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연두 진
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1 대한치주과학회지 : Vol. 37, No. 3, 2007 Protein transduction domain 을이용한 recombinant human bone morphogenetic protein-2 의골재생효과 정성원 1, 김남희 2, 육종인 2, 김창성 1, 김형준 3, 조규성 1* 1. 연세대학교치주과학교실, 치주조직재생연구소 2. 연세대학교구강병리학교실, 구강종양연구소 3. 연세대학교구강악안면외과학교실 I. 서론 Bone morphogenetic proteins(bmps) 는 transforming growth factor β(tgf-β) superfamily 에속하는복합기능의성장인자로서골과연골의형성과재생을유도하는강력한조절인자이다. BMPs 는피질골의탈회과정에서이소성연골형성과골형성을일으키는유도인자로발견되었다. Urist 는탈회된골편을쥐의피하조직에이식한경우이식편주위로이소성골형성이일어나는것을관찰하고골내에는골형성에기여하는특정단백질이있다고하였으며이를골형성단백질 (Bone Morphogenetic proteins ; BMPs) 이라고명명하였다 1). 1988년 Wozney 등이처음으로 cloning 에성공하면서부터본격적인연구가시작되었다 2). 그동안의많은연구를통하여 human recombinant Bone Morphogenetic proteins(rh-bmps) 는 TGF-β superfamily 로서, 이식되었을때신생골및신생연골이생성된다고알려져 있으며 2,3) 현재까지알려진 20 종류이상의 BMP 중 BMP -2, -4, -5, -6, -7 은쥐의이소성골형성실 험에서골유도성물질임이많은연구에서증명되었다 4,5). 그중에서, 포유류세포 (CHO cell) 로부터재조합 DNA 기술로얻어지는 rh-bmp -2, -7 는골유도능이가장우수하다고보고되어, 이를이용하여많은연구가이루어졌으며, 현재까지주로이들이생산되어연구재료로사용되고있다 년첫임상실험이진행되었고, 그안정성이입증되었다 년에는 rhbmp 를기반으로하는임상제품이출시가되었다. 이러한 rhbmp 제품은특정 carrier 를사용하여척추골융합에만사용이될수있도록 FDA 허가가나있다. 1) 하지만이방법은 (1) 낮은농도의배지에서 BMP 의분리농축을위한대규모의분리정제시설과장비가필요하고, (2) 분리정제된단백질은수용성이므로생체조직내에서혈액이나조직삼출물에의해쉽게확산되므로고등단계의종에서는효과적인골형성을위한 BMP의양은높아야한다 6,7). 물론, 이러한제품개발은환자로하여금자가골채취라는부담스러운수술을피하게할수는있지만아직까지경제적이득효과는크지않다. 또한재조합 BMP의 * 교신저자 : 조규성, 서울특별시서대문구신촌동 134 연세대학교치과대학치주과학교실, ( 전자우편 : kscho@yumc.yonsei.ac.kr) * 본연구는한국과학재단목적기초연구 (R ) 지원으로수행되었음 497

2 임상적적용시초기에체액이나혈액을통해쉽게확산되어국소적인조직재생효과가떨어진다는것인데, 이제까지이러한문제점을극복하기위해결손부에서 BMP 의송달, 유지, 점진적유리에적합한운반체에관한많은연구가있었고, 다양한생체재료가 BMP 의운반체로개발되고시험되어져왔다 7-12). 최근, 세포막투과가어려운단백질을효과적으로세포내부로전달할수있는단백질전달영역 (Protein transduction domain, PTD) 에대한연구가활발히이루어지고있다. 이러한펩타이드의세포막투과현상은빠른생체내반감기로인하여약물로사용하기어려웠던치료용단백질및거대분자인유전자들의이동을높여약물적인가치를높일수있음을보여준다. 특정아미노산배열로이루어진이러한펩타이드는자발적으로세포막을투과하여세포내로투과하여들어갈수있다는특성을가진다 13,14). PTD 는세포내로전달이어려웠던단백질, DNA, 펩타이드또는거대한화학물질등을효과적으로세포내로전달시키는기능을가진물질전달펩타이드이다 15,16). 이중대표적인펩타이드는 human immunodeficiency virus(hiv) 에서유래한 transactivator of transcription(tat) 와 Antennapedia (Antp) homeodomain 과 HSV VP22 전사인자등이있다 17,18). 특히 TAT PTD는단독으로또는다른단백질에붙어서도세포막을통과할수있으며, 10 에서 120kDa 에이르는단백질을수용체와상관없이세포내로운반할수있음이보고되었다 14,19). 초기에는 TAT 융합단백질이수용체와상관없이세포막투과를통해세포내로운반된다고보고되었으나, 최근에는 TAT융합단백질의세포내유입이 4 에서억제되는것으로알려짐에따라 endocytic pathway 를따르는것으로보고되었다 20,21). TAT융합단백질이 endocytic pathway 를거치면서야기되는문제는엔도솜에의해분해되어이입된단백질의활성이떨어지는것이다. 살아있는세포에서일어나는많은생물학적과정이다른기관의세포막과결합하는과정에서일어나기때문에, 엔도솜에의한분해는단 백질효능연구에주요고려사항이다. 이런문제를해결하고자 TAT 융합단백질의 PTD 에엔도솜을벗어나는기능이입증된 influenza virus hamagglutinin-2 의 NH-2 terminal 20 amino acid peptide(ha2) 펩타이드를삽입하여이용하려는노력이시도되고있다 22). HA2 는세포막의 sialic acid 를포함한수용기에결합하여엔도솜안으로들어오고, 엔도솜을조절함으로써단백질의기능을활성화시킨다. 실제로 TAT-P53 박테리아를이용한재조합단백질전달영역을생산해낼경우다량의생체단백질을쉽게얻을수있는장점이있어, PTD 를이용하여다양한단백질을세포내로전달하고이를이용하여새로운치료법개발이시도되고있고, 특히 HA2 와결합된 HIV-1 TAT융합단백질은기존의단백질치료연구에보다효과적으로적용될수있다. 본연구의목표는단백질전달영역을연결한재조합 BMP2(TATBMP-2) 와추가로 HA2 를결합시킨재조합 BMP2(TAT-HA2-BMP-2) 를박테리아를이용하여생산한단백질을사용하여백서의두개골결손부에이식한후, 신생골형성을조직학적으로평가해보는것이다. II. 실험재료및방법 1. 실험재료 1) 단백질전달영역함유재조합골형성단백질 (TATBMP-2) 의제작사람의 BMP-2 의 cdna 를 RT-PCR 을이용하여 cloning 후 bacterial expression vector 에클로닝하였고클로닝된 BMP-2 의 5 부위에 TAT 펩타이드 (YGRKKRRQRRR) 염기서열을삽입하였다. 염기서열맨앞에 X-press tag 를연결하였고분리정제를위해 6개의 histidine 과시작염기서열인 ATG 를삽입하여벡터를제작하였다. 제작된벡터를열충격을이용하여박테리아형질전환을일으켰다. 형질전환박테리아는대장균 BL21(E-Coli BL21; Invitron Inc) 을사용하였으며 37 에서 2시간배양 498

2) 단백질전달영역함유재조합골형성단백질 2형 (TAT-HA2-BMP-2) 의제작사람의 BMP-2 의 cdna 를 RT-PCR 을이용하여 cloning 후 bacterial expression vector 에클로닝하였고클로닝된 BMP-2 의 5 부위에 TAT 펩타이드 (YGRKKRRQRRR) 염기서열을삽입하였다.

3 하고 isopropylthio-galactoside 1mM 을첨가한후 18 시간추가배양하여골형성단백질발현을유도하였다. 원심분리를통하여배양액내의대장균을제거하였고, 8M 의요소용액을첨가하여 BMP 의 2차또는 3차구조를제거하였다. Ni-Ti bead 를이용하여얻어진단백질을결합하였고제조사의지시에따라이를세척한후 imidazole 용액을사용하여용출하여정제된단백질 (TATBMP-2) 을채취하였다. 2) 단백질전달영역함유재조합골형성단백질 2형 (TAT-HA2-BMP-2) 의제작사람의 BMP-2 의 cdna 를 RT-PCR 을이용하여 cloning 후 bacterial expression vector 에클로닝하였고클로닝된 BMP-2 의 5 부위에 TAT 펩타이드 (YGRKKRRQRRR) 염기서열을삽입하였다. 그후 primer를이용하여 Influenza virus haemagglutinin-2 의 NH2-terminal 20 amino acid peptide(ha2) (GLFGAIAGFIENGWEGMIDG) 를삽입시킨다. 그후 X-press tag, 6개의 histidine, 시작염기서열인 ATG 를삽입하여벡터를제작하였다. 형질전환및배양, 분리, 정제과정후단백질인 TAT- HA2-BMP-2 를채취하였다. 3) 실험동물본연구에서는체중 250~300g 의웅성백서 (Spraque Dawley rat) 32마리를사용하였고, 실험부위로는두개골을이용하였다. 실험동물은연세임상의학연구센터의동물실험지침에따랐다. 2. 실험방법 1) 실험군설정백서두개골결손부에아무처치도하지않은군을음성대조군으로설정하고 collagen sponge 만을이식한군을양성대조군으로, collagen sponge 에각각 TATBMP-2 solution 0.1mg/ml 과 TAT-HA2- BMP-2 solution 0.1mg/ml 를적셔이식한군을각각실험군으로설정한다. 각군은수술후 2주, 8주치유기간을두고희생시켜관찰하였으며, 각군별로 4마리씩배정하여모두 32 마리를사용하였다. 2) 백서두개골결손부형성및외과적처치 (Figure 1a, b) 각군의백서에 Ketamine hydrochloride ** 와 Xylazine 을 4:1 로혼합하고근육주사 (70mg/kg) Figure 1. Calvarial defect formation, a. 8mm circumferential defect on rat calvarium, b. collagen matrix as a carrier ** # ## Ketalar, Yuhan Co., Seoul, Korea Rompun, Bayer Korea, Seoul, Korea 2% lidocaine, 1:100,000 epinephrine, Kangmyung Pharm., Seoul, Korea 3i, Palm Beach Gardens, FL, USA Polyglactin 910, braided absorbable suture, Ethicon, Johnson & Johnson Int., Edinburgh, UK Olympus BX50, Olympus Optical Co., Tokyo, Japan 499

4 하여전신마취시켰다. 두부제모를시행하고 povidone iodine 으로소독한후고정하였다. 수술부위는 2% Lidocaine 으로침윤마취한후백서의전두골전방부에서후방부까지정중부를따라두피를절개하여두개골의상면을노출시켰다. 노출된두개골의상면에내경 8mm trephine bur # 를이용하여백서의경막 (duramater) 이드러날때까지지름 8mm 의원형결손을형성하였다 8,10,11,23,24). 실험군에는각각의실험재료를결손부에위치시켰고, 대조군은아무처치도하지않았다. 두피를덮고 4-0 coated Vicryl 로봉합하고, 1주후발사하였다. 술후 2주, 8주에각군의동물을희생하여두개골적출하였다. 3. 조직학적관찰 1) 조직학적관찰절제한조직을 10% 중성포르말린용액으로 24 시간고정한후 5% nitric acid 로 3~7 일간탈회하고통법에따라알코올로탈수한다음파라핀에포매한다. 7μm 두께로 80μm 간격으로두고연속적인관상면절단하여 4개의박편을제작하였으며, 각시편의중앙부위를절단하였다. Hematoxylin- Eosin (H-E) 염색을하여광학현미경 ## 으로관찰하였다. III. 결과 1. 임상적관찰치유양상은일반적으로특이점없이각군간유사하게진행되었다. 이식부위의노출이나염증소견, 그리고수술부위의다른합병증은나타나지않았다. 2. 조직학적관찰 1) 음성대조군 1 2주소견결손부는얇고성긴불규칙한섬유성결합조직으로채워져있으며, 출혈및육아조직이관찰된다. 신생골은주로결손부변연에국한되어형성되어있으며, 조골세포에의해둘러싸여있다. 기존의잔존골과신생골사이에반전양상 (reversal line) 이관찰된다. 신생골이형성된부위에는조골세포가밀집되어있는모습이관찰된다. 염증세포가관찰되는것으로, 연조직치유와신생골의형성이계속진행중임을알수있다. 결손부의중앙은형태를유지하지못하고상방조직에의해와해되어있는양상을나타내고있다 (Figure 2). Figure 2. Negative control 2weeks( 20, H-E) The defect was filled with loose and irregular connective tissues Arrow head = defect margin Figure 3. Negative control 8 weeks( 100, H-E) The defect was filled with dense and fibrillar connective tissues Arrow head = defect margin 500

Figure 4. Positive control(collagen only) 2 weeks( 20, H-E) Collagen membrane was remained. The new bone regeneration was observed at defect margin. Arrow head = defect margin Figure 5.

Arrow head = defect margin 2 8주소견신생골주위로비교적잘정돈된균일한밀도의결합조직이관찰되고있으나, 여전히결손부중앙에는성긴결합조직이관찰된다. 신생골말단에서는조골세포들이줄지어있으나골성조직은관찰되지않는다 (Figure 3). 2) 양성대조군 1 2주소견결손부위는 collagen 으로대부분채워져있으며, 미량의신생골이결손변연부및중앙부에서관찰된다.

5 Figure 4. Positive control(collagen only) 2 weeks( 20, H-E) Collagen membrane was remained. The new bone regeneration was observed at defect margin. Arrow head = defect margin Figure 5. Positive control(collagen only) 8 weeks( 100, H-E) Collagen membrane was fully absorbed. Defect was filled with the dense, and fibrillar connective tissues. Arrow head = defect margin 2 8주소견신생골주위로비교적잘정돈된균일한밀도의결합조직이관찰되고있으나, 여전히결손부중앙에는성긴결합조직이관찰된다. 신생골말단에서는조골세포들이줄지어있으나골성조직은관찰되지않는다 (Figure 3). 2) 양성대조군 1 2주소견결손부위는 collagen 으로대부분채워져있으며, 미량의신생골이결손변연부및중앙부에서관찰된다. collagen의흡수과정으로여겨지는다핵거대세포가관찰된다. 신생골의주변에서는조골세포들이관찰되며, 신생혈관화과정도관찰된다 (Figure 4). 2 8주소견결손부위로얇은결합조직이형성된것이관찰되고염증세포의침윤은없었다. collagen 은모두흡수되어관찰되지않는다. 밀집된결합조직이일정한방향성을갖고나열되어있다 (Figure 5). 3) 실험군실험동물간조직학적결과는다소상이한결과가나타났다. 신생골형성이없는경우이식되었던 carrier 가확인되었고 collagen 의흡수과정으로여겨지는거대다핵세포들이 collagen 주위로관찰되었다. 일반적으로 2주소견시결손부내에흡수되지않은 collagen 이관찰되었으며, 적혈구의침착및활발한혈관형성과정이관찰되었다. TATBMP-2 에비해 TAT-HA2-BMP-2 에서골결손부변연에서활발한골화과정이관찰되었다. 8주소견시 TATBMP -2 에서신생골형성은미미하였다. 결손부위로얇은결합조직이형성된것을관찰할수있었고염증세포의침윤은없었다. collagen 은모두흡수되어관찰되지않았다. TAT-HA2-BMP-2 군에서 4개체중 1개체에서골결손부를완전히신생골로채워진양상이관찰되었다. 나머지개체에서는 collagen 이완전히흡수되어, 일정한방향성을갖는결합조직으로결손부가대체되었다. (1) 0.10 mg/ml 농도 TATBMP-2 1 2주소견결손부내에아직흡수되지않은 collagen 이남아있었으며 collagen 의흡수과정이라할수있는다핵거대세포가주위로관찰된다. 신생골이형성된경우, collagen 내부및주위로신생골이관찰된다. 신생골주변으로골아세포가줄지어배열되어있다. 골결손부변연으로부터신생골이형성된것을볼수 501

Figure 6. 0.10mg/ml TATBMP-2 2weeks( 20, H-E) Figure 7. 0.10mg/ml TATBMP-2 2weeks( 100, H-E) Multinucleated giant cell was observed around collagen membrane.

N: new bone, h: host bone( 100, H-E) Figure 8. 0.10mg/ml TATBMP-2 8weeks( 20, H-E) Figure 9. 0.10mg/ml TATBMP-2 8weeks( 100, H-E) Most collagen membrane was absorbed.

Arrow head=defect margin( 20, H-E) There were dense, fibrous connective tissues.

신생골형성은 2주에비해증가된양상을띄고있으며, 계속해서골형성이진행중임을관찰할수있으나그양은미미하였다 (Figure 8, 9). (2) 0.

6 Figure mg/ml TATBMP-2 2weeks( 20, H-E) Figure mg/ml TATBMP-2 2weeks( 100, H-E) Multinucleated giant cell was observed around collagen membrane. Arrow head=defect margin( 20, H-E) New bone formation and reversal line were observed in defect margin. N: new bone, h: host bone( 100, H-E) Figure mg/ml TATBMP-2 8weeks( 20, H-E) Figure mg/ml TATBMP-2 8weeks( 100, H-E) Most collagen membrane was absorbed. New bone formation was more increased than 2 weeks group. Arrow head=defect margin( 20, H-E) There were dense, fibrous connective tissues. D: dense connective tissues( 100, H-E) 있다 (Figure 6, 7). 2 8주소견전체적으로얇은결합조직이형성된것을관찰할수있고염증세포의침윤은없었다. collagen 은모두흡수되어관찰되지않는다. 신생골형성은 2주에비해증가된양상을띄고있으며, 계속해서골형성이진행중임을관찰할수있으나그양은미미하였다 (Figure 8, 9). (2) 0.10mg/ml 농도 TAT-HA2-BMP-2 1 2주소견 (Figure 10, 11) 골결손부내에염증세포와흡수되지않은 collagen 이남아있으며, 결손부의중앙에는적혈구의침착및신생혈관화과정도관찰된다. 골결손부변연에서활발한골화과정이진행되고있음을볼수있다. 신생골주변을둘러싸고있는조골세포들이관찰된다. 2 8주소견 (Figure 12, 13) 골결손변연부는물론결손부중앙부위에서신생골의형성이관찰된다. 대부분의결손부가골로대체된것을볼수있다. 대부분의 collagen 은모두흡수되어관찰되지않는다. 대조군및 TATBMP-2 군에비해뚜렷이형성된신생골이관찰된다. 502

Figure 10. 0.10mg/ml TAT-HA2-BMP-2 2weeks( 20, H-E) Figure 11. 0.10mg/ml TAT-HA2-BMP-2 2weeks( 100, H-E) Active bone formation was observed at the defect margin.

W: woven bone, OC: osteoclast, OB: osteoblast( 100, H-E) Figure 12. 0.10mg/ml TAT-HA2-BMP-2 8weeks( 20, H-E) Figure 13. 0.10mg/ml TAT-HA2-BMP-2 8weeks( 100, H-E) Bone defect was almost filled with new bone.

고안 BMP 가소의탈회골에서분리정제된이후, 수많은 BMP 유전자군이 cloning 되면서, BMP단백질의생물-생화학적특성에대한연구가진행되어왔다.

그중 BMP-2, -4, -7 유전자는골형성능력이탁월하고임상적용가능성이높아수많은연구가진행되었다 26,27).

7 Figure mg/ml TAT-HA2-BMP-2 2weeks( 20, H-E) Figure mg/ml TAT-HA2-BMP-2 2weeks( 100, H-E) Active bone formation was observed at the defect margin. Arrow head=defect margin( 20, H-E) Woven bone and connective tissue which included osteoclast, osteoblasts and vessels were observed. W: woven bone, OC: osteoclast, OB: osteoblast( 100, H-E) Figure mg/ml TAT-HA2-BMP-2 8weeks( 20, H-E) Figure mg/ml TAT-HA2-BMP-2 8weeks( 100, H-E) Bone defect was almost filled with new bone. ( 20, H-E) Most collagen membranes were absorbed. New bone formation was to the center of defect. N: new bone, D: dense connective tissue( 100, H-E) IV. 고안 BMP 가소의탈회골에서분리정제된이후, 수많은 BMP 유전자군이 cloning 되면서, BMP단백질의생물-생화학적특성에대한연구가진행되어왔다. BMP-1 은골형성능력과는상관없는 matrix metalloproteinase 유전자로분류되고, 그외에는 BMP -2 에서 BMP-15 까지 cloning 되어있다 25). 그중 BMP-2, -4, -7 유전자는골형성능력이탁월하고임상적용가능성이높아수많은연구가진행되었다 26,27). 일반적으로고농도로농축한 BMP 는수용성형태의단백질로서혈액이나체액으로빠르게확산 되어국소적효과가떨어지는문제점이있으며, 따라서이단백질을어떻게운반하고점진적으로유리되도록하느냐가중요하였고이제까지이에관한여러운반매체나이식재에대한연구가주를이루어왔다. 또한성장인자, 즉단백질자체를적용할때발생하는문제점과운반매체 (delivery vehicle) 의용해성등의문제를해결하기위해최근에는바이러스등을이용하여유전자를전달하는방법, 즉 DNA 전달체계 (DNA delivery system) 가그대안으로연구된바있다 28,29). BMP-2 유전자를결합시킨 adenoviral vector 를제조하여토끼의대퇴부골결손부위에직접주사하는방법으로골형성효과가연구 503

8 되었다 30). 하지만, 이러한유전자전달법은정상세포의유전자변형가능성과유전자발현을조절할수없다는결정적인문제로인해임상적용가능성은매우낮은상황이다. 따라서 BMP 와같이유용한분비단백질을충분한임상적인안정성과유효성을확보하면서쉽고대량으로생산할수있는방법으로 PTD 를이용한단백질전달법이고안되었다 년 Frankel 등은 PTD 라고불리는작은아미노산구조가단백질과같은거대분자를세포내로자발적으로침투또는전달할수있음을밝혔다 13). 본연구는웅성백서의두개골결손부에단백질전달영역함유재조합골형성단백질 (TATBMP-2) 과이에 HA2를적용시켜변형한 TAT-HA2-BMP -2 를적용하여골재생효과를평가하는것을목적으로시행하였다. 백서두개골에 trephine bur 를이용하여직경 8mm 의원형결손부를형성하고음성대조군에는아무것도이식하지않고, 양성대조군에는 collagen 만을, 실험군에는농도 0.10mg/ml 인 TATBMP -2 와 TAT-HA2-BMP-2 를 collagen 을 carrier 로적용시킨후결손부에이식하였다. 술후 2주, 8주에희생하고치유결과를조직학적으로비교관찰평가하였다. 이번연구에서는백서의두개골결손부모델을사용하였는데, 이는다른동물실험모델과비교하여접근성, 재현성이좋고간편하므로골재생물질을연구하는데효과적이며편리한모델로알려져있다. 미성숙한개체는성숙한개체에비해치유능력이우수하므로 250~300g 의성체를사용하였으며, 암컷의경우호르몬의변화나임신등에의해결과에영향을끼칠수있어수컷만을사용하였다 10-12, 24). 이모델에서사용한 8mm 의원형결손은쥐의임계크기결손 (critical size defect) 으로, 이는아무런처치를하지않으면 10% 이하의골재생을이루는가장작은크기의결손을일컫는다 24,31). 일반적으로 rhbmp-2 는 0.05mg/ml 이상의농도일때 rat calvarial defect 에서우수한골형성효과를나타낸다고보고된다 11). 효과적인적정 rhbmp-2 처치농도에대하여는아직연구중이지만골형성능 은일정농도즉, 역치농도이상의 rhbmp-2 농도에비례한다고보고된다. 물론세포의활성도는역치농도이상에서도계속적으로높아지지만동물실험에서는이러한역치농도이상의농도에서는농도간의비례적관계는볼수없다. 역치농도이상에서는 rhbmp-2 의농도의존성이떨어진다는것이다. 또한우수한골형성을얻기위해서는적절농도의 BMP 가이식부위로전달될수있어야한다. rh-bmps 는수용성물질이므로적용부위에적절히전달되지않으면그효과가감소되며 8), rh-bmps 의효과를극대화하기위해서는적절한양과농도, 적용시간등이중요하다고하였다 32). 그러므로, rh-bmps 를효과적으로전달하며전달되는동안유지될수있는적절한전달체의사용은필수적이라고할수있다 8,10,33). 앞서기술한바와같이이상적인전달체를찾기위한다양한노력들 1,9-12) 이계속되고있으나, 현재까지이에대해명확히규명된바는없다. 적절한전달체를사용한다하더라도상당량의 BMP 가있어야하고또한고등동물일수록우수한골형성을기대하기위해서는보다높은농도의 BMP 가필요하다고알려져있다. 최근, 세포막투과가어려운단백질을효과적으로세포내부로전달할수있는단백질전달영역에대한연구가활발히이루어지고있다. 특정아미노산배열로이루어진이러한펩타이드는자발적으로세포막을투과하여세포내로투과하여들어갈수있다는특성을가진다 13). 이중대표적인펩타이드는 HIV 에서유래한 transactivator of transcription로서단독으로도세포내투과가가능하지만다른단백질특히거대분자의단백질을융합한상태에서도세포막을통과할수있다고보고된다 19,34). 이외에도 VP-22, ANTP, 그리고 Kaposi FGF 또는 arginine/lysine-rich peptide 의작은단백질부분이세포내로침투할수있고또한단백질을세포질과핵으로전달할수있다고보고되어지나정확한기전에대하여는아직연구중으로보고된다. 이러한전달및침투과정은세포종류와는큰상관이있다. 이러한한침투과정은 4 에서잘이루어지는것으로보 504

9 아온도차이에따른에너지의존적인과정이라볼수있으나정확한기전은상반된논란의여지가남아있다. 세포내로전달된 TATBMP-2 는 heat shock protein에의하여재구조화과정을거친후활성화된형태의 BMP 를분비하기위하여 furin cleavage 된다는것을유추할수있었다. 이는 TATBMP-2 단백질을 in vitro 에서반응시켰을때약 43-kd 의 N-terminal fragment 가관찰되었기때문이다. 활성화된분비 BMP-2 단백질은하나의 disulfide 결합에의해두개의동일한펩타이드가연결된 dimer 로구성된다. 이때, 각각의펩타이드는 114 개의아미노산으로구성되며내부에존재하는 7개의시스테인단발기중하나가다른펩타이드의동일부위와 disulfide 결합을하고있고나머지 6개시스테인은동일아미노산에서 3개의 disulfide 결합을하고있는독특한 3차원구조를가지게된다 35,36). 연구결과에서보여졌듯이 TATBMP-2 및이를개선한 TAT-HA2-BMP-2 의골재생효과에는다소개체간차이점이나타났다. 일반적으로 2주간의치유기간을둔 TATBMP-2 를적용한개체에서는골재생의효과는미미했고, TAT-HA2-BMP-2 를적용한개체에서는활발한변연골재생을확인할수있었다. 주로생성된신생골은결손부변연부위에서관찰되었으며, 결손부중심부는흡수되지않은 collagen 다발이남아있는양상이었다. 일반적으로 8주후의치유기간후조직소견시잔존해있던 collagen 들은대부분흡수된양상을보였으며, 일정한방향성을갖는밀집된결합조직이관찰되었고, 신생혈관조직이골결손부내부에형성되어있었다. TATBMP-2 의신생골형성은 8주소견시모든개체에서신생골형성은미미하였다. 반면에고른결과를보여주진못했지만, TAT-HA2-BMP-2 군에서는결손부내부가명확히신생골로재생된개체가발견되었다. 반면에, 골형성이 TATBMP-2 혹은양성, 음성대조군에비해뚜렷하지못한개체도있었다. 이는 TATBMP-2 를개선한 TAT-HA2-BMP-2 가골재생에는효과가있지만, 효율이떨어지는것을의미한다. PTD 융합단백질이세포내로전달되었을때세 포질과핵에균일하게분포하는지, 아니면특정한세포내소기관에분포를보이는지에대한보고는거의없다. TATBMP-2 가효과적인기능을하기위해서는세포질내에함입된후다시핵내로전송되어야한다. 핵내전송이실패되고핵주변으로위치되게되면원하던 TATBMP-2 의기능은떨어져 rhbmp-2 생산및세포외로의 rhbmp-2 분비는이루어지지않는다. 따라서 TATBMP-2 로인한골형성효과가줄어들게된다. 또한일반적으로골이형성되기위해서는일정한기간동안효과가지속되어야하는데, TAT과같은 PTD 를이용할경우분리정제된단백질이표면에너지를가져인접세포나조직에수분이내에상당량의단백질이투과되고, 1~2 시간내에대부분전달된다는점이단점으로작용할수있다. 이러한결과를볼때 TATBMP-2 가가지는한계성은세포질내에서균일한핵내전송이일어나지못하고, 짧은기간에유리된다는점이다. 일반적으로 TAT 융합단백질은세포내전송시 endosome 복합체형태로존재하게된다 37). 이러한형태로는핵내전송이용이하지않다. 하지만, endosome 을분해할수있는물질즉, chloroquine, polyethylenimine 을처치하게되면 TAT 융합단백질의핵내전송이수월해질수있다. 하지만이러한방법은독성을나타낼수있기때문에치료방법으로서는적절치못하다. 이에 HA2 peptide 를 TAT 과같은 PTD 에연결하여처치할경우 chloroquine 등에서우려되던독성에대한염려없이 macropinosome 을통해단백질의전송이용이함이보고되어졌다 21). 이러한결과로 HA2 와결합된 HIV-1 TAT 융합단백질은 TAT 융합단백질에비해효과적으로적용될수있음을의미한다. 실제로백서의원형골결손부에서 TAT-HA2-BMP-2 를적용시킨경우, HA2를결합시키지않은 TATBMP-2 에비해뚜렷이골형성이된것을볼수있었다. 모든개체에서일관적인효과를보이지않아개선의여지는있지만, 명확하게양성및음성대조군, TATBMP-2 실험군과비교시효과가있음을보여주었다. HA2 는세포막의 sialic acid 를포함한수용기에결합하여엔도솜안으로들 505

10 어오고, 엔도솜을조절함으로써단백질의기능을활성화시킨다. HA2가 TATBMP-2 를개선시켜명확한효과를보이지만, 일관적인결과를보여주지못하는것은 TAT-HA2-BMP-2 가균일하게용액에퍼져전달이되어야하는데, 소수성을띄는성질로말미암아서로응집하는현상이강하여, 실제목표로하는세포들에효율적으로전달이되지않는것이원인으로사료된다. 이에 TAT-HA2-BMP-2 를보다균일하게확산시켜, 목표로하는세포에적용할수있는방법에대한추가적인연구가필요하리라사료된다. V. 결론 본연구는세포내로자발적투과가가능한단백질전달영역 (protein transduction domain:ptd) 을가진 HIV-1 펩타이드를이용한재조합 TATBMP -2 와추가로 HA2를삽입시켜변형한 TAT-HA2- BMP-2 를박테리아에서생합성및정제후이들을, 0.10mg/ml 의농도로 collagen 을전달체로백서두개골결손부모델에적용하였다. 2주및 8주치유기간을둔후조직학적으로평가하였으며, 다음과같은결론을얻을수있었다. 1. TATBMP-2 의골재생효과는조직학소견에서음성대조군및양성대조군에비해뚜렷하지않았다. 2. TAT-HA2-BMP-2 의골재생효과는조직학소견에서, 음성대조군및양성대조군, TATBMP -2 군과비교하여일부개체에서명확한골형성이나타났다. 본연구인백서두개골결손부에서 PTDBMP-2 인 TATBMP-2 와 TAT-HA2-BMP-2 를 collagen 을전달체로하여 0.1mg/ml 의농도로적용시켜보았을경우 TATBMP-2 의골재생효과는미미하였고, TAT-HA2 -BMP-2 군에서골이뚜렷이형성된개체가있었다. 하지만, 모든개체에서일관적인결과를보이진못했다. 이에 TAT-HA2-BMP-2 를보다균일하게확산시 켜, 목표로하는세포에적용할수있는방법에대한추가적인연구가필요하리라사료된다. VI. 참고문헌 1. Urist MR. Bone: formation by autoinduction Clin Orthop Relat Res 2002: Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science 1988; 242: Celeste AJ, Iannazzi JA, Taylor RC, et al. Identification of transforming growth factor beta family members present in bone-inductive protein purified from bovine bone. Proc Natl Acad Sci U S A 1990;87: Sampath TK, Maliakal JC, Hauschka PV, et al. Recombinant human osteogenic protein-1 (hop-1) induces new bone formation in vivo with a specific activity comparable with natural bovine osteogenic protein and stimulates osteoblast proliferation and differentiation in vitro. J Biol Chem 1992;267: Gitelman SE, Kobrin MS, Ye JQ, et al. Recombinant Vgr-1/BMP-6-expressing tumors induce fibrosis and endochondral bone formation in vivo. J Cell Biol 1994;126: Cook SD, Baffes GC, Wolfe MW, et al 3rd. The effect of recombinant human osteogenic protein-1 on healing of large segmental bone defects. J Bone Joint Surg Am 1994;76: Cook SD, Salkeld SL, Patron LP. Bone defect healing with an osteogenic protein-1 device combined with carboxymethylcellulose. J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2005; 506

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13 - Abstract - Bone regenerative effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 employed protein transduction domain Sung-Won Jung 1, Nam-Hee Kim 2, Jong-In Yook 2, Chang-Sung Kim 1 Hyung-Jun Kim 3, Kyoo-Sung Cho 1 1. Department of periodontology, Research institute for periodontal Regeneration, College of Dentistry, Yonsei University 2. Department of Oral pathology, Oral Cancer Research institute, College of Dentistry, Yonsei University 3. Department of Oral & Maxillofacial surgery, College of Dentistry, Yonsei University Bone morphogenetic proteins(bmps) are regarded as members of the transforming growth factor-β superfamily with characteristic features in their amino acid sequences. A number of studies have demonstrated the biologic activities of BMPs, which include the induction of cartilage and bone formation. Recently there was a attempt to overcome a limitation of mass production, and economical efficieny of rh-bmps. The method producing PTD by using bacteria have advantages of acquiry a mass of proteins. Hences, a new treatment which deliver protein employed by protein transduction domain(ptd) has been tried. The purpose of this study was to evaluate the bone regenerative effect of TATBMP-2 and TAT-HA2-BMP-2 employed by PTD from HIV-1 TAT protein for protein translocation in the rat calvarial model. An 8mm calvarial, critical size osteotomy defect was created in each of 32 male Spraque-Dawley rats(weight 250~300g). The animals were divided into 4 groups of 32 animals each (4 animals/group/healing interval). The defect was treated with TATBMP-2/ACS(Absorbable collagen sponge) (TATBMP-2 0.1mg/ml), TAT-HA2-BMP-2/ACS(TAT-HA2-BMP-2 0.1mg/ml), ACS alone or left untreated for surgical control(negative control). The rats were sacrificed at 2 or 8 weeks postsurgery, and the results were evaluated histologically. The results were as follows: New bone formation were not significantly greater in the TATBMP-2/ACS group relative to negative, and positive control groups. New bone was evident at the defect sites in TAT-HA2-BMP-2/ACS group relative to negative, positive control and TATBMP-2 groups. There were a little bone regeneration in TATBMP-2 groups. While, enhanced local bone formation were observed in TAT-HA2-BMP-2 group. But, The results was not the same in all rat defects. Therefore, further investigations are required to develop a method, which disperse homogenously, and adhere to target cells. 2) Key words : bone regeneration, Bone morphogenetic protein, protein transduction domain 509

00)14-1목차1~3

00)14-1목차1~3 Effect of the bovine collagen matrix on bone formation in rat calvarial and mandibular defects Jeong-Ho Yun 1, Jee-Hee Jung 2, Jin-Woo Kim 2, Chang-Sung Kim 2, Seong-Ho Choi 2, Kyoo-Sung Cho 2 1 Department