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1 J Koren Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 42(3), 487~496(2013) 진균류균사체의고체발효커피생두로부터조제한원두커피의생리활성 연구노트 신지영 1 김훈 1 김동구 1 백길훈 2 정헌상 2 유광원 3 1 ( 주 ) 코시스바이오기업부설연구소 2 충북대학교식품공학과 3 한국교통대학교식품영양학과 Phrmcologicl ctivities of Coffee Rosted from Fermented Green Coffee Bens with Fungl Myceli in Solid-stte Culture Ji-Young Shin 1, Hoon Kim 1, Dong-Gu Kim 1, Gil-Hun Bek 2, Heon-Sng Jeong 2, nd Kwng-Won Yu 3 1 R&D Center, CosisBio Corportion Limited, Chungbuk , Kore 2 Dept. of Food Science nd Technology, Chungbuk Ntionl University, Chungbuk , Kore 3 Dept. of Food nd Nutrition, Kore Ntionl University of Trnsporttion, Chungbuk , Kore bstrct Green coffee bens (CB, Indonesin Mndheling) were fermented with three kinds of mushrooms (Phellinus linteus, PL; Hericium erinceum, HE; Gnoderm lucidum, GL) or two kinds of myceli from molds (Monscus purpureus, MP; Monscus ruber, MR) using solid-stte culture to enhnce physiologicl ctivity. fter the rosting of fermented green coffee bens, rosted coffees were extrcted with hot-wter decoction or 95% ethnol reflux. Yields from hot wter extrcts (HW, 17.7~25.3%) were higher thn those from ethnolic extrcts (EE, 9.5~12.2%). Hot-wter extrcts of rosted coffees from green coffee bens fermented with two molds (MP-CB-HW nd MR-CB-HW) showed higher totl polyphenols, flvonoids, nd DPPH free rdicl scvenging ctivity thn rosted coffees from non-fermented (CB-HW) or fermented green coffee bens with the three myceli from mushrooms. MR-CB-HW lso hd the most potent mcrophge stimulting nd mitogenic ctivity (1.32 nd 1.40-fold of CB-HW, respectively). In ddition, MP-CB-EE nd MR-CB-EE did not show ny cytotoxicity to the RW cell t concentrtion of 100 μg/ml, nd these extrcts significntly inhibited nitric oxide (NO) production from the LPS-stimulted RW cell line (38.6 nd 37.0% of the LPS-treted group). Menwhile, the chlorogenic cid concentrtions of MP-CB-HW or MR-CB-HW highly incresed (to or μg/ml, respectively), but cffeine concentrtions were not ffected by solid-stte fermenttion. In conclusion, the physiologicl ctivities of rosted coffees were enhnced by the solid-stte culture of green coffee bens with M. purpureus or M. ruber, suggesting tht these rosted coffees could possibly serve industril pplictions s functionl coffee beverges. Key words: green coffee bens, rosted coffee, fungl myceli, solid-stte culture, physiologicl ctivity 서론커피는쓴맛, 떫은맛, 신맛, 단맛등이조화되어만들어지는대표적인음료로서전세계적으로가장널리음용되고있는기호식품으로우리나라에서도커피전문점확산과자가소비증가등커피시장이지속적으로성장하고있다. 커피에는다른식품에비해폴리페놀등의항산화성분함량이높아세포손상을유발하는자유라디칼소거능이높다고알려져있으며 (1,2), 최근에는신경세포보호효과를갖는 lipophilic ntioxidnt와 chlorogenic cid 등이커피생두보다로스팅한원두커피에높은함량을나타낸다는결과도보고 되고있다 (3). 또한커피는알츠하이머 (4), 파킨슨병 (5), 제2 형당뇨병 (6), 콜레스테롤 (7), 심장질환및간경변 (8-10) 등에도우수한보호효과를갖는것으로알려지면서기호식품을넘어서커피의약리적인효과에도많은연구가이루어지고있는추세이다. 그러나커피의과다섭취는정서불안, 신경과민, 수면장애및위장장애등의카페인중독증 (cffeinism) 을유발할수있다고알려져있으며 (11), 카페인이지방산화를증가시켜혈중유리지방산, 콜레스테롤및중성지질함량을높여심혈관계, 특히관상동맥질환을발생시킬수있다는연구 (12,13) 와함께이를부정하는연구도 (14,15) 지속적으로보고되어커피섭취와심혈관계질환과의상관성 Corresponding uthor. E-mil: kwyu@ut.c.kr Phone: , Fx:

2 488 신지영 김훈 김동구 백길훈 정헌상 유광원 은여전히논쟁이되고있다. 따라서커피의유용성분극대화와함께유해성분을감소시키기위한다양한공정개발과이에따른기능성커피의개발은일상적으로섭취하는기호식품을통한다양한만성질환예방에크게기여할수있다고사료된다. 한편지구상에수만종이나존재하는귀중한생물자원인진균류 (fungus) 는세균류 (bcterium) 와대립되는개념으로통곰팡이류, 접합균류, 자낭균류및담자균류를총칭하는데효모 (yest), 곰팡이 (mold) 및버섯류 (mushroom) 등의진핵생물이속하며, 대부분영양기관인균사체 (mycelium) 와번식기관인포자 (spore) 를가지고있다. 오래전부터한방및민간생약으로사용되어온진균류는특히최근에액체배양을통해얻은균사체의항산화활성, 항암활성과면역증강활성등의생리활성에대한연구가꾸준히진행되고있다 (16-19). 따라서이러한진균류균사체가커피생두를영양원으로이용하여생육함으로써균류의생물학적전환능력 (biotrnsformtion) 을유도할수있다면커피생두의유용성분증진과균사체증식에따른생리활성시너지효과및카페인중독증등의부작용완화를기대할수있어균사체가배양된커피생두의커피음료또는기능성소재활용성이높을것으로사료된다. 그러므로본연구에서는원두커피의생리활성증진을위하여식품에사용이허가된버섯 3종 ( 상황, 노루궁뎅이및영지버섯 ) 및홍국균 2종의 5종진균류균사체를커피생두에고체발효시킨후원두커피로배전하고추출물의생리활성을평가함으로써다양한만성질환을예방할수있는기능성커피소재로서의가능성을제시하고자하였다. 재료및방법 5종진균류균사체의종균배양다양한생리활성과함께오래전부터식용으로사용되어식품의약품안전청 (KFD, Chungwon, Kore) 에서식품으로사용이허가된버섯과홍국균의 5종진균류를이용하여생리활성이증진된균사체-고체발효커피생두를제조하기위하여상황버섯 (Phellinus(P.) linteus, PL), 노루궁뎅이버섯 (Hericium(H.) erinceum, HE), 영지버섯 (Gnoderm (G.) lucidum, GL) 과 Monscus(M.) purpureus(mp) 와 Monscus ruber(mr) 의홍국균 2종을농촌진흥청국립농업과학원농업유전자원센터 (Suwon, Kore) 로부터분양받았다. 5종진균류균사체는 potto dextrose gr(pd, Difco, Detroit, MI, US) 평판배지에서 25~30 o C로 10~15 일간배양한후 potto dextrose broth(pdb, Difco) 가담긴 flsk에접종하고 shking incubtor(jeio tech, Dejeon, Kore) 에서 4~7일간배양하여커피생두고체발효용진균류종균으로제조하여추후실험에사용하였다. 5종진균류균사체-고체발효커피생두제조본연구는커피생두자체를고체배지로이용하여진균류균사체를생육시킴으로써균사체의생리활성성분과함께커피생두에대한균주의생물학적전환능력에의해커피생두의기능성을증진시키는것이목적이다. 따라서 KFD에서식품으로사용이허가된버섯균사체 3종 (PL, HE 및 GL) 과홍국균균사체 2종 (MP 및 MR) 을이용하여현재국내에서대중적으로가장많이유통되고있는대표적인커피생두품종중하나인인도네시아산 Mndheling 커피생두에고체발효시켜 3종버섯및 2종홍국균균사체-고체발효커피생두를조제하였다. 인도네시아산 Mndheling 커피생두는 ( 주 ) 발리빈 (Goyng, Kore) 에서구입하여 5종진균류균사체-고체발효의커피생두로제조하였다. 먼저구입한커피생두 100 g( 수분함량 13~14%) 에대해 2배수의물로 2시간동안 30 o C에서침지하여조직을연화시킨후, 물기를제거한다음 121 o C에서 120분간고압멸균하였다. 멸균된커피생두에 3종의버섯균사체 (PL, HE 및 GL) 및 2종의홍국균균사체 (MP 및 MR) 액체종균을 10%(w/v) 접종하고 PL과 GL은 30 o C에서, HE, MP와 MR은 25 o C에서각각고체배양하였다. 5종진균류균사체-고체발효커피생두는모두상이한증식속도및경향을나타내었으나, 일관성과경제성을고려하여모두 10일배양을통한고체발효물로조제하였으며, 발효가종료된커피생두는모두 50 o C drying oven(jeio tech) 에서 48시간동안건조하여수분을제거한 5종의균사체-고체발효 Mndheling 커피생두 (PL-CB, HE- CB, GL-CB, MP-CB 및 MR-CB) 로조제되었다. 고체발효원두커피및용매추출물제조 3종버섯및 2종홍국균균사체-고체발효커피생두를 coffee roster(genecfe, nsn, Kore) 에서중배전 (235~ 240 o C, 12~13분간로스팅 ) 하여각각의원두커피 (rosted coffee) 로조제한후 coffee grinder(bzztr, Gyeonggi-do, Kore) 를이용하여동일크기로분쇄하였다. 원두커피의용매추출물중열수추출물은배전및분쇄된 5종균사체-고체발효원두커피에 20배물을가한후 decoction법을이용하여 2시간동안 hlf volume이되도록추출하였으며 (over 90 o C), 여과지 (No. 2) 를이용하여잔사를제거하였다. 추출여과액은원심분리 (7,600 g, 4 o C, 30분 ) 로불용성침전물을제거하고상등액은농축및동결건조하여 5종진균류균사체-고체발효원두커피의열수추출물로조제하였다 ( 상황버섯, PL- CB-HW; 노루궁뎅이버섯, HE-CB-HW; 영지버섯, GL- CB-HW; M. purpureus, MP-CB-HW와 M. ruber, MR- CB-HW). 에탄올추출물의경우에는배전및분쇄된 5종의균사체- 고체발효원두커피에 10배의주정 (95% ethnol) 을가하고 heting mntle(misung Scientific Co., Yngjoo, Kore) 로환류추출법을이용하여 2시간동안추출하였으며 (3회반복 ), 여과로잔사를제거하고추출여과액은원심분리후상

3 진균류균사체 - 고체발효원두커피의생리활성 489 등액을농축및동결건조하여균사체종류에따른에탄올추출물 (PL-CB-EE, HE-CB-EE, GL-CB-EE, MP-CB-EE와 MR-CB-EE) 로조제하였다. 한편비발효한인도네시아산 Mndheling 커피생두를배전한원두커피의열수추출물과에탄올추출물 (CB-HW와 CB-EE) 을각각조제하여활성을비교하기위한시료대조군으로사용하였다. 항산화성분분석및항산화활성 3종의버섯및 2종의홍국균균사체-고체발효커피생두로부터조제된원두커피의열수및에탄올추출물의총폴리페놀화합물함량은 Folin-Cioclteu법 (20) 을이용하여측정하였다. 즉 Folin-Cioclteu's regent가알칼리조건에서시료의 polyphenol 화합물에의해환원되면청색에서노란색으로발색되는원리를이용하여추출물시료 100 μl에알칼리조건을형성하기위해 2% N 2CO 3 을 2 ml를가한후 3분간반응시키고 50% 의 Folin-Cioclteu's regent(sigm-ldrich Co., St. Louis, MO, US) 100 μl를첨가해 30 분간반응시킨후반응액을 750 nm에서측정함으로써항산화성분인총 polyphenol의함량을확인하였다. 표준물질로는 tnnic cid를사용하여검량선을작성한후원두커피추출물의총폴리페놀화합물함량은 tnnic cid에대한 mg tnnic cid equivlents(te)/100 mg 추출물로나타내었다. 총플라보노이드함량은 Zhishen 등 (21) 의방법에따라 flvonoid에알칼리를반응시키면 flvn 또는 flvonol 배당체가황색을나타내는것을원리로이용하여측정하였는데, 80% 에탄올을사용해적당히희석한추출물시료 500 μl에 10% luminium nitrte 100 μl와 1 M potssium cette 100 μl를가한후암소에서 40분간방치하고변화한흡광도값을 415 nm에서측정하여표준물질인 quercetin에대한 mg quercetin equivlents(qe)/100 mg 추출물로나타내었다. 한편화학적으로안정화된 free rdicl인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrzyl, Sigm-ldrich Co.) 는항산화물질과반응하면전자를내어주면서라디칼이소멸되고색이변하게되므로, Cheung 등 (22) 의방법을응용하여균사체-고체발효원두커피추출물에의해 DPPH의색이옅어지는정도를측정하여항산화력으로나타내었다. 즉 0.2 mm DPPH rdicl 용액에시료 50 μl를가한후상온에서 60분간반응시켜반응액의흡광도변화를 517 nm에서측정하여표준물질인 scorbic cid에대한 mg scorbic cid equivlents ntioxidnt cpcity(ec)/100 mg 추출물로비교, 산출하여나타내었다. 실험동물과동물세포배양실험동물은생후 6주령의 C3H/He, ICR 및 BLB/c 마우스 ( ) 를 ( 주 ) 샘타코 (Osn, Kore) 에서구입한후사육조에넣고정수된물과실험동물용펠렛사료 (Smyng Co., Incheon, Kore) 를자유공급하였다. 한편세포독성및 nitric oxide 생성억제실험에사용된 RW 264.7(murine mcrophge cell line) 세포주는한국세포주은행 (Seoul, Kore) 에서분양받았으며, GenDEPOT(Houston, TX, US) 에서구입한 10% fetl bovine serum(fbs), 100 U/mL의 penicillin 및 100 μg/ml의 streptomycin이함유된 DMEM 배지를사용하여 37 o C, 5% CO 2 배양기 (Vision Scientific, Dejeon, Kore) 에서 2~3일간격으로계대하면서배양하였다. 또한항염증실험의염증유도에사용된 lipopolyscchride(lps from Escherichi coli) 는 Sigm-ldrich Co. 에서구입하였고, 마이토젠및장관면역활성측정에사용된 EZ-Cytox cell vibility kit는 Deil Lbservice Co.(Seoul, Kore) 에서입수하여실험에사용하였다. 면역활성마크로파지활성은 lysosoml phosphtse 효소활성도를통해측정하였는데, ICR 마우스복강에 3% thioglycollte medium(sigm-ldrich Co.) 을 2 ml 주입하고 72시간경과된후에유도된복강마크로파지를회수하여실험에이용하였다. 마크로파지는 100 U/mL의 penicillin, 100 μl/ ml의 streptomycin, 1.25 μl/ml fungizone-mphothericin B 및 10% FBS를함유한 RPMI 1640 medium(10% FBS- RPMI) 으로세척하고 cells/ml로분산시킨후 96-well plte(spl Life Science Co. Ltd., Pocheon, Kore) 에 200 μl씩분주하여마크로파지 monolyer를형성시켰다 (23). 2 시간후상등액을제거하고 non-dherent cell을 RPMI 1640 medium으로 3회세척한후 10% FBS-RPMI 180 μl와시료 20 μl를분주하여배양하면서마크로파지를자극하였다. 24 시간후상등액을제거하고남은마크로파지에 0.1% Triton X-100(Sigm-ldrich Co.) 25 μl로세포막을용해시켜분비된 lysosoml phosphtse에기질로서 100 mm p-nitrophenyl phosphte(sigm-ldrich Co.) 150 μl와 0.1 M citrte buffer 50 μl를첨가하여반응시켰다. 시료의마크로파지활성은반응 30분후 0.2 M borte buffer를가하여정지시키고 405 nm에서 ELIS reder(tecn, Grödingen, ustri) 로흡광도를측정하여 (24) sline 대조군에대한 phosphtse 활성을 reltive ctivity(%) 로나타내었다. 한편비장세포를이용한마이토젠활성은 BLB/c 마우스를경추탈구시킨후멸균적으로 spleen을적출하여마쇄하고 0.2% NCl로적혈구를용혈시킨후금속망 (#200) 으로여과하여 splenocyte를회수하여 RPMI로 3회세척한다음 cells/ml로세포현탁액을조제하였다. 비장세포현탁액은 96-well plte에 90 μl씩분주하고적당한농도로희석한시료 10 μl를첨가하여 48시간동안 5% CO 2 배양기에서배양하였으며, 시료의마이토젠활성은 10배희석한 EZ-Cytox 용액을사용한 WST ssy(25) 를통해측정하여비장세포증식도에대한 reltive ctivity(%) 로나타내었다. 또한 Peyer's ptch를경유한장관면역활성은 Yu 등의방법 (26) 을이용하여측정하였는데, C3H/He 마우스복부를절개하여소장벽위의 Peyer's ptch를적출한후마쇄하고

4 490 신지영 김훈 김동구 백길훈 정헌상 유광원 금속망 (#200) 으로여과하여 Peyer's ptch 세포액으로조제하였다. 세포현탁액은 10% FBS-RPMI로세척하여 cells/ml의세포농도로조정한후 96-well plte에 180 μl씩분주하고적당히희석된시료를 20 μl 첨가하여 5일간배양하고상등액 (conditioned medium) 만을회수하여골수세포증식실험에사용하였다. 골수세포는동일마우스의대퇴부뼈에서회수한다음여과, 세척하고 cells/ml로조정하여 100 μl씩 well에분주하고 conditioned medium을 50 μl씩첨가하여 6일간재배양하였다. 시료의 Peyer's ptch를경유한장관면역활성은배양액에 EZ-Cytox 용액 10 μl를첨가하고 6시간반응시킨후 450 nm에서흡광도를측정하여 sline 대조군의골수세포증식도에대한 reltive ctivity(%) 로표시하였다. Nitric oxide 생성억제활성 3종의버섯및 2종의균사체-고체발효커피생두의배전과분쇄로조제된원두커피의열수및에탄올추출물의 nitric oxide(no) 의생성억제능을측정하기위해먼저시료의독성여부를 EZ-Cytox 용액을사용하여확인하고 (25) sline 대조군에대한세포생존율 (%) 로표시하였다. 한편 NO 생성억제능은 RW cell을 10% FBS-DMEM에서 cells/ml로조정하여 96-well plte에 200 μl씩분주한다음 5% CO 2 incubtor에서배양하여세포를부착시켰다. 12시간뒤배양액을모두제거하고새로운 10% FBS-DMEM 160 μl와시료 20 μl를함께첨가하고 30분후에 LPS(1 μg/ml) 를처리하여 24시간동안배양하였다. LPS로유도된 NO의측정은세포배양상등액을 50 μl 취하여 Griess 시약반응법 (27) 을이용하여측정하고 LPS처리군에대한억제율 (%) 로나타내었다. HPLC 를이용한카페인및클로로겐산함량분석커피에는다양한생리활성을나타내는화합물이많이존재한다고이미잘알려져있으며, 진균류균사체를통한커피생두의고체발효과정동안이들성분들간에도다양한변화가일어날것으로예측하고이들성분의변화를확인하기위하여대표적인생리활성성분인카페인과클로로겐산을 HPLC system(yl Instrument Co. Ltd., nyng, Kore) 으로분석하였다. 생리활성성분분석을위한장치로는 YL quternry pump(yl Instrument Co. Ltd.) 와 YL-9120 UV/Vis detector(yl Instrument Co. Ltd.) 를이용하였으며, 분석칼럼은 Phenomenex(Torrnce, C, US) 의 Lun 5μ C18을사용하였다. 이동상은 1% cetic cid(j.t. Bker, Phillipsburg, NJ, US) 와 cetonitrile(burdick&jckson, Muskegon, MI, US) 을 1.0 ml/min의유속으로사용하였으며, grdient 조건은 1% cetic cid와 cetonitrile을 0분에서 40분까지 92 : 8에서 73 :27의비율로변화시켰고, 40분부터 45분까지는 73 : 27을다시 92 : 8로변화시켰다. UV detector 의파장은 280 nm를사용하였으며시료의주입량은 20 μl로 하였고, 각각의표준물질을 10~1,000 ppm으로분석하여검량선을작성한후진균류균사체-고체발효원두커피열수추출물의카페인및클로로겐산의함량 (μg/ml) 을도출하였다. 통계처리실험결과에대한통계분석은 SPSS 통계프로그램 (Sttisticl Pckge for the Socil Science, Ver. 12.0, SPSS Inc., Chicgo, IL, US) 을이용하여실험결과의평균과표준편차를산출하고평균치 ±SD로나타내었으며, 분산분석 (NOV) 을실시한후각측정값간의유의성을 Duncn's multiple rnge test로검증하였다. 결과및고찰고체발효커피생두로조제된원두커피의용매추출물제조커피생두의기능성을증진시키기위하여식품으로사용이허가된진균류중버섯균사체 3종 (PL, HE 및 GL) 과홍국균균사체 2종 (MP 및 MR) 의고체발효를이용하였다. 커피생두는국내에서많이유통되고있는대중적품종중하나인인도네시아산 Mndheling 커피생두 (green coffee ben, CB) 를사용하였다. 5종진균류균사체-고체발효 Mndheling 커피생두 (PL-CB, HE-CB, GL-CB, MP-CB 및 MR-CB) 는물로침지및가압멸균한커피생두에종균 10% 를접종하고 10일동안배양하여조제하였다 (Tble 1). 다음으로중배전을통해원두커피로조제한후원두커피열수추출물 (PL-CB-HW, HE-CB-HW, GL-CB-HW, MP-CB-HW와 MR-CB-HW) 및에탄올추출물 (PL-CB-EE, HE-CB-EE, GL-CB-EE, MP-CB-EE와 MR-CB-EE) 로조제하였으며, 시료대조군인비발효-원두커피의열수추출물 (CB-HW) 과에탄올추출물 (CB-EE) 도조제하였다. Tble 1에서나타낸바와같이수율은시료대조군인비발효-커피생두로부터조제된원두커피추출물이열수에서 25.3% 와에탄올추출물에서 10.3% 를나타내었다. 한편진균류균사체-고체발효커피생두의경우에는 2종홍국균균사체-고체발효커피생두의원두커피가 3종버섯균사체의원두커피에비해열수추출물에서는 2.1~4.5%, 에탄올추출물의경우에도 0.3~2.5% 가량수율이높은것으로나타났는데, 이러한수율에서의차이는균사체의증식과도연관이있는것으로사료되었다. 즉 Tble 1의하단사진에서제시한것처럼 5종균사체의증식을육안으로관찰한결과, 균사체의종류에따라증식속도는상이하게다르겠지만동일한배양시간 (10일) 동안홍국균균사체-고체발효커피생두가버섯균사체-고체발효커피생두보다월등히높은증식을나타내고있음을확인할수있었기때문이다. 진균류균사체-고체발효원두커피용매추출물의항산화성분및활성 3종버섯및 2종홍국균균사체를이용하여제조한균사체

5 진균류균사체 - 고체발효원두커피의생리활성 491 Tble 1. ntioxidnt component contents nd ntioxidnt ctivities of hot-wter or ethnolic extrcts from rosted coffee of fermented green coffee bens with mushrooms or molds myceli by solid-stte culture Extrct 1) Totl polyphenol (mg TE/100 mg) Totl flvonoid (mg QE/100 mg) DPPH rdicl scvenging (mg EC/100 mg) Yield (%) 2) HW EE HW EE HW EE HW EE Non-fermented coffee CB 1.44±0.44 b3) 1.56±0.04 d 0.22± ±0.05 b 14.84±0.27 c 16.78±0.44 d Fermented coffee PL-CB HE-CB GL-CB MP-CB MR-CB 1.37±0.03 b 1.63±0.04 c 1.20± ±0.09 d 1.79±0.02 d 1.34±0.03 b 1.51±0.06 cd 1.18± ±0.06 bc 1.47±0.09 cd 0.27±0.02 b 0.33±0.02 c 0.23±0.03 b 0.40±0.02 d 0.40±0.03 d 0.25±0.02 b 0.28±0.03 b 0.20± ±0.03 b 0.27±0.03 b 12.75±0.42 b 14.98±0.82 c 10.08± ±0.64 d 18.24±0.66 d 13.04±0.81 b 14.77±0.86 c 11.04± ±0.63 b 13.22±0.56 b TE, tnnic cid equivlents; QE, quercetin equivlents; EC, scorbic cid equivlent ntioxidnt cpcity. 1) CB, rosted coffee from non-fermented Indonesin Mndheling green coffee ben; PL-CB/HE-CB/GL-CB/MP-CB/MR-CB, rosted coffee from fermented green coffee ben with 3 mushroom myceli (PL, P. linteus; HE, H. erinceum or GL, G. lucidum) or 2 molds myceli (MP, M. purpureus or MR, M. ruber) for 10 dys, respectively. 2) Yield (w/w%) ginst rw mterils. 3) Results re expressed s men±sd of qudruplicte smples, nd the different superscript is significntly different (p<0.05) in ech column <PL-CB> <HE-CG> <GL-CB> <MP-CB> <MR-CB> -고체발효커피생두로부터중배전을통하여조제한원두커피의열수및에탄올추출물에대한총폴리페놀과플라보노이드함량및 DPPH 자유라디칼소거능은 Tble 1과같이나타내었다. 먼저버섯균사체의경우, 열수추출물에서는노루궁뎅이버섯균사체-고체발효열수추출물 (HE-CB-HW) 만이시료대조군인비발효-원두커피열수추출물 (CB-HW) 에비해유의적으로높은총폴리페놀함량을나타내었으며, 플라보노이드함량에서는 3종의버섯균사체-고체발효열수추출물모두 CB-HW보다유사하거나약간높은경향을확인할수있었다. 그러나 DPPH 라디칼소거능에서는대조군인 HE-CB-HW보다유의적으로증가된활성을나타내지는않았다. 한편, 에탄올추출물에서는총폴리페놀과플라보노이드함량및 DPPH 자유라디칼소거능모두시료대조군인 CB-EE에비해 3종의버섯균사체-고체발효열수추출물이모두낮은활성을나타내었다. 그러나 2종홍국균균사체 -고체발효원두커피열수추출물인 MP-CB-HW와 MR-CB -HW는시료대조군인비발효-원두커피또는 3종의버섯균사체-고체발효원두커피열수추출물에비해서항산화성분중총폴리페놀함량에서는 CB-HW에비해 1.2배, 플라보노이드함량에서는 1.8배의유의적으로증가된함량을나타내었으며 DPPH 자유라디칼소거능도 CB-HW보다 1.2배의유의적인활성의증진을확인할수있었다 (Tble 1). 그러나에탄올추출물에서는 2종의홍국균-고체발효원두커피열수추출물인 MP-CB-EE와 MR-CB-EE가시료대조군인비발 효-원두커피에탄올추출물인 CB-EE와유사한총폴리페놀 (0.9배) 과플라보노이드함량 (0.9~1.0배) 을보이거나다소저하된 DPPH 자유라디칼소거능 (0.8배) 을나타내었다 (Tble 1). 이러한결과로부터진균류중홍국균에의한커피생두의고체발효는비발효-커피생두또는버섯균사체-고체발효보다항산화성분과활성을증진시키는것으로확인되었으며, 감소된수율 (CB-HW, 25.3%; MP-CB-HW, 22.2 %; MR-CB-HW, 23.1%) 에도불구하고항산화활성이증진된효과를나타낸것으로미루어홍국균균사체발효과정중커피생두에서다양한물질로부터항산화관련성분으로의전환가능성이일어나고있음을나타내는것으로확인되었다. 진균류균사체-고체발효원두커피용매추출물의면역활성면역활성을측정하기위해 3종의버섯및 2종의홍국균균사체-고체발효원두커피열수및에탄올추출물은모두증류수에일정농도로용해시켜사용하였다. 마크로파지, 마이토젠및장관면역활성등의면역활성에서에탄올추출물은열수추출물에비해대체적으로낮은활성을나타냄으로써에탄올추출물의저분자보다는물에추출되는고분자물질이주로면역활성에관여하는것으로관찰되었다. 일반적으로면역활성을자극하는활성성분, 즉다당류또는단백다당등의고분자화합물은저분자가용출되는에탄올추출물보다물추출물에포함되는보고 (28) 와도일치되는결과를나타내었다. 마크로파지증식활성은 Fig. 1와같이나타내었

6 492 신지영 김훈 김동구 백길훈 정헌상 유광원 ) Mcrophge ctivity Reltive ctivity (%) BC B) Mitogenic ctivity Reltive ctivity (%) c CB PL-CB HE-CB GL-CB MP-CB MR-CB B b B B Smple (100 μg/ml) b B b BC CB PL-CB HE-CB GL-CB MP-CB MR-CB b Smple (100 μg/ml) C) Intestinl immune system modulting ctivity through Peyer s ptch Reltive ctivity (%) CB PL-CB HE-CB GL-CB MP-CB MR-CB Smple (100 μg/ml) Fig. 1. Immunostimulting ctivities of hot-wter or ethnolic extrcts from rosted coffee of fermented green coffee bens with mushrooms or molds myceli by solid-stte culture. Finl concentrtion of smple is 100 μg/ml. CB, rosted coffee from non-fermented Indonesin Mndheling green coffee ben; PL-CB/HE-CB/GL-CB/MP-CB/MR-CB, rosted coffee from fermented green coffee ben with 3 mushroom myceli (PL, P. linteus; HE, H. erinceum or GL, G. lucidum) or 2 molds myceli (MP, M. purpureus or MR, M. ruber) for 10 dys, respectively., hot-wter extrct;, ethnolic extrct. Results re expressed s men±sd of qudruplicte smples, nd the different letters (smll letters, hot-wter extrcts; lrge letters, ethnolic extrcts) re significntly different (p<0.05) in ech ctivity. 는데, 시료농도 100 μg/ml에서시료대조군인비발효-원두커피열수추출물 (CB-HW) 과 3종의버섯균사체-고체발효원두커피열수추출물인 PL-CB-HW, HE-CB-HW 및 GL- CB-HW는유사한활성 (0.9~1.0배) 을나타낸반면, 2종의 c c b d B D 홍국균균사체-고체발효원두커피열수추출물인 MP-CB- HW와 MR-CB-HW는각각 CB-HW에비해 1.18배와 1.32 배의유의적으로증가된활성을나타내었다. 에탄올추출물에서는전체적으로열수추출물에비해낮은활성 (CB-HW 에비해 0.73~0.90배 ) 을나타내었으며, 열수추출물에서가장높은활성을나타낸 2종의홍국균균사체-고체발효원두커피의경우에도에탄올추출물 (MP-CB-EE 및 MR-CB-EE) 에서는 CB-HW에비해 0.79~0.83의활성만을나타내었다 (Fig. 1). 비장세포의마이토젠활성결과에서도이러한경향은더욱두드러졌는데, 마크로파지활성과마찬가지로시료농도 100 μg/ml에서시료대조군인비발효-원두커피열수추출물 (CB-HW) 과비교하여 2종의홍국균균사체-고체발효원두커피열수추출물 (MP-CB-HW 및 MR-CB-HW) 은 CB- HW의 1.35와 1.40배로유의적인증가활성을나타내었다 (Fig. 1B). 그러나 3종의버섯균사체-고체발효원두커피열수추출물 (PL-CB-HW, HE-CB-HW 및 GL-CB-HW) 은마크로파지활성에서와마찬가지로시료대조군인 CB-HW 와유의적인차이 (1.00~1.02배) 를나타내지않았다. 한편장관면역활성결과에서는 Fig. 1C에서나타낸바와같이 3종의버섯및 2종의홍국균균사체-고체발효원두커피열수추출물또는에탄올추출물이시료대조군인비발효-원두커피및비발효-발아원두커피열수또는에탄올추출물과유의적인활성차이를나타내지않았다. 진균류균사체-고체발효원두커피의 LPS 로유도된 RW 세포의 nitric oxide 생산억제활성그람음성균의세포외막구성성분인 lipopolyscchride (LPS) 에의해자극받은단구또는대식세포에서 inducible nitric oxide synthse(inos) 또는 cyclooxygense 2(COX- 2) 와같은 pro-inflmmtory enzyme에의해과발현된 nitric oxide(no) 와 prostglndins(pg) 는류마티스관절염, 다발성경화증, 알츠하이머병, 패혈성쇼크등의자가면역질환을야기한다고보고되고있다 (29,30). NO의합성경로중 inos에의한 NO 생성은자극에의해지속적으로대량생산이유도됨으로써염증반응에기여하게되는데, 세균의내독소 (endotoxin) 로알려진 LPS를마크로파지에처리하게되면염증성 cytokine, NO와같은매개물질이생성되어병리적인반응이유발되어진다고알려져있다 (31). 3종의버섯및 2종의홍국균균사체-고체발효원두커피열수및에탄올추출물의 LPS 자극에의한 RW 세포주에대한 nitric oxide(no) 억제활성을검토하기위하여먼저시료의 RW 세포주에대한독성을검토한결과 (Tble 2), 100 μg/ml의농도에서는에탄올추출물의경우 sline 대조군과유의적인차이를보이지않거나열수추출물에서는 95% 이상의높은생존율을나타내었다. 그러나 500 μg/ml로시료농도가높아진경우에는 CB와 PL-CB의열수추출물에서 95% 이하의유의적인생존율을나타냄으로

7 진균류균사체 - 고체발효원두커피의생리활성 493 Extrct 1) Tble 2. RW cell vibility of hot-wter or ethnolic extrcts from rosted coffee of fermented green coffee bens with mushrooms or molds myceli by solid-stte culture Hot-wter extrct Ethnolic extrct Cell vibility (% of control) 2) 100 μg/ml 500 μg/ml 100 μg/ml 500 μg/ml Control 100±0.87 bd 100±4.42 Non-fermented coffee CB 95.51± ± ± ±3.21 Fermented coffee PL-CB HE-CB GL-CB MP-CB MR-CB 95.78± ± ±0.73 b 99.86±0.69 b ±0.42 c 94.61± ±1.94 B 97.89±0.97 CD 96.20±0.62 BC 97.32±0.90 BC 95.74± ± ± ± ± ± ± ± ± ±2.88 1) Extrcts refer to Tble 1, nd control is only sline without ny extrct. 2) Cell vibility (%)=(bsorbnce of smple/bsorbnce of sline control) ) Results re expressed s men±sd of qudruplicte smples, nd different superscript (smll letters, 100 μg/ml; lrge letters, 500 μg/ml) is significntly different (p<0.05) in ech ctivity. 써 RW 세포주에대한 NO 억제활성을측정하기위한열수및에탄올추출물의농도는독성이발휘되지않는수준인 100 μg/ml의농도에서진행하였다 (Tble 2). LPS로유도된 RW 세포에대한 NO 생성억제활성을측정한결과, 열수추출물의경우가장높은억제능을나타낸 MR-CB-HW에서 LPS 자극군의 29.9% 의 NO 생성을억제하였으나, 이는시료대조군인비발효-원두커피열수추출물인 CB-HW(22.6% 억제 ) 와비교하여유의적인차이를나타내지는않았다 (Fig. 2). 그러나에탄올추출물에서는 2종의홍국균-고체발효원두커피에탄올추출물인 MP-CB- EE와 MR-CB-EE에서각각 38.6과 37.0% 의억제효과를나타내어, 시료대조군인 CB-EE( 각각 27.4% 및 23.3% 억제 ) 와비교하여유의적으로높은억제활성을확인할수있었다 (Fig. 2). 이러한결과로부터염증성분자인 NO의억제활성은면역활성과달리저분자가주로포함되어있다고사료되 Nitric oxide (μm) , d,e sline LPS CB PL-CB HE-CB GL-CB MP-CB MR-CB Control D bccd bc D bc c bc BCD Smple (100 μg/ml) B b BC Fig. 2. Inhibitory effects of hot-wter or ethnolic extrcts from rosted coffee of fermented green coffee bens with mushrooms or molds myceli by solid-stte culture on nitric oxide (NO) in LPS-stimulted RW murine mcrophge cell line. Extrcts refer to Fig. 1., only sline without smple or LPS;, only LPS (from Escherichi coli, 1 μg/ml) without smple;, hot-wter extrct;, ethnolic extrct. Results re expressed s men±sd of qudruplicte smples, nd vlues the different letters (smll letters, hot-wter extrcts; lrge letters, ethnolic extrcts) re significntly different (p< 0.05) in ech ctivity. 는에탄올추출물, 특히 MP-CB-EE와 MR-CB-EE에서증가됨을알수있었다. HPLC 를이용한카페인및클로로겐산의동시분석일반적으로미생물발효과정을통해기질내다양한물질이분해되고, 또새로운저분자화합물이생성된다고많은연구에서보고되어있다. 진균류균사체를통한고체발효과정에서나타나는활성성분들의변화를확인하기위해커피의대표적인수용성생리활성성분인카페인과클로로겐산을분석하기로하였다. 이들성분들은이미많은연구를통하여추출법및분석법이확립되어있다 (32-35). 본연구에서는자체동시분석법을개발하여분석을진행하였으며위성분들이물에용해되는수용성성분으로알려져있기때문에 (36) 분석은열수추출물로만진행하였다. 먼저 xnthine 유도체중의하나로인체내신경전달체계를자극하여각성, 강심및이뇨작용 (37) 등의생리활성을나타내는카페인의경우 Fig. 3에서나타낸바와같이 5종의진균류균사체-고체발효원두커피열수추출물에서비발효원두커피열수추출물과비교하여모두변화가거의없는것으로나타났다 (44.28~55,46 μg/ml). 카페인은다량으로섭취시정서불안, 신경과민, 수면장애및위장장애등의카페인중독증 (cffeinism) 과함께 (11), 최근관상동맥질환을발생시킬수있다는연구 (12,13) 등의부정적인연구결과가발표되고있는데, 본연구결과를통해진균류균사체를이용한고체발효커피의경우발효과정동안카페인을분해시키거나합성시키지는않는것으로사료될수있다. 한편커피내의대표적인폴리페놀화합물로서항산화활성 (38,39) 을비롯하여항염증 (40), 항암 (41) 및항지질대사활성 (42) 등의다양한약리작용에관여하는클로로겐산의경우, 3종의버섯균사체-고체발효원두커피에서는비발효원두커피 (39.13 μg/ml) 에비해감소하는경향을나타내었으나 (9.44~32.23 μg/ml), 2종의홍국균균사체-고체발효원두커피에서는유의적으로증가한결과를나타내었다 (MP- CB-HW, 76.21; MR-CB-HW, μg/ml)(fig. 3). 최근

8 494 신지영 김훈 김동구 백길훈 정헌상 유광원 Concentrtion (μg/ml) CB-HW PL-CB- HW HE-CB- HW GL-CB- HW MP-CB- HW MR-CB- HW Fig. 3. Cffeine nd chlorogenic cid concentrtions of hotwter extrcts from rosted coffee of fermented green coffee bens with mushrooms or molds myceli by solid-stte culture. Extrcts refer to Fig. 1., cffeine concentrtions;, chlorogenic cid concentrtions. 커피에서추출및정제된클로로겐산이 Svetol 및 GC라는이름으로상품화되었으며, 식품첨가물로다양하게유통되고있는것을감안할때본연구에서나타난바와같이비발효원두커피에비해클로로겐산이약 2배정도증가된홍국균균사체-고체발효원두커피는산업화에도매우긍정적일것이라사료된다. 결론적으로홍국균균사체를이용한고체발효-원두커피는비발효일반원두커피에비해서항산화, 면역및 NO 생성을억제하는항염증활성을증가시켰으며, 항산화및면역활성에는고분자물질이, 염증유발성분인산화질소 (NO) 의억제활성에는저분자성분이관여하고있음을확인할수있었다. 또한홍국균균사체-고체발효원두커피는카페인함량은변화시키지않은채중요한생리활성에관여하는클로로겐산의함량을유의적으로증가시켰다. 현재커피는대중적으로맛과향이중요한기호식품으로만이주로이용되고있지만, 홍국균균사체를이용한고체발효원두커피는식품외기능성소재등의다양한소재로이용가능할것으로사료된다. 한편, 본연구에서가장우수한효과를나타낸홍국균에는 zphilone 색소류 (monscin, nkflvin, rubropucttin, monscorbiurin, rubropunctmine 및 monscorburmine) 에의한항염증작용, γ-minobutyric cid의신경전달및혈압강하효과, dimerumic cid, tnnin, phenol 및 unsturted ftty cids 등에의한항산화작용등다양한생리활성이이미보고되어있으므로 (43-47), 홍국균균사체의단순한첨가에의한커피의생리활성증진이아니라발효과정에의해균사체의생물학적전환이유도되었음을명백히밝히기위해서는활성획분의정제및구조동정등이수반되어야할것이다. 또한다양한생리활성의추가연구로기존커피에서문제가되고있는카페인중독증 (cffeinism) 및대사질환억제활성등과관련된추가적인연구또한필요할것으로사료된다. 요 커피의생리활성을증진시키기위해고체발효를이용하여인도네시아산 Mndheling 커피생두에 3종의버섯균사체 (Phellinus linteus, PL; Hericium erinceum, HE; Gnoderm lucidum, GL) 및 2종의홍국균균사체 (Monscus purpureus, MP; Monscus ruber, MR) 를배양하였다. 균사체-고체발효커피생두를로스팅하여얻은원두커피는 decoction법에의한열수추출물과 reflux에의한에탄올추출물로조제하였는데, 열수추출물 (HW, 수율 17.7~25.3%) 은에탄올추출물 (EE, 9.5~12.2%) 보다더높은수율을나타내었다. 2종의홍국균균사체-고체발효커피생두로부터조제된원두커피열수추출물 (MP-CB-HW, MR-CB-HW) 은비발효원두커피또는 3종버섯균사체-고체발효원두커피열수추출물보다높은총폴리페놀및플라보노이드함량과 DPPH 자유라디칼소거능을나타내었다. 또한, 홍국균균사 체-고체발효원두커피중에서도 MR-CB-HW는가장높은마크로파지활성과마이토젠활성을나타내었다 (CB-HW의 1.32배와 1.40배 ). MP-CB-EE와 MR-CB-EE는 100 μg/ml 의시료농도에서세포에대한독성을나타내지않으면서도 LPS로유도된 RW 세포의산화질소 (NO) 의생성을효과적으로억제하였다 (LPS 처리군의 38.6과 37.0%). 한편, 홍국균균사체를이용한고체발효는카페인함량에영향을주지않으면서클로로겐산을유의적으로증가시켰다 (76.21 ~76.73 μg/ml). 결론적으로원두커피의생리활성은 M. purpureus 또는 M. ruber와커피생두의고체발효에의해서증진되었으며이러한결과는홍국균-고체발효원두커피가기능성커피음료의소재로이용될가능성을제시하는것으로사료된다. 약 감사의글 본논문은 2012년도중소기업청기술혁신과제 ( 농공상융합형기술개발사업, 과제번호 S114110) 의지원에의하여수행된것으로이에감사드립니다. 문 1. Brezová V, Šlebodová, Stško Coffee s source of ntioxidnts: n EPR study. Food Chem 114: Esquivel P, Jiménez VM Functionl properties of coffee nd coffee by-products. Food Res Int 46: Chu YF, Brown PH, Lyle BJ, Chen Y, Blck RM, Willims CE, Lin YC, Hsu CW, Cheng IH Rosted coffees high in lipophilic ntioxidnts nd chlorogenic cid lctones re more neuroprotective thn green coffees. J gric Food Chem 57: Eskelinen MH, Ngndu T, Tuomilehto J, Soininen H, Kivipelto M Midlife coffee nd te drinking nd the risk of lte-life dementi: popultion-bsed CIDE study. J lzheimers Dis 16: 헌

9 진균류균사체 - 고체발효원두커피의생리활성 Hu G, Bidel S, Jousilhti P, ntikinen R, Tuomilehto J Coffee nd te consumption nd the risk of Prkinson's disese. Mov Disord 22: Chu YF, Chen Y, Blck RM, Brown PH, Lyle BJ, Liu RH, Ou B Type 2 dibetes-relted bioctivities of coffee: ssessment of ntioxidnt ctivity, NF-κB inhibition, nd stimultion of glucose uptke. Food Chem 124: Choi EY, Jng JY, Cho YO Coffee intke cn promote ctivity of ntioxidnt enzymes with incresing MD level nd decresing HDL-cholesterol in physiclly trined rts. Nutr Res Prct 4: Chou T Wke up nd smell the coffee. Cffeine, coffee nd the medicl consequences. West J Med 157: Kltsky L, Morton C, Udltsov N, Friedmn GD Coffee, cirrhosis, nd trnsminse enzymes. rch Intern Med 166: Lopez-Grci E, vn Dm RM, Willett WC, Rimm EB, Mnson JE, Stmpfer MJ, Rexrode KM, Hu FB Coffee consumption nd coronry hert disese in men nd women: prospective cohort study. Circultion 113: Mcky DC, Rollins JW Cffeine nd cffeinism. 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