(51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) A61K 36/21 (2006.01) A61K 31/365 (2006.01) A61P 19/02 (2006.01) A23L 1/30 (2006.01) (21) 출원번호 10-2009-0050850 (22) 출원일자 2009 년 06 월 09 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 10 항 2009 년 06 월 09 일 (54) 천우슬을이용한관절염치료제 (11) 공개번호 10-2010-0132172 (43) 공개일자 2010년12월17일 (71) 출원인 강원대학교산학협력단 강원춘천시효자동 192-1 강원대학로 42 (72) 발명자 김현표 서울송파구방이동 89 올림픽선수, 기자촌아파트 247 동 901 호 권용수 강원도춘천시석사동퇴계주공 3 차아파트 302 동 506 호 (74) 대리인 신동인 (57) 요약 본발명은천우슬 (Cyathula officinalis) 추출물, 분획물또는이로부터분리한세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체를유효성분으로함유하는조성물에관한것으로, 상세하게는본발명의천우슬추출물, 분획물또는이로부터분리한세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체는연골세포에서관절연골파괴에가장중추적인역할을하는 MMP-13 의발현저해효과를보이며, 토끼연골조직배양 (rabbit cartilage tissue culture) 을통하여콜라겐분해산물 (collagen degradation product) 및프로테오글리칸 (proteoglycan) 의생성억제효과를재확인하였고, 최종적으로이러한항염증작용을 in vivo 동물모델에서확인한바, MMP-13 과다발현에기인한질환의예방및치료에유용한약학조성물및건강기능식품에이용될수있다. 대표도 - 도 1-1 -
특허청구의범위청구항 1 천우슬 (Cyathula officinalis) 추출물, 분획물또는이로부터분리한세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체를유효성분으로함유하는 MMP-13 과다발현에기인한질환의예방및치료용약학조성물. 청구항 2 제 1 항에있어서, 상기세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체는하기구조식 (Ⅰ) 의 5α-H-10-β-selina- 4(14),7(11)-dien-8-one 또는구조식 (Ⅱ) 의 atractylenoide Ⅰ 인약학조성물 : : 청구항 3 제 1 항에있어서, 상기추출물은물, C 1 내지 C 4 의저급알콜, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테 이트, 글리세린, 부틸렌글리콜또는이들의혼합용매에가용한추출물인약학조성물. 청구항 4 제 1 항에있어서, 상기분획물은천우슬의극성용매가용분획물또는비극성용매가용분획물인약학조성물. 청구항 5 제 4 항에있어서, 상기극성용매가용분획물은물, 메탄올, 에탄올, 부탄올또는이들의혼합용매에가용한분 획물인약학조성물. 청구항 6 제 4 항에있어서, 상기비극성용매가용분획물은헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 글리 세린또는부틸렌글리콜에가용한분획물인약학조성물. - 2 -
청구항 7 제 1항에있어서, 상기 MMP-13 과다발현에기인한질환은급. 만성염증성질환, 퇴행성관절염, 류마티스관절염, 외상성관절손상에따른퇴행성연골손실, 척추관절병증, 강직성척추염, 루푸스 (Lupus) 관절염, 신경계의수초탈락질환, 치근막질환, 당뇨성망막변성, 증식성유리체망막병증, 미성숙망막병증, 원추각막또는쇼그렌증후군인약학조성물. 청구항 8 제 7항에있어서, 상기 MMP-13 과다발현에기인한질환은급. 만성염증성질환, 퇴행성관절염, 류마티스관절염, 외상성관절손상에따른퇴행성연골손실, 척추관절병증, 강직성척추염또는루푸스 (Lupus) 관절염인약학조성물. 청구항 9 천우슬 (Cyathula officinalis) 추출물, 분획물또는이로부터분리한세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체를 유효성분으로함유하는 MMP-13 과다발현에기인한질환의예방및개선용건강기능식품. 청구항 10 제 9 항에있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐또는음료인건강기능식품. 명세서 발명의상세한설명 [0001] 기술분야 본발명은천우슬 (Cyathula officinalis) 추출물, 분획물또는이로부터분리한세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체를유효성분으로함유하는 MMP-13 과다발현에기인한질환의예방및치료용조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] 배경기술 [ 문헌 1] 중화인민공화국약전, 중국약전위원회, 1부, p.28, 2000 [ 문헌 2] Zhou et al., Chemical study on Cyathula officinalis Kuan, Journal of Asian Natural Products Research, 7, pp.245-252, 2005 [ 문헌 3] Okuzumi et al., Structural elucidation of cyasterone stereoisomers isolated from Cyathula officinalis, Organic Biomolecular Chemistry, 3, pp.1227-1232, 2005 [ 문헌 4] Zhou et al., Glycosides from Roots of Cyathula officinalis Kuan, Journal of Integrative Biology, 47(3), pp.368-374, 2005 [ 문헌 5] Chen et al., Structural elucidation and antitumor activity of a fructan from Cyathula officinalis Kuan, Carbohydrate Research, 338, pp.1235-1241, 2003 [ 문헌 6] 약전분과위원회, 제 9개정대한약전해설서, p.1159, 2008 [ 문헌 7] Nishikawa et al., Yakugaku Zasshi, 97, pp.515-518, 1977-3 -
[0009] [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [ 문헌 8] Endo et al., Chem. Phram. Bull., 27, pp.2594-2958, 1979 [ 문헌 9] Pachaly et al., Planta Med., 55, pp.59-61, 1989 [ 문헌 10] Pei et al., Osteoarthritis Cartilage, 14, pp.749-758, 2006 [ 문헌 11] Baek et al., Biol. Pharm. Bull. 29, pp.1423-1430, 2006 [ 문헌 12] Winter et al., Proc. Soc. Exp. Bil. Med. 111, pp.544-547, 1962 [ 문헌 13] Kim et al., Planta Med. 65, pp.465-467, 1999 [ 문헌 14] Guingamp et al., Arthritis Rheum. 40, pp.1670-1679, 1997 발명의내용 [0016] [0017] [0018] 해결하고자하는과제관절염에는여러종류가있으나, 이중가장많은환자들이겪는퇴행성관절염 ( 골관절염, osteoarthritis) 은관절의연골이닳아없어지면서국소적인퇴행성변화가나타나는질환이다. 이질환은주로노인인구에발생하여삶의질을현저히떨어뜨리는데, 손, 발, 척추와체중부과를많이받는관절, 즉, 고관절이나, 무릎관절에서많이발생한다. 또한, 류마티스성관절염은면역체계의이상으로부터발병하는자가면역질환이다. 이들관절염증질환의원인은서로다르고, 아직모든것이다밝혀져있지않지만, 질병의진행을도우며악화시키는매개체 (mediator) 들에관하여는많은부분이밝혀져있다. 즉, 인터루킨-1(interleukin-1) 등의전염증성사이토카인 (proinflammatory cytokine), 에이코사노이드 (eicosanoid)( 프로스타글란딘 (prostaglandins) 및류코트리엔 (leukotrienes)) 및이들을다량생합성하는사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2), 5-리폭시게나제 (5- lipoxygenase) 등의효소류들이관련되어있다. 최종적으로는이들매개체들의작용으로기질성금속단백분해효소 (matrix metalloproteinase; MMP) 가과발현되고, 이들의작용으로결국연골및관절의세포외기질 (extracellular matrix, ECM) 의파괴가일어나, 질병을진행시키며서서히악화되는데, MMP 중관절에서는 MMP-13( 포유류콜라겐분해효소 (mammalian collagenase)) 이가장핵심적인역할을한다고알려져있다. 연골의성분인 ECM은크게프로테오글리칸 (proteoglycan) 과당단백질 (glycoprotein) 로대별할수있다. 이것은관절연골에있는연골세포 (chondrocyte) 와염증의진행에따라모이는활막 (synovial membrane) 의섬유아세포유사활막세포 (fibroblast-like synoviocyte; FLS) 에서생합성되어세포외로분비되며, 이들의 turn-over를위하여따로 MMP를생산하여분비한다. 즉, 이들세포가한쪽으로는 ECM을생합성하며, 한쪽으로는 MMP를생산하여이들의균형을잡아관절의건강과유연함을유지한다. 그러나관절염상황에서는위에서설명한매개체들의자극에의하여이들세포로부터 MMP가높은농도로유도발현되고, 이들이 ECM을병적으로공격하여관절이서서히파괴된다. 천우슬 (Cyathula officinalis) 은비름과 (Amaranthaceae) 에속하는다년생초본으로건조한뿌리를약용하며월경부조의치료및이뇨제로중국에서사용되고있다 ( 중화인민공화국약전, 중국약전위원회, 1부, p.28, 2000). 천우슬의성분연구로는 Zhou등 (Zhou et al., Chemical study on Cyathula officinalis Kuan, Journal of Asian Natural Products Research, 7, pp.245-252, 2005) 이 4-[(1-ethoxy-2-hydroxy)ethyl]phenol, 2,3- isoproplylidene cyasterone, 24-hydroxycyasterone, 2,3-isopropylidene isocycasterone, N-[(3,4,5- trimethoxy)phenyl]formamide, 6,7-dimethoxycoumarin, butanedioic acid, p-hydroxybenzoic acid, betavulgarin, daidzin, puerarin, phenyl 1-β-D-glucopyranoside, cyasterone, sengosterone, amarasterone A, precyasterone, isocyasterone 및 makisterone B 등을분리, 보고하였으며, Okuzumi 등 (Okuzumi et al., Structural elucidation of cyasterone stereoisomers isolated from Cyathula officinalis, Organic Biomolecular Chemistry, 3, pp.1227-1232, 2005) 이 Cyasterone, 28-Epi-cyasterone 및 25-Epi-28-epicyasterone 등을분리, 보고하였다. 또한, Zhou등 [Zhou et al., Glycosides from Roots of Cyathula officinalis Kuan, Journal of Integrative Biology, 47(3), pp.368-374, 2005) 은 3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(1 3)-(n-butyl-β-D-glucopyranosiduronate)]-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid, 3-O-(methyl-β-D-glucopyranosiduronate)-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic aicd, 3-O-β-Dglucopyranosyl oleanolic acid, 3-O-β-D-glucuronopyranosyl oleanolic acid, 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl- (1 3)-(β-D-glucuronopyranosyl)] oleanolic acid, 3-O-(β-D-glucuronopyranosyl)-28-O-β-D- - 4 -
glucopyranosyl oleanolic aicd, 28-O-β-D-glucuronopyranosyl-(1 4)-β-D-glucopyranosyl hederagenin, 3- O-[α-L-rhamopyranosyl-(1 3)-β-D-glucuronopyranosyl]-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 및 3-O- [β-d-glucopyranosyl-(1 2)-α-L-rahmnopyranosyl-(1 3)-β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 등을분리하였고, MDA-MB-231(a human breast cancer cell line) 에대한세포독성 (cytotoxicity) 을측정하여활성물질로 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1 3)-(n-butyl-β-Dglucopyranosiduronate)]-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid와 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1 3)-(β -D-glucuronopyranosyl)] oleanolic acid를보고하였으며, Chen등 (Chen et al., Structural elucidation and antitumor activity of a fructan from Cyathula officinalis Kuan, Carbohydrate Research, 338, pp.1235-1241, 2003) 은폴리사카라이드 (polysacccharide) 인 fructan계열의화합물을분리하여구조를동정하고 Lewis pulmonary carcinoma cells을대상으로항암활성을측정하여보고하였다. [0019] [0020] 천우슬 (Cyathula officinalis) 은국내에서자생하는우슬 [ 쇠무릎 (Achyranthes japonica Nakai) 의뿌리 ] 과는완전히다른기원의식물이다 ( 중화인민공화국약전, 중국약전위원회, 1부, p.28, 2000; 약전분과위원회, 제 9개정대한약전해설서, p.1159, 2008). 우슬의염증관련저해작용에대하여는여러논문을통하여잘알려져있으나, 천우슬에대해서는관련된학술보고및특허가전무하다. 그러므로천우슬의염증억제작용특히관절염억제작용은현대과학적으로증명된것이없으며, 작용기전에대한보고도전무하다. 이에본발명자들은천우슬 (Cyathula officinalis) 추출물, 분획물또는이로부터분리한세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체에의한관절파괴저해작용, 관절염의예방및치료효과및그작용기전에대해지속적으로연구한결과, 연골세포에서관절연골파괴에가장중추적인역할을하는 MMP-13의발현저해효과, 콜라겐분해산물 (collagen degradation product) 및프로테오글리칸 (proteoglycan) 의생성억제효과를확인하였고, 토끼연골조직배양 (rabbit cartilage tissue culture) 을통하여상기작용을재확인하였으며, 최종적으로이러한항염증작용을 in vivo 동물모델에서확인하여본발명을완성하게되었다. [0021] [0022] [0023] 과제해결수단상기목적을수행하기위하여, 본발명은천우슬 (Cyathula officinalis) 추출물, 분획물또는이로부터분리한세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체를유효성분으로함유하는 MMP-13 과다발현에기인한질환의예방및치료용약학조성물을제공한다. 또한, 본발명은천우슬 (Cyathula officinalis) 추출물, 분획물또는이로부터분리한세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체를유효성분으로함유하는 MMP-13 과다발현에기인한질환의예방및개선용건강기능식품을제공한다. 본원에서정의되는세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체는하기구조식 (Ⅰ) 의 5α-H-10-β-selina- 4(14),7(11)-dien-8-one 또는구조식 (Ⅱ) 의 atractylenoide Ⅰ임을특징으로한다 : 화학식 1 [0024] : - 5 -
화학식 2 [0025] [0026] 본원에서정의되는상기추출물은물, C 1 내지 C 4 의저급알콜, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세 테이트, 글리세린, 부틸렌글리콜또는이들의혼합용매, 바람직하게는물, 에탄올, 메탄올, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트또는이들의혼합용매, 보다바람직하게는물, 에탄올, 클로로포름또는이 들의혼합용매에가용한추출물을포함한다. [0027] [0028] [0029] 본원에서정의되는분획물은천우슬의극성용매가용분획물또는비극성용매가용분획물임을특징으로한다. 본원에서정의되는상기극성용매가용분획물은물, 메탄올, 에탄올, 부탄올또는이들의혼합용매, 바람직하게는물또는부탄올에가용한분획물을포함한다. 본원에서정의되는상기비극성용매가용분획물은헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 글리세린또는부틸렌글리콜, 바람직하게는헥산또는메틸렌클로라이드에가용한분획물을포함한다. [0030] [0031] 본원에서정의되는 MMP-13 과다발현에기인한질환은급. 만성염증성질환, 퇴행성관절염, 류마티스관절염, 외상성관절손상에따른퇴행성연골손실, 척추관절병증, 강직성척추염, 루푸스 (Lupus) 관절염, 신경계의수초탈락질환, 치근막질환, 당뇨성망막변성, 증식성유리체망막병증, 미성숙망막병증, 원추각막또는쇼그렌증후군, 바람직하게는급. 만성염증성질환, 퇴행성관절염, 류마티스관절염, 외상성관절손상에따른퇴행성연골손실, 척추관절병증, 강직성척추염또는루푸스 (Lupus) 관절염, 보다바람직하게는퇴행성관절염또는류마티스관절염이다. 이하, 본발명의천우슬추출물및분획물을수득하는방법및이로부터세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체를분리하는방법을상세히설명한다. [0032] 천우슬 (Cyathula officinalis) 에추출용매로서물, C 1 내지 C 4 의저급알콜, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이 드, 에틸아세테이트, 글리세린, 부틸렌글리콜또는이들의혼합용매, 바람직하게는물, 에탄올, 메탄올, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트또는이들의혼합용매, 보다바람직하게는물, 에탄올, 클로로포름또는이들의혼합용매를시료중량의 1 내지 1000배, 바람직하게는 10 내지 500배 (v/w) 가하여 4 내지 40, 바람직하게는 10 내지 33 에서 1 내지 5시간, 바람직하게는 3시간씩 2회연속냉침추출, 열수추출, 초음파추출, 환류냉각추출또는가열추출등으로추출한후, 감압에서건조하여본발명의추출물을수득할수있다. [0033] [0034] 또한, 본발명의극성용매또는비극성용매가용분획물은상기에서얻은추출물, 바람직하게는천우슬에탄올추출물을추출물중량의 0.1 내지 1000배, 바람직하게는 1 내지 500배부피 (v/w) 의물에현탁시킨후, 헥산, 메틸렌클로라이드및부탄올을순차적으로가하여 1회내지 5회, 바람직하게는 2회내지 4회분획하여헥산, 메틸렌클로라이드등의비극성용매에가용한비극성용매가용분획물 ; 및부탄올, 물등의극성용매에가용한극성용매가용분획물을수득할수있다. 또한, 천우슬의뿌리를물및에탄올혼합용매로가열추출하는제 1단계 ; 수득한추출물에클로로포름과증류수를가하고분획하여클로로포름가용성분획물을수득하는제 2단계 ; 클로로포름가용성분획물을클로로포름 : 메탄올 = 15 : 1을용매로오픈컬럼크로마토그래피를실시하여 5개의분획으로나누는제 3단계 ; 상기제 3단계에서수득한분획을대상으로헥산 : 에틸아세테이트 = 4 : 1을용매로실리카겔컬럼크로마토그래피를실시 - 6 -
하여 6개의소분획으로나누는제 4단계 ; 상기제 4단계에서수득한소분획을대상으로헥산 : 에틸아세테이트 = 9 : 1을용매로실리카겔컬럼크로마토그래피를실시하여 4개의소분획으로나누는제 5단계 ; 상기제 5단계에서수득한소분획을대상으로물및메탄올혼합용매또는클로로포름을용매로 ODS 컬럼크로마토그래피또는실리카겔컬럼크로마토그래피를실시하는제 6단계의제조공정을통하여본발명의화합물을분리정제할수있다. [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] 본발명은상기의제조방법으로얻어진천우슬 (Cyathula officinalis) 추출물, 분획물또는이로부터분리한세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체를유효성분으로함유하는 MMP-13 과다발현에기인한질환의예방및치료용약학조성물을제공한다. 본발명의추출물, 분획물또는화합물을함유하는약학조성물은조성물총중량에대하여상기추출물, 분획물또는화합물을 0.1 내지 50 중량 % 로포함한다. 그러나상기와같은조성은반드시이에한정되는것은아니고, 환자의상태및질환의종류및진행정도에따라변할수있다. 본발명의추출물, 분획물또는화합물자체는독성및부작용이거의없으므로예방목적으로장기간복용시에도안심하고사용할수있는약제이다. 본발명의조성물은약학적조성물의제조에통상적으로사용하는적절한담체, 부형제및희석제를더포함할수있다. 본발명의조성물은각각통상의방법에따라산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸등의경구형제형, 외용제, 좌제및멸균주사용액의형태로제형화하여사용될수있으며, 추출물, 분획물또는화합물을포함하는조성물에포함될수있는담체, 부형제및희석제로는락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트및광물유를들수있다. 제제화할경우에는보통사용하는충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제등의희석제또는부형제를사용하여조제된다. 경구투여를위한고형제제에는정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이포함되며, 이러한고형제제는상기추출물, 분획물또는화합물에적어도하나이상의부형제예를들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는락토오스 (lactose), 젤라틴등을섞어조제된다. 또한단순한부형제이외에마그네슘스티레이트탈크같은윤활제들도사용된다. 경구를위한액상제제로는현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이해당되는데흔히사용되는단순희석제인물, 리퀴드파라핀이외에여러가지부형제, 예를들면습윤제, 감미제, 방향제, 보존제등이포함될수있다. 비경구투여를위한제제에는멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가포함된다. 비수성용제, 현탁제로는프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과같은식물성기름, 에틸올레이트와같은주사가능한에스테르등이사용될수있다. 좌제의기제로는위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴등이사용될수있다. 본발명의조성물의바람직한투여량은환자의상태및체중, 질병의정도, 약물형태, 투여경로및기간에따라다르지만, 당업자에의해적절하게선택될수있다. 그러나바람직한효과를위해서, 본발명의추출물, 분획물또는화합물은 1일 0.5 g/kg 내지 5 g/kg으로, 바람직하게는 1 g/kg 내지 3 g/kg으로투여하는것이좋다. 투여는하루에한번투여할수도있고, 수회나누어투여할수있다. 따라서상기투여량은어떠한면으로든본발명의범위를한정하는것은아니다. 본발명의조성물은쥐, 생쥐, 가축, 인간등의포유동물에다양한경로로투여될수있다. 투여의모든방식은예상될수있는데, 예를들면, 경구, 직장또는정맥, 근육, 피하, 자궁내경막또는뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에의해투여될수있다. [0043] [0044] 또한, 본발명은상기의제조방법으로얻어진천우슬 (Cyathula officinalis) 추출물, 분획물또는이로부터분리한세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체를유효성분으로함유하는 MMP-13 과다발현에기인한질환의예방및개선용건강기능식품을제공한다. 본발명의추출물, 분획물또는화합물을포함하는조성물은 MMP-13 과다발현에기인한질환의예방및개선을 - 7 -
위한약제, 식품및음료등에다양하게이용될수있다. 본발명의추출물, 분획물또는화합물을첨가할수 있는식품으로는, 예를들어, 각종식품류, 음료, 껌, 차, 비타민복합제, 건강보조식품류등이있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐또는음료인형태로사용할수있다. [0045] [0046] [0047] 본발명의추출물, 분획물또는화합물은 MMP-13 과다발현에기인한질환의예방및개선을목적으로식품또는음료에첨가될수있다. 이때, 식품또는음료중의상기추출물, 분획물또는화합물의양은일반적으로본발명의건강식품조성물은전체식품중량의 1 내지 5 중량 % 로가할수있으며, 건강음료조성물은 100 ml를기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의비율로가할수있다. 본발명의건강음료조성물은지시된비율로필수성분으로서상기추출물, 분획물또는화합물을함유하는것외에액체성분에는특별한제한점은없으며통상의음료와같이여러가지향미제또는천연탄수화물등을추가성분으로서함유할수있다. 상술한천연탄수화물의예는모노사카라이드, 예를들어, 포도당, 과당등의디사카라이드, 예를들어말토스, 슈크로스등의및폴리사카라이드, 예를들어덱스트린, 시클로덱스트린등과같은통상적인당및자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨등의당알콜이다. 상술한것이외의향미제로서천연향미제 ( 타우마틴, 스테비아추출물 ( 예를들어레바우디오시드 A, 글리시르히진등 ) 및합성향미제 ( 사카린, 아스파르탐등 ) 를유리하게사용할수있다. 상기천연탄수화물의비율은본발명의조성물 100 ml당일반적으로약 1 내지 20g, 바람직하게는약 5 내지 12g이다. 상기외에본발명의조성물은여러가지영양제, 비타민, 광물 ( 전해질 ), 합성풍미제및천연풍미제등의풍미제, 착색제및중진제 ( 치즈, 초콜릿등 ), 펙트산및그의염, 알긴산및그의염, 유기산, 보호성콜로이드증점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에사용되는탄산화제등을함유할수있다. 그밖에본발명의조성물들은천연과일쥬스및야채음료의제조를위한과육을함유할수있다. 이러한성분은독립적으로또는조합하여사용할수있다. 이러한첨가제의비율은그렇게중요하진않지만본발명의조성물 100 중량부당 0 내지약 20 중량부의범위에서선택되는것이일반적이다. [0048] 효과본발명의천우슬 (Cyathula officinalis) 추출물, 분획물또는이로부터분리한세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체는연골세포에서관절연골파괴에가장중추적인역할을하는 MMP-13의발현저해효과를보였으며, 토끼연골조직배양 (rabbit cartilage tissue culture) 을통하여콜라겐분해산물 (collagen degradation product) 및프로테오글리칸 (proteoglycan) 의생성억제효과를확인하였고, 최종적으로이러한항염증작용을 in vivo 동물모델에서확인한바, MMP-13 과다발현에기인한질환의예방및치료에유용한약학조성물및건강기능식품에이용될수있다. [0049] [0050] 발명의실시를위한구체적인내용이하, 본발명을참고예, 실시예및실험예에의해상세히설명한다. 단, 하기참고예, 실시예및실험예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명의내용이하기참고예, 실시예및실험예에한정되는것은아니다. [0051] [0052] 비교예 1. 국산우슬추출물의제조경동시장에서구입한국산우슬 (Achyranthes japonica Nakai) 100g에 100% 에탄올을 1l가하여 20 에서 3시간씩 2번연속적으로냉침추출한후, 감압에서건조하여국산우슬추출물을 5.4g 수득하여하기실험예의비교용시료로사용하였다. [0053] [0054] 실시예 1. 천우슬추출물의제조 경동시장에서구입한천우슬 (Cyathula officinalis) 각각 100g 씩에증류수, 5 내지 100% 수용성에탄올, 100% 메탄올, 헥산, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 에틸아세테이트를 1l 씩각각가하여 20 에서 3 시간씩 2 번연속 - 8 -
적으로냉침추출한후, 감압에서건조하여본발명의천우슬추출물을수득하여하기실험예의시료로사용하 였다. 각각의추출물의수율은하기표 1 에나타내었다. 표 1 [0055] 추출조건 % 수율 (w/w) 증류수추출물 (CO-W) 15.3% 5% 에탄올추출물 (CO-5-EtOH) 10.7% 10% 에탄올추출물 (CO-10-EtOH) 11.4% 25% 에탄올추출물 (CO-25-EtOH) 13.8% 50% 에탄올추출물 (CO-50-EtOH) 25.1% 75% 에탄올추출물 (CO-75-EtOH) 22.0% 100% 에탄올추출물 (CO-EtOH) 20.9% 100% 메탄올추출물 (CO-MeOH) 21.9% 헥산추출물 (CO-hexane) 2.2% 메틸렌클로라이드추출물 (CO-DCM) 3.5% 클로로포름추출물 (CO-CF) 4.1% 에틸아세테이트추출물 (CO-Ethylacetate) 7.2% [0056] [0057] 실시예 2. 천우슬극성용매및비극성용매가용분획물의제조상기실시예 1을반복하여수득한 100% 에탄올추출물 (CO-EtOH) 100 g을물 0.2l에넣은후, 분획깔대기에서각각 0.5l의헥산, 메틸렌클로라이드, 부탄올로차례로 3회분획하여헥산분획물 (5.4g), 메틸렌클로라이드분획물 (9.2g), 부탄올분획물 (21.7g) 및나머지물분획물 (36.2g) 을수득하였고, 하기실험예의시료로사용하였다. 각각의분획물의수율은하기표 2에나타내었다. 표 2 [0058] 추출조건 % 수율 (w/w) 헥산분획물 (CO-F-hexane) 5.4% 메틸렌클로라이드분획물 (CO-F-DCM) 9.2% 부탄올분획물 (CO-F-BuOH) 21.7% [0059] [0060] 실시예 3. 천우슬로부터세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체의분리및동정 천우슬의뿌리로부터활성화합물을분리하기위하여천우슬의뿌리 6 kg을 95% 에탄올 18l 로가열추출하여에 탄올추출물 1.2 kg을수득하였다. 수득한에탄올추출물에클로로포름 4l 과증류수 2l 를가하고분획하여클 로로포름가용성분획물 10 g을수득하였다. 활성-추적분리 (Activity-guided separation) 기술을이용하여, 계속적으로클로로포름가용성분획물 10 g을실리카겔 (silica gel) 200 g을충진제로사용하고, 유리분리관 (glass column; φ5 50cm ) 을이용하여, 클로로포름 : 메탄올 = 15 : 1을용매로오픈컬럼크로마토그래피 (open column chromatography) 를실시하여 5개의분획 (Ⅰ~Ⅴ) 으로나누었다. 분획 Ⅱ를대상으로헥산 : 에틸아세테이트 = 4 : 1을용매로실리카겔컬럼크로마토그래피 (silica gel column chromatography; φ3 40cm ) 를실시하여 6개의소분획 (Ⅱ-1 ~ Ⅱ-6) 으로나누었다. 소분획 Ⅱ-2를다시헥산 : 에틸아세테이트 = 9 : 1을용매로실리카겔컬럼크로마토그래피 (φ3 40cm) 를실시하여 4개의소분획 (Ⅱ-2-1 ~ Ⅱ-2-4) 으로나누었다. 소분획 Ⅱ-2-2를 80% 메탄올을용매로 ODS 컬럼크로마토그래피 (φ3 20cm) 를실시하여화합물 1을 10 mg수득하였다. 또한, 소분획 Ⅱ-2-3을 100% 클로로포름을용매로실리카겔컬럼크로마토그래피 (φ3 20cm) 를실시하여화합물 2를 17 mg수득하였다. - 9 -
[0061] 화합물 1-1 H-NMR (600 MHz, CDCl 3 ) δ : 0.77 (3H, s), 1.82 (3H, s), 1.99 (3H, s), 4.61 (1H, s), 4.86 (1H, s) ; 13 C-NMR (150 MHz, CDCl 3 ) δ : 17.33 (C-15), 22.32 (C-13), 23.14 (C-2), 23.26 (C-12), 29.19 (C-6), 36.78 (C-1 or C-3), 38.20 (C-10), 41.25 (C-1 or C-3), 47.06 (C-5), 57.61 (C-9), 106.95 (C- 14), 131.55 (C-7), 142.74 (C-11), 149.08 (C-4), 203.83 (C-8) [0062] 화합물 2-1 H-NMR (600 MHz, CDCl 3 ) δ : 0.93 (3H, s, CH 3 ), 1.89 (3H, d, J=1.2 Hz, CH 3 ), 4.62 (1H, s, C=CH 2 ), 4.90 (1H, s, C=CH 2 ), 5.59 (1H, s, C=CH); 13 C-NMR (150 MHz, CDCl 3 ) δ : 8.46 (C-13), 18.57 (C- 14), 22.66 (C-6), 23.00 (C-2), 36.18 (C-3), 38.13 (C-10), 39.10 (C-1), 48.41 (C-5), 107.48 (C-15), 119.16 (C-9), 120.45 (C-11), 147.99 (C-4), 148.09 (C-8), 148.34 (C-7), 171.38 (C-12) [0063] 상기 1 H-NMR 및 13 C-NMR 스펙트럼을문헌 (Nishikawa et al., Yakugaku Zasshi, 97, pp.515-518, 1977) 과비교하 여화합물 1 은그구조를 5α-H-10-β-Selina-4(14),7(11)-dien-8-one 으로, 화합물 2 는 1 H-NMR 및 13 C-NMR 스펙 트럼을문헌 (Endo et al., Chem. Phram. Bull., 27, pp.2594-2958, 1979; Pachaly et al., Planta Med., 55, pp.59-61, 1989) 과비교하여그구조를 Atractylenoide Ⅰ 으로각각동정하였다. [0064] [0065] 참고예 1. 토끼관절의연골조직배양및활성화 Baek등의방법에따라 (Baek et al., Biol. Pharm. Bull. 29, pp.1423-1430, 2006), 토끼관절의연골조직 (rabbit articular cartilage slice) 을잘라내고 complete DMEM 배지에서 14일동안배양하였다. 그후연골 (cartilage) 을잘라각각 48-웰플레이트에넣고, IL-1α 10ng/ml을처리하여 25일간배양하였다. 이때, 검체를여러농도로처리하여배양한후, 3, 7, 14 및 28일에상등액을얻어, 하기실험예 2에서사용하였다. [0066] [0067] [0068] [0069] 실험예 1. 천우슬의 MMP-13 발현저해효과상기실시예에서수득한천우슬추출물, 분획물및이로부터분리한화합물의 MMP-13 발현저해효과를확인하기위하여문헌에기재된방법을이용하여하기와같이실험하였다 (Pei et al., Osteoarthritis Cartilage, 14, pp.749-758, 2006). 인간연골육종세포주 (Human chondrosarcoma cell line) 인 SW1353(ATCC사 ) 을 10% FBS와페니실린 / 스트렙토마이신, 글루타민이첨가된 DMEM을사용하여배양하였다. 배지내로분비되는 MMP-13의발현을확인하기위해서 serum-free DMEM 조건하에서 IL-1β를 10 ng/ml 농도로처리하고 24시간경과후, 상등액을얻어다음의방법과같이웨스턴블랏 (western blot) 을시행하여이들 MMP의양을확인하였다. 세포배양상등액에트라이클로로아세트산 (trichloroacetic acid, Sigma) 을최종농도 15% 로첨가하여 12,000 rpm에서 10분간원심분리한다음, 상등액을버리고아세톤 (acetone) 을 1 ml 첨가한후, vortex하여 12,000 rpm에서 10분간원심분리하였다. 다시상등액을버리고실온에서 30분이상건조시킨다음, 1X sample buffer를 20 ul 넣고 vortex한후 3분간가열하여 10% gel에전기영동시켰다. PVDF로 1시간 transfer시킨후, anti-mmp-13 antibody(sigma, M4052) 를 1:5000 으로 5% 탈지유 (skim milk) 에희석하여 1시간반응시키고, anti-rabbit antibody(cell signaling) 를 1:2000으로 5% 탈지유 (skim milk) 에희석하여 1시간반응시켰다. ECL 용액 (Amersham) 을첨가하여 x-ray film에감광시켰다. 상기비교예에서수득한국산우슬추출물및실시예 1 내지실시예 3에서수득한천우슬추출물, 분획물및화합물들을각각 SW1353(1 10 6 cells/well) 에처리한후, MMP-13의양을검정하였고, 그결과는 blot의 scanning(hp Lajerjet 3052) 을통하여정량적으로하기표 3 및도 1에나타내었다. - 10 -
표 3 [0070] 실험군 농도 % 저해능 증류수추출물 (CO-W) 200 ug/ml 10.3% 5% 에탄올추출물 (CO-5-EtOH) 200 ug/ml 15.5% 10% 에탄올추출물 (CO-10-EtOH) 200 ug/ml 22.3% 25% 에탄올추출물 (CO-25-EtOH) 200 ug/ml 42.9% 50% 에탄올추출물 (CO-50-EtOH) 200 ug/ml 60.1% 75% 에탄올추출물 (CO-75-EtOH) 200 ug/ml 72.4% 100% 에탄올추출물 (CO-EtOH) 200 ug/ml 98.0% 100% 에탄올추출물 (CO-EtOH) 50 ug/ml 15.6% 100% 메탄올추출물 (CO-MeOH) 200 ug/ml 97.7% 100% 메탄올추출물 (CO-MeOH) 50 ug/ml 12.3% 헥산분획물 (CO-F-hexane) 50 ug/ml 94.4% 메틸렌클로라이드분획물 (CO-F-DCM) 50 ug/ml 82.2% 부탄올분획물 (CO-F-BuOH) 50 ug/ml 32.8% 헥산추출물 (CO-hexane) 50 ug/ml 98.1% 메틸렌클로라이드추출물 (CO-DCM) 50 ug/ml 96.7% 클로로포름추출물 (CO-CF) 50 ug/ml 95.5% 에틸아세테이트추출물 (CO-Ethylacetate) 50 ug/ml 97.4% 국산우슬 100% 에탄올추출물 200 ug/ml - 화합물 1, 20 um 72.2% [5α-H-10-β-selina-4(14),7(11)-dien-8-one] 화합물 2, atratylenolide I 20 um 52.3% 실험결과는 3회실험의평균값으로나타냄 [0071] 실험결과, 표 3에나타난바와같이, 비교예에서수득한국산우슬의 100% 에탄올추출물은 MMP-13 저해효과가전혀없었던반면에, 천우슬의추출물, 극성용매및비극성용매가용분획물의 MMP-13의저해능이월등히높음을확인할수있었다. 또한, 천우슬의비극성분획으로부터분리한세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체화합물 1 및화합물 2가활성물질임을확인할수있었다. 이결과는천우슬의추출물, 분획물및이로부터분리한화합물이관절에서의 ECM의분해를억제하여관절염치료제로작용할것이라는예상이가능하게하였다. [0072] [0073] [0074] [0075] 실험예 2. 글라이코스아미노글라이칸및콜라겐분해산물의측정상기실시예에서수득한천우슬추출물, 분획물및이로부터분리한화합물의 MMP 발현저해에따른콜라겐분해산물 (collagen degradation product) 및프로테오글리칸 (proteoglycan) 의양에미치는영향을다음과같이확인하였다. 연골글라이코스아미노글라이칸 (Cartilage glycosaminoglycan) 의분해율 (degradation) 을측정하기위하여는 1,9-dimethylene blue 용액을사용하여 535nm에서글라이코스아미노글라이칸을정량하였고, 그결과를하기수학식 1을이용하여분해율을계산하여하기표 4에나타내었다. 또한, 연골의콜라겐분해율을측정하기위하여, 상기참고예 1에서준비한배양 21일째의상등액에들어있는 type II 콜라겐분해산물 (collagen degradation product) 을 sircol collagen type II cleavage ELISA assay 를이용하여측정하였고, 그결과를하기수학식 1을이용하여분해율을계산하여하기표 4에나타내었다. 양성대조군으로는 Prednisolone(50 um) 을사용하였다. [0076] 수학식 1 분해율 (%)= [IL-1 및샘플처리군의분해량 /IL-1 처리군의분해량 ] 100-11 -
표 4 [0077] 실험군 농도 % 글라이코스아미노글라 % 콜라겐의분해 이칸의분해 Control - 22.7 ± 4.5 30.5 ± 5.1 IL-1-treated - 100.0 ± 3.1 100.0 ± 4.4 Prednisolone 50 um 38.1 ± 4.8* 47.1 ± 3.6* CO-EtOH 1 ug/ml 89.9 ± 7.1 92.6 ± 3.7 5 ug/ml 77.5 ± 4.1* 82.4 ± 5.3 20 ug/ml 45.5 ± 3.7* 55.9 ± 3.4* CO-F-DCM 1 ug/ml 63.6 ± 3.2* 67.8 ± 2.9* 5 ug/ml 44.9 ± 2.4* 51.7 ± 3.1* CO-CF 1 ug/ml 68.2 ± 4.4* 69.0 ± 2.1* 5 ug/ml 50.4 ± 3.7* 49.2 ± 3.7* 화합물 1 1 um 82.3 ± 4.7* 88.2 ± 5.7* 10 um 50.4 ± 5.2* 55.1 ± 2.6* 유의성평가는 IL-1-treated군에대한각실험군을 Student t-test(n = 3) 를실시하여구하였으며, *p < 0.01로표시하였다. [0078] 실험결과, 표 4 에나타난바와같이, 천우슬 100% 에탄올추출물, 메틸렌클로라이드분획물, 클로로포름추출물 및화합물 1 은유의적으로 ECM 의분해를억제하였고, 관절연골의분해가저해되는결과를확인할수있었다. [0079] [0080] [0081] 실험예 3. 급성염증동물모델 (in vivo) 에서의항염증작용상기실시예에서수득한천우슬추출물및이로부터분리한화합물의항염증효과를확인하기위하여, 급성염증의모델로써 carrageenan-유도발부종 (paw edema) ICR 마우스 (20-22 g, Orient-Bio 사 ) 를사용하여하기와같이실험하였다 (Winter et al., Proc. Soc. Exp. Bil. Med. 111, pp.544-547, 1962). 천우슬추출물, 분획물및이로부터분리한화합물을경구투여하고, 1시간후, 1% λ-carrageenan(cgn) 용액을오른쪽발바닥에주사하였다. 5시간후에발부종 (paw edema) 을물-치환법 (water-displacement) 으로측정하였으며, 표 5에나타내었다. 양성대조군으로는 Prednisolone(sigma, 5 mg/kg) 을사용하였다. 표 5 [0082] 실험군 용량 (mg/kg) 증가된오른쪽발 저해능 (%) 부피 (ml) CGN-treated - 0.153 ± 0.022 - Prednisolone 5 0.083 ± 0.012 45.8 CO-EtOH 10 0.144 ± 0.038 5.9 100 0.135 ± 0.027 11.8 400 0.102 ± 0.018* 33.3 CO-F-DCM 100 0.124 ± 0.032 19.0 400 0.098 ± 0.020* 35.9 CO-CF 100 0.118 ± 0.028 22.9 400 0.100 ± 0.019* 34.6 화합물 1 10 0.130 ± 0.037 15.0 100 0.106 ± 0.017* 30.7 유의성평가는 CGN-treated군에대한각실험군을 Student t-test(n = 3) 를실시하여구하였으며, *p < 0.01로표시하였다. [0083] 실험결과, 표 5 에나타난바와같이, 천우슬 100% 에탄올추출물, 메틸렌클로라이드분획물, 클로로포름추출물 - 12 -
및화합물 1 은급성염증동물모델에서유의적으로항염증작용을나타냄을확인할수있었다. [0084] [0085] [0086] 실험예 4. 만성염증동물모델 (in vivo) 에서의류마티스관절염억제작용상기실시예에서수득한천우슬추출물, 분획물및이로부터분리한화합물의항염증효과를확인하기위하여, 만성염증의모델로써열처리된건조우락균 (Mycobacterium butyricum) 을오른쪽발바닥에주사한웅성의 SD rat(200-220 g, Orient-Bio사 ) 를사용하여하기와같이실험하였다 (Kim et al., Planta Med. 65, pp.465-467, 1999). 천우슬추출물, 분획물및이로부터분리한화합물을매일경구투여하고, 2차염증 (Secondary inflammation) 인후기단계 (late phase) 의부종 (16일째) 과 adjuvant를투여하지않은발 ( 왼쪽발 ) 의부종을관절염증 (arthritic inflammation) 으로하여저해능을계산하여하기표 6에나타내었다. 양성대조군으로는 Prednisolone(5 mg/kg/day) 을사용하였다. 표 6 [0087] 실험군 용량 (mg/kg/day) 16일째, 증가된왼쪽발 저해능 (%) 부피 (ml) adjuvant-treated - 0.177 ± 0.028 - Prednisolone 5 0.052 ± 0.010* 70.6 CO-EtOH 100 0.167 ± 0.042 5.6 400 0.103 ± 0.025* 41.8 CO-F-DCM 100 0.143 ± 0.026 19.2 400 0.090 ± 0.024* 49.2 CO-CF 100 0.157 ± 0.038 11.3 400 0.129 ± 0.045 27.1 화합물 1 10 0.158 ± 0.042 10.7 100 0.114 ± 0.026* 35.6 유의성평가는 adjuvant-treated군에대한각실험군을 Student t-test(n = 3) 를실시하여구하였으 며, *p < 0.01로표시하였다. [0088] 실험결과, 표 6 에나타난바와같이, 천우슬 100% 에탄올추출물, 메틸렌클로라이드분획물및화합물 1 은만성 염증동물모델에서류마티스성관절염을유의적으로억제하는효과를확인할수있었다. [0089] [0090] [0091] [0092] 실험예 5. 퇴행성관절염모델 (in vivo) 에서의퇴행성관절염억제작용상기실시예에서수득한천우슬추출물, 분획물및이로부터분리한화합물의퇴행성관절염억제활성을확인하기위하여, in vivo 동물모델로서 rat model을사용하여하기와같이실험하였다 (Guingamp et al., Arthritis Rheum. 40, pp.1670-1679, 1997). 요오드초산 (Iodoacetic acid) 30 ul을 SD rat(200-220 g, Orient-Bio사 ) 의오른다리무릎에관절강주사로투여하였다. 천우슬추출물, 분획물및이로부터분리한화합물을 5일 /week씩매일 1회경구투여하였다. 요오드초산투여 4주후에 rat를희생시키고무릎관절을절개한후, 조직학적 (histology) 방법에따라조직을고정하고, 사프라닌 O(safranin O) 염색한다음, 현미경관찰하여결과를도 2에나타내었다. 실험결과, 도 2에나타난바와같이, 천우슬 100% 에탄올추출물 (300 mg/kg/day) 및천우슬메틸렌클로라이드분획물 (100 mg/kg/day) 은 in vivo에서퇴행성관절염저해작용을보였고, 관절의파괴를억제하였음을확인할수있었다. [0093] 실험예 6. 급성독성실험 - 13 -
[0094] [0095] [0096] 식약청의규정에따라급성독성시험을 ICR 마우스를대상으로하기와같이실시하였다. 상기실시예 1 내지실시예 3에서수득한천우슬 100% 에탄올추출물 (CO-EtOH, 2 g/kg까지 ), 천우슬메틸렌클로라이드분획물 (CO-F-DCM, 1 g/kg까지 ), 천우슬클로로포름추출물 (CO-CF, 1 g/kg까지 ), 화합물 1(5α-H-10-βselina-4(14),7(11)-dien-8-one, 400 mg/kg까지 ) 을 0.1% 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 에녹인후, 2배씩희석한검체를경구투여하고 3일동안동물의폐사여부, 임상증상및체중변화를관찰하고혈액학적검사와혈액생화학적검사를실시하였으며, 부검하여육안으로강장기와흉강장기의이상여부를관찰하였다. 실험결과, 실험물질을투여한모든동물에서특이할만한임상증상이나폐사된동물은없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학검사및부검소견등에서도독성변화는발견되지않아, 이들은인체에안전하게사용될수있을것으로사료된다. [0097] 하기에본발명의천우슬추출물, 분획물또는이로부터분리한세스퀴테르펜 (sesquiterpene) 유도체를포함하 는조성물의제제예를설명하나, 본발명은이를한정하고자함이아닌단지구체적으로설명하고자함이다. [0098] 제제예 1. 산제의제조 [0099] [0100] [0101] CO-EtOH 유당 탈크 20 mg 100 mg 10 mg [0102] 상기의성분들을혼합하고기밀포에충진하여산제를제조한다. [0103] 제제예 2. 정제의제조 [0104] [0105] [0106] [0107] CO-F-DCM 옥수수전분유당스테아린산마그네슘 10 mg 100 mg 100 mg 2 mg [0108] 상기의성분들을혼합한후통상의정제의제조방법에따라서타정하여정제를제조한다. [0109] 제제예 3. 캅셀제의제조 [0110] [0111] [0112] [0113] CO-CF 결정성셀룰로오스락토오스마그네슘스테아레이트 10 mg 3 mg 14.8 mg 0.2 mg [0114] 통상의캡슐제제조방법에따라상기의성분을혼합하고젤라틴캡슐에충전하여캡슐제를제조한다. [0115] 제제예 4. 주사제의제조 [0116] [0117] [0118] [0119] 화합물 1(5α-H-10-β-selina-4(14),7(11)-dien-8-one) 만니톨주사용멸균증류수 Na2HPO4,12H2O 10 mg 180 mg 2974 mg 26 mg - 14 -
[0120] 통상의주사제의제조방법에따라 1 앰플당 (2 ml ) 상기의성분함량으로제조한다. [0121] 제제예 5. 액제의제조 [0122] [0123] [0124] [0125] 화합물 2(atratylenolide I) 이성화당만니톨정제수 20 mg 10 g 5 g 적량 [0126] 통상의액제의제조방법에따라정제수에각각의성분을가하여용해시키고레몬향을적량가한다음상기의성 분을혼합한다음정제수를가하여전체를정제수를가하여전체 100 ml로조절한후갈색병에충진하여멸균시 켜액제를제조한다. [0127] 제제예 6. 건강식품의제조 [0128] [0129] [0130] [0131] [0132] [0133] [0134] [0135] [0136] [0137] [0138] [0139] [0140] [0141] [0142] [0143] [0144] [0145] [0146] [0147] [0148] [0149] CO-EtOH 비타민혼합물비타민 A 아세테이트비타민 E 비타민 B1 비타민 B2 비타민 B6 비타민 B12 비타민 C 비오틴니코틴산아미드엽산판토텐산칼슘무기질혼합물황산제1철산화아연탄산마그네슘제1인산칼륨제2인산칼슘구연산칼륨탄산칼슘염화마그네슘 1000 mg적량 70 μg 1.0 mg 0.13 mg 0.15 mg 0.5 mg 0.2 μg 10 mg 10 μg 1.7 mg 50 μg 0.5 mg적량 1.75 mg 0.82 mg 25.3 mg 15 mg 55 mg 90 mg 100 mg 24.8 mg [0150] 상기의비타민및미네랄혼합물의조성비는비교적건강식품에적합한성분을바람직한실시예로혼합조성하 였지만, 그배합비를임의로변형실시하여도무방하며, 통상의건강식품제조방법에따라상기의성분을혼합 한다음, 과립을제조하고, 통상의방법에따라건강식품조성물제조에사용할수있다. - 15 -
[0151] [0152] [0153] [0154] [0155] [0156] [0157] 제제예 7. 건강음료의제조 CO-F-DCM 구연산올리고당매실농축액타우린정제수를가하여 1000 mg 1000 mg 100 g 2 g 1 g 전체 900 ml [0158] [0159] 통상의건강음료제조방법에따라상기의성분을혼합한다음, 약 1시간동안 85 에서교반가열한후, 만들어진용액을여과하여멸균된 2l 용기에취득하여밀봉멸균한뒤냉장보관한다음본발명의건강음료조성물제조에사용한다. 상기조성비는비교적기호음료에적합한성분을바람직한실시예로혼합조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도등지역적, 민족적기호도에따라서그배합비를임의로변형실시하여도무방하다. [0160] [0161] 도면의간단한설명도 1은 MMP-13의발현저해능 (E: CO-EtOH(200 ug/ml), 1: CO-F-BuOH(50 ug/ml), 2: CO-F-hexane(50 ug/ml), 3: CO-F-DCM(50 ug/ml), 4: 물분획물 (50 ug/ml), Co-1: 5α-H-10-β-selina-4(14),7(11)-dien-8-one, Co-2: atractylenolide I) 을나타낸도이고, 도 2는조직검사결과 (a: Control, b: Iodoacetate-treated, c: CO-EtOH(300 mg/kg/day), d: CO-F-DCM(100 mg/kg/day)) 를나타낸도이다. 도면 도면 1-16 -
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