22 현형을유지할것으로생각된다. 7 한편, Sharif 등 8 은미소변화형신증, focal segmental glomerulosclerosis ( 이하 FSGS) 및선천신증후군환자의신사구체상피세포에서 GLEPP1의발현이소실된다고보고한바있다. 또한, 원발성 collaps

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서수 곽
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1 대한병리학회지 : 제 36 권제 1 호 2002 The Korean Journal of Pathology. 2002; 36: 21-9 신사구체질환에서 Nephrin, Glomerular Epithelial ell Protein-1 (GLEPP1) 및 WT-1 발현에관한연구 서울대학교의과대학병리학교실 접수 : 2001년 11월 29일게재승인 : 2002년 1월 21일 책임저자 : 이현순우 서울시종로구연건동 28 서울대학교의과대학병리학교실전화 : Fax: Hyunsoon@plaza.snu.ac.kr ltered Expression of Nephrin, Glomerular Epithelial ell Protein-1 (GLEPP1) and WT-1 in Glomerular Disease young Kwon Kim, Ji Hoon Kim and Hyun Soon Lee Department of Pathology, Seoul National University ollege of Medicine, Seoul, Korea ackground : Glomerular epithelial cell protein-1 (GLEPP1) and WT-1 expressed in mature visceral glomerular epithelial cell (VGE) is required for maintenance of the mature status of VGE. Nephrin protein is located at the filtration slit and regarded as a molecular component of the slit diaphragm. lterations of these proteins in proteinuric diseases are not clearly defined. Methods : We investigated the expression of GLEPP1, WT-1 and nephrin in 28 renal biopsies diagnosed with minimal change nephropathy (n=10), focal glomerulosclerosis (n=10) and membranous nephritis (n=8) by immunohistochemical staining. Normal control biopsies were obtained from six nephrectomy specimens. Results : The patients consisted of 15 males and 13 females. The mean age was 40.7 years. Nephrotic range proteinuria ( 3.5 g/day) was noted in 15 (54%) patients. GLEPP1 and nephrin expression were significantly decreased in patients as compared with those of the controls (p<0.05). The mean number of WT-1 expressing cells per glomerulus was also significantly decreased in patients as compared with those of the controls (p<0.05). However, there was no significant difference in the number of WT-1 expressing cells among the disease groups. onclusions : These results suggest that the loss of biological markers of mature VGE may play an important role in the pathogenesis of proteinuria. Key Words : Nephrosis-Lipoid-Glomerulo Nephritis-iological Markers 신사구체상피세포는후분화상태 (post-mitotic status) 에있는고도로분화된세포로, 사구체기저막을합성하고사구체의선택적투과성을유지하며모세혈관토리 (capillary tuft) 를물리적으로지지하는기능을담당한다. 1 성숙한신사구체상피세포는발돌기가발달해있으며인접한상피세포의발돌기와깍지낌구조 (interdigitation) 를이루고있다. 이발돌기와발돌기사이는틈새막 (slit membrane) 으로연결되어있어서사구체의선택적투과성의유지에깊은관여를한다. 심한단백뇨를초래하는신사구체질환의경우특징적으로사구체상피세포에서틈새막의수가감소하고발돌기가광범위하게소실되는등의형태학적변화가공통적으로관찰된다. 그러나이러한형태학적변화가일어나는기전에대해서는현재까지확실히알려진바가없다. 그이유는, 신사구체상피세포에서특이적으로발현하며기능하는분자에대한이해가부족하기때 문이다. 그러나최근에는이에대한연구가활발하게이루어져신사구체상피세포에특이적으로발현하는단백들이발견되고있다. 이중에서 WT-1, Glomerular Epithelial ell Protein-1 (GLEPP1) 및 nephrin이신사구체상피세포의기능에있어서중요한단백으로대두되고있다. 2-5 GLEPP1은 receptor protein-tyrosine phosphatase family 에속하는단백이다. 2 이단백은신사구체발달단계상 S-shaped body stage에서부터신사구체상피세포에서발현하기시작하며, 성숙한상피세포에서는주로발돌기의꼭대기쪽막 (apical membrane) 에국한되어존재하므로발돌기의분화및유지에관여할것으로생각된다. 3 WT-1은 zinc finger transcription factor로서신장발달의초기에는모든미분화세포에서발현하며, 발달이진행될수록성숙한사구체상피세포에만국한하여발현한다. 6 이단백은세포증식을억제하며, 상피세포의성숙표 21

2 22 현형을유지할것으로생각된다. 7 한편, Sharif 등 8 은미소변화형신증, focal segmental glomerulosclerosis ( 이하 FSGS) 및선천신증후군환자의신사구체상피세포에서 GLEPP1의발현이소실된다고보고한바있다. 또한, 원발성 collapsing FSGS 및 human immunodeficiency virus (HIV) -associated nephropathy 환자의사구체에서 GLEPP1, WT-1 등의발현이소실된다는보고도있다. 9 따라서, 병적상태에서이들단백발현의이상과신사구체상피세포의형태학적변화가깊은연관이있을것으로생각되나아직이에대한연구가부족한상태이다. Nephrin은염색체 19q13.1에위치하는 NPSH1 유전자에서만들어지는단백이며, 선천신증후군환자를대상으로시행한연관분석을통해이유전자에돌연변이가있음이밝혀졌다. 4 이유전자로부터만들어진 nephrin은정상적으로발돌기사이에위치하고있으며, 이유전자에돌연변이가있는환자들은임상적으로심한단백뇨를보인다. 이단백이틈새막을이루는물질의하나로, 사구체의선택적투과성을유지하는데중요한기능을할것으로생각된다. 5 병적상태와연관하여이단백의발현및기능의이상에대해서는아직알려진바가많지않다. 그러나 Furness 등 10 은, 미소변화형신증환자로부터단일신사구체를추출하여시행한역전사중합반응에서 nephrin의 mrn가감소되어있음을보고한바있다. 따라서, 선천신증후군뿐아니라후천적으로신증후군을일으키는신사구체질환에서도 nephrin 의이상이관여할것으로생각되나아직은더많은연구결과가필요하다. 따라서, 본연구자는후천적으로신증후군을일으키는대표적인원발성사구체질환인미소변화형신증, FSGS 및막사구체신염을대상으로하여, 신사구체상피세포가보이는형태학적변화를관찰하고면역조직화학염색을통하여 GLEPP1, WT- 1 및 nephrin의발현양상에어떠한변화가있는지조사하고자하였다. 또한, 신사구체의발달단계에따른각단백의발현양상에대해서도함께조사함으로써성숙한신사구체상피세포의기능에관여하는각단백의역할을규명하고자하였다. 달단계에따른각단백의발현양상을알아보기위해태령약 20주경사산되어부검한태아의신장 3예를대상으로하였다. 병리조직학적검사신생검조직을삼분하여광학현미경, 면역형광현미경및전자현미경검사를시행하였다. 광학현미경검사용조직은 4% paraformaldehyde에고정한후파라핀에포매하고연속박절하였다. 그후 HE 염색과 Periodic acid-schiff (PS) 염색을시행하였다. 면역형광현미경검사용조직은 Tissue-Tek O..T. 혼합체에포매하고 isopentane에담가액화질소에급냉한후 -70 냉동고에보관하였다. 그후냉동절편하여 fluorescein isothiocyanate (FIT) 가부착된사람의 IgG, IgM, Ig, 3, 1q 및 fibrinogen에대한각각의항체를이용하여면역형광염색을시행하였다. 전자현미경검사용조직은 glutaraldehyde에고정한후 1% osmium tetroxide에서후고정한다음 epon으로포매하였다. 포매된조직에서 1 m 두께의절편을얻고 1% toluidine blue로염색한후, 경화성변화가없고절단면이중심부를통과하는신사구체를선택하여 LK ultramicrotome을이용한초미세박절을얻었다. 이것을 uranyl acetate와 lead citrate로염색한다음투과전자현미경으로관찰하였다. 신사구체면적의측정신사구체면적은현미경에부착된디지털카메라 (D color camera, IK-T40, Toshiba, Japan) 로영상을획득한뒤형태계측용프로그램 (Image-Pro Plus TM ver 3.1, Media-ybernetics, U.S..) 을이용하여측정하였다. 먼저 200배시야에서기준이되는눈금자를영상으로획득한뒤길이를 m 단위로표준화하였다. 이후동일시야에서사구체를영상으로획득한뒤사구체토리의외곽선을기준으로사구체토리면적을구하였다. 여기서구한사구체면적의단위는 m 2 로나타내었다. 재료와방법환자 1999년 10월부터 2000년 3월까지서울대학교병원병리과에의뢰되어미소변화형신증으로진단된 10예, FSGS로진단된 10예및원발성막사구체신염으로진단된 8예를대상으로하였다. 각환자에서생검당시의연령, 성별, 혈압, 혈청의총단백, 알부민, 요질소, 크레아티닌, 콜레스테롤농도, SGOT, SGPT, 3, 4, H50, 요검사, 24시간요단백량과크레아티닌청소율등의임상검사치를조사하였다. 대조군으로는신세포암종으로진단되어신장을적출한성인신장 6예를사용하였다. 또한, 발 면역조직화학염색본연구에사용한일차항체는토끼의다클론항체인 antihuman GLEPP1 ( 미국미시간대학의 Dr. Roger Wiggins로부터기증 ) 과받은생쥐의 anti-human nephrin 단클론항체 ( 핀란드 Oulu대학의 Dr. Vesa Ruotalainen으로부터기증 ) 및토끼의다클론항체인 anti-human WT-1 (Santa ruz,, U.S..) 등이다. nti-human GLEPP-1은 1:1600, anti-human WT1과 anti-human nephrin은 1:100으로희석하여사용하였다. 면역조직화학염색은 streptavidin-biotin Kit (LS, DKO, Denmark) 를이용하여 avidin-biotin immunoperoxidase complex () 방법으로시행하였다. nti-human GLEPP-1의염색과정을요약하면다음과같다. 동결절편을 4 m 두께로

3 사구체질환에서 nephrin, GLEPP1 및 WT-1 23 잘라 10분간공기중에서건조시킨후냉아세톤용액에 20분간고정하고실온에서 20분간건조시켰다. 이를인산염완충액으로세척하고차단혈청으로 20분간반응시켰다. 여기에일차항체인 anti-human GLEPP-1을가해실온에서 1시간동안반응시킨후인산염완충액으로세척하고이차항체인 biotinylated antimouse and anti-rabbit Ig을가한후 20분간반응시켰다. 인산염완충액으로세척후 strepavidin을 30분간작용시키고다시인산염완충액으로세척하였다. 여기에 diaminobenzidine (D) 으로발색시키고흐르는수돗물에 10분간수세후 Mayer s hematoxylin으로대조염색을하였다. nti-human WT1과 anti-human nephrin 염색과정을요약하면다음과같다. 파라핀에포매된조직을 4 m 두께로잘라크실렌과알코올로단계적인탈파라핀과정을거쳤다. 구연산완충액 (10 mm, ph 5.0) 에담근뒤저주파로 15분간처리한후실온에서서서히온도를낮추었다. 인산염완충액으로수세후 3% 과산화수소수에 5분간작용시키고다시인산염완충액으로세척후 20분간차단혈청을반응시켰다. 여기에일차항체로 anti-human WT1이나 anti-human nephrin을가하고 4 에서밤사이반응시켰다. 이차항체를가하고 30분간반응시킨뒤인산염완충액으로세척하였고이를 streptoavidine에 30분간작용시킨다음다시인산염완충액으로세척하였다. D로발색시키고 5분간수세후 Mayer s hematoxylin으로대조염색하였다. GLEPP1과 nephrin의경우경화증이없는신사구체를대상으로하여, 염색양상에따라다음과같이분류하였다. 신사구체소방에서국소적으로염색상이완전히소실된사구체, 국소적으로정상에비해그염색강도가 50% 이상감소한신사구체및정상과동일한발현양상을보이는신사구체로나누어각각의경우에대해 1점, 2점과 3점의점수를주고이점수의평균값을각환자별로산출하였다. 그리고각질환별로속해있는환자들사이에서이값의차이를비교하였다. WT-1의경우에는 WT-1을발현하는신사구체내세포수를모든신사구체에서구한후평균을구하여이를각질환별로비교하였다. 통계처리각신사구체질환에서구한평균사구체면적, 사구체하나당 WT-1을발현하는세포수, GLEPP1 및 nephrin을발현하는정도는평균 ± 표준편차로표기하였다. 이들값의차이는일원배치분산분석 (one-way analysis of variance) 및 Wilcoxon rank sum test를통해분석하였다. p-value가 0.05 미만인경우에의미있는것으로판정하였다. 결과임상소견환자의임상병리적소견은 Tabel 1에요약하였다. 환자수는총 28명이었으며, 이중남자는 16명, 여자는 12명이었다. 환자의연령은미소변화형신증은 22세에서부터 69세 (43.4±18.8), FSGS는 5세에서부터 51세 (28.2±16.7), 막성신증은 22세에서부터 64세까지 (49.1±13.9) 분포하였다. 24시간요단백량은각각미소변화형신증의경우 6.0±4.6 g/day, FSGS에서 5.8± 4.3 g/day, 막성신증에서 6.1±4.5 g/day였다. 혈중요질소수치는미소변화형신증에서 22.8±13.1 mg/dl, FSGS에서 19.2 ±9.5 mg/dl 및막성신증에서 14.6±5.3 mg/dl였으며, 혈중크레아티닌수치는각각미소변화형신증에서 1.1±0.6 mg/dl, FSGS에서 0.9±0.3 mg/dl 및막성신증에서 1.0±0.4 mg/ dl였다. 사구체면적의형태계측평균사구체토리면적 (mean glomerular tuft area) 은 Table 1에요약하였다. 이값은정상대조군과미소변화형신증에서는유사한값을보여주었고, 막사구체신염과 FSGS 순으 Table 1. haracteristics of patients with glomerular diseases MD FSGS MN ontrol n ge (years) 43.4± ± ± ±15.3 Sex (M:F) 7:3 6:4 3:5 5:1 Nephrotic range proteinuria a (n) N Serum albumin (g/dl) 2.2± ± ±0.5 N Renal insufficiency b N Hypertension (n) N Mean glomerular tuft area ( m 2 ) 12,331±3,524 15,290±5,936 c 14,078±3,912 12,355±2,134 Glomerulosclerosis (%) MD: minimal lesion, FSGS: focal segmental glomerulosclerosis, MN: membranous nephropathy, M: male, F: female, N: not available. Values are mean±sd. Glomerulosclerosis; mean percentage of glomerulus showing global sclerosis or focal segmental sclerosis. a Nephrotic range proteinuria: 3.5 g/day. b Renal insufficiency: serum creatinine >1.5 mg/dl. c p<0.05 by NOV.

24 Fig. 1. Glomerular epithelial cell protein-1 (GLEPP1) expression in developing glomeruli.

() Mature glomerulus shows linear staining pattern of GLEPP1 along capillary wall. Fig. 3.

() No nephrin expression is detected in S-shaped body stage of nephrogenesis.

() In mature glomeruli, nephrin expression at cell body is decreased and staining pattern

WT-1 expression in developing glomeruli.

() ut, it is restricted to glomerular epithelial cells through capillary-loop stage.

로그값이증가하는양상을보였다. FSGS에서이수치는정상과비교하였을때유의한차이를보였다 (12,355±2,134 vs.

apillary-loop stage에서는상피세포의세포막에서강하게발현하였다 (Fig. 1). 성숙한사구체로발달이진행되면서모세혈관벽에연하여선형으로강하게발현하였다 (Fig.

4 24 Fig. 1. Glomerular epithelial cell protein-1 (GLEPP1) expression in developing glomeruli. () GLEPP1 is weakly expressed in apical surface of the glomerular epithelial cells in S-shaped body stage. () In capillary-loop stage, GLEPP1 expression is increased but, still restricted to cell body. () Mature glomerulus shows linear staining pattern of GLEPP1 along capillary wall. Fig. 3. Nephrin expression in developing glomeruli. () No nephrin expression is detected in S-shaped body stage of nephrogenesis. () In early capillary-loop stage, nephrin expression is noted at the cell body of podocytes. () In mature glomeruli, nephrin expression at cell body is decreased and staining pattern becomes finely linear along capillary wall. 15,290±5,936, p<0.05). 발달단계에따른단백발현양상 Fig. 2. WT-1 expression in developing glomeruli. () In S-shaped body stage, WT-1 is weakly expressed in immature cells. () ut, it is restricted to glomerular epithelial cells through capillary-loop stage. () In mature glomeruli, glomerular epithial cells show strong nuclear staining of WT-1. 로그값이증가하는양상을보였다. FSGS에서이수치는정상과비교하였을때유의한차이를보였다 (12,355±2,134 vs. GLEPP1은 S-shaped body stage에서부터발현하기시작하였다. 이때에는주로미성숙상피세포의꼭대기쪽세포막에서약하게발현하였다 (Fig. 1). apillary-loop stage에서는상피세포의세포막에서강하게발현하였다 (Fig. 1). 성숙한사구체로발달이진행되면서모세혈관벽에연하여선형으로강하게발현하였다 (Fig. 1). WT-1은 vesicle stage 및 S-shaped body stage에서미성숙세포의핵에서약하게발현하였다 (Fig. 2). apillary-loop stage에서는신사구체상피세포에국한되어발현하였다 (Fig. 2). 성숙한사구체에서는 WT-1이더욱강하게발현하였다 (Fig. 2). Nephrin은 vesicle stage 및 S-shaped body stage에서는발현하지않았다 (Fig. 3). 초기 capillary-loop stage에서신사구체상피세포의세포체에서발현하기시작하였다 (Fig. 3). apillary-loop stage의후반으로발달이진행하면서세포체에서의발현은더욱증가하였다. 성숙한사구체가되면서세포체에서의발현은급격히감소하였고, 사구체모세혈관벽을따라미세한선형으로강하게발현하였다 (Fig. 3).

사구체질환에서 nephrin, GLEPP1 및 WT-1 25 D D Fig. 4. Glomerular epithilial cell protein-1 (GLEPP1) expression in glomerular disease.

() normal-looking glomerulus from the patient with minimal lesion shows focally decreased expression of GLEPP1.

(D) glomerulus from the patient with membrnaous nephropathy shows focal loss of GLEPP1 staining. Table 2.

FSGS: focal segmental glomerulosclerosis, MN: membranous nephropathy. Values are mean±sd. a p<0.05 by NOV. b p<0.05 vs.

5 a 2.7±0.4 b 20.0±7.6 a FSGS (n=10) 1.7±0.5 a 2.0±0.6 a 19.3±3.5 a MN (n=8) 1.8±0.8 a 1.7±0.6 a 15.9±3.

미소변화형신증에서는정상과동일한양상으로발현하는사구체도관찰되었으나 GLEPP1의발현이국소적으로감소되거나소실된사구체도관찰되었다 (Fig. 4). 미소변화형신증환자에서관찰한전체 41개의사구체중 23개의사 Fig. 5.

() histologically normal glomerulus from minimal lesions shows wide decrease and loss of nephrin expression.

capillary lumen. (D) In the glomeruli from membranous nephropathy patients, nephrin expression is partly decreased or lost.

5 사구체질환에서 nephrin, GLEPP1 및 WT-1 25 D D Fig. 4. Glomerular epithilial cell protein-1 (GLEPP1) expression in glomerular disease. () Normal glomerulus shows linear staining pattern along capillary wall. () normal-looking glomerulus from the patient with minimal lesion shows focally decreased expression of GLEPP1. () GLEPP1 expression is severly decreased in the glomerulus from the patient with focal glomerulosclerosis. (D) glomerulus from the patient with membrnaous nephropathy shows focal loss of GLEPP1 staining. Table 2. Expression of Glomerular epithilial cell protein-1 (GLEPP1), nephrin and WT-1 in glomerular diseases GLEPP1 사구체질환에서단백발현양상 Nephrin MD: minimal lesion, FSGS: focal segmental glomerulosclerosis, MN: membranous nephropathy. Values are mean±sd. a p<0.05 by NOV. b p<0.05 vs. normal control by Wilcoxon rank sum test. Mean number of WT-1 expressing cells per glomerulus ontrol (n=6) 3.0± ± ±3.2 MD (n=10) 2.2±0.5 a 2.7±0.4 b 20.0±7.6 a FSGS (n=10) 1.7±0.5 a 2.0±0.6 a 19.3±3.5 a MN (n=8) 1.8±0.8 a 1.7±0.6 a 15.9±3.5 a GLEPP1은정상대조군의경우사구체에서모세혈관벽을따라선형으로강하게발현하였다 (Fig. 4). 정상대조군에서는 GLEPP1의발현이국소적으로감소되거나소실되는경우는관찰되지않았다. 미소변화형신증에서는정상과동일한양상으로발현하는사구체도관찰되었으나 GLEPP1의발현이국소적으로감소되거나소실된사구체도관찰되었다 (Fig. 4). 미소변화형신증환자에서관찰한전체 41개의사구체중 23개의사 Fig. 5. Nephrin expression in glomerular disease. () ll the glomeruli from normal control show fine linear staining pattern of nephrin along capillary wall. () histologically normal glomerulus from minimal lesions shows wide decrease and loss of nephrin expression. () Nephrin expression is severly decreased in the glomeruli from focal glomerulosclerosis patients showing increased cellularity and narrowing of capillary lumen. (D) In the glomeruli from membranous nephropathy patients, nephrin expression is partly decreased or lost. 구체에서 GLEPP1의발현이국소적으로감소하거나소실되었으며, GLEPP1 발현정도를나타내는값은정상대조군과비교하였을때유의하게감소하였다 (Table 2, p<0.05). FSGS에서는 GLEPP1이정상과동일한양상으로발현하는사구체와함께이의발현이국소적으로감소하거나소실되는사구체도관찰되었다 (Fig. 4). 이러한소견을보이는사구체는 FSGS의경우총 54개의사구체중 46개에해당하였으며, GLEPP1 발현정도를나타내는값은정상대조군에비해유의하게감소하였다 (Table 2, p<0.05). 막사구체신염의경우 GLEPP1의발현이감소하는소견을총 23개의사구체중 18개의사구체에서관찰할수있었다 (Fig. 4D). GLEPP1 발현정도를나타내는값은막사구체신염에서도정상대조군과비교하였을때유의하게감소하였다 (Table 2, p<0.05). 경화증이동반된사구체에서는경화된곳으로갈수록발현이감소하다가완전히경화된곳에서는전혀발현하지않았다. Nephrin 은정상대조군의모든사구체에서모세혈관벽을따라미세한선형으로강하게발현하였다 (Fig. 5). 정상대조군의사구체에서 nephrin의발현이감소되거나소실되는경우는관찰되지않았다. 미소변화형신증에서는대부분의사구체가정상과동일한발현양상을보였으나, 총 42개의사구체중 14개의사구체에서 nephrin의발현이국소적으로감소하였다 (Fig.

미소변화형신증에서 nephrin 발현정도를나타내는값은정상대조군과비교하였을때유의하게감소하였다 (Table 2, p<0.05). FSGS에서도신사구체내 nephrin의발현이국소적으로감소하거나소실된사구체를관찰할수있었다 (Fig. 5).

6 26 Fig. 6. WT-1 expression in glomerular disease. () glomerulus from control kidney shows strong nuclear staining of WT-1 protein. () WT-1 expression is decreased in podocytes adjacent to sclerotic glomerular tuft (arrows) in the glomeruli from patients with focal glomerulosclerosis. 5). 미소변화형신증에서 nephrin 발현정도를나타내는값은정상대조군과비교하였을때유의하게감소하였다 (Table 2, p<0.05). FSGS에서도신사구체내 nephrin의발현이국소적으로감소하거나소실된사구체를관찰할수있었다 (Fig. 5). FSGS에서이러한사구체는전체 49개의사구체중 40개를차지하였으며, nephrin 발현정도를나타내는값은정상대조군과비교하였을때유의하게감소한값을보였다 (Table 2, p<0.05). 막사구체신염에서신사구체내 nephrin의발현양상이정상과동일하게발현되는경우는관찰되지않았다. 포함된전체 40개의사구체모두에서 nephrin의발현이국소적으로감소되거나소실되었으며 (Fig. 5D), nephrin 발현정도를나타내는값도정상대조군과비교하여보았을때유의하게작았다 (Table 2, p<0.05). 경화증이있는사구체에서 nephrin의발현양상은 GLEPP-1과마찬가지로경화된부분으로갈수록발현이감소하다가경화된곳에서는전혀발현하지않았다. WT-1은정상대조군의신사구체상피세포의핵에서강하게발현하였다 (Fig. 6). 미소변화형신증도정상사구체와마찬가지로사구체상피세포의핵에서강한 WT-1의발현을확인할수있었다. FSGS 및막성신증에서경화증이동반된사구체내에서, 정상사구체의상피세포핵에서는 WT-1이발현하지만경화된곳으로갈수록 WT-1의발현이감소하였고, 완전히경화된부분에서는 WT-1을발현하는세포가전혀관찰되지않았다 (Fig. 6). 사구체하나당 WT-1을발현하는평균세포수 (mean number of WT1-expressing cells per glomerulus) 를구한값은 Table 2에요약되어있다. 이들측정한값은미소변화형신증, FSGS 및막사구체신염모두에서정상대조군에 비하여감소하였고이는통계적으로유의하였다 (Table 2, p<0.05). 고찰본연구에서저자들은신사구체발달단계에서 GLEPP1, WT-1 및 nephrin의발현양상을확인하였고, 대표적인신증후군성사구체질환인미소변화형신증, FSGS 및막사구체신염에서이들단백의발현이정상에비해감소하는사실을확인하였다. 신사구체상피세포는발달하는과정에서형태학적인변화와더불어여러단백질의발현양상의변화도함께보인다. 사구체발달단계는 vesicle sgage, S-shaped body stage, capillary loop stage 및 mature glomeruli의넷으로나눌수있다. 11 특히, 사구체가 S-shaped body sgate에서 capillary loop stage로이행될때사구체상피세포는미성숙한세포에서유사분열을멈추고특징적인발돌기를갖는성숙한세포로분화하게된다. 이러한발달과정에서세포증식능을나타내는 proliferating cell nuclear antigen과 Ki-67의발현은줄어들고 WT-1의발현은점점증가한다. 2 또한, podocalyxin, GLEPP-1, ZO-1 단백과조혈계표지자인 LL, 3b receptor 등도 S-shaped body stage에서발현하기시작하며상피세포가분화함에따라그발현이더욱증가한다. 12 신사구체발달에따른 GLEPP1 및 WT-1의발현양상은이전에보고한다른저자들의결과와크게다르지않다. 8,9 Nephrin 의경우는아직이에대한보고가없었던바처음으로

7 사구체질환에서 nephrin, GLEPP1 및 WT-1 27 이를확인하였다. WT-1은신사구체가발달함에따라사구체상피세포에국한하여그발현이점점증가하였다. 이는신사구체상피세포의증식능과역비례관계에있는바로, WT-1의기능이세포주기를억제한다는기존의결과와잘부합한다고생각된다. GLEPP1은신사구체상피세포의꼭대기쪽막에서약하게발현하기시작하였다. 이후 capillary-loop stage와 mature glomeruli를거치면서세포체 (cell body) 에서뿐만아니라, 발돌기쪽으로그발현이이동하여모세혈관벽을따라선형으로강하게발현하였다. Nephrin은초기 capillary stage에서사구체상피세포의꼭대기쪽막및가쪽막에서강하게발현하다가후기로진행하면서모세혈관벽에연하여아주미세한선형으로발현하였는데이는 GLEPP1의발현양상과유사하다. 즉, 이들단백은발돌기의발달과더불어발현이증가함과동시에발돌기쪽으로이동하였다. 따라서, GLEPP1과 nephrin은신사구체상피세포의발돌기의발달과매우밀접한연관이있을것으로생각된다. 한편, nephrin도성숙한상피세포로분화함에따라발현한다는점에서 GLEPP1, WT-1과마찬가지로성숙표현형을나타내는생화학적지표로볼수있겠다. 사구체질환중에서 GLEPP1, WT-1 등의성숙형을나타내는지표들의감소는 HIV-associated nephropathy와 collapsing FSGS에서보고된바가있다. 9 이들연구결과에의하면, 실험군에포함된미소변화형신증, 막사구체신염의경우 GLEPP1 과 WT-1은정상과동일한양상으로발현한다고보고하였다. 그러나이들저자들은사구체에서성숙형을나타내는지표들의발현양상을, 전혀발현하지않는경우와정상과동일하게발현하는두유형으로만구분하였다. 그러나 Sharif 등 8 은 FSGS의경우에도 GLEPP1이세포체 (cell body) 쪽으로이동하는양상과더불어국소적으로발현이소실된다는결과를보고한바가있어, 본저자들은보다많은사구체를대상으로개개의사구체상피세포에서이들단백발현의미소한차이를자세하게관찰해볼필요성을느꼈다. 그결과, 본연구에서저자들은미소변화형신증에서도정상에비해발현이감소하는경우를확인할수있었으며, FSGS 및막사구체신염에서는국소적으로소실되는경우도관찰하였다. WT-1의경우도미소변화형신증, FSGS 및막사구체신염모두에서발현하기는하였지만, 사구체하나당 WT-1을발현하는세포의수를산출하였을때에는정상에비해이모든경우에서그값이감소하는사실을확인하였다. 후천적으로발생하는신증후군성사구체질환에서아직 nephrin의발현에대해서는연구된결과가없었으나본저자들이이를처음으로확인하였다. 정상대조군의경우 nephrin의발현이감소한사구체는관찰되지않았다. 그러나미소변화형신증, FSGS 및막사구체신염모두에서국소적으로 nephrin의발현이감소하거나소실된사구체가관찰되었다. 질환간에이러한소견을동반하는사구체의비율에약간의차이는있지만, 이들질환모두 nephrin 발현정도를나타내는값은정상대조군과비교해보았을때유의하게감소하였다. Furness 등 10 이사람에서채취한단일신사구체를대상으로 nephrin mrn의발현을역전사중합반응과 ELIS법으로확인한결과정상에비해미소변화형신증에서 nephrin mrn 의발현이현저하게감소하였고, 막사구체신염의경우는정상과비슷한정도로발현하는것을보고하였다. 그러나본저자들이면역조직화학적방법으로확인해본결과막성신증의경우에도상당수의사구체에서 nephrin의발현이감소함을확인하였다. Furness 등의실험에는한명의막성신증환자를대상으로하였으며, 또한이환자에게서시행한생검조직에서오직한개의신사구체만을선택한반면, 본저자들은 8명의환자에게서약 40개의신사구체를대상으로하였으므로본저자들의결과가통계적인면에서더신뢰성이있다고판단된다. 또한, 본저자들은면역조직화학적검사방법으로단백발현을관찰한것이나, 이들저자들은역전사중합반응에의해 mrn의발현을본것이므로, 이러한방법상의차이에의해서도다른결과를보일수있다고생각된다. 사람에게서심한단백뇨를유발하는질환들은신사구체상피세포의발돌기가광범위하게소실되고일부의경우에는기저막에서탈락되는등의소견을공통적으로보이며, 이러한변화는동물을대상으로한 aminonucleoside 신증모델에서도관찰된다. 13,14 이는사구체상피세포의정교한구조가사구체의선택적투과성을유지하는데중요한역할을하고있음을입증한다. 그러나신증후군을초래하는다양한신사구체질환에서상피세포의형태학적변화가나타나는기전에대해서는아직까지명확하게알려진바가없다. 일부의연구자들은신사구체상피세포의탈분화 (dedifferentiation) 에의해이들질환이발생한다는가설을제시하고있다. 8 그근거로는, 신증후군을일으키는질환에서관찰되는신사구체상피세포의전자현미경적특징이미성숙상피세포와흡사한소견을보이며, 11 이러한사구체질환에서 GLEPP1의발현양상도미성숙상피세포와흡사한양상을보이기때문이다. 8 또한, FSGS에서드물지만사구체상피세포의유사분열이관찰되었다는보고도이를지지하는것으로생각된다. 15 한편, 원발성 collapsing FSGS와 HIV-N의경우에도상피세포의발돌기소실과더불어서유사분열이비교적빈번히관찰되며, 이른바성숙형을나타내는지표들인 GLEPP1, WT- 1, podocalyxin 등의발현이현격히감소하거나소실되며 Ki-67 이재발현한다. 9 한편, 저자들은본연구에포함된미소변화형신증, FSGS 및막사구체신염의경우도, 비록 HIV-associated nephropathy와원발성 collapsing FSGS의경우처럼현격하지는않더라도, 성숙형의지표들이동일하게감소함을확인하였다. 비록현재까지이들사구체질환을일으키는요인이분명히밝혀진것은아니지만, 여러요인들로인해상피세포가손상을입고변성되면서보이는일련의형태학적변화와생화학적지표들의변화가위에서열거한질환들에유사하게나타나는점으로미루어볼때, 이들모든신증후군을초래하는질환의발생에는공통된병태생리적기전이작용하는것으로생각된다.

8 28 그렇다면이들단백의발현에변화가생기는것이신사구체상피세포의기능과구조와는직접적으로어떠한연관이있는가에대해의문이제기될것이다. Topham 등 16 은사람의사구체상피세포를대상으로한실험에서세포골격과국소접착 (focal adhesion) 을유지하는데황화 (phosphorylation) 와탈황화 (dephosphorylation) 의균형이중요함을밝힌바있다. GLEPP1은염기서열분석결과세포질내의부분이 tyrosine phosphatase 기능을할것으로생각된다. 3,17 또한, 분리된토끼와쥐의사구체에 GLEPP1의세포막밖의부분을인지하는항체를처리하였을때단백질의유출이유발된다는보고도있어, 이단백이세포내신호전달체계에영향을미칠것으로생각된다. 18 따라서, 여러병적상태에서 GLEPP-1의발현이감소하게되면발돌기의구조를유지하는분자의황화상태에영향을주게되어형태학적변화를초래할것으로생각된다. 그러나, GLEPP1이세포내분자들의황화상태에직접영향을줄수있는지에대해서는아직실험적인증거들이불충분하다. 한편, Nephrin은여덟개의 Ig-like motive, 한개의 fibronectin type III-like domain, transmembrane domain과 intracellular domain 으로구성된다. 5 세포막밖에있는여덟개의 Ig motive 는인접한 nephrin의동일부분과서로접착하여틈새막사이에서발돌기와발돌기를부착시키는접착분자로서의기능을담당할것으로추측된다. 따라서, nephrin이사구체상피세포에서여러요인에의해감소하게되면발돌기사이의접착력이떨어지게되고발돌기가소실되며, 그결과단백뇨를초래하게될것으로생각된다. 그러나 nephrin이실제로접착분자로기능을하는지아직실험적으로입증되지않았다. 사구체상피세포를포함하여완전히분화된세포에서세포의증식과분화는, 잘알려진바와같이상호배타적관계에있다. 근조직분화과정에서 MyoD는 p21의전사를통해세포증식을억제하고근세포내에여러단백의합성을유도하여, 근세포의형태학적및생화학적분화를유도한다. 한편 Englert 등 7 은골육종기원의세포주를통한실험에서 WT-1에의해 p21단백이유도됨을입증한바있다. 따라서, 여러요인에의해손상받은신사구체상피세포에서 WT-1이하향조절 (down regulation) 되면억제되어있던세포증식능이재발현하고, 성숙한상피세포에서발현하는단백들에중대한변화가오게될것이다. 그러나위에서약술한기전들이신사구체상피세포에서도동일하게작용하는지를입증하기위해서는더많은연구가필요할것이다. 요약하면, 신사구체상피세포의발돌기와틈새막으로이루어지는정교한구조는신사구체의선택적투과성을유지하는데중요한구성요소이다. 상피세포는발달과정을통해이러한구조를획득하게된다. 상피세포는성숙한세포로분화함에따라형태학적분화와더불어서, GLEPP1, WT-1 및 nephrin 등의발현등생화학적분화가동반하여나타난다. 따라서, 이들단백은신사구체상피세포의분화를유도하고성숙한상태를유지 하는데중요한역할을담당할것으로생각된다. 한편, 심한단백뇨를초래하는신사구체질환에서는공통적으로발돌기소실과상피세포의탈락등이빈번히관찰되는바, 신사구체상피세포의손상으로인한형태학적변화가이들질환에있어서중요한병태생리적기전으로작용함을알수있다. 본연구에포함된미소변화형신증, FSGS 및막사구체신염은모두심한단백뇨를초래하는대표적신사구체질환으로이들질환에서상피세포의형태학적변화가관찰됨과동시에성숙형을나타내는 GLEPP1, WT-1 및 nephrin의발현이정상에비해감소하였다. 그리고이러한지표의변화는질환들간의차이에도불구하고공통적으로관찰되었다. 따라서, 단백뇨를초래하는이들신사구체질환의발생에는공통된병태생리적기전이작용할것으로생각되며, 또한이들지표의감소가이러한과정에서중요한역할을담당할것으로판단된다. 참고문헌 1. Mundel P, Kriz W. Structure and function of podocytes: an update. nat Embryol 1995; 192: Mundlos S, Pelletier J, Darveau, achmann M, Winterpacht, Zabel. Nuclear localization of the protein encoded by the Wilms tumor gene WT1 in embryonic and adult tissues. Development 1993; 119: Thomas PE, Wharram L, Goyal M, Wiggins JE, Holzman L, Wiggins R. GLEPP1, a renal glomerular epithelial cell (podocyte) membrane protein tyrosine phosphatase: Identification, molecular cloning, and characterization in rabbit. J iol hem 1980; 169: Kestilae M, Lenkkeri U, Maennikkoe M, et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein-nephrin-is mutated in congenital nephrotic syndrome. Mol ell 1998; 1: Ruotsalainen V, Ljungberg P, Wartiavaara J, et al. Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes. Proc Natl cad Sci US 1999; 96: Mundel P, Reiser J, Kriz W. Introduction of differentiation in cultured rat and human podocytes. J m Soc Nephrol 1997; 8: Englert, Maheswaran S, Garvin J, Kreidberg J, Harber D. Induction of p21 by the Wilms tumor suppressor gene WT1. ancer Res 1997; 57: Sharif K, Goyal M, Kershaw D, Kunkel R, Wiggins R. Podocyte phenotype as defined by expression and distribution of GLEPP-1 in the developing glomerulus and in nephrotic glomeruli from MD, NF and FSGS. Exp Nephrol 1998; 6: arisoni L, Kriz W, Mundel P, D aggati V. The dysregulated podocyte phenotype: a novel concept in the pathogenesis of col-

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