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1 Journal of Korean Medicine Rehabilitation Vol. 24 No. 3, July 2014 pissn eissn Original Article 정훈 이현재 김빛나라 이치호 이은정 허동석 오민석대전대학교한의과대학한방재활의학과교실 The Effects of Sibjeondaebotanggamibang on the Treating of Wound Hoon Jung, K.M.D., Hyun-Jae Lee, K.M.D., Binnara Kim, K.M.D., Chi-Ho Lee, K.M.D., Eun-Jung Lee, K.M.D., Dong-Seok Heo, Ph.D., Min-Seok Oh, K.M.D. Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Dae-Jeon University RECEIVED June 16, 2014 REVISED July 1, 2014 ACCEPTED July 14, 2014 CORRESPONDING TO Min-Seok Oh, Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Dae-Jeon University, 1136 Dunsan-dong, Seo-gu, Daejeon , Korea TEL (042) FAX (042) Copyright 2014 The Society of Korean Medicine Rehabilitation Objectives This study was aimed to investigate the effects of Sibjeondaebotanggamibang (SJT) on the wound-induced rats. Methods <In vitro> It was observed the effects of anti-oxidation and anti-inflammation by using of lipopolysaccharide (LPS)-treated RAW cells. For the observing on SJT anti-oxidation, it needed to mesure the total amount of polyphenol, DPPH scavenging ability, ABTS scavenging ability and the value of ROS production. In order to observe on the anti-inflammation of SJT, it was mesured the value of No and Cytokine (TNF-α, IL-1β, IL-6). <In vivo> It needed to make a scar (around 2x2 cm 2 ) on the top of the fascia in the back of the rats and then the rats were divided into 4 groups (n=6). Control group was not treated at all, whereas SJ group was orally medicated SJT, Terra group was percutaneously applied Terramycin, and SJ+Terra group was both orally medicated SJT and percutaneously applied Terramycin per day for three weeks. The size of wound was measured with Digimatic Caliper and the blood samples (WBC, neutrophil, monocyte, lymphocyte) were analyzed using Minos-ST, which were collected by cardiac puncture. The effect on inflammatory cytokine (TNF-α, IL-1β, IL-6), immunological cells in synovial fluid was measured. To measure the wound factor expressed by wounded skin sample, we extracted RNA and to investigate MMP-1,2,9 we used RT-PCR. For performing histopathological examinations, we paralyzed the rats by ether, and extracted wounded skin tissues, which were measured by H & E, and monitored on the optical microscope. Results <In vitro> 1. DPPH and ABTS scavenging activity of SJT was increased concentration-dependantly, and ROS scavenging activity was significantly increased (10, 100 μg/ ml). 2. NO production was significantly reduced in SJT treated cells (100 μg/ml), both TNF-α and IL-6 in SJT treated cells (1, 10, 100 μg/ml), and IL-1β in SJT treated cells (1, 100 μg/ml). <In vivo> 1. The size of wound was significantly decreasing in SJ group, Terra group, SJ+Terra group. 2. WBC was significantly reduced in SJ and SJ+Terra group, monocyte in SJ+Terra group. Neutrophil was also reduced in SJ, SJ+Terra group but meaningless. 3. TNF-α and IL-6 were significantly reduced in SJ group, Terra group, SJ+Terra group, and IL-1β in SJ+Terra group. 4. mrna expression in MMP-1 was significantly reduced in SJ group. 5. Collegan production and chronic inflammation were significantly decreased in SJ group, Terra group, SJ+Terra groups. Re-epithelization on the skin in Terra group, SJ+Terra groups was decreased. Conclusions According to this in vitro experiment, Sibjeondaebotanggamibang (SJT) has the effects of anti-oxidative and anti-inflammatory. By in vivo experiment, SJT has the effects of anti-inflammatory. Moreover, the progress of recovery was found visually, heamatologically, genetically and histopathologically. In conclusion, it could be thought that SJT has effect on the treating of wound. (J Korean Med Rehab 2014;24(3):51-69) Key words Sibjeondaebotang, Shi Quan Da Bu Tang, Anti-inflammation, Anti-oxidation, Treating of wound 51

2 정훈 이현재 김빛나라 이치호 이은정 허동석 오민석 서론»»» 신체조직의치유는신호전달단백질에의해조절되는여러가지다양한생화학적, 생물기계적, 세포적, 호르몬적, 병리적기전들에의해서조절된다 1,2). 창상이란세포학적또는해부학적연속성이파괴된상태를말하며, 창상치유란세포가재생, 분화, 증식되어그연속성을다시유지하는것을말한다 3). 창상의한의학적분류는농의형성시기에따라初期, 成膿, 潰後의 3단계로분류하는데치료법칙도여기에따라서消, 托, 補의 3가지의기본법칙으로분류된다 4). 창상의치유는生肌작용으로生肌란肌肉의瘡癰에서腐肉이없어지고新肉이생기는과정을뜻한다 5). 창상치유에대한연구는스테로이드 6), 항생제 7), 연고제 8), 방사선조사 9), 레이저광선 10), 초음파 11) 등다양한방면으로진행되고있으며, 한의학분야에서는연고제 12) 와좌욕제 13) 를이용한창상치유효과및四君子湯 14), 十全大補湯 15), 紫雲膏 16) 등을이용한生肌作用에대한논문이발표되고있다. 창상치유에대한처방중十全大補湯은 太平惠民和劑局方 에최초로수록되었는데이는氣血을보하는八物湯에黃芪, 肉桂를加味하여만든처방으로氣血이久衰하고陰陽이病弱한것을치료하는처방이다 17,18). 이는창상의三大治法중補法에해당되는처방으로, 신 15) 은모세혈관투과성, 육아종형성및섬유아세포의증식능에대한실험에서十全大補湯의生肌作用에관한유의성있는결과를보고하였다. 최근창상치유효과를위한실험들이 in vivo 및 in vitro의방법으로이루어지고있는데 19-21) 十全大補湯의 in vivo 실험에대한연구는접하기어려운실정으로, 창상치유에대한十全大補湯의효능을실험적으로조명해보는것은의미있는일이라생각된다. 이에저자는十全大補湯에淸熱解毒, 凉散風熱하여癰腫疔瘡을치료하는外科의聖藥인金銀花 22) 를加味하고益衛固表, 托毒生肌하여皮膚水腫과膿成不潰혹은潰久不斂등피부질환에특효가있는黃芪 22) 의양을증량한十全大補湯加味方을제조하여 in vitro 실험으로항산화효과, 항염증효능을관찰하였다. 또한 in vivo 실험을위해창상이유발된 rat의자연치유군과십전대보탕복용군, 테라마이신도포군, 십전대보탕과테라마이신의동시처치군으로나눠창상면적측정, 혈액학적검사및 Cytokine 측정, MMP1,2,9 유전자발현측정및병리조직학적변화를관찰하여유의한결과를얻었기에보고하는바이다. 재료및방법»»» 1. 재료 1) 세포 실험에사용된세포는 RAW 세포로서한국세포주은행 ( 서울, 한국 ) 에서구입하여사용하였다. 2) 동물 실험에사용된동물은수컷 6주령의 Wistar rat (170~200 g) 를오리엔트바이오 ( 성남, 한국 ) 에서구입하여사용하였고, 동물은실험당일까지퓨리나 ( 성남, 한국 ) 에서구입한고형사료와물을충분히공급하고, 자유식이하면서온도 22±2 o C, 습도 55±15%, 12시간 (light-dark cycle) 의환경에서 1주간적응시킨후실험에사용하였다. 본연구는 OO대학교동물실험윤리위원회의승인을받아동물윤리준칙에의거하여진행되었다 ( 승인번호 : DJUARB ). 일반사료의kg당조성내용과분량은다음과같다 (Table I). 3) 약재 실험에사용한十全大補湯加味方은 方藥合編 23) 에근거하였으며, 金銀花는 12 g을加味하고黃芪는 4배양인 16 g을增量하여처방하였다. 약재는 ( 주 ) 옴니허브 ( 대구, 한국 ) 에서구입하였고, 대전대학교지역혁신센터난치성 Table I. The Components of Normal Diet Components Percentage (%) Crude protein 20.0 Crude fat 4.5 Crude fiber 6.0 Crude calcium oxide 7.0 Calcium 0.5 Phosphorus 1.0 Total amount J Korean Med Rehab 2014;24(3):51-69

3 Table II. The Compositions of Sipjeondaebotanggamibang (SJT) Herbal medicine name Pharmacognostic name Amount (g) 黃芪 Astragali Radix 16.0 金銀花 Lonicerae Flos 12.0 甘草 Glycyrrhizae Radix et Rhizoma 5.0 白茯苓 Hoelen 5.0 白芍藥 Paeoniae Radix 5.0 白朮 Atractylodis Rhizoma Alba 5.0 熟地黃 Rehmanniae Radix Preparata 5.0 人蔘 Ginseng Radix Alba 5.0 川芎 Cnidii Rhizoma 5.0 當歸 Angelicae Gigantis Radix 4.0 肉桂 Cinnamomi Cortex Spissus 4.0 Total amount 71.0 면역질환의동서생명의학연구센터 (TBRC) 에서정선후사용하였으며, 처방구성과용량 (1첩) 은다음과같다 (Table II). 4) 시약 본실험에사용된시약은 lipopolysaccharide ( 이하 LPS로표기 ), dimethyl sulfoxide (DMSO), 1,1-diphenyl- 2-picryl-hydrazyl (DPPH) 은 Sigma-Aldrich Co. (st. Louis, MO, USA) 에서, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배양액, Fetal Bovine Serum (FBS), Penicillin 및 Streptomycin은 Hyclone Co. (Logan, Ut, USA), Cell viability assay kit은 Daeillab service Co. ( 서울, 한국 ), Nitric oxide detection kit은 Intron Biotechnology Co. ( 수원, 한국 ) 에서구입하였다. 중금속분석을위한 HNO 3 는 Duksan 사 ( 안산, 한국 ) 에서, As, Pb, Hg, Cd standard solution은 SCP Science사 (Quebec, Canada) 에서구입하였고, Folin-Ciocalteu's phenol reagent는 Merck사 (Darmstadl, Germany) 에서, gallic acid와 sodium carbonate 는 Sigma-Aldrich 사 (St. Louis, MO, USA) 에서구입하였다. Cytokine Milliplex Map Immunoassay kit은 Millipore Co. (Bellerica, MA, USA) 에서, HPLC 분석에이용된 water와 acetonitrile 은 Ducksan Co. ( 안산, 한국 ) 에서, Rat IL-6, TNF-α, IL-1β Kit 은 R&D System 사 (Minneapolis, USA), total RNA purification kit는 GeneAll사 ( 서울, 한국 ) 에서, 주정은 ( 주 ) 주정판매월드 ( 전주, 한국 ) 에서구입하였다. 대조군에사용된테라마이신은 Pfizer 사 (Jakarta, indonesia) 에서구입하였다. 5) 기기본실험에사용된기기는 Rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan), Freeze dryer ( 일신바이오베이스, 한국 ), ELISA reader (Molecular Devices, USA), Luminex (Millipore Co., USA), HPLC (Shimadzu LC-20AD, Japan), HPLC column (ACE 5 C18, mm, 5μm), Flow cytometry system (BD Biosciences Immunocytometry Systems, USA), Light Microscope (Carl ZEISS, Germany), Digimatic Caliper은 Mitutoyo사 (Kawasaki, Japan), Milliplex analyst software ( 고마바이오텍, 서울, 한국 ), RT premix kit (Bioneer, 대전, 한국 ), 자동혈구측정기 (Melet schloesing, France), 유세포분석기 (BD bioscience, USA) 를사용하였다. 2. 방법 1) 시료추출十全大補湯加味方 2첩을 80% 주정 1 L에넣고 3시간환류추출후여과액을얻어 rotary vacuum evaporator 에서감압농축하였다. 농축된용액을 freeze dryer로동결건조하여 14.6 g의분말을얻었다 (Sipjeondaebotanggamibang 이하 SJT로표기 ). 얻어진분말은냉동고에서보관하며필요한농도로 3차증류수에희석하여사용하였다. 추출수율에따른한첩분량은 7.3 g이었다. 2) 중금속검사납, 비소, 카드뮴분석을위해 SJT 0.5 g을극초단파시료전처리장치전용용기에넣고질산 10 ml을넣은후, 용기를후드안에정치시켜발생가스를제거하고분해하였다. 분해가끝난다음분해액을여과지로여과하여용량플라스크에넣고물을넣어표준액의농도범위로희석하여검액으로하였다. 따로질산 10 ml를극초단파시료전처리장치전용용기에넣어검액조제와같은방법으로조작하여공시험액으로사용하였다. 준비된검액, 표준액및공시험액을가지고유도결합플라즈마분광계 (ICP) 를이용하여검량선을작성하고공시험액으로보정하여검액을측정하였다. 수은분석의경우 SJT 50 mg을수은분석기를이용하여측정하 53

4 정훈 이현재 김빛나라 이치호 이은정 허동석 오민석 였다. 3) HPLC 분석 SJT 30 mg을 80% 주정 1 ml에녹여 0.45 μm membrane filter로여과후이중 20 μl를 HPLC 시료로사용하였다. HPLC는 Shimadzu 사 (Kyoto, Japan) 의 system controller (CBM-20A), pump (LC-20AD), column oven (CTO-20A), diode array detector (SPD-M20A) 를사용하였으며, column 은 ZORBAX Eclipse Plus C18 ( mm, 5 μm) 을사용하였다. HPLC는 water(a) 와 acetonitrile(b) 로 gradient elution system 을적용시켜 0~5분 (0% B), 5~40분 (30% B), 40~60분 (80% B), 60~80분 (100% B) 로설정하였다. 유속은 1.0 ml/min이었으며 column 온도는 40 o C를유지하였고, UV wavelength 는 210 nm로설정하여분석하였다. 4) In vitro (1) 세포독성측정세포독성측정을위해 Raw 세포를 96 well plate에 10 4 cells/well 로분주하여 24시간동안배양하였다. 실험을하기전에새로운배양액으로교체하였고, SJ 및개별약재추출물을각각 1, 10, 100 (μg/ml) 의농도로처리하여다시 24시간동안배양하였다. 배양후 10 μl의 WST solution 을첨가하여배양기 (37 o C, 5% CO 2 ) 에서 30분간반응시켰다. 반응후 450 nm에서흡광도의변화를측정하여대조군에대한세포생존율을백분율로표시하였다. (2) 항산화활성측정 1 총폴리페놀함량측정총폴리페놀함량은 Folin-Ciocalteu 시약을이용하는방법으로측정하였다. 추출시료용액 1 ml에 50% Foiln- Ciocalteu's phenol reagent 0.5 ml를가하여실온에서 3 분간반응시켰다. 반응용액에 Na 2 CO 3 포화용액 1 ml와 7.5 ml 증류수를차례로혼합하여 30분간정치시킨뒤, 12,000 rpm에서 10분간원심분리한후상등액을취해 760 nm에서흡광도를측정하였다. 총폴리페놀함량은 gallic acid를표준물질로이용하여작성한검량선에따라함량을구하였으며측정단위로는 GAE (Gallic acid equivalent)/g을사용하였다. 2 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) 소거능측정 자유라디칼소거활성시험은안정한자유라디칼 DPPH 를사용하는방법으로주정에용해시킨 0.2 mm의 DPPH 용액 150 μl와 SJT (1, 10, 100, 1,000 ug/ml) 100 μl를각각혼합하고, 37 o C에서 30분간반응시킨후, 517 nm 에서흡광도를측정하였다. 대조군은시료액대신증류수을넣었으며, DPPH 용액대신주정을넣어보정값을얻었다. 자유라디칼소거율은아래의식에따라계산하였다. 소거율 (%)=( 대조군의흡광도 - 시료첨가군의흡광도 ) 100 대조군의흡광도 3 ABTS radical 소거능측정 ABTS assay 방법은기존에보고된방법을 96 well plate에맞게수정하여실시하였다. SJT는최종농도가 1, 10, 100, 1,000 (μg/ml) 의농도로될수있게희석시켰으며, ABTS 용액은 7.4 mm ABTS (2,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 와 2.6 mm potassium persulphate 를제조한후, 암소에하루동안방치하여양이온 (ABTS ㆍ +) 을형성시킨다음 734 nm에서흡광도를측정하여흡광도값이 1.5 이하가나오도록희석하고, 희석된 ABTSㆍ +. 용액 150 μl와 SJT를각각 5 μl 혼합하고, 실온에서 10분간반응시킨후, 734 nm에서흡광도를측정하였다. 항산화능은증류수를대조군으로하여대조군에대한 ABTS 라디칼소거능을백분율로나타내었다. 소거율 (%)=( 대조군의흡광도 - 시료첨가군의흡광도 ) 100 대조군의흡광도 4 세포내 ROS 생성측정 RAW 세포내에서 reactive oxygen species (ROS) 를측정하기위하여 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA) 를이용하였다. 12 well plate 에 Raw 세포를 cells/well 이되게분주하였다. 24시간동안배양한후여기에 LPS (1 μg/ml) 및 SJ 주정발효추출물 (1, 10, 100 μg/ml) 을각각의 well에첨가한후 24시간동안 37 o C, 5% CO 2 배양기에서배양한후 1,200 rpm에서 5분간원심분리하였다. 원심분리후모은세포를차가운 PBS로 2회세척한후, DCF-DA 10 μm이되도록첨가하여 15분동안빛이차단된상온에서염색하였다. 염색후차가운 PBS를넣어 1,200 rpm에서 5분간원심분리한다음상층액을제거하고, 다시 PBS 400 μl를부유시켜유세포분석기를이용하여형광강도의세기에 54 J Korean Med Rehab 2014;24(3):51-69

5 따른변화를분석하였다. (3) 항염증효능측정 1 Nitric oxide (NO) 측정 NO의농도는배양액내의 nitrite 농도를 Griess Reagent 방법으로측정하였다. RAW 세포는 96 well plates에 cells/well 로분주하여 24시간동안배양한후 SJT (1, 10, 100 μg/ml) 를처리하고, LPS (1 μg/ ml) 로처리하여다시 24시간동안배양하였다. N1 buffer 50 μl를각 well에처리한후 10분간상온에서암소반응후, N1 buffer 50 μl를처리한것에 N2 buffer 50 μl 를각 well에처리하고 10분간반응시킨후, 540 nm에서흡광도를측정하였다. Nitrite standard의농도별표준곡선을이용하여배양액의 NO 농도를결정하였다. 2 Cytokine 측정 Cytokine 생성량측정을위해 RAW 세포를 12 well plates에 cells/ml 가되도록분주하고, 24시간동안배양한후, SJT (1, 10, 100 μg/ml) 을처리하고, LPS (1 μg/ml) 로처리하였다. 24시간동안배양한후세포배양액을수거하여배양액에함유된 TNF-α, IL-1β, IL-6를 Milliplex map cytokine kit을이용하여측정하였고 Milliplex analyst software를통해분석하였다. 5) In vivo (1) 창상유발및실험군분류마취제 ( 졸레틸 0.5 ml+ 럼푼 0.1 ml) 을이용하여 Rat를마취한후, 배부 ( 背部 ) 의피부를깨끗이제모한다. 제모된피부를알콜로깨끗이소독한후, 척추를기준으로고관절정중앙에 2 2 cm 2 의크기로정사각형을작도한다. 수술용가위를이용하여피부를근막위까지제거하여창상을유발하였다. 실험군은자연치료를한 Control 군, SJT만투여한 SJ군, 테라마이신 (Oxytetracycline HCL 5 mg+polymaxin B Sulfate I.U) 을처치한 Terra군, SJT를투여하고테라마이신을함께처치한 SJ+Terra 군으로총 4그룹으로나누고 (n=6), 각 cage에는한마리씩수용하였다. (2) 약물처치창상을유발한후, 다음날부터모든군은 3주간자유식이를하였고, SJ군과 SJ+Terra 군은 SJT를 3주간매일 1 회 2 ml (200 mg/ kg ) 씩오전 10시에경구투여하였다. Terra군과 SJ+Terra 군에는테라마이신을창상유발후 1주 동안은 2일주기, 유발후 2주, 3주동안은 3일주기로창상부위에충분히도포하였다. SJT 투여량은 1첩을성인체중 60 kg에 1회투여용량으로하고, 1첩으로부터얻은시료를마우스체중 30 g으로기준하여산출하였다. (3) 창상면적측정창상유발후 1일, 4일, 8일, 11일, 15일, 19일, 22일총 3주동안의창상면적을측정하였다. 측정방법은 Digimatic Caliper 를이용하여측정평균산출하였다. (4) 혈액학적분석최종실험종료후 EDTA 처리된튜브형주사기를이용하여심장에서 10 ml를채혈하였다. 그중전혈과혈청을서울의과학연구소에의뢰하여총백혈구, 백혈구중호중구, 단핵구, 림프구의분포도와 AST, ALT, creatinine, BUN을측정하였다. 혈구세포수는심장천자법으로채취한혈액을자동혈구측정기로 Fonio법에준하여 Minos- ST로측정하였다. (5) 혈청내염증 Cytokine 측정혈청내에서염증성 Cytokine 을측정하기위해, 혈액을채취하여 30분간상온에서굳힌뒤 3,000 rpm에서 15분간원심분리후혈청을분리하였다. 모든군의혈청 25 μl을각각 filterplate에넣고 TNF-α, IL-1β, IL-6가섞인 Bead를각각 25 μl 씩넣은후 2시간동안실온에서배양하였다. 2회 wash한뒤 Detection Antibody 25 μl 넣고 1시간동안실온에서배양후 Streptavidin-Phycoerythrin 25 μl 넣고다시실온에서 30분배양하였다. 2 회 wash한뒤 Sheath Fluid 150 μl를넣고 Luminex 를사용하여 TNF-α, IL-1β, IL-6를측정하였다. (6) 유전자발현측정 1 RNA 추출쥐의배부창상피부조직에서발현된창상인자를측정하기위해 RT-PCR 을시행하였다. 분리한피부조직을동결시킨뒤 homogenizer 로조직을파쇄하여 RNAzolB 1000 μl를넣고 chloroform (CHCl 3 ) 200 μl를첨가한후 15초간다시혼합하였다. 이를얼음에 2분간방치하였고, 13,000 rpm에서원심분리한후약 400 μl의상층액을회수하여 isopropanol 400 μl와동량혼합후천천히흔들고얼음에서 15분간방치하였다. 이를다시 13,000 rpm에서원심분리한후 80% EtOH로수세하고 1분간 vaccum pump에서건조하여 RNA를추출하였다. 55

6 정훈 이현재 김빛나라 이치호 이은정 허동석 오민석 2 역전사중합효소연쇄반응역전사 (reverse transcription) 반응은 RT premix kit의 mixture (reaction buffer, dntps mixture, RNase inhibitor, stabilizer, oligo dt15 primer) 를사용하여 total RNA 1 μg이되게 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 처리된증류수에최종부피가 20 μl가되도록하여첨가하였다. 이 20 μl의반응혼합액을잘섞은뒤 2,000 rpm에서 5초간원심침강하여 45 o C heating block에서 60분동안반응시켜 first-strand cdna 를합성하였다. 이를다시 95 o C에서 5분동안방치하여 M-MLV RT를불활성화시킨후합성이완료된 cdna 를 polymerase chain reaction (PCR) 에사용하였다. 3 RT-PCR RT-PCR은 DNA polymerase 1U/tube에 250 mm dntps mix, RT buffer (10 mm Tris-HCl, ph 9.0, 30 mm KCl, 1.5 mm MHCl 2 ) 를포함한 mixture 에각샘플과 primer 를넣고 PCR을시행하였다. MMP-1 은 55 o C에서 2 분, 95 o C에서 10분, 60 o C에서 15초, MMP-2 은 61 o C에서 2분, 95 o C에서 10분, 60 o C에서 15초, MMP-9 은 57 o C에서 2분, 95 o C에서 10분, 60 o C에서 15초, GAPDH 는 57 o C에서 2분, 95 o C에서 10분, 60 o C에서 15초동안각 30 cycles 조건으로 PCR을수행하였으며, 사용된 primer 는아래와같다 (Table III). 1% agarose gel에전기영동후유전자발현의여부를 UV로촬영하여각그룹별로 band를확인하고, RNA 발현을나타냈다. (7) 병리조직학적검사병리조직학적검사를위해창상피부조직을적출하였다. 각실험군별로적출한조직은 10% 중성포르말린에 48시간고정하여고정이완료된조직들을흐르는수돗물에서 12시간수세한뒤조직내고정액을완전제거하였 다. 조직의탈수를위해 60% 에서부터 100% 알코올에이르기까지농도상승순으로탈수하고, xylene 에투명과정을거친다음파라핀블럭을제작하였다. 제작된블럭은박절기 (microtome) 를이용해 3~4 μm 두께로절편을만들어탈파라핀및함수과정을거친다음 hematoxyline 과 eosin (H&E) 염색을실시하여광학현미경상에서관찰및촬영하였다 (Fig. 1). (8) 간기능및신장기능검사혈청내에서 AST, ALT 활성도를측정하기위해실험종료후심장천자법을이용하여혈액을채취하였다. 혈액을 30분간상온에서굳힌뒤 3,000 rpm에서 15분간원심분리후혈청을분리하여, 서울의과학연구소 ( 서울, 한국 ) 에분석의뢰하였다. 간기능검사를위해 AST, ALT 활성도는 JSCC UV method 의원리를이용하여생화학자동분석기로측정하였다. 또한신장기능검사를위해 Creatinine 의함량은 Creatinine Jaffe Method, BUN의함량은 Kinetic UV assay for urea/urea nitrogen 의방법을이용하여생화학자동분석기로측정하였다 3. 통계처리실험결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's T-test 를이용하여통계처리하였으며, p<0.05, p<0.01 및 p< 수준에서유의성을검정하였고, 그값은평균 Table III. The Sequences of Primers in Used This Study Primer F/R Sequences MMP-1 F GAG ACG TGG ACC GAC AAC AG R AGG CCC ATA TAA AGC CTG GA MMP-2 F TGG CGA GTA CTG CAA GTT CC R GTA AGA GGT GCC CTG GAA GC MMP-9 F CCT GCA GTG CCC TTG AAC TA R TCC AAC AAG AAA GGA CAG CG GAPDH F GTT ACC AGG GCT GCC TTC TC R CAC CCC ATT TGA TGT TAG CG Fig. 1. Tissue preparation processing. 56 J Korean Med Rehab 2014;24(3):51-69

7 (mean)± 표준편차 (standard deviation) 로표기하였다. 결과»»» 1. 중금속검사 SJT의중금속함량을측정한결과, 카드뮴의경우기준치이하로검출되었고그외납, 비소, 수은은검출되지않았다 (Table IV). 2. HPLC 패턴분석 HPLC를이용하여 SJT의 pattern 을분석한결과, 210 nm에서 retention time이 39.62분, 45.66분, 56.48분, 56.73분대에 peak를확인할수있었다 (Fig. 2). 3. In vitro 98.4±2.3%, 10μg/ml 농도에서 103.1±4.5%, 100μg/ ml 농도에서 100.3±5.2% 의세포생존율을나타내었다 (Fig. 3). 2) 항산화활성에미치는영향 (1) 총폴리페놀함량총폴리페놀함량은 gallic acid를표준물질로하여측정한결과, 41.14±1.51 mg/g으로나타났다 (Table V). (2) DPPH 소거능 DPPH 소거율은 1 μg/ml 농도에서 7.4±1.1%, 10 μg/ ml 농도에서 10.2±1.1%, 100 μg/ml 농도에서 54.1± 2.0%, 1,000 μg/ml 농도에서 94.3±1.0% 로나타나농도의존적으로증가하였다 (Fig. 4). (3) ABTS 소거능 ABTS 소거율은 1 μg/ml 농도에서 1.9±1.2%, 10 μ g/ ml 농도에서 4.7±0.5%, 100 μg/ml 농도에서 21.2± 3.4%, 1,000 μg/ml 농도에서 86.7±0.5% 로나타나, 농 1) 세포독성에미치는영향 RAW 세포주세포생존율은대조군을 100.0± 1.0% 로나타냈을때 SJT 투여군은 1μg/ml 농도에서 Fig. 2. HPLC chromatogram of Sibjeondaebotanggamibang. Column: ZORBAX Eclipse Plus C18 ( mm, 5 μm), sample injection volume; 20 μl, mobile phase; H 2O(A)/ ACN(B) gradient elution: 0~5 min (0% B), 5~40 min (30% B), 40~60 min (80% B), 60~80 min (100% B), flow rate; 1.0 ml/min, detector; PDA detector. Table IV. Sibjeondaebotanggamibang Composition of Heavy Metals Pb As Cd Hg permissive density (mg/kg) Sibjeondaebotanggamibang N.D.* N.D N.D. *N.D.: Not detected. Fig. 3. Effects of Sibjeondaebotanggamibang on the cell viability of RAW cells. Cells were treated with 1, 10, 100 (μg/ml) of SJT for 24 hours. Cell viability was determined using the WST assay. The results are expressed as mean±s.d. from three independent experiments. Table V. Total Phenolic Contents of Sibjeondaebotanggamibang Sample Total phenolics (mg GAE*/g ext.) Sibjeondaebotanggamibang 41.14±1.51 *Total phenolic contents was expressed as milligram of gallic acid equivalent (GAE) per gram of extract. 57

8 정훈 이현재 김빛나라 이치호 이은정 허동석 오민석 Fig. 4. DPPH free radical scavenging activity of Sibjeondaebotanggamibang at various concentration. Extracts were incubated with DPPH solution at 37 o C for 30 mins. Activities were determined by measurement of absorbance at 517 nm. The results are expressed as mean±s.d. from three independent experiments. Fig. 6. Effects of Sibjeondaebotanggamibang on the ROS production in Raw cells. The Raw cells were stimulated with LPS and treated with medium, SJT (1, 10, 100 μg/ml) for 24 hours. The ROS production was analysed following incubation with DCFH-DA by flow cytometry. The results were presented by the mean±s.d. from three independent experiments. Significant value was calculated by compared with Control group by student's t-test (**p <0.01, ***p<0.001). Fig. 5. ABTS free radical scavenging activity of Sibjeondaebotanggamibang at various concentration. Extracts were incubated with ABTS solution at RT for 10 mins. Activities were determined by measurement of absorbance at 517 nm. The results were expressed as mean±s.d. from three independent experiments. 도의존적으로 ABTS 소거율이증가하였다 (Fig. 5). (4) ROS 생성 ROS 생성은대조군을 100.0±1.0% 로나타냈을때, 정상군은 37.5±7.9%, SJT 투여군은 1 μg/ml 농도에서 94.9±8.4%, 10 μg/ml 농도에서 76.8±4.1%, 100μ g/ml 농도에서 70.7±3.4% 로농도의존적으로감소하였으며, 대조군에비해 10, 100 (μg/ml) 농도에서유의성있게감소하였다 (Fig. 6). Fig. 7. Effects of Sibjeondaebotanggamibang on NO production in LPS-stimulated RAW cells. Cells were treated with LPS (1 μg/ml) and 1, 10, 100 (μg/ ml) of SJT for 24 hours. The results are expressed as mean±s.d. from three independent experiments. Significant value was calculated by compared with Control group by student's t-test (*p<0.05). 3) 항염증효능에미치는영향 (1) NO 생성 NO 생성량은대조군을 100±2.0% 로나타냈을때, 정상군은 35.6±5.0%, SJT 투여군은 1 μg/ml 농도에서 102.9±5.6%, 10 μg/ml 농도에서 98.4±1.3%, 100 μg/ ml 농도에서 85.9±1.9% 로나타나, 대조군에비해 J Korean Med Rehab 2014;24(3):51-69

9 Fig. 8. Effects of Sibjeondaebotanggamibang on LPS-stimulated TNF-α production in RAW cells. Cells were treated with LPS (1 μg/ml) and 1, 10, 100 (μg/ ml) of SJT for 24 hours. The results are expressed as mean ±S.D. from three independent experiments. Significant value was calculated by compared with Control group by student's t-test (*p<0.05). Fig. 10. Effects of Sibjeondaebotanggamibang on LPS-stimulated IL-6 production in RAW cells. Cells were treated with LPS (1 μg/ml) and 0, 1, 10, 100 (μg/ ml) of SJ for 24 hours. The results are expressed as mean ±S.D. from three independent experiments. Significant value was calculated by compared with Control group by student's t-test (*p<0.05). Fig. 9. Effects of Sibjeondaebotanggamibang on LPS-stimulated IL-1β production in RAW cells. Cells were treated with LPS (1 μg/ml) and 1, 10, 100 (μg/ ml) of SJT for 24 hours. The results are expressed as mean ±S.D. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with Control group by student's t-test (*p<0.05, **p<0.01). 유의성있게감소하였다 (Fig. 8). 2 IL-1β IL-1β 생성량은대조군이 36.9±2.1 pg/ml, 정상군이 14.3±2.1 pg/ml, SJT 투여군은 1μg/ml 농도에서 29.7 ±2.6 pg/ml, 10 μg/ml 농도에서 29.6±4.6 pg/ml, 100 μg/ml 농도에서 24.6±2.4 pg/ml로나타나, 대조군에비해모든농도에서감소하였고, 1과 100 (μg/ml) 농도에서유의성있게감소하였다 (Fig. 9). 3 IL-6 IL-6 생성량은대조군이 ±651.1 pg/ml, 정상군이 2.8±1.6 pg/ml, SJT 투여군은 1 μg/ml 농도에서 ±455.0 pg/ml, 10 μg/ml 농도에서 ± pg/ml, 100 μg/ml 농도에서 ±649.3 pg/ ml로나타나, 대조군에비해모든농도에서유의성있게감소하였다 (Fig. 10). μg/ml 농도에서유의성있게감소하였다 (Fig. 7). (2) Cytokine 생성 1 TNF-α TNF-α 생성량은대조군을 ±198.4 pg/ml로나타냈을때, 정상군은 251.6±33.7 pg/ml, SJT 투여군은 1 μg/ml 농도에서 ±85.9 pg/ml, 10 μg/ml 농도에서 ±90.0 pg/ml, 100 μg/ml 농도에서 ±114.1 pg/ml 로나타나, 대조군에비해모든농도에서 4. In vivo 1) 간기능에미치는영향 ALT는 Control 군이 28.3±1.7 U/L, SJ군이 32.8±3.3 U/L, Terra군이 29.5±2.4 U/L, SJ+Terra 군이 32.7±5.3 U/L로나타났다. AST는 control군이 97.5±6.0 U/L, SJ군이 105.8±5.5 U/L, Terra군이 97.5±7.8 U/L, SJ+Terra군이 103.8±9.2 U/L로나타났다 (Fig. 11). 59

10 정훈 이현재 김빛나라 이치호 이은정 허동석 오민석 2) 신장기능에미치는영향 Fig. 11. Effect of Sibjeondaebotanggamibang and terramycin on the ALT and AST in wound-induced rats. The results were expressed as mean±s.d. from 6 wound-induced rats. group treated with SJT. Terra: wound-induced rats group treated with terramycin. SJ+Terra: wound-induced rats group treated with SJT and terramycin (1) Creatinine Creatinine 농도는 control군은.53±0.02 mg/dl, SJ군은 0.59±0.04 mg/dl, Terra군은 0.53±0.02 mg/dl, SJ+ Terra군은 0.57±0.04 mg/dl 로나타났다 (Fig. 12). (2) BUN BUN은 control 군은 16.42±1.43 mg/dl, SJ군은 ±1.71 mg/dl, Terra군은 16.77±1.18 mg/dl, SJ+Terra군은 17.18±1.24 mg/dl로나타났다 (Fig. 13). 3) 창상면적측정창상면적은 control 군은 80.2%, SJ군에서 94.7%, Terra 군은 92.1%, SJ+Terra군은 95.1% 의감소를나타내 Fig. 12. Effect of Sibjeondaebotanggamibang and terramycin on the creatinine in wound-induced rats. The results were expressed as mean±s.d. from 6 wound-induced rats. group treated with SJT. Terra: wound-induced rats group treated with terramycin. SJ+Terra: wound-induced rats group treated with SJT and terramycin. Fig. 13. Effect of Sibjeondaebotanggamibang and terramycin on the BUN in wound-induced rats. The results were expressed as mean±s.d. from 6 wound-induced rats. group treated with SJT. Terra: wound-induced rats group treated with terramycin. SJ+Terra: wound-induced rats group treated with SJT and terramycin. Table VI. The Change of Wound Size in Sibjeondaebotanggamibang and Terramycin Group Con 100.0±30.5% 96.2±21.5% 82.8±17.9% 52.3±5.9% 36.7±2.1% 24.3±3.0% 19.8±7.0% SJ 100.0±17.6% 88.4±14.5% 62.4±16.9% 36.1±8.1 * % 13.9±4.7 % 8.3±2.3 % 5.3±1.2 * % Terra 100.0±20.6% 93.7±23.0% 74.5±19.3% 38.7±8.3*% 14.9±4.7 % 10.4±3.2 % 8.3±1.8 * % SJ+Terra 100.0±26.1% 90.6±23.6% 56.4±13.1% 27.2±7.4 % 10.2±3.4 % 7.6±3.3 % 4.9±1.6 * % The results were expressed as mean±s.d. from 6 wound-induced rats. Significant value was calculated by compared with Control group by student's t-test (*p<0.01, p<0.001). group treated with SJT. Terra: wound-induced rats group treated with terramycin. SJ+Terra: wound-induced rats group treated with SJT and terramycin. 60 J Korean Med Rehab 2014;24(3):51-69

11 Fig. 15. Effects of Sibjeondaebotanggamibang and terramycin on levels of WBC in the blood of wound-induced rats. The results were expressed as mean±s.d. from 6 wounded rats. Significant value was calculated by compared with Control group by student's t-test (*p<0.05, **p<0.01). group treated with SJT. Terra: wound-induced rats group treated with terramycin. SJ+Terra: wound-induced rats group treated with SJT and terramycin. Fig. 14. (A, B) The change of wound size in Sibjeondaebotanggamibang and terramycin groups. The results were expressed as mean±s.d. from 6 wound-induced rats. group treated with SJT. Terra: wound-induced rats group treated with terramycin. SJ+Terra: wound-induced rats group treated with SJT and terramycin. 었다. SJ군, Terra군, SJ+Terra 군에서각각 10일, 14일, 17 일, 21일째유의성있게감소하였다 (Table VI, Fig. 14A, B). 4) 혈액내면역세포에미치는영향 (1) 총백혈구백혈구생성량은 control 군이 11.78±1.29 Thous/uL 로나타났고, SJ군이 7.66±2.09 Thous/uL, Terra군이 9.73 ±2.15 Thous/uL, SJ+Terra 군이 6.82±2.05 Thous/uL 로나타나, control 군에비해 SJ군과 SJ+Terra 군에서유의성 Fig. 16. Effects of Sibjeondaebotanggamibang and terramycin on levels of neutrophi in the blood of wound-induced rats. The results were expressed as mean±s.d. from 6 wounded rats. group treated with SJT. Terra: wound-induced rats group treated with terramycin. SJ+Terra: wound-induced rats group treated with SJT and terramycin. 있게감소하였다 (Fig. 15). (2) 호중구호중구의비율은 control 군이 2.80±1.01% 로나타났고, SJ군이 2.48±0.63%, Terra군이 2.97±0.19%, SJ+Terra군이 1.97±0.37% 로나타나, control 군에비해 SJ군, SJ+ Terra군에서는감소하였다 (Fig. 16). (3) 림프구혈액내백혈구에대한림프구의비율은 control 군이 90.20±8.72% 로나타났고, SJ군이 95.38±1.19%, Terra군이 93.38±3.20%, SJ+Terra군이 88.32±14.50 % 로나타나, control 군과 SJ군, Terra군, SJ+Terra 군에서큰차이를 61

12 정훈 이현재 김빛나라 이치호 이은정 허동석 오민석 Fig. 17. Effects of Sibjeondaebotanggamibang and terramycin on levels of Lymphocyte in the blood of wound-induced rats. The results were expressed as mean±s.d. from 6 wounded rats. Con: natural treatment rats group. SJ: wound- induced rats group treated with SJT. Terra: wound-induced rats group treated with terramycin. SJ+Terra: wound-induced rats group treated with SJT and terramycin. Fig. 19. Effects of Sibjeondaebotanggamibang and terramycin on levels of TNF-α in the serum of wound-induced rats. The results were expressed as mean±s.d. from 6 wounded rats. Significant value was calculated by compared with Control group by student's t-test (***p<0.001). group treated with SJT. Terra: wound-induced rats group treated with terramycin. SJ+ Terra: wound-induced rats group treated with SJT and terramycin. Fig. 18. Effects of Sibjeondaebotanggamibang and terramycin on levels of Monocyte in the blood of wound-induced rats. The results were expressed as mean±s.d. from 6 wounded rats. Significant value was calculated by compared with Control group by student's t-test (*p<0.05, **p<0.01). group treated with SJT. Terra: wound-induced rats group treated with terramycin. SJ+Terra:; wound-induced rats group treated with SJT and terramycin. 보이지는않았다 (Fig. 17). (4) 단핵구혈액내백혈구에대한단핵구의비율은 control 군이 1.45±0.61% 로나타났고, SJ군이 0.30±0.16%, Terra군이 0.30±0.19%, SJ+Terra 군이 0.18±0.04 % 로나타나, control군에비해 SJ군, Terra군, SJ+Terra 군에서모두유의성있게감소하였다 (Fig. 18). Fig. 20. Effects of Sibjeondaebotanggamibang and terramycin on levels of IL-1β in the blood of wound-induced rats. The results were expressed as mean±s.d. from 6 wounded rats. Significant value was calculated by compared with Control group by student's t-test (*p<0.05). group treated with SJT. Terra: wound-induced rats group treated with terramycin. SJ+Terra: wound-induced rats group treated with SJT and terramycin. 5) 혈청내염증 cytokine 생성에미치는영향 (1) TNF-α TNF-α는 control 군이 66.4±11.1 pg/ml, SJ군이 46.4 ±6.8 pg/ml, Terra군이 47.3±6.7 pg/ml, SJ+Terra 군이 46.4±5.5 pg/ml로나타나, control군에비해나머지모 62 J Korean Med Rehab 2014;24(3):51-69

13 Fig. 21. Effects of Sibjeondaebotanggamibang and terramycin on levels of IL-6 in the serum of wound-induced rats. The results were expressed as mean±s.d. from 6 wounded rats. group treated with SJT. Terra: wound-induced rats group treated with terramycin. SJ+Terra: wound-induced rats group treated with SJT and terramycin. Fig. 23. Histopathological findings of wound tissue section on Sibjeondaebotanggamibang and terramycin treated in woundinduced rats ( 50). The results were expressed as mean±s.d. from 6 wounded rats. group treated with SJT. Terra: wound-induced rats group treated with terramycin. SJ+Terra: wound-induced rats group treated with SJT and terramycin. 든군에서유의성있게감소하였다 (Fig. 19). (2) IL-1β IL-1β는 control 군이 104.2±13.4 pg/ml, SJ군이 92.4 ±14.6 pg/ml, Terra군이 93.8±15.2 pg/ml, SJ+Terra군이 84.9±11.7 pg/ml 로나타나, control 군에비해 SJ+ Terra 투여군에서유의성있게감소하였다 (Fig. 20). (3) IL-6 IL-6는 control 군이 916.3±137.7 pg/ml, SJ군이 ±99.4 pg/ml, Terra군이 867.1±81.0 pg/ml, SJ+Terra군이 861.1±69.3 pg/ml로나타나, control군에비해나머지모든군에서감소하였다 (Fig. 21). Fig. 22. Effects of Sibjeondaebotanggamibang and terramycin on MMP-1, 2, 9 gene expression in wound tissue. The results were expressed as mean±s.d. from 6 wounded rats. Significant value was calculated by compared with Control group by student's t-test (*p<0.05). group treated with SJT. Terra: wound- induced rats group treated with terramycin. SJ+Terra: wound- induced rats group treated with SJT and terramycin. 6) 유전자발현에미치는영향창상피부조직에서의 MMP-1, 2, 9 발현량을측정한결과, control군의 mrna expression 량을 100% 로나타내었을때, MMP-1 에서 SJ군, Terra군, SJ+Terra 군이 47%, 67%, 64%, MMP-2 에서 SJ군, Terra군, SJ+Terra 군이 70%, 63

14 정훈 이현재 김빛나라 이치호 이은정 허동석 오민석 90%, 68%, MMP-9에서 SJ군, Terra군, SJ+Terra군이 128%, 71%, 81% 를나타내어, MMP-1의 SJ군에서유의성이있는감소하였다 (Fig. 22). 7) 조직병리학적변화창상피부조직을관찰한결과, control군에서는콜라겐이증착되고, 피부의재상피화가두텁게일어났으며, 만성염증이나타났다. 콜라겐의증착과만성염증은 control군에비해 SJ군, Terra군, SJ+Terra 군에서모두감소하였고, 피부의재상피화는 Terra 투여군, SJ+Terra 투여군에서감소하였다 (Fig. 23). 고찰»»» 창상이란세포학적또는해부학적연속성이파괴된상태 3) 로창상치유는파괴된조직을회복시키는복잡한생물학적인과정이며, 재상피화, 창상수축, 유아조직형성및교원질합성등을포함한여러과정을통하여진행된다 24). 이러한과정은동시적으로일어나며, 반흔을형성하거나, 조직의재생을유도하여창상면적이감소된다 3). 이런치유과정이제대로진행되지않을경우비후성반흔및캘로이드등이나타날수있고, 만성염증으로진행되기도한다 25). 매년 20만건이넘는 TA 등외상의증가 26) 와수술기술의발전등으로매년 100만건이상수술이진행 27) 되는상황속에서창상시해당부위의염증으로인한손상이외에미용적인문제등을야기시켜사회활동에지장을초래할수있어창상치유혹은수술후피부의회복및치료에관심이점점증가하고있다 3). 창상의한의학적치료법으로는시간에따른初期, 成膿, 潰後의삼단계로분류하여치료법칙도이에따라消, 托, 補의세가지의기본법칙으로분류하였다. 그중消法은병변의손상을초기에消散시키는것이고, 托法이란化膿되어있지않은것을消退시키거나腐敗한肉을조속히化膿시켜消退시키는방법을말한다. 또한補法은창상의후기에국한적으로波潰된후瘡口가장기간에걸쳐유합되지않는경우에사용한다 4). 창상치유에대한연구는스테로이드 6), 항생제 7), 연고제 8), 방사선조사 9), 레이저광선 10), 초음파 11) 등다양한방 면으로진행되고있으며, 한의학분야에서는연고제 12) 와좌욕제 13), 단미제 28) 등을이용한창상치유및四君子湯 14), 十全大補湯 15), 紫雲膏 16) 등의생기작용에대한논문이발표되어연구가진행되고있으나, 창상을위한다양한蕩劑, 散劑, 丸劑및塗布劑등이 東醫寶鑑 등을통해전해지고있음에도불구하고이에대한과학적효능확인을위한연구는거의이루어지지않았다 29). 十全大補湯은宋代 太平惠民和劑局方 에처음으로수록된처방 30) 으로, 補氣하는四君子湯과補血하는四物湯을합하여八珍湯이라명하고氣血의손상이重하여眞陰이內竭하고虛陽이外鼓하여諸症이일어나게되면助陽固表하는黃芪를加하여하고引火歸元하는肉桂를가하여사용하는처방이다 31,32). 모세혈관투과성실험, 육아종형성실험및섬유아세포의증식능에대해실험하여十全大補湯이生肌작용에효과가있는지를규명했던연구 15) 에착안하여十全大補湯加味方이창상치유에적합하리라는가설을세우고, 이에淸熱解毒, 凉散風熱하여擁腫疔瘡을치료하는外科의聖藥인金銀花 22) 를加味 (12 g) 하고益衛固表, 托毒生肌하여皮膚水腫과膿成不潰혹은潰久不斂등피부질환에특효가있는黃芪 22) 의양을 4배증량 (16 g) 한十全大補湯加味方을구성하여 in vitro 및 in vivo 실험을통해창상치유효과를관찰하였다. In vitro 실험에서는 SJT를시료로하여 LPS로자극된 RAW 세포에서항산화활성과염증 Cytokine 에미치는영향을분석하였고, in vivo 실험에서는창상이유발된 rat으로창상면적측정, 혈청내염증 Cytokine 측정, 유전자발현측정, 혈액학적검사및병리조직학적변화를관찰하여 SJT의창상치유효과를확인하였다. In vitro 실험에서이용한 RAW 세포는대식세포주로서, Cytokine 의자극만으로도스스로 NO를생성하여세포독성을갖는물질의독성검정을위해유용하게사용된다 33). RAW 세포활성에이용한 LPS는동물실험에서의자가면역질환유발물질로, 대식세포를자극하여 IL-1β와 IL-6을분비시켜 TNF-α 분비를유발한다 34). 먼저, 안정성확보를위해 HPLC를측정하고, 안전성확인을위해중금속함량, 세포독성검사를하였다. SJT의 HPLC pattern 을분석한결과, 210 nm에서 retention time이 39.62분, 45.66분, 56.48분, 56.73분대에 peak를확인할수있었다 (Fig. 2). SJT의중금속함량을측정한결과, 카드뮴의경우기준 64 J Korean Med Rehab 2014;24(3):51-69

15 치이하로검출되었고그외납, 비소, 수은은검출되지않았고 (Table IV), 세포독성검사에서는 SJ 1, 10, 100 (μg/ ml) 농도에서세포생존율이모두 95% 이상으로나타났다 (Fig. 3). 이를통해 SJT가 1, 10, 100 (μg/ml) 농도에서 in vitro상안전성을지닌약물임을입증하였다. In vitro 실험에서 SJT의창상치유효과를확인하기위해항산화및항염증효과를관찰하였는데, 항산화효능을관찰하기위해폴리페놀함량, DPPH 소거활성, ABTS 소거활성, ROS 생성소거능을측정하였다. 페놀성화합물은다양한생리활성에관여하는것으로, 특히페놀성화합물의종류나함량은항산화활성에큰영향을주는것으로알려져있다 35,36). 생체내에서의산소 free radical 반응은생체조직의노화나질병과관련이있으며페놀성물질의 hydroxyl group은유지의유리기수용체로서유지산패의초기단계에생성된유리기들이안정된화합물을형성하도록하여산화억제작용을한다 37). SJT의폴리페놀함량을측정한결과 41.14±1.51 mg/g로나타나폴리페놀함량을통한항산화효과를입증하기는어려웠다 (Table V). DPPH는다양한천연소재로부터항산화물질을검색하는데많이이용된다. DPPH 검사는간편하고비용이저렴한항산화실험법으로가장널리쓰이고있다 38,39). SJT 의 DPPH 소거활성을측정한결과, 농도가증가함에따라소거활성역시증가하여 SJT의항산화효능을확인하였다 (Fig. 4). ABTS 항산화측정법은 DPPH와같은라디컬소거법에의한항산화능측정법이라는점에서는같지만, 화학반응을통해자유라디칼이유발된용액에시료를넣어항산화를측정한다는점에서다르며, 단시간에측정할수있고, 소수성과친수성모두에적용가능하다 40,41). SJT의 ABTS 소거활성을측정한결과, SJT의농도가증가함에따라 ABTS 소거활성역시증가하여 SJT의항산화효능을확인하였다 (Fig. 5). ROS는생체내에서지속적으로생성이되지만적절하게제어되지않으면축적되어단백질, 지질, 핵산등에손상을야기한다 42). ROS가정상적으로소거되지않았을때잔존하는자유라디칼에의해산화적스트레스를받게됨으로서다른질병의원인이되기도하기때문에 43,44) 활성 radical 에전자를공여하는 radical 소거작용은항산화효 과나인체에서노화를억제하는척도로이용된다 45). RAW 세포의 ROS 생성량을측정한결과, ROS 생성량이대조군에비해 SJT 투여군에서유의성있게감소하였다 (Fig. 6). 폴리페놀함량은비록높지않았지만, DPPH 소거활성, ABTS 소거활성, ROS 생성소거능을확인한결과 SJT는항산화효능을지닌다고할수있겠다. 다음으로 SJT의항염증효능을관찰하기위해 NO, TNF-α, IL-1β, IL-6을측정하였다. 염증반응을조절하는 NO는혈관확장, 신경전달체제, 항균물질, 면역조절등에관여한다 46,47). 과량생성되면 TNF-α, IL-1 및 IL-6 등 pro-inflammatory cytokine 뿐만아니라 COX-2 같은염증매개물질도과량생산하여, 과도한면역반응을일으킨다 48). 본실험에서 RAW 세포의 NO 생성량을측정한결과, 대조군에비해 SJT 투여군 100 (μg/ml) 에서 NO가유의성있게감소하여, SJT의항염증활성이유효함을알수있었다 (Fig. 7). Cytokine 은염증성활막에서다량생산되어기질의합성을저해하고분해를촉진하는등염증반응과치유에중요한역할을하는인자들로 cytokine 의억제는창상치료의지표로사용된다 20,49). 그중 TNF-α는염증반응을유발하는인자로, 반응이시작되면다른염증매개인자들과함께증상을악화시킨다 50). IL-1β는 T세포를활성화시키고림프구, 단핵구등의세포염증부위침윤을증가시키며 51), IL-6는 B세포의증식, 분화, 항체형성에관여하는물질로 IgM, IgG, IgA 의증식을유도하고 T세포분화증식에관여하는것으로알려져있다 52). TNF-α, IL-1β, IL-6 생성에대한 SJT의억제효과를측정한결과, TNF-α와 IL-6 생성량은 SJT 투여군 1, 10, 100 (μg/ml) 에서유의성있게감소하였고 (Fig. 8, 10), IL-1β 생성량은 SJT 투여군 1, 100 (μg/ml) 에서유의성있게감소하여 (Fig. 9) SJT의항염증작용을확인할수있었다. 이를통해 in vitro 실험상 SJT의항산화및항염증효과를확인하여창상치유의가능성을확인하였다. In vivo 실험에서는창상이유발된 rat을자연치료한 control 군, SJT만투여한 SJ군, 테라마이신을처치한 Terra 군, SJT과테라마이신을함께처치한 SJ+Terra 군의총 4 그룹으로나눠 Digimatic Caliper 를이용한창상면적측 65

16 정훈 이현재 김빛나라 이치호 이은정 허동석 오민석 정, Minos-ST를사용한혈액학적분석, Luminex를사용하여혈청내 cytokine 측정, RT-PCR 을시행하여 MMP- 1,2,9 측청, 광학현미경을이용한병리조직학적검사를시행해창상치유력을측정하였다. 창상을유발하여대조군실험을한동물은 6주령의 Wistar rat을사용하였다. 배부에근막위까지 2 2 cm 2 크기로정사각형모양의창상을유발하여 3주간 control 군은별무처치, SJ군은매일 1회씩 SJT을경구투여하였고, Terra군은창상부위에테라마이신을 1주동안은 2일주기, 2~3주는 3일주기로충분히도포하였다. SJ+Terra 군은 SJT 경구투여와테라마이신도포를동시에하였다. 테라마이신은 Oxytetracycline 과 Polymyxin B sulfate 를합쳐생성한것 53) 으로 Oxytetracycline은 Streptomyces rimosus에서대사된것으로세균의단백질생합성을억제하여그람양성균주, 그람음성균주에항균효과를나타내는 tetracycline 계열의항생제이고, Polymyxin B sulfate는 Bacillus polymyxa 에기원한항생제로그람음성균주및눈에감염된 Pseudomonas aeruginosa 와 Haemophilus aegyptius 에항균효과가있다고알려져있다 54). 따라서, SJT의효과검증을위해양성대조군으로이용하였으며, 십전대보탕과동시투약하여병용요법의효과를비교하였다. In vivo 실험에서는간기능검사, 신기능검사를통해약물의안전성을확인하였는데, 간기능을반영하는혈청 AST와 ALT 농도 55-57), 신장기능을반영하는 BUN과사구체의여과율을반영하는혈청 creatinine 농도 58,59) 는모두대조군에비해유의한증감을보이지않아 SJT가비교적안전한약물임을확인하였다 (Fig. 11~13). In vivo에서창상면적을측정한결과 control 군에비해 SJ군, Terra군, SJ+Terra 군에서유의성있게감소하였고 (Table VI, Fig. 14A, B). 특히, SJ군의창상면적의감소가 Terra 투여군보다회복이빠르게나타났으며병용투여군이가장좋은결과를보였다. 피부의손상은 TNF-α, IL-1및 IL-6 등염증매개인자의함량변화와더불어염증부위에백혈구의침윤을일으킨다. 그중에서도호중구의침윤은 hydrogen peroxide 의생성을가져오고이는혈관의투과성을증가시키므로창상치유과정과밀접한관련성을가지고있다 60). 혈액내백혈구에대한림프구의비율은 control 군과실험군의큰차이를보이지않았으나, 혈액내총백혈구 의생성량과백혈구에대한호중구의비율이 control 군에비해 SJ군과 SJ+Terra 군에서유의성있는감소를보여 (Fig. 15, 16) SJT가혈액학적으로창상치유에효과가있음을보였다. 특히, 혈액내백혈구에대한단핵구의비율은 control군에비해 SJ+Terra군에서유의성있는감소를나타내테라마이신과 SJT의병용이효과가있음을보여앞으로의치료에도병용가능성을보여주었다. In vitro에서확인된 Cytokine 억제를통한항염증작용이 in vivo에서도유용한지확인하기위해혈청내 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성량을측정한결과, TNF-α는 control 군에비해다른모든군에서유의성있는감소를나타내었다 (Fig. 19). IL-1β는 control군에비해 SJ+Terra 군에서유의성있는감소를나타내었다 (Fig. 20). 이는 SJT 투여가항염증작용을도와창상치유에효과가있음을알수있음뿐아니라, SJT와테라마이신의병용투여가창상치유의더효과적일수있음을보여준다. 창상인자의변화를확인하기위해 MMP-1, MMP-2, MMP-9 를측정하였다. 교원질은피부진피세포의대부분을차지하는성분으로서, 교원질의감소는단백질분해효소인 Matrix metalloprotease (MMPs) 의증가때문이라고보고되었다 61). 창상치유과정중증식기에서섬유아세포가육아조직을형성함과동시에창상내에존재하는기존의기질은섬유아세포및염증세포에서분비되는 MMPs 에의해파괴된다 62). 그후 MMPs 와 Tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) 에의해세포양과혈류양이감소하면서치유가완성된다 63). MMPs 는조직리모델링에관여하는데 collagen, fibronectin, laminin 및 proteoglycan 등을파괴하며 64,65), 기능에따라 collagenase, gelatinase, stromelysins, membrane type 등으로나뉜다 66). MMP-1은 collagenase, MMP-2와 MMP-9는 gelatinase 로이는일반적으로염증및창상시급격히상승한다고알려져있어 67,68) 콜라겐과세포외기질의보전및기능에주요한영향을끼친다 69). 본연구에서 MMP-9 에서의 mrna expression 양이 Terra군과 SJ+Terra군에서감소함을나타내었고, MMP-1 과 MMP-2에서는 SJ군, Terra군과 SJ+Terra 군모두감소함을나타내었다. 특히, MMP-1 의 SJ군에서유의성있는감소가나타났다 (Fig. 22). MMP-1, 2와 MMP-9 가같은경향성을보이지는않았지만 collagenase 와일부 gelatinase 가감소하므로창상치유에 SJT가유효함을알수있다. 66 J Korean Med Rehab 2014;24(3):51-69

17 창상피부조직을 Hematoxylin & Eosin 염색하여관찰한결과, control 군에서는콜라겐의증착되고, 피부의재상피화가두텁게일어났으며, 만성염증이생겼으나 SJ군, Terra군, SJ+Terra군에서콜라겐의증착과만성염증의감소를나타내었고, Terra군, SJ+Terra 군에서피부의재상피화가감소하며, 색이옅어졌다 (Fig. 23). 이는 SJT가콜라겐의증착과만성염증을감소시켜병리조직학적으로창상치유에도움이됨을알수있다. 이상의연구결과를종합하면, 十全大補湯加味方 (SJT) 의투여는 LPS로자극된 RAW 세포에서항산화및항염증효과를증가시켰고, 창상을빠르게회복시켰다. 또한, 혈액내면역세포를줄여창상치유를돕고, 혈액내의염증 cytokine 과염증매개인자발현을억제하는항염증효과와유전자검사상항염증효과, 콜라겐의증착과만성염증으로의진행을억제하는효과가있었다. 이는 SJT가 in vitro 및 in vivo 실험상창상치유에긍정적인영향을끼친다는것으로향후임상연구등을통해 SJT가창상치유약물로이용될수있으리라사료된다. 결론»»» 十全大補湯加味方 (SJT) 를처리한 RAW 세포관찰을통해항산화효과및항염증효능을확인하고, 창상이유발된 rat의 SJT 경구투여후창상면적측정, 혈청내염증 cytokine 측정, 유전자발현측정, 혈액학적및병리조직학적변화를관찰하여다음과같은결론을얻었다. <In vitro> 1. DPPH와 ABTS의소거활성은 SJT의농도의존적으로증가하였고, ROS는 SJT 10, 100 (μg/ml) 에서유의하게감소하였다. 2. NO는 SJT 100 μg/ml에서, TNF-α와 IL-6은 SJT 1, 10, 100 (μg/ml) 에서 IL-1β는 SJT 1, 100 (μg/ml) 에서유의하게감소하였다. <In vivo> 1. 창상면적은 SJ군, Terra군, SJ+Terra 군에서각각 10 일, 14일, 17일, 21일째유의하게감소하였다. 2. 총백혈구생성량은 SJ군과 SJ+Terra 군에서, 단핵구의비율은 SJ군, Terra군, SJ+Terra군에서유의하게감소 하였고, 호중구의비율은 SJ군, SJ+Terra군에서감소하였지만유의성은없었다. 3. TNF-α와 IL-6은 SJ군, Terra군, SJ+Terra 군에서 IL-1 β는 SJ+Terra군에서유의하게감소하였다. 4. MMP-1 에서 mrna expression 이 SJ군에서유의하게감소하였다. 5. 병리조직학적검사상콜라겐의증착과만성염증은 control군에비해 SJ군, Terra군, SJ+Terra군에서모두감소하였고, 피부의재상피화는 Terra군, SJ+Terra 군에서감소하였다. 이상과같이十全大補湯加味方 (SJT) 은 in vitro에서항산화, 항염증효과가있었고, in vivo에서항염증효과및육안적, 혈액학적, 유전자적, 병리조직학적으로창상의회복에유의하였다. 결론적으로 SJT는창상치유효과가있을것으로사료된다. 참고문헌»»» 1. Anitua E, Andia I, Ardanza B, Nurden P, Nurden AT. Autologous platelets as a source ofproteins for healing and tissue regeneration, ThrombHaemost. 2004;91(1): Mehrara BJ, McCarthy JG. Repair And grafting of bone. In;Mathes SJ, Hentz VR, eds. Plastic Surgery. Philadelphia, PA: Saunders 2006; 대한성형외과학회, ( 표준 ) 성형외과학 = Textbook of plastic surgery Chapter 3. 창상치유 2009: 류지윤. 외과피부과의변증론치, 서울, 서원당, 1987: 채인식外. 한방의학용어대사전, 서울, 계축문화사, 2002: 한창동, 이환모, 이훈범, 한명훈, 유환욱. 백서피부에서스테로이드및비스테로이드소염진통제가급성창상치유및콜라겐형성에미치는영향, 대한정형외과학회지. 2003: 38(4): 장익수, 임풍. 폐쇄처치와항생제연고도포가허혈창상의치유에미치는영향, 가톨릭대학의학부논문집. 1994: 47(3): 유영천, 유석근. 창상치유에관한복합마데카솔의효과. Archives of Plastic Surgery. 1998:25(8): 최순철, 박태원, 유동수, 이진구. 방사선조사가설의개방성창상치유에서섬유아세포의재형성에미치는영향에관한연구. Imaging Science in Dentistry. 1997:27(1): 곽동호, 이상한. 저출력레이저광선이백서설창상치유에미치는영향. 대한구강악안면외과학회지. 1987:13(2):

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