공개특허 공개특허 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2021년05월13일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61

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두삼 방
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(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2021-0054481 (43) 공개일자 2021년05월13일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/355 (2006.01) A23L 33/105 (2016.01) A61P 13/08 (2006.

1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2021년05월13일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/355 ( ) A23L 33/105 ( ) A61P 13/08 ( ) (52) CPC 특허분류 A61K 36/355 ( ) A23L 33/105 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2020 년 11 월 05 일 심사청구일자 (30) 우선권주장 2020 년 11 월 05 일 년 11 월 05 일대한민국 (KR) 전체청구항수 : 총 8 항 (71) 출원인 경희대학교산학협력단 경기도용인시기흥구덕영대로 1732 ( 서천동, 경희대학교국제캠퍼스내 ) (72) 발명자 엄재영 서울특별시성북구한천로 713, 505 동 1902 호 박진봉 서울특별시도봉구덕릉로 349, 406 동 201 호 ( 창동, 주공 4 단지아파트 ) (74) 대리인 위병갑 (54) 발명의명칭금은화추출물을포함하는전립선비대증예방또는치료용조성물 (57) 요약 본발명은금은화추출물을포함하는전립성비대증예방또는치료용약학적조성물및건강기능성식품에관한것으로, 본발명의금은화추출물은 5 알파환원효소의발현을억제함으로써전립선비대증을효과적으로예방또는치료할수있다. 대표도 - 도 1-1 -

2 (52) CPC 특허분류 A61P 13/08 ( ) A23V 2002/00 ( ) A23V 2200/30 ( ) A61K 2800/782 ( ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 과제번호 부처명 2018R1A2A 과학기술정보통신부 과제관리 ( 전문 ) 기관명한국연구재단 연구사업명이공분야기초연구사업중견연구 ( 보호육성분야 ) 연구과제명및부작용완화연구 기여율 1/1 상용한약과피나스테리드의상호작용기전규명을통한전립선비대증개선효능증대 과제수행기관명 경희대학교 연구기간 ~

3 명세서청구범위청구항 1 금은화추출물을유효성분으로포함하는전립선비대증예방또는치료용약학적조성물. 청구항 2 제 1 항에있어서, 상기금은화추출물은 5알파환원효소의발현을억제하는것인약학적조성물. 청구항 3 제 2 항에있어서, 상기금은화추출물은 5알파환원효소 2형의발현을억제하는것인약학적조성물. 청구항 4 제 1 항에있어서, 상기금은화추출물은물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산및시클로헥산으로이루어진군중에서선택되는 1종이상의용매에의해추출된것인약학적조성물. 청구항 5 제 4 항에있어서, 상기용매는물및에탄올로이루어진군중에서선택되는 1종이상의용매인약학적조성물. 청구항 6 제 4 항에있어서, 상기용매는물또는에탄올인것인약학적조성물. 청구항 7 금은화추출물을유효성분으로포함하는전립선비대증예방또는개선용건강기능성식품. 청구항 8 제 1 항의전립선비대증예방또는치료용약학적조성물을인간을제외한환자에게투여하는것을포함하는전립선비대증예방또는치료방법. 발명의설명 [0001] 기술분야 본발명은금은화추출물을유효성분으로포함하는전립선비대증예방또는치료용약학적조성물및건강기능 성식품에대한것이다. [0002] [0003] [0004] 배경기술전립선비대증은전립선이비대해져방광하부의요로를막아소변의흐름이감소된상태로정의되었으나, 현재는 50세이상의남성에서빈뇨 (8회이상 / 일 ), 야간뇨, 긴박뇨 ( 강하고갑작스런요의 ), 절박뇨 ( 소변을참기어려움 ), 지연뇨 ( 소변의배출이지연됨 ), 단절뇨 ( 소변의흐름이끊김 ), 배뇨시힘을주어야하는현상등의방광배출장애를나타내는증상을통칭한하부요로증상의호소 로서전립선비대증을정의한다. 전립선비대증발생의가장주요한유발인자는연령증가와남성호르몬이며, 전립선의조직학적비대는 35세부터시작되어 60대남성의경우 60%, 80대남성의경우 90% 에서전립선의비대가나타나며, 이중 50% 의환자군에서전립선의비대로인한배뇨장애를호소한다. 전립선비대증의약물치료제는크게알파차단제와안드로겐억제제 (5알파환원효소억제제 ) 로분류된다. 알파차단 - 3 -

4 제는전립선요도의압력과긴장을낮추어주는약물로서시중에서판매되는알파차단제로는테라조신 (terazosin), 독사조신 (doxazosin), 탐스로신 (tamsulosin), 알푸조신 (alfuzosin) 등이있다. 그러나알파차단제는전립선의비대된현상을줄여주는효과는없으므로일시적인치료방법일뿐이며, 어지럼증, 무기력증, 두통, 시야장애등의부작용이보고되었다. 안드로겐억제제는전립선의비대과정에서핵심적인역할을수행하는 5알파환원효소 (5α-reductase) 를억제하여전립선의비대를막아주는약물이다. 5알파환원효소억제제로서시중에는피나스테리드 (finasteride) 와두타스테리드 (dutasteride) 가판매되고있다. 그러나이들약물은복용후효과가나타날때까지시간이오래걸리며, 성기능관련부작용이있다. [0005] [0006] 이와같이현재까지개발중이거나시판되고있는약물은대부분부작용이많이나타나므로, 새로운기전의전립선비대증치료제개발이요구되고있다. 상기와같은문제를해소하기위해, 본발명자들은금은화추출물이전립선비대를억제하는효능을가지고있음을확인하여, 본발명을완성하였다. 선행기술문헌 [0007] 특허문헌 ( 특허문헌 0001) 한국등록특허 호 발명의내용 [0008] [0009] [0010] 해결하려는과제본발명의목적은전립선비대증예방또는치료용약학적조성물을제공하는것이다. 본발명의다른목적은전립선비대증예방또는개선용건강기능성식품을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은전립선비대증예방또는치료방법을제공하는것이다. [0011] [0012] [0013] [0014] 과제의해결수단상기의목적을달성하기위하여, 본발명은금은화추출물을유효성분으로포함하는전립선비대증예방또는치료용약학적조성물을제공한다. 또한, 본발명은금은화추출물을유효성분으로포함하는전립선비대증예방또는개선용건강기능성식품을제공한다. 나아가, 본발명은본발명에따른전립선비대증예방또는치료용약학적조성물을환자에게투여하는것을포함하는전립선비대증예방또는치료방법을제공한다. [0015] 발명의효과본발명은천연물유래성분으로서생체친화적이고부작용이없는금은화추출물을전립선비대증의예방또는치료에적용시킨것으로, 금은화추출물의우수한 5알파환원효소발현억제효능및전립선비대억제효과에의해효과적인전립선비대증예방또는치료용조성물및건강기능성식품을제공할수있다. [0016] 도면의간단한설명 도 1 은본발명의금은화추출물의전립선조직비대억제효과를나타낸것이다. 도 2 는본발명의금은화추출물의추출용매에따른인간전립선상피세포 (RWPE-1 세포 ) 의세포생존율을나 타낸것이다. 도 3 은본발명의금은화추출물의추출용매에따른 5 알파환원효소억제효과를나타낸것이다. [0017] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하첨부된도면을참조하여본발명의실시예들을상세히설명한다. 이하의설명에있어, 당업자에게주지저 - 4 -

5 명한기술에대해서는그상세한설명을생략할수있다. 또한, 본발명을설명함에있어서, 관련된공지기능또는구성에대한구체적인설명이본발명의요지를불필요하게흐릴수있다고판단되는경우에는그상세한설명을생략할수있다. 또한, 본명세서에서사용되는용어 (terminology) 들은본발명의바람직한실시예를적절히표현하기위해사용된용어들로서, 이는사용자, 운용자의의도또는본발명이속하는분야의관례등에따라달라질수있다. [0018] 따라서본용어들에대한정의는본명세서전반에걸친내용을토대로내려져야할것이다. 명세서전체에서, 어떤부분이어떤구성요소를 " 포함 " 한다고할때, 이는특별히반대되는기재가없는한다른구성요소를제외 하는것이아니라다른구성요소를더포함할수있는것을의미한다. [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] 본발명은금은화추출물을유효성분으로포함하는전립선비대증예방또는치료용약학적조성물및건강기능성식품에관한것이다. 상기금은화 (Lonicerae Flos) 는인동덩굴 Lanicera japonica Thunberg의꽃봉오리또는막피기시작한꽃을사용하는한약으로특유한냄새가약간있고맛은담담하며약간쓴성질을갖는다. 한의학적으로청열해독, 양혈지혈, 산풍열의효능이있으며강한항균작용으로여러가지염증성질환과감기로인한발열및외과의부스럼등에효과가있는것으로알려져있다. 본발명의금은화추출물은상기금은화를적절한용매로추출한것일수있다. 상기추출하기위한적절한용매는약학적으로허용되는유기용매라면어느것을사용해도무방하며, 물또는유기용매를사용할수있다. 예를들어, 추출용매로서정제수, 메탄올 (methanol), 에탄올 (ethanol), 프로판올 (propanol), 이소프로판올 (isopropanol), 부탄올 (butanol) 등을포함하는탄소수 1-4개의무수또는함수저급알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 클로로포름, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산, 에테르, 벤젠, 메틸렌클로라이드, 및시클로헥산등의각종용매를단독으로혹은혼합하여사용할수있다. 바람직하게는, 상기금은화추출물은물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산및시클로헥산으로이루어진군중에서선택되는 1 종이상의용매를단독으로혹은혼합한용매에의해추출된것일수있다. 보다바람직하게는, 상기용매는물및에탄올로이루어진군중에서선택되는 1종이상의용매를단독으로혹은혼합한용매인것일수있고, 물또는에탄올인것이가장바람직한것일수있다. 추출방법으로는열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법등의방법중어느하나를선택하여사용할수있다. 또한, 목적하는추출물은추가로통상의분획공정을수행할수도있으며, 통상의정제방법을이용하여정제될수도있다. 본발명의금은화추출물의제조방법에는제한이없으며, 공지되어있는어떠한방법도이용될수있다. 예를들어, 상기금은화의추출은, 상기추출용매를금은화중량의 5 내지 30배부피의양으로첨가하여추출하는것일수있다. 추출온도는 20 내지 50 인것일수있으나, 이에한정되는것은아니다. 또한, 추출시간은 10 내지 72시간인것일수있으나, 이에한정되는것은아니다. [0027] [0028] [0029] 상기전립선비대증은 5알파환원효소의발현에의해발생되는전립선일수있고, 바람직하게는 5알파환원효소 2 형의발현에의해발생되는전립선일수있으나, 이에제한되지않는다. 상기금은화추출물은 5알파환원효소의발현을억제하여전립선비대를개선시키는것일수있고, 바람직하게는 5알파환원효소 2형의발현을억제하여전립선비대를개선시키는것일수있으나, 이에제한되지않는다. 상기 5알파환원효소 (5α-환원효소) 는테스토스테론으로부터디하이드로테스토스테론생합성에있어가장중요한효소이기때문에양성전립선비대증의조절을위한주요표적으로인식되고있다. 3종의 5알파환원효소중 I 형 (1형) 과 II 형 (2형) 은임상적으로가장중요하다. 그중간질과상피의전립선핵막에위치한 2형은양성전립선비대증과관련된디하이드로테스토스테론생성에더관여한다고보고되었다. 테스토스테론과디하이드로테스토스테론은남성생식기관의발달에중요한역할을하지만디하이드로테스토스테론은테스토스테론보다안드로겐수용체에대한친화도가높다. 안드로겐수용체에대한디하이드로테스토스테론의높은친화성은테스토스테론보다는전립선상피세포및간질세포의증식을촉진시키는데필요한안드로겐의존성장인자의전사활성 - 5 -

6 을강력하게자극할수있다. 이과정은안드로겐수용체를핵으로전이시켜발생하는안드로겐반응요소 (AREs) 의 DNA 서열에결합하기위해특정안드로겐수용체의보조활성제동원을필요로한다. [0030] 본발명의일실시예에서는금은화추출물이전립선비대증이유발된래트에서증가된전립선중량을감소시키고, 인간전립선상피세포에서 5 알파환원효소 2 형의발현수준을감소시킴으로써, 양성전립선비대증을예방, 치료 또는개선시킬수있음을확인하였다 ( 실험예 1 내지 4 참조 ). [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] 본발명에따른금은화추출물을유효성분으로포함하는전립선비대증예방또는치료용약학적조성물은약학적으로유효한양의금은화추출물을단독으로포함하거나하나이상의약학적으로허용되는담체, 부형제또는희석제를포함할수있다. 상기에서 " 약학적으로유효한양 " 이란상기생리활성성분이동물또는사람에게투여되어목적하는생리학적또는약리학적활성을나타내기에충분한양을말한다. 그러나상기약학적으로유효한양은증상의정도, 환자의연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여경로및치료기간등에따라적절히변화될수있다. 또한, 상기에서 " 약학적으로허용되는 " 이란생리학적으로허용되고인간에게투여될때, 통상적으로위장장애, 현기증과같은알레르기반응또는이와유사한반응을일으키지않는것을말한다. 상기담체, 부형제및희석제의예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트및광물유를들수있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제및방부제등을추가로포함할수있다. 또한, 본발명의조성물은포유동물에투여된후활성성분의신속, 지속또는지연된방출을제공할수있도록당업계에공지된방법을사용하여제형화될수있으며, 경구또는비경구투여를위한다양한형태로제형화될수있다. 제형은분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질또는경질젤라틴캡슐, 멸균주사용액, 멸균분말의형태일수있다. 본발명에따른조성물은경구, 경피, 피하, 정맥또는근육을포함한여러경로를통해투여될수있으며, 활성성분의투여량은투여경로, 환자의연령, 성별, 체중및환자의중증도등의여러인자에따라적절히선택될수있다. 또한, 본발명의조성물은목적하는효과를상승시킬수있는공지의화합물과도병행하여투여할수있다. [0038] [0039] [0040] [0041] 나아가본발명에따른조성물은상기기술한바와같이약학적조성물로사용할수있을뿐만아니라, 건강기능식품으로도사용할수있다. 예컨대, 식품의주원료, 부원료, 식품첨가제, 기능성식품또는음료로용이하게활용할수있다. 상기 식품 이란, 영양소를한가지또는그이상함유하고있는천연물또는가공품을의미하며, 바람직하게는어느정도의가공공정을거쳐직접먹을수있는상태가된것을의미하며, 통상적인의미로서, 식품, 식품첨가제, 기능성식품및음료를모두포함하는것을말한다. 상기식품용조성물을첨가할수있는식품으로는예를들어, 각종식품류, 음료, 껌, 차, 비타민복합체, 기능성식품등이있다. 추가로, 특수영양식품 ( 예, 조제유류, 영, 유아식등 ), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류 ( 예, 라면류, 국수류등 ), 빵류, 건강보조식품, 조미식품 ( 예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장등 ), 소스류, 과자류 ( 예, 스낵류 ), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품 ( 예, 발효유, 치즈등 ), 기타가공식품, 김치, 절임식품 ( 각종김치류, 장아찌등 ), 음료 ( 예, 과실음료, 채소류음료, 두유류, 발효음료류등 ), 천연조미료 ( 예, 라면스프등 ) 를포함하나이에한정되지않는다. 상기식품, 음료또는식품첨가제는통상의제조방법으로제조될수있다. 또한, 상기 기능성식품 또는 건강기능성식품 이란식품에물리적, 생화학적, 생물공학적수법등을이용하여해당식품의기능을특정목적에작용, 발현하도록부가가치를부여한식품군이나식품조성이갖는생체방어리듬조절, 질병방지와회복등에관한체내조절기능을생체에대하여충분히발현하도록설계하여가공한식품을의미하며, 구체적으로는건강기능성식품일수있다. 상기기능성식품에는식품학적으로허용가능한식품보조첨가제를포함할수있으며, 기능성식품의제조에통상적으로사용되는적절한담체, 부형제및희 - 6 -

7 석제를더욱포함할수있다. [0042] 상기건강보조식품의종류로는이에제한되지는않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐또는음료형태일수있다. [0044] [0045] [0046] 또한, 본발명은본발명에따른전립선비대증예방또는치료용약학적조성물을환자에게투여하는것을포함하는전립선비대증예방또는치료방법을제공한다. 본발명의치료방법은상기약학적조성물을치료적유효량으로개체에투여하는것을포함한다. 특정개체에대한구체적인치료적유효량은달성하고자하는반응의종류와정도, 경우에따라다른제제가사용되는지의여부를비롯한구체적조성물, 개체의연령, 체중, 일반건강상태, 성별및식이, 투여시간, 투여경로및조성물의분비율, 치료기간, 구체적조성물과함께사용되거나동시사용되는약물을비롯한다양한인자와의약분야에잘알려진유사인자에따라다르게적용하는것이바람직하다. 따라서본발명의목적에적합한조성물의유효량은전술한사항을고려하여결정하는것이바람직하다. 상기환자는임의의포유동물에적용가능하며, 상기포유동물은인간및영장류뿐만아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개및고양이등의가축을포함한다. [0048] 본발명의이점및특징, 그리고그것들을달성하는방법은상세하게후술되어있는실시예들을참조하면명확 해질것이다. 이하, 본발명을실시예에의해상세히설명하기로한다. 그러나이들실시예들은본발명을구체 적으로설명하기위한것으로서, 본발명의범위가이들실시예에한정되는것은아니다. [0050] [0051] < 실시예 1> 금은화추출물의제조본발명의실험에사용한금은화 (Lonicerae flos, LF) 는두손애약초 (Youngchun, Korea) 에서제공받아사용하였다. 물 ( 증류수 ) 및에탄올수용액을이용하여추출용매를달리한금은화추출물을제조하였다. 질소농축된금은화추출물은 DMSO(dimethyl sulfoxide, (CH 3 ) 2 SO) 에녹여서실험에사용하였다. [0053] [0054] 1-1. 금은화물추출물의제조 금은화 100 g 에 2 L 의물을넣고 36 에서 48 시간동안흔들어주면서가열하지않고추출하였으며, 질소농 축시켜용매를제거하여분말상태의금은화물추출물 (LJEE 0%, LF, 수율 16.6%) 을수득하였다. [0056] [0057] 1-2. 금은화 30% 에탄올추출물의제조 금은화 100 g 에 2 L 의 30%(v/v) 에탄올수용액을넣고 36 에서 48 시간흔들어주면서추출하였으며, 질소농 축시켜용매를제거하여분말상태의금은화 30% 에탄올추출물 (LJEE 30%, 수율 18.0%) 을수득하였다. [0059] [0060] 1-3. 금은화 50% 에탄올추출물의제조 금은화 100 g 에 2 L 의 50%(v/v) 에탄올수용액을넣고 36 에서 48 시간흔들어주면서추출하였으며, 질소농 축시켜용매를제거하여분말상태의금은화 50% 에탄올추출물 (LJEE 50%, 수율 20.8%) 을수득하였다. [0062] [0063] 1-4. 금은화 70% 에탄올추출물의제조 금은화 100 g 에 2 L 의 70%(v/v) 에탄올수용액을넣고 36 에서 48 시간흔들어주면서추출하였으며, 질소농 축시켜용매를제거하여분말상태의금은화 70% 에탄올추출물 (LJEE 70%, 수율 19.8%) 을수득하였다. [0065] 1-5. 금은화 100% 에탄올추출물의제조 - 7 -

8 [0066] 금은화 100 g 에 2 L 의 100%(v/v) 에탄올용매를넣고 36 에서 48 시간흔들어주면서추출하였으며, 질소농 축시켜용매를제거하여분말상태의금은화 100% 에탄올추출물 (LJEE 100%, 수율 9.2%) 을수득하였다. [0068] [0069] < 실험예 1> 전립선비대증의유발전립선비대증을유발하기위해래트 14마리의서혜부에 4주간 TP(5mg/kg/day) 를주입하였다. 4주간의전립선비대증유발이후추가적인 4주간 TP를주입한질병대조군과추가적인 4주간 TP와함께금은화추출물 (LF, 150 mg/kg/day) 를주입한실험군으로처치를달리하여실험을진행하였다. [0071] [0072] < 실험예 2> 조직무게측정및체중보정을통한 prostate index 측정전립선비대증의유발및금은화추출물의개선효과를확인하기위해실험예 1에서와같이총 8주간의실험후래트들의전립선조직의부피및무게를측정하였다. 또한체중에따른조직무게의차이를보정하기위해전립선의무게 mg을체중 100g에대하여나누어 prostate index를계산하였다. 전립선조직의측정결과는도 1에나타냈으며, 금은화추출물처리군이질병대조군에비해전립선조직의비대를억제하였으며, 이는조직의부피 ( 도 1a) 와체중 100g에대하여전립선조직의무게 (mg) 를보정한 prostate index( 도 1b) 모두에서개선효과를보였음을확인할수있었다. [0074] [0075] < 실험예 3> 추출용매에따른세포독성측정 추출용매에따른금은화추출물의세포독성을확인하기위해인간전립선상피세포인 RWPE-1 세포를이용하여 세포생존율을측정하였다. [0076] 세포는 96 웰플레이트 (96-well plate) 에 1 x 10 5 cell/200μl 로각웰에배양하였으며 CO 2 가 5% 로유지되는 36 세포배양기에서 24 시간배양하였다. 추출물은 DMSO를용매로사용하여 20 mg/ml 로희석하였으며도 2 에기재된농도로각 well에처리하였다. 약물이처리된플레이트는 CO 2 가 5% 로유지되는 36 세포배양기에서 24 시간배양하였다. 이후새로운배양액으로교체한뒤 WST-1 세포증식분석혼합액 (Biomax, Seoul, Korea) 을 10 μl/200μl씩각웰에추가하여 CO 2 가 5% 로유지되는 36 세포배양기에서 4 시간배양하였다. 배양이끝난플레이트는분광광도계를이용하여 440nm 파장의흡광도를측정하였다. [0077] DMSO 를단독으로넣은웰을기준으로세포독성을정량화한결과, 금은화물추출물은 500μg/ml, 금은화 30% 에탄올추출물은 100μg/ml, 금은화 50% 에탄올추출물은 50μg/ml, 금은화 70% 에탄올추출물과 100% 에탄올 추출물에서는 10μg/ml 의농도까지세포독성이없음을확인하였다 ( 도 2). [0079] [0080] < 실험예 4> 추출용매에따른 5 알파환원효소억제효과측정 인간전립선상피세포인 RWPE-1 을 8 x 10 5 /2ml 로배양하여 CO 2 가 5% 로유지되는 36 세포배양기에서 24 시간배 양하였다. 플레이트의배양액을새것으로교체한후 TP(4μM) 를 30분전처리하였다. 이후용매별금은화추출물을실험예 3에서측정한독성이없는농도로처리하여 CO 2 가 5% 로유지되는 36 세포배양기에서 8 시간배양하였다. 전립선비대증을유발시킨세포모델을웨스턴블롯 (western blot) 분석법을사용하여추출용매에따른금은화추출물의 5알파환원효소 2형 (5α-reductase-2, 5AR2) 의발현억제효과를분석하였다. [0081] 용매별추출물이처리된세포를 RIPA 버퍼 (50 mm Tris-HCl (ph 7.5), 0.1% 소듐도데실설페이트 (sodium dodecyl sulphate, SDS), 0.1% Triton X-100, 1% Nonidet P-40, 0.5% 소듐데옥시콜레이트 (sodium deoxycholate), 150 mm NaCl 및 1 mm 페닐메틸설포닐플루오라이드 (phenylmethylsulphonyl fluoride)) 로용해시킨후, 8% 소듐도데실설페이트-폴리아크릴아마이드겔 (sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel) 전기영동으로분리하고나이트로셀룰로스 (nitrocellulose) 멤브레인으로옮겼다. 멤브레인은실온에서 1시간동안 5% 탈지유가함유된 TBST(10mM Tris, 150mM NaCl 및 0.05% Tween20, ph 7.6) 로블로킹하고, TBST로세척한후, 5알파환원효소 2형 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 또는액틴 (β-actin, Santa Cruz - 8 -

9 Biotechnology, Inc.) 1차항체와함께 4 에서밤새동안배양하였다. 이어서멤브레인을실온에서 2시간동안적절한 horseradish peroxidase (Jackson Lab.) 가부착된 2차항체 (Amersham Biosciences, Westborough, MA, USA) 와반응시켰다. 목적단백질밴드는제조자의지시에따라강화된화학발광 (enhanced chemiluminescence, ECL) 용액 (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) 을사용하여 LAS 이미지게이지 (LAS Image Gauge) 프로그램에서측정하였으며, 그결과를도 3에나타내었다. [0082] [0083] 도 3에나타낸바와같이, 질병대조군 (TP로전립선비대증을유발시킨 vehicle 처리세포 ) 의경우정상군 (vehicle 처리세포 ) 보다 5알파환원효소 2형 (5AR2) 의발현이크게증가하였으나, 금은화추출물을투여한실험군의경우 5알파환원효소의발현증가가완화됨을확인하였고, 특히, 금은화물추출물및금은화 100% 에탄올추출물에서발현이가장크게억제됨을확인하였다. 따라서, 본발명의금은화추출물을유효성분으로포함하는조성물은전립선비대증의예방, 치료및개선용으로효과적으로사용될수있다. [0085] 이제까지본발명에대하여그바람직한실시예들을중심으로살펴보았다. 본발명이속하는기술분야에서통상의지식을가진자는본발명이본발명의본질적인특성에서벗어나지않는범위에서변형된형태로구현될수있음을이해할수있을것이다. 그러므로개시된실시예들은한정적인관점이아니라설명적인관점에서고려되어야한다. 본발명의범위는전술한설명이아니라특허청구범위에나타나있으며, 그와동등한범위내에있는모든차이점은본발명에포함된것으로해석되어야할것이다

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(52) CPC 특허분류 A23L 1/3002 ( ) A23L 1/337 ( ) A61K 2236/19 ( ) - 2 -

(52) CPC 특허분류 A23L 1/3002 ( ) A23L 1/337 ( ) A61K 2236/19 ( ) - 2 - (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/03 (2006.01) A23L 1/30 (2006.01) A23L 17/60 (2016.01) A23L 33/00 (2016.01) (52) CPC 특허분류 A61K 36/03 (2013.01) A23L 1/29 (2013.01) (21) 출원번호