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승형 금
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1 Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society Vol. 13, No. 12 pp , 장만 1, 이건섭 1, 모상현 2, 신경순 1, 오정균 3, 이택견 1* 1 한국해양과학기술원, 2 바이오에프디엔씨항노화연구소, 3 목포대학교생명과학과 Production of antibodies for saxitoxin analysis and sensitivity analysis of anti-saxitoxin antiserum Man Chang 1, Gunsup Lee 1, Sang Hyun Moh 2 Kyoungsoon Shin 1, Chung-Kyoon Auh 3 and Taek-Kyun Lee 1* 1 Korea Institute Ocean Science & Technology 2 Department of Biological Science, Mokpo National University 3 Anti-aging Research Institute of BIO-FD&C Co.,Ltd. 요약해양미세조류유래독성물질에대한이해와활용에있어서가장중요하지만간과되고있는부분은독성물질을검출할수있는빠르고, 쉽고경제적인검출기술을개발하는것이다. 이논문에서우리는삭시톡신 (STX) 에대한항체를생산하였다. 헤모시아닌 (mariculture keyhole limpet hemocyanin, mcklh) 과오브알부민 (ovalbumin, OVA) 을운반단백질로사용하였다. 면역반응을위해서 mcklh-stx 결합체를 BALB/c 쥐에복강주사하였다. 채혈후항-STX 항혈청을분리하였다. 항혈청의역가분석을위하여유리 STX와 OVA-STX로코팅된 microtiter plate를이용하여간접 ELISA 실시하였다. 발색반응을위한이차항체로는 goat anti-mouse IgG-phosphatase conjugate가사용되었다. 항-STX 항혈청은 OVA-STX와유리 STX에특이적으로반응하였다. 항-STX 항혈청의민감도는매우높았으며, STX를위한검출한계는약 64.9 ng/kg이었다. Abstract The most essential but missing components to understand and use toxic substances from marine microalgae are developing the fast, easy and economical determining technology for detecting it. In this paper we produced the antibodies against saxitoxin (STX). Mariculture keyhole limpet hemocyanin (mcklh) and ovalbumin (OVA) were used as carrier proteins. mcklh-stx conjugates were injected into the peritonial cavity of BALB/c mouse for immunization. After bleeding from mouse, anti-stx antiserum was isolated. Indirect enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) was performed to determine antiserum titer using the microtiter plate coated with free STX and OVA-STX. A goat anti-mouse IgG-phosphatase conjugate was used as secondary antibody to enable chromogenic reaction. Reactions of anti-stx antiserum were very specific on the OVA-STX and free STX. Sensitivity of anti-stx antiserum on STX was very high and STX detection limit was to be 64.9 ng/kg for indirect ELISA. Key Words : Saxitoxin, Immunization, Antiserum, ELISA 1. 서론 우리나라남해안에서주로발생하는유해조류의이상 증식현상 ( 적조 ) 은대체로유독성편모조류에의한것으로, 우리나라총어업생산의 30 % 를차지하는양식산업에막대한피해를주고있는실정이다. 이에따라국내 본논문은한국해양과학기술원 (PE98785) 및국토해양부 (PM57270) 의연구과제로수행되었음. * Corresponding Author : Taek-Kyun Lee (Korea Institute Ocean Science & Technology) Tel: tklee@kiost.ac Received September 5, 2012 Revised November 28, 2012 Accepted December 6,

2 연구소뿐만아니라대학등에서도적조방제를위한다각적인노력을기울이고있다 [1,2]. 적조에의한피해중가장심각한것은일부유해적조생물들에의해합성되어분비되거나세포내함유되는독성물질로인한피해라할수있다. 유독식물플랑크톤에의해합성, 분비되는독성물질은크게 paralytic shellfish poison(psp), diarrhetic shellfish poison(dsp), amnestic shellfish poison (ASP) 등으로분류되는데, 최근에국내외적으로중요하게다루어지고있는독성물질로는 PSP 중삭시톡신 (saxitoxin, STX) 계열을들수있다 [3]. PSP는모화합물이 STX인여러독성물질 (Fig. 1) 에의해일어난다. STX는가장치명적인 (LD 50 9 μg/kg) 비단백질성독소중의하나이며 [4], 여러해양와편모조류나담수조류에의해생성되는마비성패독중의하나이다. PSP 독소검출시험법중 EU의기준시험법인 mouse bioassay(mba) 가전통적으로활용되어왔으며 [5], 여러가지알려진단점을보완하고자대체시험법으로 HPLC-FLD[6] 를이용하는방법이제시된바있다 [7]. [Fig. 1] Chemical structure of saxitoxin derivatives 그외에 receptor-based assays[8], cytotoxicity tests 또는 electrophysiological assays[9,10] 와같은생물학적방법과 HPLC[11], spectroscopy[12] 및 mass spectrometry[13] 와같은분석학적방법이 PSP 독소를검출하기위해개발되어왔다. 그러나알려진다양한방법중 ELISA를사용하는방법이상대적으로값싸고, 빠르고, 많은시료의처리에적합하며, 복잡하고비싼장비를요구하지않고자동화할수있는것으로받아들여지고있다 [14]. 이에따라많은실험실에서 ELISA를이용한 immunoassay 기법의개발을시도하였고 [15], 그결과최근에는 STX를위한 ELISA kit[16] 가시장에서판매되고있다. 그러나 STX의면역학및세포학적검출및확인을위한다양한연구를위해서는 STX 항체가실험실에서요구되는반면, 항체자체를상업적으로구입할수는없는실정이다. 이에따라우리는 PSP 독소중 STX에대한다양한면역학적및세포학적연구의기반을구축하고자 STX에특이한항체를생산하였다. 시험된여러가지시도중에우리는 keyhole limpet hemocyanin(klh) 에결합된 STX 를쥐에주사하여혈청으로부터항체를생산하고, 생산된항체는간접 enzyme-linked immunosorbent assays (Indirect-ELISA) 를개발하기위해사용되었다. 항체와 STX의반응에의해발색되는정도를측정함으로써독성물질을검출하도록하는항체생산과정및검출한계를분석하였다. 2. 재료및방법 2.1 삭시톡신-단백질접합체의제조 정제된 STX는 NRC-CNRC(Canada) 에서구입하였으며, 단백질과의접합 (conjugation) 은 Imject Immunogen EDC conjugation kit(pierce, IL, USA) 를사용하였다. 운반단백질 (carrier protein) 로사용될 mariculture keyhole limpet hemocyanin (mcklh) 및 ovalbumin(ova) 를 10 mg/ml의농도가되도록탈염수에녹였다. STX는 conjugation buffer(0.1 M MES, 0.9 M NaCl, 0.02% NaN 3, ph 4.7) 에 4 mg/ml의농도가되도록준비하였다. 접합을위하여 500 μl의 STX와 200 μl의운반단백질용액을섞은후, 50 μl의 1-ethyl-3-[3- dimethylamino-propyl] carbodiimide hydrochloride (EDC, 10 mg/ml) 용액을섞어서실온에서 2시간동안접합반응을수행하였다. 반응이끝난후에접합이되지않은 STX와운반단백질용액에남아있는 EDTA는탈염컬럼 (D-SaltTM desalting column) 을사용하여제거하였다. STX-운반단백질접합체는 SDS-PAGE를통하여확인하였다. 단백질복합체는 Bradford assay 용액을이용하여정량후, 적정량을분주하여 20 에보관하였다. 2.2 면역반응 (Immunization) 다클론항혈청의제조를위하여 BALB/c 쥐 (4 주령 ) 를면역반응 (immunization) 유도를위한시험동물로사용하였다. 첫번째면역반응에는 complete Freunds adjuvant를사용하였으며, 두번째면역반응부터는 incomplete Freunds adjuvant를사용하였다. 각면역반응에는쥐한마리당 50 g의 mcklh-stx 접합체가되도록멸균된 6209

한국산학기술학회논문지제 13 권제 12 호, 2012 phosphate buffered saline(pbs) 용액에희석하여사용하였으며, 복강주사하였다. 면역반응은 10 일에한번씩실시하였다. 총 4 회의면역반응후에항체 titer를측정하기위하여채혈을하였으며, 혈전을원심분리에의하여제거한후, 상층의혈청만을사용하였다. 2.3 ELISA 2.3.1 Free STX의고정화 (immnobilization) Free STX의고정화를위하여, 96-well microtiter plate 를 BSA(5 g/ml in 0.

3 한국산학기술학회논문지제 13 권제 12 호, 2012 phosphate buffered saline(pbs) 용액에희석하여사용하였으며, 복강주사하였다. 면역반응은 10 일에한번씩실시하였다. 총 4 회의면역반응후에항체 titer를측정하기위하여채혈을하였으며, 혈전을원심분리에의하여제거한후, 상층의혈청만을사용하였다. 2.3 ELISA Free STX의고정화 (immnobilization) Free STX의고정화를위하여, 96-well microtiter plate 를 BSA(5 g/ml in 0.2 M carbonate buffer, ph 9.4, with 0.15 M NaCl, 200 μl/well) 로코팅하였다. 실온에서 overnight으로반응시킨 plate는 PBST(PBS with 0.05%(v/v) Tween 20) 로 3 회세척후, 추가적으로 PBS 로 3 회세척하였다. Free STX는동일한완충용액에 25 M 용액으로만들어 100 μl 씩각 well에분주하여실온에서 overnight 반응하였다. 항혈청민감도의측정을위해서는 0-50 μm 범위에서 serial dilution을하여동일한방법으로 microtitier plate에분주하였다. 반응후남은 free STX는 PBST로 3 회세척하여제거하였으며, 2 %(w/v) BSA(in PBS) 를각 well에 200 μl 씩분주하여실온에서 3 시간동안반응시켜 blocking을하였다. Blocking 후에 microtiter plate는 PBST로 3 회세척하였다 OVA-STX conjugate 의고정화 OVA-STX의고정화는 coating buffer(0.2 M carbonate buffer, ph 9.4) 로 1 μg/ml이되도록희석한 OVA-STX 접합체를 96-well microtitier plate에 100 μl 씩분주하여 4 에서 overnight 반응시켜실시하였다. 반응후, blocking을위하여 PBST에 2%(w/v) 의 BSA 용액을만들었으며, 각 well에 100 μl 씩분주하여 37 에서 1 시간동안반응하였다. Blocking 후에 microtiter plate는 PBST 로 3 회세척하였다. 대하여두번반복하여실시하였으며, 항혈청을넣지않는 well을 (-) 대조구로사용하였다. 반응이끝난후, PBST 로 3회세척하였으며, 이차항체로는 goat anti-mouse IgG-phosphatase conjugate (Sigma) 를 0.2%(w/v) BSA/PBST로 1000배희석하여사용하였다. 각 well에 100 μl 씩분주한후, 37 에서 1 시간동안반응시켰으며, PBST로세척한후에 pnpp를사용하여발색반응을실시하였다. Microplate reader를이용하여 405 nm에서의흡광도를측정하였다. 2.4 Antiserum Sensitivity 측정순차적으로희석된 free STX를고정화시킨 microtitier plate에 anti-mcklh-stx antiserum을 0.2%(w/v) BSA/PBST로 5000 배희석하여 100 μl 씩분주하고동일한조건에서실험을진행하였다. STX의검출한도는 non-linear four-parameter logistic calibration plots법에의해계산되었다 [17]. 3. 결과및고찰 3.1 STX- 단백질접합체의확인 정제된 STX은 Imject Immunogen EDC conjugation kit(pierce) 를사용하여운반단백질에접합되었으며, STX- 운반단백질접합체는 Fig. 2과같이 SDS-PAGE를통하여접합여부를확인하였다. (-) 대조구로사용한 KLH와비교하여볼때 STX가운반단백질에접합된것을확인하였다 Indirect ELISA 항혈청역가분석을위해다음과같은방법으로실험을진행하였다. Free STX가코팅된 microtiter plate의경우는 BSA(0.5 g/well) 만코팅되어있는 well을, OVA-STX 가코팅된경우는 OVA(1 μg/well) 를코팅시킨 well을대조구로사용하였다. 일차항체결합을위하여 mcklh-stx로면역반응시킨 mouse에서채취한항혈청 (antiserum) 을 0.2%(w/v) BSA/PBST를이용하여 1/1000 부터 1/64000까지 1/2씩 serial dilution하여 100 μl씩분주한후, 37 에서 1 시간동안반응시켰다. 각항원에 [Fig. 2] Detection of STX-protein conjugate by SDS-PAGE. 1, low M.W. marker; 2, OVA; 3, OVA-STX; 4, KLH; 5, KLH-STX. 3.2 OVA-STX 에대한항 -STX 항혈청의 titration mcklh-stx 로면역반응시킨쥐로부터획득한항혈 6210

4 청의 titer를알아보기위하여, OVA-STX 및 OVA를코팅시킨 micrititer plate를이용하여 indirect ELISA를실시하였다. 항-STX 항혈청은 OVA-STX와특이적으로반응을하며, OVA에는반응하지않았다 (Fig. 3). 1/10000 희석조건에서도높은흡광도값 (OD 405 1) 을보이는것으로보아민감도가높은것으로나타났다. Absorbance at 405 nm 1.5 OVA-STX 1.2 OVA ,000 2,000 4,000 8,000 16,000 32,000 64,000 Dilution factor [Fig. 3] Titration curve of anti-stx antiserum using ELISA 3.3 Free STX 에대한항 -STX 항혈청의 titration 항-STX 항혈청에대한 free STX의반응을분석하기위하여, free-stx를도말한 micrititer plate를이용하여 indirect ELISA를실시하였다. Fig. 4에서와같이, free STX와특이적으로반응을하며, 이혈청은 STX가없는 PBS 용액에서는반응하지않았다. 특히 1/16000 희석조건에서도높은흡광도값 (OD 405 1) 을나타내었다. Absorbance at 405 nm ,000 2,000 4,000 8,000 16,000 32,000 64,000 D ilution factor Free-STX PBS [Fig. 4] Titration curve of anti-stx antiserum on free STX using ELISA 특히생산된항-STX 항혈청을현장적용하였을경우, 반응을보이는값인 OD 405=1 이상인값은이론적으로 11,530배희석하였을때얻을수있으며, 초기 free-stx 농도가 2.5 μm이었으므로 2.5 μm을 11,530으로희석한값즉 nm 즉 64.9 ng/kg의 STX까지효과적으로감 지할수있을것으로판단된다 (Table 1). [Table 1] Sensitivity of anti-stx antiserum Dilution Factors for anti-stx antiserum 1,000 5,000 10,000 11,530 OD 405 of Free-STX Concentrations of STX (nm) PSP 독소를검출하기위한시험법으로는 mouse bioassay(mba) 가알려져있으며, EU의기준시험법으로지정되어있다 [5]. 그러나 MBA의복강독성시험법의결과는구강독성시험법에비해정확한결과를얻기어려우며, MBA의민감도는상대적으로낮은것으로평가되고있다 [18]. 또한시험결과는시험동물종및상태, 추출및희석비율, 시료준비등시험조건에의해영향을많이받는것으로알려져있다 [19,20]. 이에따라 Association of Official Analytical Chemists(AOAC) 는 HPLC-FLD를이용하는방법을 STX를포함하는 PSP 독소의검출시험법으로제시하였고, EU에의해 MBA의대체시험법으로인증된바있다 [7]. 그러나 HPLC-FLD 방법은시간이많이들고, 비싸고, 숙련된인력이요구되는등아직도많은단점을가지고있다 [18]. 면역학적검출기법이 1980년대중반에개발되었고 [21,22], 식품및환경분석에널리활용되고있다. 일반적으로다클론항체는 STX-단백질결합체를토끼에주사하여얻었다 [22,24,25]. 그러나개발된 STX-항체는 neostx 또는 GTX1,4와교차반응을하는것으로나타나, 동일한항원을사용한단클론항체개발도수행된바있다 [26]. 그러나단클론항체의경우다클론항체보다민감도가떨어져실제바이오센서나키트로개발되지않고있다. 특히 ELISA 법은 MBA 법에비해민감도가높으며, 다른 PSP 독소에의한간섭이적은것으로알려져있기때문에, PSP 계열의독소를분석하는데있어서활용도가매우높을것으로판단된다. References [1] H. G. Kim, S. G. Lee and K. H. An. Recent red tides in Korean coastal waters. Nat Fish. Res. Develop. Ins. Korea, 280p [2] N. H. Jeoung, H. J. Son and S. Y. Jeong. The Algicidal Activity of Pseudoalteromonas sp. NH-12 against the 6211

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한국산학기술학회논문지제 13 권제 12 호, 2012 오정균 (Chung-Kyoon Auh) [ 정회원 ] 1983 년 8 월 : KAIST 생물공학 ( 이학석사 ) 1995 년 3 월 : UC Davis 식물학 ( 이학박사 ) 2000 년 9 월 ~ 2004 년 8 월 : 성균관대학교생명과학과연구교수 2005 년 ~ 현재 : 목포대학교생명과학과부교수

7 한국산학기술학회논문지제 13 권제 12 호, 2012 오정균 (Chung-Kyoon Auh) [ 정회원 ] 1983 년 8 월 : KAIST 생물공학 ( 이학석사 ) 1995 년 3 월 : UC Davis 식물학 ( 이학박사 ) 2000 년 9 월 ~ 2004 년 8 월 : 성균관대학교생명과학과연구교수 2005 년 ~ 현재 : 목포대학교생명과학과부교수 식물분자생물학, 식물환경생리학 이택견 (Taek-Kyun Lee) [ 정회원 ] 1991 년 2 월 : 성균관대학교생물학 ( 이학석사 ) 1998 년 2 월 : 성균관대학교식물분자생리학 ( 이학박사 ) 1998 년 9 월 ~ 2000 년 8 월 : 한국해양연구원연수연구원 2000 년 ~ 현재 : 해양과학기술원남해특성연구부책임연구원 환경분자생리학, 해양환경독성학 6214

환경중잔류의약물질대사체분석방법확립에 관한연구 (Ⅱ) - 테트라사이클린계항생제 - 환경건강연구부화학물질연구과,,,,,, Ⅱ 2010

11-1480523-000702-01 환경중잔류의약물질대사체분석방법확립에 관한연구 (Ⅱ) - 테트라사이클린계항생제 - 환경건강연구부화학물질연구과,,,,,, Ⅱ 2010 목차 ⅰ ⅱ ⅲ Abstract ⅳ Ⅰ Ⅱ i 목차 Ⅲ Ⅳ i 목차 ii 목차 iii Abstract α β α β iv Ⅰ. 서론 Ⅰ 1 Ⅱ. 연구내용및방법 Ⅱ. 2 Ⅱ. 연구내용및방법