(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 15/63 (2006.01) G01N 33/52 (2006.01) G01N 33/58 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01) (21) 출원번호 10-2012-0063804 (22) 출원일자 2012 년 06 월 14 일 심사청구일자 2012 년 06 월 14 일 (65) 공개번호 10-2013-0023057 (43) 공개일자 2013 년 03 월 07 일 (30) 우선권주장 1020110086057 2011 년 08 월 26 일대한민국 (KR) (56) 선행기술조사문헌 US20060134629 A1 KR1020080036547 A 2011 년도한국생물공학회춘계학술발표대회. 2011.4, p.190* Gene Therapy. 2002, Vol.9, pp.337-344* * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2015년05월12일 (11) 등록번호 10-1519627 (24) 등록일자 2015년05월06일 (73) 특허권자 한국생명공학연구원 대전광역시유성구과학로 125 ( 어은동 ) (72) 발명자 이승구 대전광역시유성구과학로 125 ( 어은동 ) 최수림 대전광역시유성구과학로 125 ( 어은동 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 손민 전체청구항수 : 총 18 항심사관 : 문동현 (54) 발명의명칭생체내단백질간상호작용의분석방법 (57) 요약 본발명은세포내단백질간상호작용을분석하는방법에관한것으로, 보다구체적으로목적 (bait) 단백질, 제 1 형광단백질및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로구성된제 1 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제 1 구조물, 및표적 (prey) 단백질및제 2 형광단백질로구성된제 2 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제 2 구조물을포함하는세포를제공하고, 상기융합단백질을발현시켜세포내에서봉입체 (inclusion body) 를형성시킨다음, 형광단백질의형광신호를측정하여세포내단백질간상호작용을분석하는방법, 상기구조물들을포함하는세포를이용하여목적단백질과결합하는표적단백질을분리하는방법, 상기세포, 및상기구조물을포함하는단백질간상호작용분석용키트에관한것이다. 대표도 - 도 1-1 -
(72) 발명자감종식대전광역시유성구과학로 125 ( 어은동 ) 송재준대전광역시유성구과학로 125 ( 어은동 ) 이상준 대전광역시유성구과학로 125 ( 어은동 ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 20110701-305-696-001-04-00 부처명 연구관리전문기관 연구사업명 연구과제명 기여율 15/100 농림수산식품부 농촌진흥청 차세대바이오그린 21 사업 인공유전자회로기술개발 주관기관 한국생명공학연구원 연구기간 2011.05.01 ~ 2011.12.31 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 20110701-305-696-001-06-00 부처명 연구관리전문기관 연구사업명 연구과제명 기여율 15/100 농림수산식품부 농촌진흥청 차세대바이오그린 21 사업 Phyto- 센서부품 / 모듈통합및가시화 주관기관 한국생명공학연구원 연구기간 2011.05.01 ~ 2011.12.31 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 연구관리전문기관 KGM0121113 교육과학기술부 기초기술연구회 연구사업명주요사업 ( 연구개발과제 ) 연구과제명 기여율 10/100 Livecell imaging 핵심기술개발및활용연구 주관기관 한국생명공학연구원 연구기간 2011.01.01 ~ 2011.12.31 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 2011-0002344 부처명 연구관리전문기관 교육과학기술부 한국연구재단 연구사업명원천기술개발사업 ( 첨단융합기술 ) 연구과제명 기여율 30/100 통합적단백질설계를위한고속친화도분석및스크리닝기술개발 주관기관 한국생명공학연구원 연구기간 2011.03.01 ~ 2012.02.29 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 1345142202 부처명 연구관리전문기관 교육과학기술부 기초기술연구회 연구사업명협동연구개발사업 ( 기초기술연구회 ) 연구과제명 기여율 30/100 Cellulose-basedbiofuel 생산효율향상을위한합성생물학기술 주관기관 한국생명공학연구원 연구기간 2010.12.15 ~ 2011.12.31-2 -
명세서청구범위청구항 1 (i) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광단백질및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로구성된제1 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제1 구조물, 및표적 (prey) 단백질및제2 형광단백질로구성된제2 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제2 구조물을포함하는, 진핵세포를제공하는단계 ; (ii) 상기융합단백질을발현시켜진핵세포내에서봉입체 (inclusion body) 를형성시키는단계 ; 및 (iii) 목적단백질과표적단백질의상호작용을형광단백질의형광신호로측정하는단계를포함하는, 진핵세포내단백질간상호작용을분석하는방법. 청구항 2 제 1 항에있어서, (iv) 봉입체에형광이응집되면목적단백질및표적단백질이상호작용하는것으로판단하는 단계를추가로포함하는방법. 청구항 3 제 1 항에있어서, 상기방법은목적단백질과표적단백질간의상호작용을형광단백질의형광으로정량적으로 분석하는것인방법. 청구항 4 제 1 항에있어서, 상기 (i) 단계의제 1 구조물및제 2 구조물은별개의벡터또는하나의벡터내에존재하는것 인방법. 청구항 5 제 4 항에있어서, 상기제 1 구조물및제 2 구조물이 IRES (internal ribosome entry site) 서열을포함하는폴 리뉴클레오티드로연결되어하나의벡터에존재하는것인방법. 청구항 6 제 5 항에있어서, 상기 IRES 는서열번호 11 의뉴클레오티드서열로기재되는것인방법. 청구항 7 제 1 항에있어서, 상기목적단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드및표적단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드 는단백질을코딩하는유전자를포함하는라이브러리로부터유래된것인방법. 청구항 8 제 1 항에있어서, 상기제 1 형광단백질및제 2 형광단백질은서로다른형광을나타내는것을특징으로하는 - 3 -
방법. 청구항 9 제1항에있어서, 상기형광단백질은 GFP (Green Fluorescent Protein), EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), mgfp (modified green fluorescent protein), RFP (Red Fluorescent Protein), mrfp (Monomeric Red Fluorescent Protein), ERFP (Enhanced Red Fluorescent Protein), DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein), BFP (Blue Fluorescent Protein), EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein), CFP (Cyan Fluorescent Protein), CGFP (Cyan Green Fluorescent Protein), ECFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein), YFP (Yellow Fluorescent Protein), EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein), AzG (Azami Green), HcR (HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein) 및 BFP (Blue Fluorescent Protein) 로이루어지는군에서선택된것인방법. 청구항 10 제 1 항에있어서, 상기형광검출은형광현미경또는유세포분석기로수행하는것인방법. 청구항 11 (i) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광단백질및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로구성된제1 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제1 구조물, 및표적 (prey) 단백질및제2 형광단백질로구성된제2 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제2 구조물을포함하는진핵세포를제공하는단계 ; (ii) 상기융합단백질을발현시켜진핵세포내에서봉입체 (inclusion body) 를형성시키는단계 ; 및 (iii) 목적단백질에결합된표적단백질을분리하는단계를포함하는, 목적단백질과상호작용하는표적단백질을분리하는방법. 청구항 12 제 11 항에있어서, 상기 (i) 단계의제 1 구조물및제 2 구조물은별개의벡터또는하나의벡터내에존재하는 것인방법. 청구항 13 제 12 항에있어서, 상기제 1 구조물및제 2 구조물이 IRES (internal ribosome entry site) 서열을포함하는폴 리뉴클레오티드로연결되어하나의벡터에존재하는것인방법. 청구항 14 제 13 항에있어서, 상기 IRES 는서열번호 11 의뉴클레오티드서열로기재되는것인방법. 청구항 15 제 11 항에있어서, 상기표적단백질의분리는유세포분석기를이용하는것인방법. 청구항 16-4 -
제 11 항에있어서, 상기목적단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드및표적단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드 는단백질을코딩하는유전자를포함하는라이브러리로부터유래된것인방법. 청구항 17 제 11 항에있어서, 상기제 1 형광단백질및제 2 형광단백질은서로다른형광을나타내는것을특징으로하는 방법. 청구항 18 제11항에있어서, 상기형광단백질은 GFP (Green Fluorescent Protein), EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), mgfp (modified green fluorescent protein), RFP (Red Fluorescent Protein), mrfp (Monomeric Red Fluorescent Protein), ERFP (Enhanced Red Fluorescent Protein), DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein), BFP (Blue Fluorescent Protein), EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein), CFP (Cyan Fluorescent Protein), CGFP (Cyan Green Fluorescent Protein), ECFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein), YFP (Yellow Fluorescent Protein), EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein), AzG (Azami Green), HcR (HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein) 및 BFP (Blue Fluorescent Protein) 로이루어지는군에서선택된것인방법. 청구항 19 삭제청구항 20 삭제청구항 21 삭제 발명의설명 [0001] 기술분야본발명은세포내단백질간상호작용을분석하는방법에관한것으로, 보다구체적으로목적 (bait) 단백질, 제1 형광단백질및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로구성된제1 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제1 구조물, 및표적 (prey) 단백질및제2 형광단백질로구성된제2 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제2 구조물을포함하는세포를제공하고, 상기융합단백질을발현시켜세포내에서봉입체 (inclusion body) 를형성시킨다음, 형광단백질의형광신호를측정하여세포내단백질간상호작용을분석하는방법, 상기구조물들을포함하는세포를이용하여목적단백질과결합하는표적단백질을분리하는방법, 상기세포, 및상기구조물을포함하는단백질간상호작용분석용키트에관한것이다. [0002] 배경기술생명체의많은기능들은분자간상호작용네트워크에의해조절된다. 따라서, 세포내단백질-단백질상호작용 (protein-protein interactions, PPI) 의이해는현대생물학연구에서중요한이슈이다. PPI는면역침강법 (immunoprecipitation) 및 TAP (tandem affinity purification) 와같은 in vitro 실험방법에의해주로확인되어왔다. 그러나, in vitro 접근법으로는다이나믹한 in vivo 단백질간상호작용을정확히분석하기에는한계가있다. 또는 Y2H (yeast two-hybrid) 분석이 in vivo 조건에서높은민감성으로 PPI를검출하는방법으로사용되어왔으나, 반드시효모에서수행되어야하며, 핵전위를필요로하고, 직접접촉을관찰하는것이아니 - 5 -
고 2 차유발되는전사활성과효과를측정하는간접적인분석방법이므로, 결과적으로거짓양성이발생되는단점 이있다. [0003] [0004] 상기와같은단점을극복하기위하여, FRET (fluorescence resonance energy transfer), 형광상보 (fluorescence complementation) 방법및형광동시집적 (fluorescence co-localization) 방법등과같은형광기술을바탕으로한수많은새로운방법이개발되어왔다. 이중 FRET 방법은공여 (donor) 단백질및수용체 (acceptor) 단백질이 2-8 nm 거리내에있을때형광스펙트럼이변화하는것을검출하는방법으로, 두개의서로다른파장영역의형광물질이인접하였을경우하나의형광을일으키는에너지 (donor) 가다른형광물질에전달되는공명이일어나다른형광 (acceptor) 이일어나는현상을이용한것이다. 형광상보 (fluorescence complementation) 방법은살아있는세포내에서단백질간의결합을확인할수있는방법으로서, 그원리는형광단백질을 N-절편과 C-절편으로나눈후각각에결합단백질을붙여서세포내에발현시킨후, 두단백질이결합하면형광단백질의 N-, C-절편이결합하게되어완전한형광단백질이만들어지고, 이에따라, 비로소세포가형광을나타내게되는것을이용한것으로, GFP 절편의상보작용에의한형광회복을바탕으로한방법이다. 비록상기두방법은고속대량분석기구인유세포분석기를이용하여분석하는경우동물세포에서일어나는상호작용을효과적으로분석할수있었으나, 이를박테리아세포에적용하는것은쉽지가않다. 예를들어, FRET 방법은진핵세포와비교하여상당히작은크기의박테리아세포에서작은신호를민감하게정량하기에는검출수준이매우낮았다. 형광상보방법은큰세포에따라단백질발현이균일하지않을수있고박테리아내다른요소들에영향을받아서거짓양성을발생하는경우가많았다. 형광동시집적방법은진핵세포의특별한세포소기관에집적되어사용되지만, 박테리아시스템은세포소기관구조가없어서, 박테리아시스템에는적용할수없다. 그러나, 최근에목적 (bait) 단백질이융합된세포분열유도단백질및형광표적 (prey) 단백질이동시발현되어형광 PPI 복합체가 E. coli 세포내의양쪽말단염색체부위로재배열하는연구결과가보고된바있다 (Edwards, A. N., et al., 2009. An in vivo imaging-based assay for detecting protein interactions over a wide range of binding affinities. Anal. Biochem. 395:166-77.). [0005] 이에본발명자들은살아있는세포에서생체물질간상호작용을분석할수있는방법을개발하기위해예의노력한결과, 셀룰로모나스피미 (Cellulomonas fimi) 유래의패밀리 II CBD (cellulose-binding domain) 가 E. coli 내에서자가-응집을하여봉입체 (inclusion bodies, IB) 를형성하는것을확인하고, CBD-유도 IB는상호작용단백질들이동시-발현될때, 입자내의특정상호작용단백질을포획하는경향이있는것을확인하였다. 이에본발명자들은상기봉입체를박테리아세포뿐만아니라진핵세포내의인공세포소기관구조로사용하여새로운형광동시집적방법을개발하고자하였다. 이에본발명자들은역평행류신지퍼 (leucine zipper) 를상호작용단백질의모델로사용하여 FCIB (fluorescence colocalization on inclusion bodies) 를형광현미경및고속대량분석기인유세포분석기로관찰하여낮은결합친화도를갖는상호작용단백질의결합을분석및분리할수있음을확인하고본발명을완성하였다. 발명의내용 [0006] [0007] 해결하려는과제본발명의하나의목적은 (i) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광단백질및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로구성된제1 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제1 구조물, 및표적 (prey) 단백질및제2 형광단백질로구성된제2 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제2 구조물을포함하는세포를제공하는단계 ; (ii) 상기융합단백질을발현시켜세포내에서봉입체 (inclusion body) 를형성시키는단계 ; 및 (iii) 목적단백질과표적단백질간의상호작용을형광단백질의형광신호로측정하는단계를포함하는, 세포내단백질간상호작용을분석하는방법을제공하는것이다. 본발명의또하나의목적은 (i) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광단백질및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로구성된제1 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제1 구조물, 및표적 (prey) 단백질및제2 형광단백질로구성된제2 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제2 구조물을포함하는세포를제공하는단계 ; (ii) 상기융합단백질을발현시켜세포내에서봉입체 (inclusion body) 를형성시키는 - 6 -
단계 ; 및 (iii) 목적단백질에결합된표적단백질을분리하는단계를포함하는, 목적단백질과상호작용하는 표적단백질을분리하는방법을제공하는것이다. [0008] [0009] 본발명의또하나의목적은상기구조물이도입된세포를제공하는것이다. 본발명의또하나의목적은상기구조물을포함하는단백질간상호작용검출용키트를제공하는것이다. [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] 과제의해결수단상기목적을달성하기위한하나의양태로서, 본발명은 (i) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광단백질및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로구성된제1 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제1 구조물, 및표적 (prey) 단백질및제2 형광단백질로구성된제2 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제2 구조물을포함하는세포를제공하는단계 ; (ii) 상기융합단백질을발현시켜세포내에서봉입체 (inclusion body) 를형성시키는단계 ; 및 (iii) 목적단백질과표적단백질간의상호작용을형광단백질의형광신호로측정하는단계를포함하는, 세포내단백질간상호작용을분석하는방법을제공한다. 본발명의상기방법은기존의세포내단백질간상호작용을검출하는방법으로사용된 FRET (fluorescence resonance energy transfer), 형광상보 (fluorescence complementation) 방법및형광동시집적 (fluorescence co-localization) 방법의단점을보완하기위한방법으로 CBD 단백질태그가세포내에서봉입체를형성하여형광단백질이봉입체에응집하는현상을통해간편하게상호작용을검출할수있는방법이다. 특히, 기존의봉입체의경우에는활성이없어서, 활성이있는단백질간의상호작용검출에는한계가있었으나, 본발명의 CBD 단백질은소수성잔기가외부로다수노출되어있어, 결합하는단백질의정상적인폴딩 (folding) 상태에서봉입체를형성하여실제활성을갖고있는단백질간의생체내에서일어나는단백질간상호작용을검출할수있다는장점이있다. 또한, 이러한장점에의해서단백질의발현수준에영향이없으므로, 과발현상태에서상호작용의신호 (signal) 가줄어드는단점이없어서과발현에의한노이즈제거에도장점을갖고있다. 본발명에서용어, " 목적 (bait) 단백질 " 이란이와상호작용하는단백질을알고자하는단백질로서, 봉입체에제시되어상호작용하는표적 (prey) 단백질과결합하여세포내인공소기관으로작용하는봉입체주위로형광이집중될수있도록하는단백질을의미한다. 본발명에서용어, " 표적 (prey) 단백질 " 이란목적단백질과상호작용할수있는단백질을의미한다. 목적단백질및표적단백질은이에제한되지는않으나, 다양한치료용단백질, 신호전달단백질등각각상호작용의대상이되는물질을의미할수있다. 상기목적단백질및표적단백질은천연형단백질뿐만아니라, 기능을담당하는도메인, 폴리펩타이드일부일수있다. 상호작용의검출또는스크리닝을위해목적단백질은실험자가알고있는물질을의미하며, 표적단백질은미지의물질을지칭하여사용될수있으나, 이에제한되지않는다. 바람직하게상기목적단백질및표적단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드는다양한단백질을코딩하는유전자를포함하는라이브러리로부터유래된것일수있다. 이는전체게놈성 DNA 및 cdna 라이브러리와같은생물체전체게놈에서부터얻을수있다. 또한, 상기목적단백질및표적단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드는공제라이브러리 (subtracted 라이브러리 ) 또는맞춤라이브러리 (sized 라이브러리 ) 와같은전체게놈서브셋에서부터얻을수있다. 본발명에서용어, " 제1 형광단백질 " 및 " 제2 형광단백질 " 은당업자가검출가능한신호를생성할수있는물질을의미하며, 이의예로는 GFP (Green Fluorescent Protein), EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), mgfp (modified green fluorescent protein), RFP (Red Fluorescent Protein), mrfp (Monomeric Red Fluorescent Protein), ERFP (Enhanced Red Fluorescent Protein), DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein), BFP (Blue Fluorescent Protein), EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein), CFP (Cyan Fluorescent Protein), CGFP (Cyan Green Fluorescent Protein), ECFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein), YFP (Yellow Fluorescent Protein), EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein), AzG (Azami Green), HcR (HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein) 및 BFP (Blue Fluorescent Protein) 로이루어지는군에서선택된형광단백질일수있으나, 이에제한되지않는다. 상기제1 형광단백질및제2 형광단백질은동일한형광단백질을이용할수도있으나, 바람직하게는구별의편의를위해서제1 형광단백질및제2 형광단백질은서로다른형광을나타내는단백질을사용할수있다. - 7 -
본발명의일실시예에따르면목적단백질에는제 1 형광단백질로 GFP 단백질을, 표적단백질에는제 2 형광단 백질로 RFP 단백질을사용하여각기다른색깔을나타내는단백질로나타내어목적단백질및표적단백질의동 시발현시에손쉽게상호작용여부를판단하였다. [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] (i) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광단백질및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로구성된제1 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제1 구조물, 및표적 (prey) 단백질및제2 형광단백질로구성된제2 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제2 구조물을포함하는세포를제공하는단계에있어서, 상기제1 구조물및제2 구조물은별개의벡터또는하나의벡터내에존재할수있다. 별개의벡터내에존재할경우, 목적단백질, 제1 형광단백질및 CBD 단백질로구성된제1 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는벡터는제1 형광단백질및 CBD 융합단백질의 N-말단에목적단백질이융합된단백질을발현할수있는벡터이며, 표적 (prey) 단백질및제2 형광단백질로구성된제2 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는벡터는제2 형광단백질의 N-말단에표적단백질이융합된융합단백질을발현할수있는벡터일수있다. 하나의벡터내에존재할경우, 목적단백질, 제1 형광단백질및 CBD 단백질로구성된제1 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제1 구조물, 및표적 (prey) 단백질및제2 형광단백질로구성된제2 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제2 구조물이 IRES (internal ribosome entry site) 서열을포함하는폴리뉴클레오티드로연결된형태의벡터일수도있다. 바람직하게 IRES 뉴클레오티드서열은서열번호 11의뉴클레오티드서열일수있다. 본발명의일실시예에따르면목적단백질로류신지퍼2 (LZ2) 를제1 형광단백질로 GFP를사용하고, 표적단백질로류신지퍼1 (LZ1) 을제2 형광단백질로 RFP를사용한 pcbd(lz1- LZ2) 벡터를사용하여 "LZ1-RFP" 융합단백질및 "LZ2-GFP-CBD" 융합단백질을세포내에서동시발현시켜서 LZ1 및 LZ2의상호작용을관찰하였다 ( 도 4 및 5). 이와같은벡터의구조는도 2에개략적으로나타냈다. 동물세포에서의발현은도 8에나타낸셔틀벡터에의해서수행될수있다. 또한, 본발명의일실시예에따르면다양한결합력을가지는루신지퍼를이용하여목적단백질과표적단백질간상호작용을정량적으로분석할수있음을확인하였다 ( 실시예 13 및 14). 또한, 상기제1 구조물또는제2 구조물은상기융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드외에다른서열을추가로포함할수있다. 그예로, 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드의발현을조절할수있는서열일수있으나, 이에제한되지않는다. 상기폴리뉴클레오티드와폴리뉴클레오티드의발현을조절할수있는서열은서로작동가능하게연결된것일수있다. 본발명에서용어, " 작동가능하게연결된 (operably linked)" 은, 하나의폴리뉴클레오티드단편이다른폴리뉴클레오티드단편과결합되면그의기능또는발현이다른폴리뉴클레오티드단편의영향을받지만, 이들폴리뉴클레오티드단편의여러가능한결합조합중에서각폴리뉴클레오티드가그기능을수행하는데있어검출할만한영향이없는상태의결합을의미한다. 즉, 일반적기능을수행하도록폴리뉴클레오티드발현조절서열과목적하는단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드서열이기능적으로연결되어있는것을말한다. 또한, 본발명에서 " 작동가능하게연결된 " 은형광단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드가목적또는표적단백질및 / 또는 CBD 단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드와형광단백질의발현또는기능이가능하도록연결된것을포함할수있으나, 이에제한되지않는다. 작동가능한연결은당해기술분야에서잘알려진유전자재조합기술을이용하여제조할수있으며, 부위-특이적 DNA 절단및연결은당해기술분야에서일반적으로알려진효소등을사용할수있다. 본발명에서용어, " 벡터 " 란적당한숙주세포에서목적단백질을발현할수있는발현벡터로서, 유전자삽입물이발현되도록작동가능하게연결된필수적인조절요소를포함하는유전자작제물을말한다. 본발명의벡터는프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화시그널, 인핸서같은발현조절요소외에도막표적화또는분비를위한신호서열또는리더서열을포함하며목적에따라다양하게제조될수있다. 벡터의프로모터는구성적또는유도성일수있다. 또한, 발현벡터는벡터를함유하는숙주세포를선택하기위한선택성마커를포함하고, 복제가능한발현벡터인경우복제기원을포함한다. 벡터는자가복제하거나숙주 DNA 에통합될수있다. 벡터는플라스미드벡터, 코즈미드벡터, 바이러스벡터등을포함한다. 본발명에서제1 구조물및제2 구조물을포함하는세포를제공하는단계란하나의벡터또는별개의벡터를적합한세포에도입하여이루어질수있다. 본발명에서용어, " 도입 " 이란형질전환또는형질도입에의해외래 DNA를세포로유입시키는것을의미한다. - 8 -
형질전환은 CaCl 2 침전법, CaCl 2 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide) 라는환원물질을사용함으로써효율을높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘침전법, 원형질융합법, 실리콘카바이드섬유를이용한교반법, 아그로박테리아매개된형질전환법, PEG를이용한형질전환법, 덱스트란설페이트, 리포펙타민및건조 / 억제매개된형질전환방법등의당업계에공지된여러방법에의해수행될수있다. 형질도입은감염 (infection) 을수단으로하여바이러스또는바이러스벡터입자를사용하여세포내로유전자를전달시키는것을의미한다. [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] 본발명에서용어, "CBD (cellolose-binding domain) 단백질 " 은봉입체 (inclusion body) 형성을촉진시킬수있는단백질로서, 융합태그로사용되어봉입체형성을촉진할수있다. 상기 CBD 단백질은목적단백질또는형광단백질의 C-말단에연결될수있으나, 이에제한되지않는다. 본발명의목적상상기 CBD 단백질은봉입체형성을유도할수있는단백질은제한없이포함될수있으며, 그예로셀룰로모나스피미 (Cellulomonas fimi) 유래의패밀리 II CBD일수있으며, 그예로서열번호 28로정의되는아미노산서열의단백질일수있으나, 이에제한되지않는다. 또한, 상기 CBD 단백질은셀룰로모나스피미엑소글루카나제 (exoglucanase) 유전자 (GenBank: M15824.1) 의 CBD 부분으로서, 서열번호 29의뉴클레오티드서열로정의되는폴리뉴클레오티드가코딩하는단백질일수있으나, 이에제한되지않는다. 본발명의일실시예에서는셀룰로모나스피미 (Cellulomonas fimi) 유래의패밀리 II CBD가 E. coli 내에서자가-응집을하여봉입체 (inclusion bodies, IB) 를형성하는것을확인하였다 ( 실시예 8). 이와같은봉입체는세포내인공적인세포소기관으로작용하여, 봉입체에융합된단백질이봉입체에집중될수있도록한다. 상기세포내단백질간의상호작용을분석하는방법은 (iv) 봉입체에형광이응집되면목적단백질및표적단백질이상호작용하는것을판단하는단계를추가로포함할수있다. 목적단백질및표적단백질이상호작용하지않으면목적단백질에결합된제1 형광단백질만이 CBD에의해유도된봉입체에존재하고, 표적단백질과융합된제2 형광단백질은세포질에분산되어존재하나, 목적단백질및표적단백질이상호작용하면목적단백질이표적단백질과결합하여표적단백질이 CBD에의해유도된봉입체로끌려와서제1 형광및제2 형광이봉입체에응집하게된다. 이에, 세포내의봉입체에위치한형광신호는목적단백질과표적단백질의상호작용을나타낼수있다. 이러한본발명의작용원리는도 4C에나타냈다. 또한, 상기세포내단백질간의상호작용을분석하는방법은목적단백질및표적단백질간의상호작용을정량적으로분석할수있다. 구체적으로, 목적단백질및표적단백질간의상호작용이증가될수록표적단백질에연결된제2 형광단백질의형광정도가감소하며, 목적단백질에연결된제1 형광단백질의형광정도가증가하게된다. 이에, 표적단백질에연결된제2 형광단백질의형광정도를목적단백질에연결된제1 형광단백질의형광정도로나눈형광비를통하여상호작용을정량적으로측정및분석할수있다. 본발명의일실시예에서는다양한결합력을지닌 LZ1을이용하여형광수준을측정한결과 RFP와 GFP의형광비 (FL2/FL1 ratio) 가결합력에의존적임을확인하였다 ( 도 12 내지 13). 이와같은형광검출은형광을분석할수있는기기를이용하여확인할수있으며, 바람직하게는형광현미경또는유세포분석기로수행할수있다. [0029] 본발명자들은살아있는세포내에서의목적단백질과표적단백질의상호작용이본발명의방법에의해수행될수있는지확인하기위하여, 일실시예에서형광단백질의 C-말단태그로사용된 CBD가봉입체를형성하므로, CBD가융합되지않은 GFP 단백질은세포질에분산되어존재하는반면, CBD가융합된 GFP 단백질은봉입체에높은형광집중을형성하는것을확인하여 ( 도 3A 내지 C), GFP의기능에는영향이없이형광현미경및유세포분석기로분산된형광단백질과봉입체에위치하는형광단백질을완전히구분할수있는것을확인하였다. 아울러, 상호작용하는것으로알려진역평행류신지퍼단백질인 LZ2 및 LZ1 각각을목적단백질과표적단백질로선정하여 "LZ1-RFP" 및 "LZ2-GFP-CBD" 융합단백질을박테리아세포내에서동시발현시킨단백질-단백질상호 작용이있는군에서는 (PPI + ) 형광현미경으로관찰한결과녹색및빨간색형광이세포내의봉입체위치에동시위치하는반면 ( 도 4B 내지 4C), LZ1의상호작용단백질인 LZ2를봉입체를유도하는 "GFP-CBD" 융합단백질에결합시키지않고 "LZ1-RFP" 및 "GFP-CBD" 만박테리아세포내에서동시발현시킨단백질-단백질상호작용이없는군에서는 (PPI - ) 빨간색형광이세포질내분산되는것을확인하여 ( 도 4B 내지 4C), 본발명의방법이살아있는세포내의단백질-단백질상호작용유무를빠르게확인할수있는것을확인하였다. 또한, 유세포분석기 - 9 -
를이용한분석결과도히스토그램이명확히구분되는것을확인하였으며 ( 도 5A 내지 C), 고속대량유세포분석기로 PPI + 세포와 PPI - 세포를선택적으로분류할수있음을확인하였다 ( 도 6). 또한, 동물세포에서도 CBD에의하여봉입체가형성되는것을확인하여 ( 도 8B), 본발명의분석방법이박테리아세포뿐만아니라, 동물세포의 PPI를검출할수있는방법임을뒷받침하였다. 아울러, 다양한결합력을지니는 LZ1을이용하여본발명의검출방법이단백질간의상호작용을정량적으로분석할수있는기술임을확인하였다 ( 도 10, 12 및 13). 이와같은결과는본발명의살아있는세포의단백질간상호작용검출방법이신속하고간단하게이루어질수있으며, 상호작용을정량적으로분석할수있다는것을뒷받침하는것이다. [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] 또하나의양태로서, 본발명은 (i) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광단백질및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로구성된제1 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제1 구조물, 및표적 (prey) 단백질및제2 형광단백질로구성된제2 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제2 구조물을포함하는세포를제공하는단계 ; (ii) 상기융합단백질을발현시켜세포내에서봉입체 (inclusion body) 를형성시키는단계 ; 및 (iii) 목적단백질에결합된표적단백질을분리하는단계를포함하는, 목적단백질과상호작용하는표적단백질을분리하는방법을제공한다. 표적단백질, 목적단백질, 제1 형광단백질, 제2 형광단백질, CBD, 제1 구조물및제2 구조물은상기에서설명한바와같다. 표적단백질의분리는다양한방법으로수행될수있으나, 바람직하게는유세포분석기를이용할수있다. 유세포분석기는적합한조건에따라세포를분류할수있으며, 목적단백질에표적단백질이결합된경우를조건으로선정하면, 상기세포만을따로분류할수있다. 본발명의표적단백질을분리하는방법은살아있는세포내에서목적단백질과상호작용하고있는표적단백질을분리할수있는이점을지닌다. 본발명자들은일실시예에서단백질-단백질상호작용이일어나는경우및일어나지않는경우에형광의강도차이를이용하여고속대량유세포분석기로세포를분류할수있는것을확인하고, 분류된세포를웨스턴블롯팅으로확인한결과, LZ2-GFP-CBD에상응하는밴드만이확인되는것을확인하여 ( 도 6), 유세포분석기로선택적으로상호작용단백질을분류할수있음을확인하였다. [0035] [0036] 또하나의양태로서, 본발명은 (a) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광단백질및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로구성된제1 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제1 구조물, 및 (b) 표적 (prey) 단백질및제2 형광단백질로구성된제2 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제2 구조물을포함하는세포를제공한다. 상기제1 구조물및제2 구조물은별개의벡터또는하나의벡터내에존재할수있다. [0037] [0038] [0039] [0040] 또하나의양태로서, 본발명은 (a) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광단백질및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로구성된제1 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제1 구조물, 및 (b) 표적 (prey) 단백질및제2 형광단백질로구성된제2 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드를포함하는제2 구조물을포함하는단백질간상호작용검출용키트를제공한다. 바람직하게상기키트는상기제1 구조물및제2 구조물이포함된벡터를추가로포함할수있으며, 더욱바람직하게는상기벡터가도입된세포를추가로포함할수있다. 본발명의키트는상기제1 구조물및제2 구조물을포함하는세포이외에형광단백질검출에사용되는당업계에공지된도구및 / 또는시약을추가로포함할수있다. 본발명의키트는필요에따라각성분들을혼합하는데사용될튜브, 웰플레이트, 사용방법을기재한지시자료등을추가로포함할수있다. 상기방법들에서이용될수있는실험과정, 시약및반응조건은종래당업계에서통상적으로알려져있는것들을이용할수있으며, 이는당업자에게자명한일이다. - 10 -
[0041] 발명의효과본발명의방법을이용하면살아있는세포내에서생체물질간의상호작용을손쉽게고속으로분석할수있으며, 형광현미경및유세포분석기를이용하여대량의라이브러리에서목적상호작용단백질을초고속으로탐색및분리할수있는고속탐색기술을제공할수있다. 아울러, 분리된목적상호작용단백질을이용하여결합을방해하는의약품등의생산에이용될수있다. [0042] 도면의간단한설명 도 1 은 overlap PCR 로류신지퍼를융합한 CBD (LZ1-RFP 및 LZ2-GFP-CBD) 의유전자적구조의개략도이다. 도 2는 pcbd(lz1-lz2) 및 pcbd(lz1) 의유전자지도의대표개략도이다. 도 3은 GFP 및 CBD의융합에의한형광봉입체의형성을나타낸도이다. (A) 는세포질내의분산된 GFP를위한 pgfp, 및세포내의 GFP 집중생성을위한 pgfp-cbd의구조도이고 ; (B) 는천연 GFP 및 GFP-CBD의현미경관찰결과이며 ; (C) 는 GFP 및 GFP-CBD 단백질을포함하는세포의유세포분석기분석결과를나타낸다. 옅은녹색및짙은녹색시그널은각각분산된 GFP 및집중된 GFP-CBD 단백질을포함하는두종류의세포의다른형광분포를나타낸다. 도 4는 FCIB (fluorescence colocalization on inclusion bodies) 를이용한류신지퍼 (LZ1 및 LZ2) 간의단백질-단백질상호작용 (PPI) 의현미경분석결과를나타낸도이다. (A) 는목적및표적단백질의발현 6시간후의 PPI + ( 왼쪽 ; 무색 ) 또는 PPI - ( 오른쪽 ; 빨간색 ) 를포함하는양쪽세포의배양액의육안관찰결과이고 ; (B) 는 PPI + (LZ1-RFP 및 LZ2-GFP-CBD 단백질 ) 또는 PPI - (LZ1-RFP 및 GFP-CBD 단백질 ) 를포함하는세포의현미경관찰결과이며 ; (C) 는 PPI 간의관계계략도및형광봉입체의동시위치를나타낸것이다. RFP 및 GFP는 PPI + 의경우봉입체내에동시위치하고, PPI - 의경우 GFP 집중을형성하는대신에 RFP 단백질이분산된다. 도 5는 FCIB에서 LZ1 및 LZ2 류신지퍼간 PPI의유세포분석기분석결과를나타낸도이다. (A) 는 FL1 및 FL2 plot에서 PPI + ( 파란색점 ) 또는 PPI - ( 검정색점 ) 을포함하는세포의형광분석이고 ; (B) 는 FL2 (RFP) 히스토그램에서 PPI + ( 짙은빨간색 ) 또는 PPI - ( 옅은빨간색 ) 세포간의비교이며 ; (C) 는 FL1 (GFP) 히스토그램에서 PPI + ( 짙은녹색 ) 또는 PPI - ( 옅은녹색 ) 간의비교를나타낸다. 도 6 은 FACS (fluorescence activated cell sorter) 로분류한 PPI + 세포의 SDS-PAGE (A) 및웨스턴블롯팅 (B) 분석결과를나타낸다. 1 레인은 PPI + 세포 ; 2 레인은 PPI - 세포 ; 3 레인은 PPI + 및 PPI - 세포의혼합 ; 4 레인은 FACS에의해분류된 PPI + 세포를나타낸다. 도 7은 LZ1-RFP 및 LZ2-GFP-CBD 단백질입자모두를발현하는 PPI + 세포의투과전자현미경사진이고 ( 왼쪽 ), 분리된 CBD-IB의주사전자현미경사진이며 ( 오른쪽 ), 전자현미경의배율은 20,000 배이다. 도 8은동물세포 (HeLa) 에서 CBD의융합에의한 GFP의봉입체형성을확인한결과이다. (A) 는 GFP-CBD유전자를대장균-동물세포셔틀벡터 (pcmv) 에클로닝한벡터그림이며 ; (B) 는동물세포에서발현된 GFP-CBD의봉입체를현미경으로관찰한결과이다. 도 9는다양한루신지퍼의결합력을지니는돌연변이균주들의 mlz1-rfp 및 LZ2-GFP-CBD의세포내발현량을조사한 SDS-PAGE 결과이다. 도 10은돌연변이균주들의 mlz1와 LZ2간의결합력에따라 RFP 단백질의 GFP 봉입체로의집적현상을형광현미경으로관찰한도이다. (A) 는결합력에따라세포내집적현상이발생하고있음을보여주는도이고, (B) 는결합력에따른봉입체에서의 GFP와 RFP의형광변화를보여주는도이다. 도 11은 GFP 형광봉입체를 sonication을통해부분파쇄을수행했을때에 sonication 시간에따라형광이증가되는것을관찰한도이다. GFP의형광은 510nm에서 emission된다. 도 12는돌연변이균주들의 mlz1와 LZ2간의결합력을유세포분석기로분석한도이다. (A) 는 FL1과 FL2 plot에서 - 11 -
결합력에따른각균주들의형광분포를분석한도이고, (B) 는 FL2 혹은 FL1 히스토그램에서 RFP 혹은 GFP의형광변화를각각비교한도이다. 여기서결합력이강한순서대로 mlz1(4/27) 은남색, LZ1은하늘색, mlz1(25) 는녹색, mlz1(11) 은연두색, mlz1(13/25/27) 은주황색으로나타나고있다. (C) 는 GFP(FL1) 과 RFP(FL2) 의상대적평균형광값을나타난도이다. 도 13은유세포분석기로 mlz1-lz2에대한형광을측정하였을때, 결합력에따른 FCIB값 (FL2/FL1의비 ) 의패턴을분석한도이다. [0043] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하, 실시예를통하여본발명을더욱상세하게설명하기로한다. 이들실시예는단지본발명을예시하기위 한것으로, 본발명의범위가이들실시예에의해제한되는것으로해석되지는않는다. [0044] [0045] 실시예 1: 유전자및효소확보패밀리 II의 CBD (cellulose-binding domain) 유전자는한국생명공학연구원생물자원센터 (Korean Collection of Type Cultures, KCTC) 의셀루로모나스피미 (Cellulomonas fimi) KCTC 9143 균주의엑소글루카네이즈 (exoglucanase) 유전자로부터클로닝하였다. 개선된 GFP (green fluorescent protein) 유전자는상용플라스미드벡터인 pegfp (Clontech, CA) 로부터얻었다. RFP (monomeric red fluorescent protein 1) 유전자를갖고있는플라스미드벡터 prfp는한국대전에위치한 KAIST로부터제공받았다. 역평행의두개의류신지퍼유전자인 LZ1 (EQLEKKLQALEKKLAQLEWKNQALEKKLAQ; 전하를띄는잔기는밑줄로표시함, 서열번호 1) 및 LZ2 (ALKKELQANKKELAQLKWELQALKKELAQ; 전하를띄는잔기는밑줄로표시함, 서열번호 2) 는각각예일대학교의 Regan 박사로부터제공받은 pmrbad-z-cgfp 및 pet11a-z-ngfp로부터얻었다 (Magliery, T. J., et al., 2005. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: scope and mechanism. J. Am. Chem. Soc. 127:146-57.). 모든제한효소는 Roche Applied Science (Indianapolis, IN) 로부터구입하였다. T4 DNA 라이게이즈는 Fermentas (Glen Burnie, MD) 로부터구입하였다. [0046] [0047] 실시예 2: DNA 조작 모든프라이머는한국대전의바이오니아에서합성하였다. 본발명에서사용한프라이머를하기표 1 에나타냈 다. NdeI 및 XhoI 제한효소부위를볼드체로표시하였다. [0048] 프라이머이름 서열 (5' 3') 서열번호 프라이머 1 GATATACATATGGTGAGCAAGGGCGAG 3 프라이머 2 GGTGCTCGAGTTACTTGTACAGCTTGTCCATGCC 4 프라이머 3 CCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCAAGCGAGCAGCTGGAA 5 프라이머 4 CAATTCTTTTTTGAGGGCCATATGATAATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTTAGGCGCCGGTGGAGTGGC 6 GGCC 프라이머 5 GGCCGCCACTCCACCGGCGCCTAAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATTATCATATGGCCCTCAAAAAAGA 7 ATTG 프라이머 6 CAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCTGCGCCAGTTCCTTTTTCAG 8 프라이머 7 CTGAAAAAGGAACTGGCGCAGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG 9 프라이머 8 GCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGCCGACCGTGCAGGGCGTGCC 10 표 1 [0049] [0050] gfp 유전자를프라이머 1 ( 서열번호 3) 및프라이머 2 ( 서열번호 4) 를이용하여 pegfp로부터증폭시키고, NdeI 및 XhoI으로절단하고, pet21a 벡터 (Invitrogen, CA) 로클로닝하여 pgfp를제조하였다. gfp 및 cbd 유전자를 Ha, J.-S., et al., (2008. Thermostable beta-glycosidase-cbd fusion protein for biochemical analysis of cotton scouring efficiency. J Microbiol Biotechnol 18:443-448.) 에기재된방법에따라 overlap PCR로융합하고, pet21a 벡터의 NdeI and HindIII 부위로삽입하여 pgfp-cbd 플라스미드벡터를제조하였다. 두개의류신지퍼유전자인 LZ1 및 LZ2를각각 prfp 및 pgfp-cbd에연결하여, pet21 플라스미드벡터내의 LZ1-RFP 및 LZ2-GFP-CBD 융합단백질을코딩하는유전자를프라이머 3 내지프라미어 8 ( 서열번호 5 내지 10) 을 - 12 -
이용하여 overlap PCR로융합하고, Datsenko, K. A., et al. (2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 97:6640-5.) 에기재된방법에따라 pkd46를포함하는 E. coli DH5α 세포를이용하여재조합하였다. IRES (internal ribosome entry site, 5'-AATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATTATCAT-3', 서열번호 11) 는 LZ1-RFP 및 LZ2-GFP-CBD 유전자사이에위치하였다 ( 도 1). 상기방법에의해제조된플라스미드벡터를 pcbd(lz1-lz2) 로명명하였다. LZ1-RFP 및 GFP-CBD 융합단백질을코딩하는유전자를포함하는 pcbd(lz1) 플라스미드벡터를상기에서설명한 overlap PCR 로제조하였다 ( 도 2). [0051] [0052] 실시예 3: 단백질발현 E. coli BL21(DE3) 를발현숙주세포로사용하였다. 상기세포를실시예 2에서제조한 pcbd(lz1-lz2) 또는 pcbd(lz1) 로형질전환하고, 앰피실린 (50 μg / ml ) 을포함하는 LB 배지에서배양하였다. 600 nm에서 OD 값이 0.5 일때, CBD-유도봉입체 (CBD-IB) 를유도하기위하여, IPTG (isopropyl-1-thio-β-d-galactopyranoside, 1 m M) 를첨가하고, 세포를 37 에서 6시간배양하였다. 배양된세포가봉입체를형성하였는지를현미경으로확인하였다. E. coli 세포를얼음상에서소니케이션으로파괴하고, 융합단백질의발현을 SDS-PAGE 및웨스턴블롯팅분석으로확인하였다. 비수용성분획또는 CBD-IB를 16,300xg에서 10분간원심분리로분리및수득하여, Triton X-100 (0.5%) 을포함하는 PBS 버퍼 (ph 7.4) 로재현탁하여, 막-결합침전물을제거하였다. [0053] [0054] 실시예 4: 웨스턴블롯팅분석전체세포추출물의분획 (20 μl ) 을 SDS-PAGE (12%) 에전기영동하고, PVF 막 (polyvinylidene fluoride membrane, Millipore, MA) 으로전기-이동시켰다. 블롯을 1차항-GFP 마우스항체 (Sigma-Aldrich, WI) 로혼성화하고, 항-마우스-IgG 염소항체 HRP 컨쥬게이트 (Bio-Rad, CA) 를 5 % 스킴밀크를포함하는 TTBS 버퍼 (20 mm Tris-HCl (ph 7.5), 0.1 M NaCl, 0.1% Tween-20) 에준비하였다. 혼성화밴드를 Opti-4CN 기질키트 (Bio- Rad, CA) 를이용하여검출하였다. [0055] [0056] 실시예 5: 형광현미경분석아가플레이트상의형광 E. coli 콜로니를 GFP 필터 (Ex: 455-485 nm, Em: 500-545 nm) 및 RFP 필터 (Ex: 540/25 nm, Em: 605/55 nm) 를장착한 AZ100 멀티줌현미경 (Nikon, Japan) 을이용하여관찰하였다. 형광 CBD- IB를발현하는 E. coli 세포의 GFP 및 RFP 각각의형광이미지를필터세트 44 (Ex: BP 475/40 nm, Em: BP 530/50 nm) 및필터세트 15 (Ex: BP 546/12 nm, Em: LP 590 nm) 를장착한 Axiovert 2000M 형광현미경 (Carl Zeiss, Germany) 을이용하여관찰하였다. 칼라이미지 (pseudo-color image) 를 Axioversion 4.5 프로그램 (Carl Zeiss) 로생성하였다. [0057] [0058] [0059] 실시예 6: 전자현미경분석 E. coli 세포를 0.1 M 인산나트륨버퍼 (ph 7.2) 내의 2.5 % 파라포름알데히드및 2.5 % 글루타알데히드혼합물로 2시간동안고정시키고, 동일한버퍼내의 1% 4산화오스뮴에서 1시간동안후-고정시켰다. 에탄올및프로필렌옥시드로탈수시키고, Epon-812 내에포매시켰다. 초박편을 ULTRACUTE microtome (Leica, Germany) 으로제조하고, 아세트산우라닐및납시트레이트로염색한후, CM20 투과전자현미경 (Philips, Netherlands) 으로관찰하였다. 분리한 CBD-IB를상기와동일한조전에서고정시키고, 점층적농도의에탄올로탈수시키고, 아세트산이소아밀로치환시키고, CO 2 의임계점에서건조시켰다. 시료를금속코팅기 (sputter coater, SC502, Polaron, UK) 내 의금으로코팅하고, 주사전자현미경 LEO 1455VP (LEO GmbH, Germany) 으로관찰하였다. [0060] [0061] 실시예 7: 유세포분석기분석 유세포분석을 FACS Calibur (BD Biosciences, CA) 로수행하였다. 분석게이트는 SSC 및 FSC 파라미터를바탕 - 13 -
으로세팅하였다. GFP 및 RFP 형광을각각 FL1 (530/30 nm) 및 FL2 (585/42 nm) PMT로검출하였다. 5,000의이벤트가각시료에서카운팅되었다. 데이터를 BD CellQuest Pro (version 4.0.2, 145 BD Biosciences) 소프트웨어를이용하여수집하였다. 세포분류를한국생명공학연구원전북지원에서 FACS Aria Cell Sorter (BD Biosciences, CA) 를이용하여수행하였다. GFP 및 RFP 형광을각각 FITC (530/30 nm) 및 PE-Texas Red (610/20 nm) PMT로검출하였다. 데이터를 BD FACSDiVa 소프트웨어 (version 4.0.2, BD Biosciences) 를이용하여분석하였다. [0062] [0063] [0064] [0065] 실시예 8: 박테리아세포내의 CBD-유도봉입체에의한형광집중 (foci) CBD 융합에의한형광봉입체 (IB) 의형성이이루어지는지확인하기위하여, pgfp 또는 pgfp-cbd를포함하는 IPTG-유도 E. coli 세포를관찰하였다 ( 도 3A). 그결과, E. coli 내의 gfp 유전자단독의발현은세포질내에녹색형광이분산되어있으나, GFP-CBD 융합단백질은세포내의봉입체에높은형광집중을형성하는경향이있었다 ( 도 3B). 이와같은결과는 CBD-유도봉입체가 GFP의적절한접힘 (folding) 및천연형태형성을방해하지않는다는것을뒷받침하는것이다. 즉, 본발명의방법이목적및표적단백질의실제구조에는변형이없이실제단백질간의상호작용을분석할수있다는것을뒷받침한다. 세포질내의수용성 GFP ( 옅은녹색 ) 를포함하는세포와봉입체상의 GFP ( 짙은녹색 ) 를나타내는세포를유세포분석기분석을수행하여비교하였다. 결과적으로, 세포질내에 GFP가분산되어있는세포의형광수준은봉입체상의 GFP를나타내는세포보다약 10 배높았다 ( 도 3C). 이러한차이는봉입체내에응집된 GFP 분자와비교하여세포질내의분산된 GFP가레이저에의해더많이조사 (excitation) 되기때문일것이다. 상기와같은결과는형광현미경뿐만아니라유세포분석기를이용하여세포내봉입체에위치하는형광단백질과세포질에분산된형광단백질을서로완전히구분할수있다는것을뒷받침하는것이다. [0066] [0067] 실시예 9: 단백질상호작용의표지자로서 FCIB (Fluorescence colocalization on inclusion bodies) 목적 (bait) 단백질을포함하는형광봉입체가세포질내의표적 (prey) 단백질을모집할수있는지 조사하였다. 역평행류신지퍼 LZ1 및 LZ2 (K D = 20 μm) 를박테리아세포내에서 FCIB 를형성하는모델단백질 로이용하였다. LZ1 및 LZ2 은반대펩타이드의반대전하간의이온잔기상호결합및소수성잔기상호결합에 의해상호간에안정적인헤테로다이머상호작용을수행할수있다고알려져있으며, 이는 LZ1 및 LZ2 호모다이 머결합력보다 10 5 배더높은것이다. [0068] Edward er al. ((2009) An in vivo imaging-based assay for detecting protein interactions over a wide range of binding affinities. Anal. Biochem. 395, 166-177.) 은 DivIVA (cell division protein) 가특정염색체부위에위치하는특징을이용한형광이미지분석은실용적이며넓은범위의결합친화도 (1 nm 내지 15 μm) 를걸쳐검출할수있다고보고하고있다. 그러나, 본발명의 FCIB 기술을이용하면역평행류신지퍼 (K D = 20 μm) 와같이매우약한 PPI도검출할수있다. 이것은봉입체가세포내에서커다란크기의인공적세 포소기관구조를형성하므로표적단백질이봉입체내에표지되는목적단백질에더결합할수있고, 더강한 형광신호를나타낼수있기때문이다. 따라서, 본발명의 FCIB 는약한결합친화도를갖는 PPI 도검출할수 있는아주민감한분석방법임을알수있다. [0069] [0070] LZ1을 RFP의 N-말단에융합시켜서표적단백질인 LZ1-RFP을제조하고, 목적단백질로서 LZ2를 GFP-CBD의 N-말단에연결한 LZ2-GFP-CBD를제조하였다. 상기표적및목적단백질 (LZ1-RFP 및 LZ2-GFP-CBD) 을동시에 E. coli BL21(DE3) 에서발현시켜, PPI를유도하였다. 또한, 대조군으로 LZ1-RFP 및 GFP-CBD를 E.coli BL21 (DE3) 에발현시켰다. 그결과, 놀랍게도배양액 (culture broth) 에서빨간색이검출되지않은반면 (PPI +, 도 4A), LZ1-RFP 및 GFP- CBD 단백질을모두발현하는세포를포함하는배양액에서빨간색이현저하게나타났다 (PPI -, 도 4A). [0071] 현미경관찰결과, 양 E. coli 세포 (PPI + 및 PPI - ) 의말단영역에서봉입체가나타났고 ( 도 4B 의검정색화살 표 ), 상기영역에 GFP 집중이정확하게존재하는것을확인하였다 ( 도 4B 의흰색화살표 ). RFP 현미경관찰은 - 14 -
LZ1-RFP 또한노란색화살표로나타낸것과같이, LZ2 를나타내는 CBD- 유도녹색형광봉입체에위치한다는것 을나타냈다 ( 도 4B). 그러나, LZ1-RFP 단백질은 LZ2 가녹색형광봉입체에포함되지않을때에는세포질전체 에분산되어있었다. [0072] 결론적으로, PPI가세포내에서일어나면, 녹색및빨간색형광단백질이세포내의봉입체위치에동일하게집적한다는것을알수있다. 반면에, PPI가세포내에서일어나지않으면, 빨간색형광단백질이녹색형광봉입체위치에동일하게집적하는대신에세포질에분산된상태로관찰된다 ( 도 4C). 이와같은결과들은 FCIB가살아있는세포내의 PPI를빠르게모니터할수있다는것을뒷받침하는것이다. [0073] [0074] [0075] 실시예 10: 박테리아세포내의 PPI 유세포분석유세포분석은세포-대-세포의형광분석에가장강력한도구중하나로사용되어왔다. 상기실시예 8에서언급한바와같이, 봉입체형성에의해세포내에집중된 GFP 단백질이세포내에서분산된 GFP 단백질과비교하여분명한차이를나타낸다는것을유세포분석을통해입증하였다 ( 도 3C). 이에, LZ1 및 LZ2 간의 PPI 결과에의해 RFP 단백질이봉입체에집중되는현상과 PPI가없어 RFP 단백질이분산되는현상이유세포분석기로확인될수있는지를알아보았다. 그결과, 도 5A에나타낸바와같이, FCIB 상의 PPI + 세포 ( 파란색점 ) 및 PPI - 세포 ( 검정색점 ) 는 FL1 및 FL2 plot에서다른위치에서분포하고있었다. FL1 및 FL2 형광강도의데이터는두개의히스토그램으로구분되어 개별적으로구획되었다. 각 RFP(FL2) 와 GFP(FL1) 의히스토그램에서 PPI + 세포와 PPI - 세포는상호작용의존재여부에따른형광차이를분명하게보여주고있었다 ( 도 5B, 5C). RFP의경우 PPI + 세포에서는 LZ1 및 LZ2의상호작용에의하여봉입체에위치함에따라 PPI - 세포에비하여낮은형광수준을나타내는반면, GFP의경우에는 LZ2-RFP와의결합에의해증가된 GFP 형광수준을나타내었다. 이와같은결과를통해단백질간상호작용의존재여부에따른형광차이를분명하게확인할수있었다. 이와같은결과는 FCIB를바탕으로한유세포분석기결과가작은-크기의박테리아세포에서도 PPI 결정에매우유효하다는것을뒷받침하는것이다. [0076] 다음으로본발명자들은 PPI + 및 PPI - 세포가 RFP 형광강도의차이를이용하여고속대량유세포분석기로 PPI 스크리닝이가능한지를조사하였다. 동일한수의 PPI + 세포와 PPI - 세포를혼합하고유세포분석기에 투입하였다. PPI + 세포를검출할수있는조건에서 PPI + 세포와 PPI - 세포혼합물로부터세포를분류하였다. 분류된세포를항 -GFP 항체로웨스턴블롯팅을수행하였다 ( 도 6). [0077] 그결과, 분류전의세포들은 PPI + 세포내의 LZ2-GFP-CBD 에대한 44.7 kda 및 PPI - 세포내의 GFP-CBD 에대한 41.2 kda의두개의혼합밴드를나타냈다. 웨스턴블롯팅분석의분류된 PPI + 세포의레인 ( 레인 4) 에서는 GFP-CBD의밴드와비교하여매우분명하게관찰되는 LZ2-GFP-CBD에상응하는강한신호를검출하였다. 이와같은결과는 PPI + 혹은 PPI - 를가진박테리아세포를초고속분석장비인 FACS를이용하여선택적으로분류할수있음을뒷받침하는것이다. [0078] 포유동물세포에서는 FRET 을이용한유세포분석기분석은 PPI 를갖는많은수의세포를분석하는강력한도구로 이용되어왔으나, 비교적적은변동범위로인하여 FRET 세포는박테리아세포내의 FACS- 기반스크리닝에는적 합하지않은단점이있어왔으나, 본발명은이와같은단점을극복할수있다. [0079] [0080] 실시예 11: 상호작용형광입자의현미경분석 CBD를 C-말단에융합태그로사용하면, E. coli 세포내에서봉입체의형성을촉진한다 ( 도 3B 및 4B). CBD 태그에의한 In vivo 봉입체형성을전자현미경으로관찰하였다 ( 도 7). 세포내의 CBD-IB는 TEM 사진에서전형적인굴절형의봉입체로나타나며, SEM (scanning electron microscopy) 사진에서분리된봉입체는무정형단백질입자의다중복합체로나타났다. - 15 -
[0081] [0082] 실시예 12: 동물세포내의 CBD-유도봉입체에의한형광집중 (foci) CBD 융합에의한형광봉입체 (IB) 의형성이동물세포에서도박테리아와동일하게관찰되는지를확인하였다. GFP-CBD가동물세포에서도발현될수있도록대장균-동물세포셔틀벡터인 pcmv벡터 (Stratagene, CA) 에 GFP-CBD 유전자를클로닝하였다 ( 도 8A). GFP-CBD가클로닝된 pcmv벡터를 Plasmid Midi Kit(Qiagen, Germany) 를이용하여정제및회수하였다. 동물세포주로서 HeLa(CCL-2, ATCC) 를이용하였다. HeLa 세포주는 10% 의혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS) 과 1% 의 antibiotic-antimycotic (Invitrogen) 이포함된 DMEM 배지 (Invitrogen, CA) 를이용하여 37, 5% CO 2 조건을유지하는배양기에서계대배양하며실험에사용할수있도록준비하였다. 동물세포주에유전자를도입하는방법은다음과같다. 먼저 T-25 flask 의바닥에 HeLa 세포의개수가 90% 정도 되도록 37, 5% CO 2 조건에서충분히배양시킨후, trypsin-edta 를처리하여세포를 flask 의바닥에서분리하 여 4-well plate 에 1x10 5 cell/well 의개체수가되도록분주하고, 37, 5% CO 2 조건에서배양하였다. 24 시간 이지난후 LipofectaminTM 2000 을이용하여 pcmv 벡터에클로닝된 GFP-CBD 유전자를세포에도입시킨후, 4 시간 뒤에 10% 의혈청이포함된 DMEM 배지로교환하여 37, 5% CO 2 조건에서하루동안배양하였다. 다음날공초 점현미경으로 GFP-CBD 가발현된 HeLa 세포를관찰하였다. [0083] 그결과, 박테리아와동일하게동물세포에서도 CBD 의유도에의해 GFP 봉입체가형성되어있는것을확인할수 가있었다 ( 도 8B). 이러한결과는박테리아세포뿐만아니라, 동물세포에서도 CBD 를이용하여봉입체를형성 시켜 PPI 를관찰할수있음을뒷받침하는것이다. [0084] [0085] 실시예 13: 다양한결합력을가지는루신지퍼 (LZ) 유전자의제작앞서본실시예 9, 10에서는상호작용의존재여부, 즉, LZ2의존재여부를형광현미경과유세포분석기로분석할수있음을확인하였다. 다음으로는다양한결합력을지니는 LZ1에대해 FCIB방법으로정량적으로측정할수있는지를조사하였다. 참고문헌을기반으로다양한결합력을지니는돌연변이 mlz1을제작하였다 (Magliery, T. J., et al., 2005. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: scope and mechanism. J. Am. Chem. Soc. 127:146-57.). 돌연변이 mlz1(mlz1(4/27) 은야생형 LZ1에비하여루신지퍼상호작용이증대된돌연변이이고, mlz1(25), mlz1(11) 및 mlz1(13/25/27)) 은야생형 LZ1에비하여루신지퍼상호작용이감소된돌연변이이다. 돌연변이 mlz1(mlz1(4/27), mlz1(25), mlz1(11), mlz1(13/25/27)) 에대한아미노산서열및결합력에대한정보는표 2에나타냈다. 여기서밑줄은치환된아미노산을나타나고있다. [0086] 돌연변이체아미노산서열돌연변이위치 K d (μm) 서열번호 표 2 LZ1 EQLEKKLQALEKKLAQLEWKNQALEKKLAQ 없음 20 1 mlz1(4/27) EQLKKKLQALEKKLAQLEWKNQALEKELAQ 4/27 8 12 mlz1(25) EQLEKKLQALEKKLAQLEWKNQALKKKLAQ 25 31 13 mlz1(11) EQLEKKLQALKKKLAQLEWKNQALEKKLAQ 11 50 14 mlz1 EQLEKKLQALEKELAQLEWKNQALKKELAQ 13/25/27 1000 15 (13/25/27) [0087] 돌연변이 mlz1유전자의제작은 Quikchange site-directed mutagenesis kit (Stratagene, CA) 를사용하였다. pcbd(mlz1(4/27)-lz2) 벡터를제작하기위해서 pcbd(lz1-lz2) 벡터를주형으로하여프라이머 9 내지프라이머 10 ( 서열번호 16 내지 17) 으로 1차 PCR를수행한다음, PCR 산물을주형으로하여프라이머 11 내지프라이머 12 ( 서열번호 18 내지 19) 로 2차 PCR를수행하였다. 만들어진 2차 PCR산물에 DpnI 처리를하여주형유전자를제거하고 pcbd(mlz1(4/27)-lz2) 벡터를 XL1-Blue competent 균주에형질전환시켰다. 다음으로는, pcbd(mlz1(25)-lz2) 벡터를제작하기위해서 pcbd(lz1-lz2) 벡터를주형으로하여프라이머 13 내지프라이머 14 ( 서열번호 20 내지 21) 로 PCR을수행하고상기방법과동일하게 pcbd(mlz1(25)-lz2) 벡터가삽입된형질전환균주를제작하였다. 다음으로는, pcbd(mlz1(11)-lz2) 벡터를제작하기위해서 pcbd(lz1-lz2) 벡터를주형으로하여프라이머 15 내지프라이머 16 ( 서열번호 22 내지 23) 으로 PCR을수행하고상기방법과동일하게 - 16 -
pcbd(mlz1(11)-lz2) 벡터가삽입된형질전환균주를제작하였다. 다음으로는, pcbd(mlz1(13/25/27)-lz2) 벡터를제작하기위해서 pcbd(lz1-lz2) 벡터를주형으로하여프라이머 17 내지프라이머 18 ( 서열번호 24 내지 2 5) 로 1차 PCR을수행하고, PCR 산물을주형으로하여프라이머 19 내지프라이머 20 ( 서열번호 26 내지 27) 으로 2차 PCR를수행하였다. 그리고상기방법과동일하게 pcbd(mlz1(13/25/27)-lz2) 벡터가삽입된형질전환균주를제작하였다. 본발명에서사용한프라이머를하기표 3에나타냈다. 치환된염기의위치는밑줄로표시하였다. [0088] 프라이머이름 서열 (5' 3') 서열번호 프라이머 9 GCAAGCGAGCAGCTGAAAAAGAAGTTACAAGCC 16 프라이머 10 GGCTTGTAACTTCTTTTTCAGCTGCTCGCTTGC 17 프라이머 11 CCAAGCATTGGAAAAAGAACTCGCGCAGATGGCC 18 프라이머 12 GGCCATCTGCGCGAGTTCTTTTTCCAATGCTTGG 19 프라이머 13 GGAAAAACCAAGCATTGAAAAAAAAACTCGCGCAG 20 프라이머 14 CTGCGCGAGTTTTTTTTTCAATGCTTGGTTTTTCC 21 프라이머 15 GAAGTTACAAGCCCTGAAGAAAAAACTTGCTCAGCTG 22 프라이머 16 CAGCTGAGCAAGTTTTTTCTTCAGGGCTTGTAACTTC 23 프라이머 17 CAAGCCCTGGAGAAAGAACTTGCTCAGCTGG 24 프라이머 18 CCAGCTGAGCAAGTTCTTTCTCCAGGGCTTG 25 프라이머 19 GGAAAAACCAAGCATTGAAAAAAGAACTCGCGCAGATGGCC 26 프라이머 20 GGCCATCTGCGCGAGTTCTTTTTTCAATGCTTGGTTTTTCC 27 표 3 [0089] 단백질발현을위하여각유전자를 E. coli BL21(DE3) 발현숙주세포에형질전환시켰고실시예 3 의방법으로단 백질발현을유도하였다. [0090] [0091] [0092] [0093] 실시예 14: 다양한결합력을가지는루신지퍼 (LZ) 간상호작용의정량적분석 pcbd(lz1-lz2) 벡터또는돌연변이 mlz1을포함하는 pcbd(mlz1-lz2) 벡터들을각각도입한균주를대장균에서발현시킨결과, 세포내에서 mlz1-rfp와 LZ2-GFP-CBD은 1:1 수준으로발현되고있었으며, 각균주간의발현율은비슷하였다 ( 도 9). 그다음, 각균주에서의 GFP 및 RFP의동시집적현상을형광현미경으로관찰하였다. 예상대로상호작용의결합력이강할수록 RFP 단백질이 GFP 단백질이존재하는봉입체의위치에동일하게집적되었으며, 반면에, 결합력이약할수록빨간색형광단백질이점점세포안에퍼지는것을확인하였다 ( 도 10A). 또한결합력에따라봉입체에서의 GFP와 RFP 단백질의형광도현격한차이를보여주었다. 결합력이강할수록 GFP의형광은증가한반면, RFP의형광은감소하였다. 반대로, 결합력이약할수록 GFP의형광은감소한반면, RFP의형광은증가하였다 ( 도 10B). 결합력에따른 RFP의형광감소는실시예 8의결과와동일하게집적현상에의해형광이감소된것으로추측되었고결합력에따른봉입체에서의 GFP의형광의증가현상은실시예 10에서수행된루신지퍼의결합이존재하면형광이증가한결과와동일한것으로 LZ2-RFP의결합이 GFP-봉입체의자체활성에도영향을미치고있음을보여주는결과였다. 본발명자들은 GFP 봉입체를소니케이션으로부분적으로파쇄시켰을때, 전체적인형광이증가하는것을관찰하였다 ( 도 11). 이것은봉입체가물리적충격에의하여일부부풀어지고내부에있는 GFP가노출되어형광이증가한것으로, 봉입체내부에제대로활성되지못한 GFP 단백질이다수존재하고있음을유추할수있었다. 한편, 본발명에서는표적및목적단백질 (LZ1-RFP, LZ2-GFP-CBD) 이세포내에서발현되어 LZ1-GFP 봉입체가형성되는중간에서도류신지퍼간의상호작용이존재하고있기때문에, LZ2-RFP는 GFP-봉입체표면뿐만아니라, 내부에도존재할수있다. 즉, 봉입체내부에존재하는 RFP 단백질이봉입체내부에있는활성되지못한 GFP 단백질의활성을회복시키는데기여한것으로추측되었다. 다음으로유세포분석기를이용하여동일한돌연변이균주들을정량적으로분석하고자하였다. 형광현미경에서관찰된결과와마찬가지로결합력이강할수록 RFP의형광이감소하였으며, GFP의형광이증가하였다 ( 도 12A, C). 유세포분석기에서 RFP의형광의감소는적었지만, GFP의형광증가는매우커서결합력에의한차이를잘반영하고있었다 ( 도 12B). 그러나 RFP 관찰에서는상호작용증가에따른 RFP 형광감소폭이예상보다작게나타났는데이는유세포분석기가 488nm 아르곤레이져를사용하고있기때문이다. 즉, EGFP가 488nm에서의 extinction coefficient (ε) 가 55,000 M -1 cm -1 로높은반면에, RFP 는 488 nm 에서 extinction coefficient 는 - 17 -
15,400 M -1 cm -1 로매우낮고, 최대 excitation (584 nm) 의 10분의 1수준으로밖에 excitation되지않기때문에 EGFP에비해민감도가매우낮은것이다. 더구나상호작용에따라 GFP-RFP FRET이역으로 RFP 형광을증가시키게되므로 RFP 형광감소폭은더욱좁아지게되는것으로판단된다. 하지만유세포분석에서는두형광이동시에관찰되므로결합력에의한형광증가및형광감소를통하여대장균내상호작용을더욱분명하게구분짓게해주었다. [0094] [0095] 유세포분석기에의한측정값을정량적으로분석하기위해 RFP와 GFP의형광비 (FL2/FL1 ratio) 를계산하였다. 계산값을보고된결합력 (affinity, 1/Kd) 과비교하였을때, FCIB값은결합력에의존적임을확인하였다. 또한 FICB방법을통하여 Kd= 8~1000 um의결합력을감지할수있었다 ( 도 13). 이러한결과들은 FCIB방법을이용하여다양한범위의결합력을정량적으로측정및분석할수있음을보여주고있다. 현재까지대량의세포를신속하고민감하게분석할수있는유세포분석기에서미생물내상호작용을분석하는것은매우어려운일로생각되었다. 왜냐하면미생물에서는상호작용의다이나믹범위가동물세포에비해매우적었기때문이다. 그러나본발명인형광동시집적분석방법 (FCIB) 을통해서는형광현미경뿐만아니라유세포분석기에서도상호작용의결합력을정량적으로분명하게구별할수있었다. 따라서본발명은대량의라이브러리에대한고속탐색을수행하는분자수준에서의상호작용분석 ( 예를들면, single chain antibody, decoy receptor, artificial scaffold protein) 및개량 ( 특이성, 결합력향상 ) 연구에광범위하게활용될수있을것으로기대된다. [0096] 이상의설명으로부터, 본발명이속하는기술분야의당업자는본발명이그기술적사상이나필수적특징을변경하지않고서다른구체적인형태로실시될수있다는것을이해할수있을것이다. 이와관련하여, 이상에서기술한실시예들은모든면에서예시적인것이며한정적인것이아닌것으로서이해해야만한다. 본발명의범위는상기상세한설명보다는후술하는특허청구범위의의미및범위그리고그등가개념으로부터도출되는모든변경또는변형된형태가본발명의범위에포함되는것으로해석되어야한다. 도면 도면 1-18 -
도면 2 도면 3-19 -
도면 4-20 -
도면 5-21 -
도면 6 도면 7-22 -
도면 8 도면 9-23 -
도면 10 도면 11-24 -
도면 12 도면 13-25 -
서열목록 <110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for Detecting Protein-Protein Interactions in Cells <130> PA120478KR <150> KR 10-2011-0086057 <151> 2011-08-26 <160> 29 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <220><223> LZ1(Leucine zipper 1) <400> 1 Glu Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 20 25 30 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <220><223> LZ2(Leucine zipper 2) <400> 2 Ala Leu Lys Lys Glu Leu Gln Ala Asn Lys Lys Glu Leu Ala Gln Leu 1 5 10 15 Lys Trp Glu Leu Gln Ala Leu Lys Lys Glu Leu Ala Gln 20 25 <210> 3 <211> 27 <220><223> Primer 1-26 -
<400> 3 gatatacata tggtgagcaa gggcgag 27 <210> 4 <211> 34 <220><223> Primer 2 <400> 4 ggtgctcgag ttacttgtac agcttgtcca tgcc 34 <210> 5 <211> 65 <220><223> Primer 3 <400> 5 cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatggca agcgagcagc 60 tggaa 65 <210> 6 <211> 81 <220><223> Primer 4 <400> 6 caattctttt ttgagggcca tatgataatc tccttcttaa agttaaacaa aattatttta 60 ggcgccggtg gagtggcggc c 81 <210> 7 <211> 81 <220><223> Primer 5 <400> 7 ggccgccact ccaccggcgc ctaaaataat tttgtttaac tttaagaagg agattatcat 60 atggccctca aaaaagaatt g 81-27 -
<210> 8 <211> 42 <220><223> Primer 6 <400> 8 cagctcctcg cccttgctca cctgcgccag ttcctttttc ag 42 <210> 9 <211> 42 <220><223> Primer 7 <400> 9 ctgaaaaagg aactggcgca ggtgagcaag ggcgaggagc tg 42 <210> 10 <211> 68 <220><223> Primer 8 <400> 10 gcagccaact cagcttcctt tcgggctttg ttagcagccg gatctcagcc gaccgtgcag 60 ggcgtgcc 68 <210> 11 <211> 36 <220><223> IRES <400> 11 aataattttg tttaacttta agaaggagat tatcat 36 <210> 12 <211> 30 <212> PRT <220><223> mlz1(4/27) - 28 -
<400> 12 Glu Gln Leu Lys Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Gln 20 25 30 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <220><223> mlz1(25) <400> 13 Glu Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Lys Lys Lys Leu Ala Gln 20 25 30 <210> 14 <211> 30 <212> PRT <220><223> mlz1(11) <400> 14 Glu Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 20 25 30 <210> 15 <211> 30 <212> PRT <220><223> mlz1(13/25/27) <400> 15 Glu Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Gln 1 5 10 15-29 -
Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Lys Lys Glu Leu Ala Gln 20 25 30 <210> 16 <211> 33 <220><223> Primer 9 <400> 16 gcaagcgagc agctgaaaaa gaagttacaa gcc 33 <210> 17 <211> 33 <220><223> Primer 10 <400> 17 ggcttgtaac ttctttttca gctgctcgct tgc 33 <210> 18 <211> 34 <220><223> Primer 11 <400> 18 ccaagcattg gaaaaagaac tcgcgcagat ggcc 34 <210> 19 <211> 34 <220><223> Primer 12 <400> 19 ggccatctgc gcgagttctt tttccaatgc ttgg 34 <210> 20 <211> 35-30 -
<220><223> Primer 13 <400> 20 ggaaaaacca agcattgaaa aaaaaactcg cgcag 35 <210> 21 <211> 35 <220><223> Primer 14 <400> 21 ctgcgcgagt ttttttttca atgcttggtt tttcc 35 <210> 22 <211> 37 <220><223> Primer 15 <400> 22 gaagttacaa gccctgaaga aaaaacttgc tcagctg 37 <210> 23 <211> 37 <220><223> Primer 16 <400> 23 cagctgagca agttttttct tcagggcttg taacttc 37 <210> 24 <211> 31 <220><223> Primer 17 <400> 24 caagccctgg agaaagaact tgctcagctg g 31 <210> 25-31 -
<211> 31 <220><223> Primer 18 <400> 25 ccagctgagc aagttctttc tccagggctt g 31 <210> 26 <211> 41 <220><223> Primer 19 <400> 26 ggaaaaacca agcattgaaa aaagaactcg cgcagatggc c 41 <210> 27 <211> 41 <220><223> Primer 20 <400> 27 ggccatctgc gcgagttctt ttttcaatgc ttggtttttc c 41 <210> 28 <211> 108 <212> PRT <220><223> CBD(cellulose binding domain) <400> 28 Ser Gly Pro Ala Gly Cys Gln Val Leu Trp Gly Val Asn Gln Trp Asn 1 5 10 15 Thr Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr Val Lys Asn Thr Ser Ser Ala Pro 20 25 30 Val Asp Gly Trp Thr Leu Thr Phe Ser Phe Pro Ser Gly Gln Gln Val 35 40 45 Thr Gln Ala Trp Ser Ser Thr Val Thr Gln Ser Gly Ser Ala Val Thr - 32 -
50 55 60 Val Arg Asn Ala Pro Trp Asn Gly Ser Ile Pro Ala Gly Gly Thr Ala 65 70 75 80 Gln Phe Gly Phe Asn Gly Ser His Thr Gly Thr Asn Ala Ala Pro Thr 85 90 95 Ala Phe Ser Leu Asn Gly Thr Pro Cys Thr Val Gly 100 105 <210> 29 <211> 327 <220><223> CBD(cellulose binding domain) <400> 29 agtggtccgg ccgggtgcca ggtgctgtgg ggcgtcaacc agtggaacac cggcttcacc 60 gcgaacgtca ccgtgaagaa cacgtcctcc gctccggtcg acggctggac gctcacgttc 120 agcttcccgt ccggccagca ggtcacccag gcgtggagct cgacggtcac gcagtccggc 180 tcggccgtga cggtccgcaa cgccccgtgg aacggctcga tcccggcggg cggcaccgcg 240 cagttcggct tcaacggctc gcacacgggc accaacgccg cgccgacggc gttctcgctc 300 aacggcacgc cctgcacggt cggctga 327-33 -