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1 대한치주과학회지 2008; 38: E. coli 발현시스템에의해생산된 recombinant human bone morphogenetic protein-2 의정제와생물학적활성 최경희 1, 문금옥 1, 김수홍 1, 윤정호 2, 장경립 3, 조규성 4* 1. ( 주 ) 코웰메디, 기술연구소 2. 관동대학교의과대학명지병원치과 3. 부산대학교생명과학부 4. 연세대학교치과대학치주과학교실, 치주조직재생연구소 Purification and biological activity of recombinant human bone morphogenetic protein-2 produced by E. coli expression system Kyung-Hee Choi 1, Keumok Moon 1, Soo-Hong Kim 1, Jeong-Ho Yun 2, Kyung-Lib Jang 3, Kyoo-Sung Cho 4* 1. Research Development Institute, Cowellmedi Co. LTD. 2. Department of Dentistry, College of Medicine, Kwandong University, Myongji Hospital 3. Depatment of Biological Science, College of Natural science, Pusan National University 4. Department of Periodontology, Research Institute for Periodontal Regeneration, College of Dentistry, Yonsei University ABSTRACT Purpose: Bone morphogenetic protein-2(bmp-2) has been shown to possess significant osteoinducitve potential. There have been attempts to overcome a limitation of mass production, and economical efficiency of BMP. The aim of this study was to produce recombinant human BMP-2(rhBMP-2) from E. coli in a large scale and evaluate its biological activity. Materials and Methods: The E.coli strain BL21(DE3) was used as a host for rhbmp-2 production. Dimerized rhbmp-2 was purified by affinity chromatography using Heparin column. To determine the physicochemical properties of the rhbmp-2 expressed in E. coli, we examined the HPLC profile and performed Western blot analysis. The effect of the purified rhbmp-2 dimer on osteoblast differentiation was examined by alkaline phosphatase (ALP) activity and representing morphological change using C2C12 cell. Results: E. coli was genetically engineered to produce rhbmp-2 in a non-active aggregated form. We have established a method which involves refolding and purifying a folded rhbmp-2 dimer from non-active aggregates. The purified rhbmp-2 homodimer was characterized by SDS-PAGE as molecular weight of about 28kDa and eluted at 34% acetonitrile, min(retention time) in the HPLC profile and detected at Western blot. The purified rhbmp-2 dimer stimulated ALP activity and induced the transformation from myogenic differentiation to osteogenic differentiation. Conclusion: rhbmp-2 was produced in E. coli using genetic engineering. The purified rhbmp-2 dimer stimulated ALP activity and induced the osteogenic differentiation of C2C12 cells. (J Korean Acad Periodontol 2008;38:41-50) KEY WORDS: E.coli; rhbmp-2; purification; alkaline phosphatase. 2) 서론 골과연골의형성과재생을유도하는조절인자인 bone morphogenetic proteins(bmps) 는 transforming growth fac- Correspondence: Dr. Kyoo-Sung Cho Department of Periodontology, Research Institute for Periodontal Regeneration College of Dentistry, Yonsei University, 134 Shinchon- Dong 134, Seodaemun-gu Seoul, , Korea kscho@yuhs.ac, Tel: , Fax: * This work was supported by the Korea Research Foundation Grant funded by the Korean Government (MOEHRD) (KRF E00184). 접수일 : 2008 년 1 월 30 일 ; 채택일 : 2008 년 2 월 28 일 tor-β(tgf-β) superfamily 에속하는복합기능의성장인자이다. 1965년 Urist 1) 는의해탈회된골편을쥐의피하나근육내부에이식하면이식편주위로이소성골형성 (ectopic bone formation) 이일어나는것을관찰하고그에관계하는물질을추출하여골형성단백질 (bone morphogenetic proteins: BMPs) 이라고명명하였다. BMP 는몇몇종류의세포들의성장과분화를조절하는것으로알려져있다. BMP 는연골모세포를자극하여기질합성을유도하고, 조골세포를자극하여 alkaline phosphatase(alp) 활성도를증가시키고콜라겐합성을자극한다 2). 아울러, monocyte의 chemo- 41

2 최경희, 문금옥, 김수홍, 윤정호 대한치주과학회지 2008 년 38 권 1 호 taxis 3) 와 neural cell 의분화 4) 에관계하며일반적으로배발생기에중요한역할 5) 을한다. 또한, BMP 는생체내 (in vivo) 에서미분화간엽세포에작용하여연골내골화작용과유사한방식으로골형성을유도한다고알려져있으며, 성체에서도새롭게골이형성되는과정동안 BMP 의농도가형성되는부위에서증가됨이관찰되었다 6). 1988년 Wozney 2) 등이처음으로클로닝 (cloning) 에성공하면서부터 BMP 에관한본격적인연구가시작되었으며, 이후많은연구를통해 20 종류이상의 BMP 중 BMP-2, -4, -5, -6, -7 등이골유도성이있다고밝혀졌다 7-11). 그중에서, 포유류세포 (CHO cell) 로부터재조합 DNA 기술로얻어지는 recombinant human BMP(rhBMP)-2, -7이골유도능이가장우수하다고보고되어 12), 이를이용하여많은연구가이루어져왔다. 특히동물모델을이용하여임상적적용을위한많은연구들이있었다. rhbmp 는두개골, 하악골, 장골의골결손부재생을촉진시켰다 ) BMP-2 의효과와임상적응용범위는정형외과영역뿐만아니라치과영역에서도그안전성과효과가증명되어지고있다 16,17). 대부분의 BMP 들은대용량생산을하기위해포유류세포들을이용하여만들어졌다. Chinase hamster ovary(cho) cell에서 BMP-2 2,18) 가발현되었는데, 세포내에서 BMP 전구체가생산된후 modification되어세포외로 native homodimer 가분비되었다. Human BMP-4 는 mouse myeloma cell line(nso) 과 human embryonic kidney cell line(292) 에서생산되어졌고, human BMP-7(OP-1) 은 CHO cell과 primate cell line에서생산되어졌다 19). Maruoka 등 20) 이 insect cell에서 baculovirus 세포발현시스템을이용하여 human BMP-2 생산을시도했으나 cellular lysate 에서만활성이나타나고상등액에서나타나지않았다. 또한비슷한시스템이 BMP-2 와 BMP-7 의 homodimer와 heterodimer를생산하는데이용되었으나 BMP 활성은세포내에서만나타났다 21). 이와같이생산되는 BMP 의골형성능을임상에효과적으로적용하기위해서는생산이용이하고대량생산이가능하여경제적인가치와충분한골형성능을동시에지녀야한다. 그러나, 기존의포유류세포를이용하여생산된 rhbmp 는골형성에있어서효과적인것으로입증되었으나, 생산비용이높아일상적인임상시술에적용시키는데에는한계점이있어왔다. 그러므로, 새로운방식에의해 BMP 를추출 정제하거나인공적으로생산하여사용하고자하는노력들이계속있어왔 다. 이와같은과정에서, E. coli 같은박테리아시스템을이용하여 BMP-2 와 BMP-4 가생산되어져그활성이 in vivo 와 in vitro 에서확인되었다 22-24). E. coli 같은박테리아를사용한 rhbmp 의생산은경제적으로 BMP 의생산비용을낮추어 BMP 의임상적용을보다용이하게할것으로평가되었다. 본연구는 E. coli 발현시스템을이용하여, rhbmp-2 를안정적으로다량생산하는시스템을갖추고생산된단백질을활성이있는상태로정제하는것을목표로하였다. 그리고생산된 rhbmp-2 의활성을 in vitro에서확인하고자하였다. 재료및방법 1. E. coli 를이용한 human BMP-2 의발현및정제 1) Human BMP-2 유전자의클로닝 (cloning) U2OS 세포를 10% 우태아혈청, 100unit/ml 페니실린, 100 ug/ml 스트렙토마이신을첨가한 DMEM(Gibco BRL, NY, USA) 배지를사용하여 5% CO 2 를공급하면서 37 에서 CO 2 incubator(thermo Electron Co, Ohio, USA) 에서배양하였다. Human BMP-2 유전자를얻기위하여 U2OS 세포에서 total cellular RNA를 Trizol(Gibco BRL, NY, USA) 용액을사용하여추출하여역전사반응을실시하였다. cdna 를주형으로 sense primer 로 5'-AGAAGAACATATGCAAGCCAAA CACAAACAGCG G-3', antisense primer 로 5'-AATTTT ACAGCTTCTAGCGACACCCACAACCCT-3' 을사용하여 polymerase chain reaction(pcr) 을실시하였다. PCR 산물을분리하여 pgem-t vector(promega, USA) 에삽입시킨후 E. coli(dh5α) 세포를이용하여클로닝하였다. 형질전환체를선별하여 rhbmp-2 유전자를발현벡터 (prset(a)) 에삽입하여 prset(a)/hbmp-2 로명명하였다. prset(a)/ hbmp-2 로 BL21(DE3) 를형질전환시켜 50 ug/ml ampicillin 을포함한 LB배지에접종하여 37 에서배양하여발현을확인하였다. 2) 고밀도세포배양발효조 (KoBioTec, Incheon, Korea) 를이용하여 Fatemeh 등의방법 25,26) 을응용하여고밀도로배양하였다. 단일균체 (a single colony) 한개를 Ampicillin(200 ug/ml) 이첨가된 LB 액체배지 300 ml 에접종하여진탕배양기 (Shacking incubator) 에서 37, 200 rpm 의회전속도로 16~18 시간동안 42

3 J Korean Acad Periodontol 2008; 38(1) E.coli 발현시스템에의해생산된 recombinant human bone morphogenetic protein-2 의정제와생물학적활성 배양하여전배양액 (seed culture) 을만들었다. 이전배양액을본배양액 (batch culture; yeast extract 1g/L, peptone 2 g/l) 에 10% 를접종하였고, 본배양액은발효조를이용하여온도 30, 교반속도 250 rpm 으로교반하면서 24 시간동안배양하였다. 배양하면서주기적으로샘플을채취하여 600 nm 에서흡광도를측정하였다. A600이 3~4 사이가되면멸균된영양배지 (Glucose 33.3 g/l, peptone 10 g/l, yeast extract 5 g/l, MgSO 4 1 g/l, CaCl g/l, ZnSO g/l, CuSO g/l) 를첨가하면서 24시간동안배양하였다. 3) 단백질정제 24시간동안배양한배양액을수거하여 4, 8,000xg에서 10 분동안원심분리 (Sovall, CA, USA) 하여세포체를침전시키고상등액을제거하였다. 세포침전체를 50 mm 인산나트륨완충액 (sodium phosphate buffer, ph 7.0) 로 2회세척한후 220 mg( 습량 )/L의농도로현탁시켰다. 현탁액을 -80 deepfreezer(nihon Freezer, Japan) 에보관하였다. 냉동된현탁액을냉장온도에서해동시킨후가압하여세포를파쇄한후 5,500xg, 4 에서 45 분간원심분리하였다. 원심분리후침전물에 50 mm 인산나트륨완충액 (ph 7.0) 으로재현탁시킨후다시원심분리하여침전물을 -80 에보관하였다. 냉동시킨침전물을 2 mg( 습량 )/L 농도로완충액 A(20 mm Tris-HCl(pH 8.5), 0.5 mm EDTA, 1%(v/v) Triton X-100) 에재현탁하여현탁액을 26,000xg, 4 에서 30 분간원심분리하여 inclusion bodies 를수거하였다. Inclusion bodies 를용해완충액 (solubilization buffer: 4 M Guanidine-HCl, 0.1 M Tris-HCl(pH 8.5), 0.1 M dithiothreitol, 1 mm EDTA) 을첨가하여 16~18 시간동안천천히교반시키면서단백질을용해시켰다. 용해시킨후 26,000 xg, 4 에서 45 분간원심분리하여불용성물질들을침전시켜제거하였다. 용해된단백질용액을재변성화완충액 (renaturation buffer: 0.5 M Guanidine-HCl, 50 mm Tris-HCl(pH 8.5), 0.75 M 2-(cyclohexylamino) ethanesulfonic acid(ches), 1 M NaCl, 5 mm EDTA, 5 mm total Glutathione) 으로희석시켜 72 시간정도둔후용해성분획과불용성분획을 38,000 xg, 4 에서 10분간원심분리하여분리하였다. 재변성과정을거친 mature rhbmp-2 가본래의 3차구조를가지게되면 N-말단이 heparin-binding site 를가지게된다 24). 이성질을이용하여 refolded rhbmp-2 이량체 (dimer) 를 Heparin Sepharose 6 Fast Flow column(ge healthcare, USA) 을이용하여단량체 (monomer) 와분리하여정제하였다. 재변성과정을지나온대부분의단백질은 heparin column 에결합하였으며 NaCl 의농도를달리하여용출 (elution) 시켰다. NaCl 의농도구배를연속적으로만들어 rhbmp-2 의용출을확인한후 3단계의농도구배를주어분리하였다. 2. 정제한 rhbmp-2 의생화학적특성 1) HPLC(High performance Liquid Chromatography) 분석정제된 rhbmp-2 이량체를 0.1% TFA(Trifluoroacetic acid) 에 1 ug/ul 의농도로녹여 C4 reversed-phase HPLC column(4.6 mm 50 mm, 300 A, 5 um particle size; Grace vydac, CA, USA) 에 10 ug 을로딩하고유속 (flow rate) 은 1 ml/min 으로 HPLC(Nanospace 51-2, Shiseido, Japan) 로 chromatography 를실시하였다. 0.1% TFA 로수세후이동상을 0.1% TFA 로하면서 0~50% acetonitrile 구배로용출하였다. 각분획의단백질검출은 214 nm 로모니터하였다. 2) Western Blotting 분석 rhbmp-2 이량체를환원조건과비환원조건에서 15% SDS-PAGE로전기영동하여 Mini Trans-Blot cell(biorad, CA, USA) 을이용하여 nitrocellulose membrane (Hybond PVDF, Amersham, USA) 으로단백질을이동시킨다. 그후 5% skimmed milk 에 1시간반응시키고 1차항체는 monoclonal anti-bone morphogenetic protein-2 antibody(sigma, Missouri, USA) 를 1000:1, 2차항체는 goat anti-mouse IgG(Bio-rad, CA, USA) 를 2000:1 로사용하였다. 그리고 chemiluminescent ECL kit(lab frontier, Korea) 를사용하여검출하였다. 3. 정제한 rhbmp-2 의생물학적활성 (in vitro test) 정제한 rhbmp-2 단량체와이량체각각의생물학적활성을측정하기위하여 C2C12 cell에서의 alkaline phosphatase(alp) 의활성과세포의형태변화를관찰하였다. 6-well plate(spl, Korea) 에세포들을 cells/ml 농 43

4 최경희, 문금옥, 김수홍, 윤정호 대한치주과학회지 2008 년 38 권 1 호 도로접종하여 growth medium(dmem containing 15% FBS) 에서배양하였다. rhbmp-2 의효과를시험하기위해 1일이지난후 growth medium 을 rhbmp-2 단량체와이량체가각각 1 μg/ml 의농도로포함된 low mitogen medium (DMEM cotaining 5% FBS) 으로교환하였다. 4일이지난후 rhbmp-2 를처리한세포와처리하지않은세포의형태변화를 Inverted microscope(nikon, NY, USA) 로 40배의배율에서관찰하였다. ALP 활성도변화를측정하기위해 rhbmp-2 이량체를농도별 (0, 0.2, 1, 5, 10 μg/ml) 로위와같은방법으로각각처리후 3일간배양한후에세포들을 lysis buffer(0.1 M Tris-HCL, ph 9.6, 1% NP-40, 1 mm MgCl 2, 1 mm ZnCl 2) 를첨가하여세포를해리시켰다. cell lysate 20 μl 에 p-nitrophenyl phosphate Liquid Substrate system (Sigma, Missouri, USA) 200 μl 를첨가하여혼합하여 37, 항온수조에서효소반응을시킨후 0.5 N NaOH 용액을첨가하여반응을중지시켰다. ALP 활성도는아래와같이상대적으로측정하였다. 대조군에서의 A 420 은 0.1 이하로나타났다. ALP 활성도 = 420 nm 에서반응액의흡광도 /cell lysate 의총단백질 1 mg 단백질정량분석은 Bradford 법으로 Bio-rad protein assay kit(bio-rad, CA, USA) 를사용하여측정하였다. 결과 1. rhbmp-2 단백질의생산및정제 Human BMP-2 생산시스템을구축하기위해인간유래 골아세포주인 U2OS cell 에서 human BMP-2 의 mature form 유전자를 RT-PCR 법으로클로닝하여확보하고자하였다. 사람세포에서 BMP-2 가만들어질때전구체로만들어진후세포내시스템에의해다듬어져최종적으로 mature form 이라불리는작은이량체로만들어져세포외로분비되어작용한다. 표적세포의세포막에있는수용체와결합하여신호전달 (signal transduction) 과정을거쳐표적세포의유전자발현에작용한다. 따라서효과를가지는부분은 mature form 이므로본연구에서는 mature form 을생산하고자하였다. RT-PCR 의결과 369bp의 PCR product를얻었다. 이를 pgemt vector 에클로닝하여 sequenceing 한결과 human BMP-2 의 C-말단쪽의 mature form 의 114 아미노산잔기의핵산서열과일치하였다. 스크리닝한형질전환체클론들을각각 small-scale 로배양하여 IPTG induction 시켜재조합단백질이고농도로발현되는클론을선별하여실험에사용하였다. 재조합단백질은 soluble form 이아닌 insoluble form 으로 inclusion body 를형성하였다 (Fig. 1). 형질전환체를분리하여발효조를사용하여영양배지를첨가하면서산소의농도와 ph가적당한값을나타내는시기에 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 로단백질발현을유도시켰다. 이후 24 시간을더배양했을때평균적으로 600 nm 에서의흡광도 (A600) 가 12~14에달했다. 이이후로는세포밀도를나타내는 A600의값이지수적으로증가하지않았다. 이때배양을중단하고세포들을수거하였다. 이때의세포밀도는 15 g/l 였다. 본연구에서플라스크를이용한배양에서는세포밀도가 3~3.5 g/l 로서이와비교할때플라스크배양보다 5배정도세포밀도가높은데, 이는더개선되어야할부분으로서이문제는발효조의조건과배양조건의복합적인문제라고고려된다. 세포체를수거하여파쇄후 inclusion body 분획을모아서용해 이량화시켜 Heparin col- Figure 1. Expression and localization of rhbmp-2 protein in E. coli, Comassi blue-stained reduced 12% SDS-PAGE analysis. NI; cultivation in non-induced contition, I; cultivation in induced condition(1mm IPTG, 37 for 3h). Lanes: C, crude extract of recombinant E. coli; S, soluble fraction of crude extract; IS, Insoluble fraction of crude extract. 44

$Dimer represents dimer fraction and Monomer represents monomer fraction. Figure 3.$

5 J Korean Acad Periodontol 2008; 38(1) E.coli 발현시스템에의해생산된 recombinant human bone morphogenetic protein-2 의정제와생물학적활성 Figure 2. Identification of dimerized and purified rhbmp-2, commasie blue-stained 12% SDS-PAGE analysis. Lanes: M, protein marker; U, nonreduced rhbmp-2; R, reduced rhbmp-2. Dimer represents dimer fraction and Monomer represents monomer fraction. Figure 3. rhbmp-2 dimer purification in order to purified step by heparin affinity chromatography, silver-stained nonreduced 15% SDS-PAGE analysis. Lanes: M, protein marker; 1, dialysed renaturation mixture; 2, flow through fraction; 3, eluted fraction with 0.15M NaCl; 4, eluted fraction with 0.3M NaCl; 5, eluted fraction with 0.5M NaCl. umn 으로 affinity chromatography를실시하였다. 그결과 Fig. 3에서보여지는바와같이 0.3 M NaCl 분획에서대부분의단량체와소량의이량체가용출되었고 0.5M NaCl 분획에서이량체들이용출되었다. 분리 정제된 rhbmp-2 단량체와이량체를 SDS-PAGE로분석하여확인하였다. 본연구에서생산된단량체의크기는약 114 아미노산잔기로계산되며단량체의분자량은약 14 kda 으로나타났으며이량체는두개의단량체가이황화결합으로연결되므로비환원조건에서단량체와같은크기의밴드로나타났다. 이량체의크기는약 28kDa으로나타났다 (Fig.2, Fig.3). 2. rhbmp-2 의생화학적특성 순수분리된단백질의정제도를확인하기위하여 HPLC와 western blotting, silver staining을하였다. Fig.3 의 Lane 5는 0.5M NaCl 분획을비환원조건에서 SDS-PAGE를하여 silver staining 을한것이다. 99% 이상의정제도를보여준다. 정제된 rhbmp-2 이량체의 HPLC profile 을보면머무름시간 (retention time) 이 분이며 33% acetonitril 분획에서단백질이용출되고정제도는 99% 이다 (Fig. 4). 또한면역학적방법으로 rhbmp-2 이량체를확인하였다. 그결과환원조건과비환원조건에서실시했을때이량체와단량체, 둘다에서밴드가나타났다. Fig. 5에서 R 라인에서 28kDa 의크기를가진 spot 이보이는데이는본래단량체였던단백질을환원시키는과정에서미량이다량체로남아있었기때문으로판단된다 (Fig. 5). Figure 4. HPLC profile of purified rhbmp-2 45

6 최경희, 문금옥, 김수홍, 윤정호 대한치주과학회지 2008 년 38 권 1 호 Figure 5. Western blotting of purified rhbmp-2 UR; nonreduced condition, R; reduced condition 3. rhbmp-2 의생물학적활성 (in vitro study) 본연구에서생산한 rhbmp-2 의생물학적활성을확인하기위하여 C2C12 세포를이용하였다. rhbmp-2 가배양액에일정농도이상함유되면 C2C12 세포는분화경로의변화로세포의형태가변화하게된다. 또한세포들에게서 ALP 의활성이나타나며 rhbmp-2 의농도가증가하면 ALP 의활성도증가된다고알려져있다. rhbmp-2 단량체와이량체의생물학적활성차이를보기위하여각각을분리정제하여 myogenic differentiation 조건에서 C2C12 cell 에처리한결과, 이량체를처리한세포군에서만 5일이지나도 myotube 가형성되지않았다 (Fig. 6). 이로서 rhbmp-2 는이량체로존재하여야표적세포의세포막에있는막수용체와결합하여작용을나타냄을알수있다. 그래서 ALP 활성의변화는정제된 rhbmp-2 이량체만으로측정하였다. rhbmp-2 를농도별로달리처리하였을때 ALP 활성이 Fig. 5에나타난바와같이처리농도가증가함에따라증가하였다. ALP 활성은 200 ng/ml 에서약하게증가하다 Figure 7. Dose response effects of a purified rhbmp-2 dimer on ALP activity in C2C12 cells. The cells were cultured for 3 days with different concentrations of rhbmp-2 dimer. The ALP activity of the cell lysate was measured using β -nitrophenylphosphate as a substrate. substrate. 가 500 ng/ml 이상의농도에서강하게증가하였다 (Fig. 7). 이는 Katagiri 등 27) 의결과와유사하다. 고찰 골형성유도인자에대한많은연구들이일찍부터있어왔다. Urist 등 1) 은포유류의피질골로부터골형성유도인자를추출하여그인자를골형성단백질 (Bone Morphogenetic protein: BMP) 이라고명명하였다. 초기에골형성단백질은비탈회골, 또는탈회골에서분리정제되어연구에사용 Figure 6. Photographs of Morphological change of C2C12 cells. We treated purified rhbmp-2 dimer fraction and monomer fraction to C2C12 cells. (Original magnification 1X40) 46

7 J Korean Acad Periodontol 2008; 38(1) E.coli 발현시스템에의해생산된 recombinant human bone morphogenetic protein-2 의정제와생물학적활성 되었다. Anderson 등 28,29) 은 Saos-2 와 U2OS 두인간유래세포주에서여러가지 BMP 와 transforming growth factor-β(tgf-β) 의발현을비교하고분리추출한 BMP 가동물또는세포배양실험에서각각상이하지만골유도능이있음을보고하였다. 그러나자연골 (native bone) 에서추출되는 BMP 함량은 1~2 μg/kg(bmp/ 피질골 ) 수준이다. 현재약 20 여종류의 BMP 가알려져있는데 BMP-1 을제외한모든 BMP 는 TGF-β 의한부류로간주되고있다 21,26). BMP-2 는 4, 5, 6, 7형과함께경골과연골의신생을유도하며골이식을위한여러가지 late-stage tissue engineering products 의강력한골유도성분으로서알려져있다. 그중 rhbmp-2 와 rhbmp-7 은골유도능이가장우수하다고보고되어주로이들이생산되어여러다양한연구에재료로사용되어지고있다 12). BMP-2 는 7개의 cystein domain 을가지고있는구조로이는 TGF-β 의 1차구조와유사하며세포내에서 396 개의아미노산잔기로이루어진전구체로만들어져이량화 (dimerization) 된후 proteolytically cleaved 되어 mature form 으로만들어진후세포외로분비되어작용하는 paracrine type 의성장인자로서 osteoprogenitor 세포들을유인하여증식시키고골조직으로의분화를촉진한다 13). Human BMP-2 는 1980 년대후반에처음클로닝되었는데동물세포인 CHO cell 이나 E. coli를이용하여생산하여사용되어지고있다. 동물세포를사용한경우세포외로분비된 mature form 을분리정제하여사용하고 E. coli 를이용한경우는 mature form 을만들수있게클로닝하여세포내에 inclusion body를생성시켜분리한후용해시켜분리하여 in vitro renaturation 을시켜사용하는방법들이보고되어져있다 23,30). 이런유전공학적방법으로만들어진 rhbmp-2 는대부분이동질이량체 (homodimer) 형이다. Homodimeric bone morphogenetic protein-2(bmp-2) 는배발생기뿐만아니라뼈조직재생과복구에중요역할을하는 TGF-βsuperfamily 에속하고전임상및임상연구들에서 homodimeric BMP-2 는골결손부, 비유합골절, 골다공증, 척추유합, 치근단수술 31) 같은다양한치료과정에유효함을보여주었다. 본실험에서는활성이있는 rhbmp-2 를생산하기위해 BMP-2 의발현이많이되는 U2OS cell 을사용하여 BMP-2 의 mature form 부분을클로닝하여 E. coli 를형질전환시켜생산하였다. E. coli 에서생산된 BMP-2 는당화 (glycosylation) 가되어있지않는점이동물세포 (CHO cell) 를이용하여생산한경우와다르나 Vallejo 등 23) 의보고에의하면동물세포에서생산한 rhbmp-2와 E. coli 에서생산한 rhbmp-2 homodimer 의생물학적활성은차이가없다. 본연구에서동물세포에서생산한 rhbmp-2 와직접비교하지는않았지만그활성은충분히나타났다. Katagiri 등 27) 은마우스의 primary muscle cell 과 C2C12 cell 을비교하여실험했는데 myogenic phenotype을억제하고 osteoblast phenotype 을유도할수있는 BMP-2 의유효량은일치함을보고하였다. 또한 C2C12 세포는배양액에포함된 FBS 농도가 15% 에서 5% 로감소되면 multinucleated Myotube 로분화하였다. 이런 Myogenic differentiation 조건에서 BMP-2 이량체를처리하면 Troponin T(Tn T) 와 myosin heavy chain(mhc) 의발현이저해되고 ALP 와 osteocalcin의발현이증가되면서 myotube 로의발현이저해되고조골세포로분화함을보고하였다 27). 본연구에서생산한 rhbmp-2 이량체와단량체를분리하여 C2C12 cell 에처리했을때, 그결과, rhbmp-2 이량체를처리한세포군에서는 myotube 의형성이저해되어나타나지않음을광학현미경에서관찰할수있었다 (Fig. 6). 한편, rhbmp-2 에의한골유도과정에서의주논점은국소적 rhbmp-2 농도와골형성과의상관관계이다. rhbmp-2 는 myogenesis 의저해제 27) 이고 adipogenesis의저해제 32) 이면서여러가지세포계에서 osteogenesis의강력한촉진제이다. 전달체 (carrier) 로부터의 rhbmp-2 의 initial burst 는 rhbmp-2 에반응하는세포들을전달체가있는곳, 즉고농도인부분으로끌어모으는역할을하고조금씩방출되는단백질은모아진세포들이분화발달하도록유도할것이다 31). 이처럼여러가지생분해성소재들에의한 rhbmp-2 의골조직유도능의증가는소재자체의성질로인한 rhbmp-2 의방출양식에의해서도많은영향을받게된다. rhbmp-2 를수용할수있는전달체로서 gelatin/beta-tcp complex, poly-d, L-lactic acid-para-dioxanone-polyethylene glycol polymer 31), hydroxyapatite implant 33), 콜라겐, Biphasic calcium phosphate 등 34-36) 다양한생분해성소재가연구되어지고있다. 그러므로본연구에서생산한 rhbmp-2 이량체의전달체개발에대한후속연구또한많이이루어져야하리라생각된다. 결론적으로, 본실험에서는발효조를이용하여 rhbmp-2 단백질을안정적으로발현하는 E. coli를고밀도로배양하 47

8 최경희, 문금옥, 김수홍, 윤정호 대한치주과학회지 2008 년 38 권 1 호 는방법을확립했으며 non-active aggregate 로만들어진단백질을세포외 (in vitro) 에서용해시켜이량화반응 (dimerization) 을조건을맞추어안정적으로이루어지게하여충분한활성을가진상태로분리정제하였다. 이를이용하여동물실험을통한 rhbmp-2 의 in vivo 에서의활성을검정하는등, 추후의다양한실험을통하여본방법으로생산한 rhbmp-2 단백질의효과를검정하는실험들이필요할것으로사료된다. 또한치과나정형외과영역에서임상에적용될수있도록, 보다충분한생물학적안전성검토가필요할것으로생각된다. 참고문헌 1. Urist MR. Bone Formation by autoinduction. Science 1965;150: Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science 1988;242: Cunningham NS, Paralkar V, Reddi AH. Osteogennin and recombinant bone morphogenetic protein 2B are chemotactic for human monocytes and stimulate transforming growth factor β1 mrna expression. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89: Paralkar VM, Weeks BS, Yu YM, Kleininman HK, Reddi AH. Recombinant human bone morphogenetic protein 2B stimulates PC12 cell differentiation and binding to type IV collagen. J Cell Biol 1992;119: Hogan BLM. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev 1996;10: Barnes GL, Kostenuik PJ, Gerstenfeld LC, Einhorn TA. Growth factor regulation of fracture repair. J Bone Miner Res 1999;14: Wikesjö UM, Guglielmoni P, Promsudthi A, et al. Periodontal repair in dogs: effect of rhbmp-2 concentration on regeneration of alveolar bone and periodontal attachment. J Clin Periodontol 1999;26: Kim CS, Choi SH, Choi BK, et al. The effect of recombinant human bone morphogenetic protein-4 on the osteoblastic differentiation of mouse calvarial cells affected by Porphyromonas gingivalis. J Periodontol 2002;73: Kingsley DM, Bland AE, Grubber JM, et al. The mouse short ear skeletal morphogenesis locus is associated with defects in a bone morphogenetic member of the TGF beta superfamily. Cell 1992;71: Solloway MJ, Dudley AT, Bikoff EK, et al. Mice lacking Bmp6 function. Dev Genet 1998;22: Jena N, Martín-Seisdedos C, McCue P, Croce CM. BMP7 null mutation in mice: developmental defects in skeleton, kidney, and eye. Exp Cell Res 1997;230: Wang EA, Rosen V, D'Alessandro JS, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein induces bone formation. Proc Natl Acad Sci USA 1990;87: Chen D, Zhao M, Mundy GR. Bone morphogenetic proteins. Growth Factors 2004;22: Cook SD, Salkeld SL, Rueger DC. Evaluation of recombinant human osteogenic protein-1(rhop-1) placed with dental implant in fresh extraction sites. J Oral Implantol 1995;21: Cook SD, Wolfe MW, Salkeld SL, Rueger DC. Effects of recombinant human osteogenic protein-1 on healing of segmental defects in non-human primates. J Bone Joint Surg Am 1995;77: Jones AL, Bucholz RW, Bosse MJ, et al. Recombinant human BMP-2 and allograft compared with autogenous bone graft for reconstruction of diaphyseal tibial fractures with cortical defects: a randomized, controlled trial. J Bone Joint Surg Am 2006;88: Govender S, Csimma C, Genant HK, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 for treatment of open tibial fractures: a prospective, controlled, randomized study of four hundred and fifty paients. J Bone Joint Surg Am 2002;84: Wang EA, Rosen V, D'Alessandro JS, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein induces bone formation. Proc Natl Acad Sci USA 1990;87: Sampath TK, Maliakal JC, Hauschka PV, et al. Recombinant human osteogenic protein-1 (hop-1) induces new bone formation in vivo with a specific activity comparable with natural bovine osteogenic protein and stimulates osteoblast proliferation and differentiation in vitro. J Biol Chem 1992;267: Maruoka Y, Oida S, Iimura T, et al. Production of functional human bone morphogenetic protein -2 using a baculovirus/sf-9 insect cell system. Biochem Mol Biol Int 48

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Microsoft Word doc Effect of rhbmp-2 produced by E-coli expression system on bone formation in rat calvarial defects Suk-Hoon Kwon The Graduate School Yonsei University Department of Dental Science Effect of rhbmp-2 produced