.001, Mann-Whitney U test). 결론 : 혈장 hnrnp B1 mrna는정상대조군또는양성폐질환군에비해비소세포폐암환자에서유의하게증가되어있었다. 따라서, 혈장 hnrnp B1 mrna는암표지자로서비소세포성폐암의검출에유용할수있을것으로판단된다. 참고문헌 1. Jemal A, Siegel R, Ward E, Murray T, Xu J, Thun MJ. Cancer statistics, CA Cancer J Clin 2007;57: National Cancer Information Center. Cancer incidence. cancer.go.kr/cms/statics/incidence/index.html. (Updated on Jun 2008). 3. Melamed MR. Lung cancer screening results in the National Cancer Institute New York study. Cancer 2000;89: Kopreski MS, Benko FA, Kwak LW, Gocke CD. Detection of tumor messenger RNA in the serum of patients with malignant melanoma. Clin Cancer Res 1999;5: Zhou J, Mulshine JL, Unsworth EJ, Scott FM, Avis IM, Vos MD, et al. Purification and characterization of a protein that permits early detection of lung cancer. Identification of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein-a2/b1 as the antigen for monoclonal antibody 703D4. J Biol Chem 1996;271: Fleischhacker M, Beinert T, Ermitsch M, Seferi D, Possinger K, Engelmann C, et al. Detection of amplifiable messenger RNA in the serum of patients with lung cancer. Ann N Y Acad Sci 2001;945: Sueoka E, Sueoka N, Iwanaga K, Sato A, Suga K, Hayashi S, et al. Detection of plasma hnrnp B1 mrna, a new cancer biomarker, in lung cancer patients by quantitative real-time polymerase chain reaction. Lung Cancer 2005;48: Zech VF, Dlaska M, Tzankov A, Hilbe W. Prognostic and diagnostic relevance of hnrnp A2/B1, hnrnp B1 and S100 A2 in non-small cell lung cancer. Cancer Detect Prev 2006;30: Sato A, Sueoka-Aragane N, Saitoh J, Komiya K, Hisatomi T, Tomimasu R, et al. Establishment of a new method, transcription-reverse transcription concerted reaction, for detection of plasma hnrnp B1 mrna, a biomarker of lung cancer. J Cancer Res Clin Oncol 2008; 134: Mayeda A, Munroe SH, Caceres JF, Krainer AR. Function of conserved domains of hnrnp A1 and other hnrnp A/B proteins. EMBO J 1994;13: Livak KJ. Comparative Ct Method. ABI PRISM 7700 Sequence Detection System. User Bulletin No. 2. Relative Quantitation of Gene Expression. PE Applied Biosystems, Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, Yaros MJ. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res 1977;37: Sozzi G, Conte D, Mariani L, Lo Vullo S, Roz L, Lombardo C, et al. Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients. Cancer Res 2001;61: Mulcahy HE, Lyautey J, Lederrey C, qi Chen X, Anker P, Alstead EM, et al. A prospective study of K-ras mutations in the plasma of pancreatic cancer patients. Clin Cancer Res 1998;4: Andriani F, Conte D, Mastrangelo T, Leon M, Ratcliffe C, Roz L, et al. Detecting lung cancer in plasma with the use of multiple genetic markers. Int J Cancer 2004;108: Esteller M, Sanchez-Cespedes M, Rosell R, Sidransky D, Baylin SB, Herman JG. Detection of aberrant promoter hypermethylation of tumor suppressor genes in serum DNA from non-small cell lung cancer patients. Cancer Res 1999;59: Chen XQ, Stroun M, Magnenat JL, Nicod LP, Kurt AM, Lyautey J, et al. Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung cancer patients. Nat Med 1996;2: Beau-Faller M, Gaub MP, Schneider A, Ducrocq X, Massard G, Gasser B, et al. Plasma DNA microsatellite panel as sensitive and tumor-

7 Plasma hnrnp B1 mrna in NSCLC 255 specific marker in lung cancer patients. Int J Cancer 2003;105: Bremnes RM, Sirera R, Camps C. Circulating tumour-derived DNA and RNA markers in blood: a tool for early detection, diagnostics, and follow-up? Lung Cancer 2005;49: Sozzi G, Conte D, Leon M, Cirincione R, Roz L, Ratcliffe C, et al. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol 2003;21: Bruhn N, Beinert T, Oehm C, Jandrig B, Petersen I, Chen XQ, et al. Detection of microsatellite alterations in the DNA isolated from tumor cells and from plasma DNA of patients with lung cancer. Ann NY Acad Sci 2000;906: Soria JC, Rodriguez M, Liu DD, Lee JJ, Hong WK, Mao L. Aberrant promoter methylation of multiple genes in bronchial brush samples from former cigarette smokers. Cancer Res 2002;62: Sueoka E, Sueoka N, Goto Y, Matsuyama S, Nishimura H, Sato M, et al. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein B1 as early cancer biomarker for occult cancer of human lungs and bronchial dysplasia. Cancer Res 2001;61: Wu S, Sato M, Endo C, Sakurada A, Dong B, Aikawa H, et al. hnrnp B1 protein may be a possible prognostic factor in squamous cell carcinoma of the lung. Lung Cancer 2003;41: Livak KJ and Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C[T]) Method. Methods 2001;25: Matsuyama S, Goto Y, Sueoka N, Ohkura Y, Tanaka Y, Nakachi K, et al. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein B1 expressed in esophageal squamous cell carcinomas as a new biomarker for diagnosis. Jpn J Cancer Res 2000;91:

Can032.hwp

Can032.hwp Chromosomal Alterations in Hepatocellular Carcinoma Cell Lines Detected by Comparative Genomic Hybridization Sang Jin Park 1, Mahn Joon Ha, Ph.D. 1, Hugh Chul Kim, M.D. 2 and Hyon Ju Kim, M.D. 1 1 Laboratory