(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 31/353 (2006.01) A61K 31/352 (2006.01) A61K 31/35 (2006.01) A61K 31/385 (2006.01) (21) 출원번호 10-2011-0130620 (22) 출원일자 2011 년 12 월 07 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 7 항 2011 년 12 월 07 일 (11) 공개번호 10-2013-0063970 (43) 공개일자 2013년06월17일 (71) 출원인 강원대학교산학협력단 강원도춘천시강원대학길 1 ( 효자동 ) (72) 발명자 원무호 강원도춘천시신북읍아리산길 22 박정호 대전광역시유성구노은동열매마을아파트 811 동 804 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 특허법인천지 (54) 발명의명칭신규한화합물, 그제조방법및이를포함하는약학적조성물 (57) 요약 본발명은신규한화합물및그용도와이의제조방법에관한것이다. 또한, 본발명은신규한화합물을유효성분으로포함하는조성물, 구체적으로약학조성물, 더구체적으로신규한화합물및이의염을유효성분으로포함하는허혈성뇌혈관질환치료, 예방및개선용조성물에관한것이다. 상기화학식 1의구조를갖는화합물은신경세포보호능및신경세포사억제능이우수하고, 아교세포활성억제능이뛰어나며, 뇌허혈에민감하다고알려져있는뇌해마조직 CA1 영역의신경손상을효과적으로예방할수있어서, 허혈성뇌혈관질환을효과적으로치료, 예방및개선하는데유용하게사용할수있다. 또한이러한효과가동물실험을통하여확인되었으므로, 인체에대한부작용도없거나극히적을것으로예상되므로, 뇌신경세포의보호및뇌질환의치료, 예방또는개선을위해다양하게응용될수있을것으로기대된다. 대표도 - 도 2-1 -
(72) 발명자 유기연 강원도강릉시토성로 39, 106 동 1306 호 ( 홍제동, 홍제힐스테이트 ) 황인구 서울특별시관악구봉천 11 동 180-164 B01 호 이충현 경기도안양시만안구현충로 10-2 ( 안양동 ) 최정훈 강원도춘천시후평동포스코아파트 104 동 1502 호 박준하 경기도양평군양서면국수길 57 김인혜 강원도춘천시퇴계동퇴계주공 6 차 601 동 905 연고흠 충청북도음성군음성읍설성로 22, 106 동 506 호 ( 한성진주아파트 ) 임용배 대전광역시동구계족로 137, 새들뫼아파트 105 동 1004 호 ( 대동 ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 2011K000267 부처명 교육과학기술부 연구사업명 21세기프론티어연구개발사업, 뇌기능활용및뇌질환치료기술개발연구사업단 연구과제명 천연소재성분의화학적구조변경을이용한허혈성신경세포 주관기관 고려대학교산학협력단 연구기간 2011.04.01 ~ 2012.03.31-2 -
특허청구의범위청구항 1 하기화학식 1의구조를갖는화합물또는그의약학적으로허용되는염을유효성분으로포함하는허혈성뇌혈관질환치료또는예방용조성물. 청구항 2 제1항에있어서, 상기허혈성뇌혈관질환은뇌경색, 뇌출혈, 지주막하출혈및백질이상증으로이루어진군에서선택된어느하나인허혈성뇌혈관질환치료또는예방용조성물. 청구항 3 하기화학식 1의구조를갖는화합물또는그의약학적으로허용되는염을유효성분으로포함하는신경세포재생용약학조성물. 청구항 4 하기화학식 1의구조를갖는화합물또는그의약학적으로허용되는염을유효성분으로포함하는신경세포의손상에대한치료또는예방용조성물. 청구항 5 하기화학식 1 의구조를갖는화합물또는그의약학적으로허용되는염을유효성분으로포함하는뇌손상에 대한치료또는예방용조성물. - 3 -
청구항 6 하기화학식 1 의구조를갖는화합물또는그의약학적으로허용되는염 : 청구항 7 하기화학식 2의구조를갖는화합물을하기화학식 3의구조를갖는화합물과반응시켜하기화학식 1의구조를갖는화합물을제조하는단계를포함하는것을특징으로하는화합물의제조방법. [ 화학식 2] [ 화학식 3] 명세서 기술분야 - 4 -
[0001] 본발명은신규한화합물, 그제조방법및이를유효성분으로포함하는약학조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] 배경기술최근보고된바에의하면, 미국을비롯한선진국의평균수명이급증하고있어서, 2030년에는 65세이상의노령인구의경우두배가량늘어날것으로전망되고있다. 상기급속한노령인구의증가와함께선진국과일부개발도상국의사회경제적환경이구조적으로변화함에따라, 보건및의학분야에서도지난 50여년간주요한사망원인이되었던급성전염성질병보다는만성허혈성질병에대한관심이증대되고있다. 특히, 급속한노령인구의증가에따라, 뇌, 척추또는말초신경등의손상을포함한허혈성신경질환이계속해서증가하고있는추세이다. 우리나라의경우에도노령인구의비율을살펴보면지난 2000년 65세이상인구가총인구에서차지하는비중이 7.2 % 에이르러고령화사회에들어섰으며, 오는 2019년에는이비율이 14 % 를넘어고령사회에진입할것으로전망되고있다. 노령화인구의증가로인해서지난 50여년간사망의주된원인이되었던급성전염성질병보다는만성허혈성질병이더욱더큰문제로대두되고있다. 특히만성허혈성질병중에서뇌혈관질환에의한사망은단일질환에의한사망률중에서 2위를기록하고있는매우중요한질환이다. 구체적으로, 2002년 WHO의조사에근거한보고서에의하면, 2000년기준세계 60억인구중알츠하이머성치매환자는 3,700만명, 뇌졸중환자는 4,100만명으로보고되고있으며, 현재뇌졸중을비롯하여알츠하이머성치매, 파킨슨병등허혈성뇌혈관질환의연간시장규모는미국이 200조원, 한국이약 10조원에달하며, 2004년 WHO에근거한 OECD 보고서에의하면세계뇌졸중시장은약 10조원이며, 국내도 450 원억이소비되는것으로알려져있으며, 2010년에는이보다 4 배이상증가하여, 해외는약 41조, 국내는약 2,500억원의시장규모를이룰것으로예상된다. 2005년에발표된 2004년통계청발표자료에의하면, 뇌혈관질환은우리나라사망원인에 2위를차지하는질환이고, 미국에서도심장질환과암에이어 3번째사망원인에해당하는질환이다. 상기뇌혈관질환이란흔히뇌졸중이라고도하며, 뇌혈류이상으로인해갑작스레유발되는신경학적결손증상의하나로, 크게 2가지형태로분류될수있다. 하나는주로교통사고등과같이외부의충격에의해서뇌에있는혈관이터져서발생하는뇌출혈과같은출혈성뇌질환이고, 다른하나는주로노령의사람들에서자주나타나는질환으로뇌혈관폐쇄등과같이뇌혈관이막혀서뇌에혈액과산소공급이되지못하여, 뇌세포가죽게되어발생되는질환으로, 뇌경색과같은허혈성뇌질환이있다. 우리나라의뇌혈관질환은약 27% 가뇌출혈인반면, 약 69% 가뇌경색으로, 최근들어서점차적으로뇌경색이증가되고있는추세이다. 상기뇌경색은허혈성뇌혈관질환이라고도하며, 뇌혈관이막혀서뇌에혈액과산소공급을되지못하여, 뇌세포가죽게되어발생하는질환을의미한다. 상기뇌경색이나뇌출혈로인해뇌의기능을잃게되면외견상반신마비, 언어장애및의식장애등의신체증상이나타나기도하며, 심한경우에는사망을할수도있다. 일예로, 뇌졸증환자의 15% 내지 30% 는반신마비나정신발달장애와같은영구적인장애가남게되며, 근본적인병인의이해및치료기술개발에대한수요가증가되고있음에도불구하고, 치료후에도상당수가재발하는것으로알려져있다. 뇌혈관질환중높은발병률을갖고있는허혈성뇌혈관질환은뇌의혈류가감소되어산소와포도당의공급이이루어지지않아, 해마 CA1 영역에지연성신경세포사 (delayed neuronal death) 가유발되어발생되는질환을의미한다. 또한, 상기허혈성뇌질환은동맥경화나심장마비와같은병리학적상황에서뇌에혈액이공급되지않음으로써유발되는것으로알려져있다. 구체적으로, 상기허혈성뇌질환은뇌혈관벽에콜레스테롤이침착되면서생기거나심혈관계통내에서생성된혈전이뇌혈관을막거나, 기타노폐물이뇌혈관을막아서발병하게되며, 뇌의혈류가감소되어산소와포도당의공급이이루어지지않아, 해마부위, 구체적으로해마 CA1 영역에지연성신경세포사 (delayed neuronal death) 가유발되어발생된다. 상기해마부위는노화및각종허혈성질환에의해손상을쉽게받는부위로알려져있으며, 특히노화에따라서고유의기능인단기및일과적기억이현저하게감소되는것으로알려져있다. 이러한노화에따른기능저하에대해서과거에는신경세포의손상에의한것으로알려져있고, 최근들어신경세포손상외에신경세포재 - 5 -
생의현저한감소로인해해마기능저하가나타날수있는것으로보고되고있다. [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] 상기해마 CA1 영역에지연성신경세포사 (delayed neuronal death) 가유발되어발생되는질환을의미하며, 지연성신경세포사는몽골리안저빌 (Mongolian gerbil) 을이용한일과성전뇌허혈모델 (transient forebrain ischemic model) 을통한실험에서살펴보면, 5분간뇌허혈유도 4일후해마 (hippcampus) 의 CA1 영역에서신경세포사가관찰되는것으로보고되고있다. 또한, 허혈성뇌신경세포사는흥분성세포독성, 산화적스트레스, 질산화적스트레스및세포예정사와같은기전에의해서유발된다고알려져있다. 특히, 일시적대뇌허혈 (transient cerebral ischemia) 은해마 CA1 영역의피라밋신경세포와같은취약한세포에서선택적신경세포사멸을유발한다. 이러한취약성은글루타메이트 (glutamate) 신경독성, 세포예정사단백질의활성화, 미토콘드리아의이상, 2차적염증반응에의한것으로생각되고있다. 상기지연성신경세포사의원인은세포내로칼슘의과다유입, 프리라디칼 (free radical) 관련신경세포손상또는글루타메이트-수용체매개신경세포손상이라고알려져있다. 보다구체적으로, 뇌허혈이발생되면, 산소와포도당의공급이차단되어신경세포에서는 ATP(Adenosine Triphosphate) 의감소로인해능동수송의역전이발생되어, 신경세포의탈분극이일어나고, 시냅스의글루타메이트 (glutamate) 가유리되어세포외글루타메이트의농도가증가한다. 상기세포외글루타메이트의축적은 NMDA(N-methyl-D-aspartic Acid), AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid) 및메타보트로픽글루타메이트수용체 (metabotropic glutamate receptor) 의연속적인활성을유도하여, 칼슘의세포내과다유입을초래한다. 칼슘의세포내유입은특히칼슘의존성프로테아제, 리파제및모듈레이터의활동을촉발시키고, 결국프리라디칼을포함하는세포독성분자가생성되어 DNA 및세포막등의세포구조물을파괴하여신경세포사가유발하는것으로알려져있다. 상기신경세포사는뇌허혈이있은후, 상당한시간이경과된뒤에나타나므로, 이를지연성신경세포사 (delayed neuronal death) 라고한다. 상기뇌신경계질환또는허혈성신경질환을치료하기위해서세포이식, 외과적수술등다양한치료법이제시되고있지만대부분이위험요소와부작용을나타내고있으며, 기전적인연구를바탕으로뇌허혈시유발되는신경세포사를효과적으로억제하는물질을탐색하거나, 물질에대한기전을밝히는연구가많이수행되고있으나, 손상기전의복잡성등으로실질적으로신경세포의손상을보호하는치료제는개발되지못하고있는실정이다. 지금까지유일하게뇌허혈치료제로 FDA 공인시판중인조직플라스미겐활성자 (tissue plasminogen activator) 는혈전용해제로뇌허혈을유발시키는혈전을녹여빠른산소및포도당의공급을유도하는물질이다. 따라서, 직접적으로신경세포를보호하는것이아니기때문에빠른사용이필요하며, 혈전용해제라는특징때문에과량사용하거나, 자주사용하는경우에는혈관벽이얇아져결국출혈성뇌혈관질환을유발할수있어문제가된다. 또한, 초기의세포내칼슘유입을효과적으로저해함으로써글루타메이트유도세포독성을억제하기위한칼슘채널억제제 (calcium channel blocker) 인 MK-801의경우임상적테스트가실행이되었으나, 그부작용으로인해약물을폐기한바있다. 한편, 이외에도많은물질이임상테스트를실시하고있으나, 뇌졸중에대한치료효과보다는오히려약물의투여로인해나타나는부작용이매우심각하여, 실제약물로사용기어려운것으로보고되고있다. 뿐만아니라, 최근뇌신경세포의재생이가능하다는것이보고되기는하였으나, 이러한뇌신경세포의재생은그조직학적특성을고려하건데용이하지아니할것으로예상된다. 최근천연물을이용하여뇌허혈에의한신경세포사멸을효과적으로보호하기위한연구가국내외적으로무수히많이진행되고있으며일부임상시험단계까지연구가되고있지만, 아직까지혈전용해제이외에임상적으로사용되는물질은없는실정이다. 따라서, 뇌혈관질환의특성을고려해볼때뇌혈관질환은치료보다는그에대한예방이강조되고있는경향이며, 뇌신경세포를효과적으로보호할수있는물질의개발이요구되고있다. 선행기술문헌 [0022] 특허문헌 ( 특허문헌 0001) KR 0879816 B - 6 -
( 특허문헌 0002) KR 2011-0090155 A ( 특허문헌 0003) KR 2011-0054452 A [0023] 비특허문헌 ( 비특허문헌 0001) Kirino T, Sano K. Acta Neuropathol., 62, pp201-208(1984) ( 비특허문헌 0002) Kirino T. Brain Res., 239, pp57-69(1982) ( 비특허문헌 0003) Kang TC, et al., J Neurocytol., 30, pp945-955(2001) ( 비특허문헌 0004) Won MH, et al., Brain Res., 836, pp70-78(1999) 발명의내용 [0024] 해결하려는과제상기종래의문제점을해결하기위하여, 본발명의목적은허혈성뇌혈관질환을효과적으로, 치료, 예방또는개선하고, 신경세포보호능이우수하며, 뇌허혈에의한뇌손상을억제할수있고, 항아교세포활성억제능이뛰어나, 허혈성뇌혈관질환의치료, 예방또는개선에효과가있고, 부작용은적은신규화합물, 상기화합물의제조방법및이를함유하는조성물을제공하는것을목적으로한다. [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명은신규한화합물을유효성분으로포함하는조성물, 구체적으로신규한화합물및이의염을유효성분으로포함하는허혈성뇌혈관질환치료, 예방및개선용조성물을제공한다. 또한, 본발명은상기신규한화합물, 그제조방법및이의용도를제공한다. 또한, 본발명은상기신규한화합물을유효성분으로포함하는조성물을제공한다. 구체적으로, 본발명은하기화학식 1의구조를갖는화합물또는그의약학적으로허용되는염을유효성분으로포함하는허혈성뇌혈관질환치료또는예방용조성물을제공한다. 구체적으로, 상기허혈성뇌혈관질환은뇌경색, 뇌출혈, 지주막하출혈및백질이상증으로이루어진군에서선택된어느하나일수있다. [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] 또한, 본발명은상기화학식 1의구조를갖는화합물또는그의약학적으로허용되는염을유효성분으로포함하는신경세포재생용약학조성물을제공한다. 또한, 본발명은상기화학식 1의구조를갖는화합물또는그의약학적으로허용되는염을유효성분으로포함하는신경세포의손상에대한치료또는예방용조성물을제공한다. 또한, 본발명은상기화학식 1의구조를갖는화합물또는그의약학적으로허용되는염을유효성분으로포함하는뇌손상에대한치료또는예방용조성물을제공한다. 이하본발명을상세히설명한다. 본발명의발명자들은신경세포보호능이우수하고, 아교세포활성억제능이우수한물질의경우신경세포의손상에대한치료또는예방효과가뛰어나이와관련된질병의치료또는예방효과가있을수있고, 허혈성뇌 - 7 -
혈관질환의치료또는예방효과도있을수있다는사실에착안하여이러한효능이있는물질에대해연구하던 중, 신규한화합물을도출하였고, 이들의제조법을확립하였으며, 상기화합물이신경세포보호능이우수하며, 아교세포활성억제능이뛰어나는것을동물모델을이용한실험을통하여확인하여, 본발명을완성하였다. [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] 본발명에있어서허혈성뇌혈관질환이란, 뇌의혈류가감소되어산소와포도당의공급이정상적으로이루어지지않아, 뇌세포중뇌허혈에민감하다고알려져있는해마조직 CA1 영역의신경세포에지연성신경세포사가유발되어발생되는질환을통칭하며, 일예로뇌경색, 뇌출혈, 지주막하출혈, 백질이상증, 알츠하이머병, 치매, 파킨슨병, 헌팅턴병중풍, 노인성치매등일수있다. 본발명에있어서, 조성물이란명시된성분들을포함하는생성물또는명시된성분들을명시된양으로포함하는생성물뿐만아니라명시된성분들의배합물로부터직접또는간접적으로야기되는생성물을포함하는의미이다. 본발명에있어서, 유효량또는치료학적유효량이란목적하는치료, 경감, 억제또는예방효과를발생시키는데효과적인본발명의유효성분또는조성물의양을의미한다. 본발명의한실시예에의하면, 본발명은하기화학식 1의구조를갖는화합물또는그의약학적으로허용되는염을유효성분으로포함하는허혈성뇌혈관질환치료또는예방용조성물에관한것이다. [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] 또한, 본발명은상기화학식 1의구조를갖는화합물또는그의약학적으로허용되는염을유효성분으로포함하는신경세포재생용약학조성물에관한것이다. 또한, 본발명은상기화학식 1의구조를갖는화합물또는그의약학적으로허용되는염을유효성분으로포함하는신경세포의손상에대한치료또는예방용조성물에관한것이다. 또한, 본발명은상기화학식 1의구조를갖는화합물또는그의약학적으로허용되는염을유효성분으로포함하는뇌손상에대한치료또는예방용조성물에관한것이다. 상기허혈성뇌혈관질환이란병적인노화와관련되어뇌세포의조기사멸로인해임상적으로인지기능및운동기능등에서병적인소견이발생진행되는병의분류를통칭한다. 노화에따라서고유의기능인단기및일과적기억이현저하게감소되는것으로알려져있고, 이러한현상은신경세포손상및신경세포재생의현저한감소로인해해마의기능저하로나타난다. 바람직하게는노화로인한과립밑구역부위에서의신경세포의재생및분화의감소에의한해마의기능성저하일수있다. 상기허혈성뇌혈관질환의예로는알츠하이머병, 파킨슨병, 기억력감퇴, 노인성치매뇌출혈, 뇌신경질환, 뇌허혈및허혈성신경질환으로구성된군으로부터선택되는어느하나인것이바람직하나이에한정되지않는다. 상기허혈성뇌혈관질환은더욱바람직하게는알츠하이머병, 파킨슨병및노인성치매로이루어진군중에서선택된어느하나일수있다. 본발명의상기화학식 1의구조를갖는화합물은동물실험을통하여확인한결과, 신경세포보호능및신경세포사억제능이우수하고, 아교세포활성억제능이뛰어나며, 뇌허혈에민감하다고알려져있는뇌해마조직 CA1 영역의신경손상예방효과가우수한것으로확인되었다. 따라서, 상기화학식 1의구조를갖는화합물은상기와같은효과를가지고있으므로, 허혈성뇌혈관질환의치료, 예방또는개선을위한조성물의유효성분으로포함될수있다. 이러한측면에서, 상기허혈성뇌혈관질환의치료, 예방또는개선용조성물은허혈성뇌혈관질환을예방, 개선또는치료하기위한의약조성물일수있다. 상기허혈성뇌혈관질환치료또는예방용조성물은조성물총중량에대하여상기화학식 1의구조를갖는화합물을 0.001 내지 99.99 중량 %, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량 % 로포함할수있다. - 8 -
[0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] 상기조성물은상기화학식 1의구조를갖는화합물외에영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산및그의염, 알긴산및그의염, 유기산, 보호성콜로이드증점제, ph 조절제, 안정화제방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에사용되는탄산화제등을추가로함유할수있다. 상기추가성분의함량은바람직하게는상기화학식 1의구조를갖는화합물 100 중량부당 0.1 내지 200,000 중량부범위에서추가할수있으나, 이에한정되는것은아니다. 상기화학식 1의구조를갖는화합물및그염을유효성분으로포함하는조성물은그제조에통상적으로사용하는적절한담체, 부형제및희석제를더욱포함할수있다. 본발명의상기화학식 1의구조를갖는화합물을유효성분으로포함하는조성물에포함될수있는담체, 부형제및희석제로는락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 생리식염수, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트및광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜및리퀴드파라핀으로이루어진군에서선택된 1 이상일수있으나, 이에한정되는것은아니며, 통상의담체, 부형제또는희석제모두사용가능하다. 상기성분들은상기유효성분인화학식 1의구조를갖는화합물에독립적으로또는조합하여추가될수있다. 본발명의상기화학식 1의구조를갖는화합물및그염을유효성분으로포함하는조성물은각각통상의방법에따라산제, 과립제, 정제, 현탁제, 에멀젼, 시럽등의경구형제형물로사용될수있다. 상기화학식 1의구조를갖는화합물및그염을을유효성분으로포함하는조성물은조성물총중량에대하여상기화학식 1의구조를갖는화합물을 0.001 중량 % 내지 99.9 중량 %, 바람직하게는 0.1 중량 % 내지 99 중량 %, 더욱바람직하게는 1중량 % 내지 50 중량 % 포함할수있다. 또한, 상기추가성분의함량은바람직하게는상기화학식 1의구조를갖는화합물 100 중량부당 0.1 내지 200 중량부범위에서추가할수있다. 또한, 상기화학식 1의구조를갖는화합물및그염을유효성분으로포함하는조성물은약제화하는경우, 통상의충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제또는방부제등을더욱포함할수있으며, 경구또는비경구모두사용할수있다. 구체적으로경구투여를위한고형제제에는정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이포함되며, 이러한고형제제는상기항균조성물에적어도하나이상의부형제예를들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는락토오스 (lactose), 젤라틴등을섞어조제된다. 또한, 단순한부형제이외에마그네슘스테아레이트, 탈크같은윤활제들도사용된다. 경구를위한액상제제로는현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이해당되는데, 흔히사용되는단순희석제인물, 리퀴드파라핀이외에여러가지부형제예를들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제등이포함될수있다. 또한, 본발명의의약조성물의제형은사용방법에따라바람직한형태일수있으며, 특히포유동물에투여된후활성성분의신속, 지속또는지연된방출을제공할수있도록당업계에공지된방법을채택하여제형화할수있다. 구체적인제형의예로는과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 전제, 침제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 환제, 연질또는경질젤라틴캅셀등일수있다. 더나아가본발명의치료용조성물은당해기술분야의공지된적절한방법을사용하여또는레밍턴의문헌 (Remington's Pharmaceutical Science( 최근판 ), Mack Publishing Company, Easton PA. 18th, 1990) 에개시되어있는방법을이용하여바람직하게제형화될수있다. 본발명의의약조성물의바람직한투여량은상태및체중, 질병의정도, 약물형태, 투여경로및기간에따라다르지만, 본발명이속하는기술분야에서통상의지식을가진자에의해적절하게선택될수있다. 바람직하게는본발명의의약조성물은상기화학식 1의구조를갖는화합물의양을기준으로 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 보다효과적이기위해서는 0.01 내지 100 mg/kg으로투여하는것이바람직하다. 투여는하루에한번투여할수도있고, 수회나누어투여할수도있다. 상기투여량과투여횟수는어떠한면으로든본발명의범위를한정하는것은아니다. 본발명의다른측면에서, 본발명은신규한화합물을제공한다. 상기신규한화합물은하기의화학식 1의구조를갖는화합물일수있으며, 이들의약제학적으로허용가능한염또는약학적으로허용되는염일수있다. - 9 -
[0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] 본발명의또다른측면에의하면, 본발명은상기신규한화합물의용도를제공한다. 상기용도는의약적용도또는약리적용도일수있다. 구체적으로상기용도는질병의치료, 예방또는개선을위한것일수있으며, 보다구체적으로허혈성뇌혈관질환의치료, 예방또는개선을위한용도일수있다. 또한, 또다른측면에의하면, 본발명은신규한화합물의제조방법을제공한다. 본발명의화합물은하기반응식 1, 구체적으로하기반응식 2에도시된방법에의해제조될수있지만, 이들예로만한정되는것은아니다. 하기의반응식 1은본발명의대표적인화합물들의제조방법을나타내는것으로, 다른화합물들은당업자들에의해숙지된시약및출발물질의적당한변화에의해제조될수있다. 또한, 하기반응식 2는상기반응식 1의일예로, 상기반응에있어서, 첨가되는용매등을일예로예시한것이다. 상기화학식 1의구조를갖는화합물을제조하는방법은하기반응식 1에기재된바에의할수있다. [ 반응식 1] [0067] [0068] [0069] 보다상세하게는, 상기반응식 1의제조방법은, 하기화학식 2의구조를갖는화합물, 구체적으로알파리포익산 (alpha-lipoic acid, 화학식 2) 을하기화학식 7의구조를갖는화합물, 구체적으로데커시놀 (decursinal, 화학식 3) 과반응시켜, 하기반응식 1의구조를갖는화합물을제조하는단계를포함하는신규한화합물의제조방법일수있다. [ 화학식 2] [0070] [0071] [ 화학식 3] [0072] [0073] 상기반응식 1 에서상기화학식 1 의구조를갖는화합물을제조하는방법은일예로, 하기반응식 2 에의해수 행될수있다. - 10 -
[0074] [ 반응식 2] [0075] [0076] [0077] 보다구체적으로, 상기화학식 2의구조를갖는화합물을디클로로메탄에녹인후, 상기화학식 3의구조를갖는화합물을반응시켜제조하는방법일수있다. 일예로, 상기화학식 2의구조를갖는화합물과상기화학식 3의구조를갖는화합물을반응시켜상기화학식 1의구조를갖는화합물을제조하는방법은상기화학식 2의구조를갖는화합물을디클로로메탄 (MC) 에녹인후, DMAP(4-Dimethylaminoprtidine) 및에틸렌디클로라이드 (EDC, ethylene dichloride) 를첨가하고반응시킨후, 상기화학식 3의구조를갖는화합물을첨가하고반응시키는방법으로수행할수있다. [0078] 발명의효과상술한바와같이, 본발명의신규화합물은신경세포보호능및신경세포사억제능이우수하고, 아교세포활성억제능이뛰어나며, 뇌허혈에민감하다고알려져있는뇌해마조직 CA1 영역의신경손상예방효과가우수하여, 상기효과로인하여허혈성뇌혈관질환을효과적으로치료, 예방및개선하는데유용하게사용할수있고, 또한이러한효과가동물실험을통하여확인되었으므로, 인체에대한부작용도없거나극히적을것으로예상되므로, 의약조성물또는건강기능식품조성물과같은다양한용도로널리사용될수있다. [0079] 도면의간단한설명도 1은본발명의일실시예에따른신규한화학식 1의구조를갖는화합물의허혈성뇌혈관질환보호효과를알아보기위하여, 뇌허혈유발후 4일이경과된실험동물의해마조직을크레질바이올렛 (cresyl violet) 으로염색하여촬영한사진으로, 상기 A는뇌허혈을유발시키지않은정상군 (Sham) 의해마전체를촬영한사진이고, B는 CA1 영역을촬영한사진이며, 상기 C는용매만을투여한후뇌허혈을유발시킨대조군 (Vehicle) 의해마전체를촬영한사진이고, D는 CA1 영역을촬영한사진이며, 상기 E는 20 mg/kg의알파리포익산 (LA) 을투여한군의해마전체를촬영한사진이고, F는 CA1 영역을촬영한사진이며, 상기 G는 20 mg/kg의데커시놀 (DA) 을투여한군의해마전체를촬영한사진이고, H는 CA1 영역을촬영한사진이며, 상기 I는 20 mg/kg의상기화합물 (LA+DA) 을투여한군의해마전체를촬영한사진이고, J는 CA1 영역을촬영한사진이다. 도 2는본발명의일실시예에따른신규한화학식 1의구조를갖는화합물의허혈성뇌혈관질환보호효과를알아보기위한것으로, 신경세포생존률을뇌허혈유발 4일후에생존해있는세포수를정상군에대한상대적수치로나타낸그래프이다. 상기그래프에서 Sham은정상군을의미하고, Vehicle은뇌허혈을유발시킨대조군을의미하며, LA는 20 mg/kg의알파리포익산을투여한군을의미하고, DA 는 20 mg/kg의데커시놀을투여한군을의미하며, LA+DA는 20 mg/kg의상기화합물을투여한군을의미한다. 도 3은본발명의일실시예에따른신규한화학식 1의구조를갖는화합물의허혈성뇌혈관질환보호효과를알아보기위한것으로, 뇌허혈유발후 4일이경과된실험동물의해마조직의 CA1 영역을사멸신경세포에대한 Fluoro-Jade B(F-JB) 를이용하여형광염색한사진이다. 상기사진에서 A는뇌허혈을유발시키지않은정상군 (Sham) 을의미하고, B는용매만투여한후뇌허혈을유발시킨대조군 (Vehicle) 을의미하며, C는 10 mg/kg의상기화합물 (LA+DA) 을투여한군을의미하고, D는 20 mg/kg의상기화합물 (LA+DA) 을투여한군을의미한다. 도 4는본발명의일실시예에따른신규한화학식 1의구조를갖는화합물의허혈성뇌혈관질환보호효과를알아보기위한것으로, 뇌허혈유발 4일후에사멸한세포수를대조군에대한상대적수치로나타낸그래프이다. 상기그래프에서 Sham은정상군을의미하고, Vehicle은뇌허혈을유발시킨대조군을의미하며, 10 mg은 10 mg/kg의상기화합물 (LA+DA) 을투여한군을의미하며, 20 mg은 20mg/kg의상기화합물 (LA+DA) 을투여한군을의미한다. 도 5는본발명의일실시예에따른신규한화학식 1의구조를갖는화합물의허혈성뇌혈관질환보호효과를 - 11 -
알아보기위하여, 뇌허혈유발후 4일이경과된실험동물의해마조직의 CA1 영역을별아교세포의표지자인항- GFAP(GFAP) 항체 (A, C, E 및 G), 미세돌기아교세포의표지자인항-Iba-1(Iba-1) 항체 (B, D, F 및 H) 를면역조직화학 (immunohistochemistry) 방법으로관찰한사진이다. 상기사진에서 A 및 B는정상군 (Sham) 을의미하고, C 및 D는뇌허혈을유발시킨대조군 (Vehicle) 을의미하며, E 및 F는 10 mg/kg의상기화합물 (LA+DA) 을투여한군을의미하며, G 및 H는 20 mg/kg의상기화합물 (LA+DA) 을투여한군을의미한다. 도 6은본발명의일실시예에따른신규한화학식 1의구조를갖는화합물의허혈성뇌혈관질환보호효과를알아보기위한것으로, 도 6a는뇌허혈유발 4일후에 GFAP로염색된세포수를정상군에대한상대적수치로나타낸그래프이고, 도 6b는뇌허혈유발 4일후에 Iba-1으로염색된세포수를정상군에대한상대적수치로나타낸그래프이다. 상기그래프에서 Sham은정상군을의미하고, Vehicle은뇌허혈을유발시킨대조군을의미하며, 10 mg은 10 mg/kg의상기화합물 (LA+DA) 을투여한군을의미하고, 20 mg은 20 mg/kg의상기화합물 (LA+DA) 을투여한군을의미한다. [0080] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하, 본발명의바람직한실시예를기재한다. 하기의실시예는본발명을예시하기위한것일뿐본발명의권 리범위가하기실시예에의해한정되는것은아니다. [0081] [0082] [0083] 실시예 1: 신규화합물의제조 신규화합물을제조하기위해알파리포익산과데커시놀을반응식 2 의방법으로반응시켜제조하였다. 구체적으로, 하기화학식 2 의알파리포익산 (alpha-lipoic acid, 0.86 g 4.47 mmol) 을 CH 2 Cl 2 (20 ml) 에녹인 후, DMAP 0.12 g(1.02 mmol) 와 EDC (0.86 g, 4.47 mmol) 를첨가하고, 실온에서 10 분동안아르곤조건에서교 반하였다. 이후, 하기화학식 3 의데커시놀 (Decursinol, 0.5 g, 2.03 mmol) 을넣고아르곤조건에서 24 시간 환류반응시킨후실온으로냉각하였다. [0084] [ 화학식 2] [0085] [0086] [ 화학식 3] [0087] [0088] 유기층을 H 2 O 로씻어준후에무수 MgSO 4 로처리후유기용매를제거하였다. 남은합성물을실리카컬럼크로마 토그래피 (EtOAc : Hexane = 1 : 2) 로분리하여화합물을수득하고, 이를분석하여다음과같은결과를수득하여, 생성된화합물이하기화학식 1의화합물 (LA+DA), 구체적으로 (S)-2,2-dimethyl-8-oxo-2,3,4,8- tetrahydropyrano[3,2-g]chromen-3-yl 5-(1,2-dithiolan-3-yl)pentanoate인것을확인하였다. 상기생성된화합물은 0.45 g으로총수율이 51% 인것으로확인되었다 (RF = 0.57 at EtOAc:Hexane=1:1). [0089] 1 H NMR (CDCl3,400MHz) 1.35(s, 3H), 1.38(s, 3H), 1.42(m, 2H), 1.68(m, 4H), 1.90(m, 1H), 2.33(t, J=7.2, 2H), 2.45(m, 1H), 2.83(d, J=4.8, 1H), 2.88(d, J=4.8, 1H), 3.15(m, 2H), 3.48(m, 1H), 5.05(t, J=4.8, 1H), 6.23(d, J=9.6, 1H), 6.80(s,1H), 7.17(s,1H), 7.59(d, J=9.6, 1H) - 12 -
[0090] [0091] [0092] [0093] 실시예 2: 실험동물을이용한신규화합물의뇌허혈시신경세포보호효능측정1 상기실시예 1에서제조된상기화학식 1의화합물의신경세포보효효능을체중 65g 내지 75g인수컷몽골리안저빌 (Mongolian gerbil, Harlan, USA) 을마취시켜온목동맥 (common carotid artery) 을노출후결찰하여뇌허혈을유발시킨후에, 몽골리안저빌의해마조직을염색하여관찰하는방법을통하여확인하였다. [0094] [0095] 실시예 2-1. 실험동물의사육체중 65 내지 75g의수컷몽골리안저빌 (Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus, Halan, USA) 40 마리를오전 7시부터오후 7시까지빛을가하는일정한명암주기, 21 내지 25 의온도및 45% 내지 65% 의상대습도의조건에서사육하였다. 실험동물의사료는일반적인펠렛건조사료 ( 대한실험동물, 대한민국 ) 를사용하였고, 사료와물은상시로섭취할수있게하였다. [0096] [0097] [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] 실시예 2-2. 뇌허혈시신경세포보호효능측정상기화학식 1의화합물 (LA+DA) 의신경세포보호효과를확인하기위해, 보다구체적으로뇌허혈에의한신경세포의사멸방지효과를추가적으로확인하였다. 구체적으로, 상기실시예 2-1에서사육한실험동물에알파리포익산 (LA) 과데커시놀 (DA) 및상기실시예 1에서제조된상기화학식 1의화합물 (LA+DA) 을실험동물체중 1 kg 당 20 mg이되도록 1% DMSO에용해하여, 뇌허혈유발 3일전부터매일식도용바늘을이용하여실험동물에경구투여하였다. 또한, 투여용량에대한효과를확인하기위하여, 상기실시예 2-1에서사육한실험동물에상기화학식 1의화합물 (LA+DA) 을실험동물체중 1kg 당 10 mg이되도록 1% DMSO에용해하여, 뇌허혈유발 3일전부터매일식도용바늘을이용하여실험동물에경구투여하였다. 상기 3일간상기알파리포익산, 데커시놀또는화학식 1의화합물 (LA+DA) 을투여한후에, 질소와산소가 7 : 3 으로혼합된가스에 3% 이소플루란 (isoflurane, Baxtor, USA) 을혼합한가스를이용하여실험동물을전신마취하였다. 상기의질소와산소혼합가스에 2.5% 이소플루란을혼합한가스를이용하여실험동물의마취상태를유지하면서실험동물에대한수술을수행하였다. 실험동물에대한수술은목부위의털을깎고소독한다음절개를하여양쪽온목동맥을노출시키고, 동맥류클립 (aneurysm clip, Staelting, USA) 을이용하여 5분동안결찰하여뇌허혈을일으킨후, 클립을제거하여재관류시키는방법으로수행하였다. 이때, 각실험군은검안경 (ophthalmoscope) 을이용하여망막중심동맥 (central artery of retina) 의혈액순환유무를관찰하여완전한온목동맥의폐쇄여부를확인하였다. 뇌허혈을유발시키는동안직장내체온계를삽입하여체온을측정하였으며, 실험동물의온도에따라자동으로조절되는온열패드를사용하여체온을정상체온인 36.7 내지 37.3 로일정하게유지시켰다. 상기실험동물은뇌허혈유발 4일후에티오펜탈소듐 (thiopental sodium, 유한양행, 대한민국 ) 을체중 1 kg당각각 30mg의용량으로복강내주사하여마취시킨다음, 1,000 ml당헤파린 1,000 IU를함유한 4 의생리식염수를좌심실로주입하여관류세척하였다. 관류세척이완료된상기동물에대해 4 의 4% 파라포름알데하이드 (0.1 M 인산완충액 (in 0.1 M phosphate buffer; PB), ph 7.4) 를이용하여관류고정을수행하였다. 뼈절단기를이용하여관류고정이끝난실험동물의머리뼈공간을열어뇌를적출하였다. 적출된실험동물의뇌를 4 의 4% 파라포름알데하이드 (in 0.1 M phosphate buffer; PB, ph 7.4) 를이용하여 4시간동안 - 13 -
후고정하였다. 후고정이끝난뇌는 30% 수크로스용액 (in 0.1 M 인산완충액 (phosphate buffer)) 에넣어바닥에가라앉을때까지침강시킨후, 슬라이드마이크로톰 (sliding microtome, Reichert-Jung, 독일 ) 으로상기뇌의조직을 30 μm두께로잘라조직절편을만들었다. 상기의조직절편을보존액 (storing solution) 이들어있는 6 웰플레이트에넣어염색을수행할때까지 4 에서보관하였다. [0104] [0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] 상기만들어진조직절편중에서해마형성체 (hippocampal formation) 가잘나와있는조직을선택하고, 조직절편에묻어있는보존액을없애기위해 0.01M PBS로 10분씩 3회세척하였다. 상기세척된조직절편을젤라틴입힌슬라이드에도말하여 37 에서충분히건조시켰다. 충분히건조시킨상기조직절편을증류수에잠시담가둔후, 2% 크레실바이올렛아세테이트 (cresyl violet acetate, Sigma, USA) 용액에 1분간담가조직절편의염색을수행하였다. 상기의염색한조직절편을흐르는물에충분히세척하여슬라이드에묻어있는과량의염료를제거하였다. 상기과량의염료를제거한조직절편을증류수에잠시담근후에 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 및 100% 에탄올용액으로순차적으로처리하여탈수및과량의크레실바이올렛세척을수행하였다. 상기조직절편에서니슬소체 (Nissle body) 가보이는것을확인한후, 자일렌 (Junsei, 일본 ) 에담가투명화한다음카나다발삼 (Canada Balsam, Kanto, 일본 ) 으로봉입하였다. 대조군은상기상기화학식 1의화합물 (LA+DA) 을녹이는데이용된 1% DMSO만을경구투여한것을제외하고는상기와동일한방법으로준비하였으며, 정상군은알파리포익산 (LA) 과데커시놀 (DA) 및상기화학식 1의화합물 (LA+DA) 을포함한어떠한물질도투여하지않고, 허혈-재관류수술도시행하지아니하였으며, 정상군의조직절편은상기와동일한방법으로준비하였다. 디지털카메라 (Axiocam, Cal Zeiss, Germany) 가부착되어있는악시오엠1 현미경 (AxioM1 microscope, Carl Zeiss, 독일 ) 으로전체해마영역을 25배, CA1 영역을 200배로각각확대하여각조직절편들을사진촬영하였다. 상기가자추출물및분획물을투여한실험군, 대조군및정상군의조직절편을촬영한결과를도 1에나타내었다. 유의성의검증을위하여, 상기도 1은각군중에서가장일반적인부분을골라촬영한사진이다. 또한, 상기촬영한사진에대해이미지분석기 (Optimas 6.5, USA) 프로그램을이용하여보라색으로염색된상기조직절편의신경세포를계수하였다. 각군에대한유의성의검증을위하여일원분산분석 (one-way ANOVA test) 을수행하였다. 상기측정한조직절편의신경세포를계수한결과를정상군 (Sham) 에대한상대적인수즉, 정상군의신경세포계수결과를 100% 로하여각실험군의계수결과를도 2에나타냈다. 상기도 1에서알수있는바와같이, 정상군 (Sham, 도 1의 A 및 B) 은해마의영역전체에서신경세포가보라색으로진하게염색되고, 특히 CA1 영역에서는피라미드층에신경세포가밀집하여있는것을관찰할수있었다. 그러나, 추출물을투여하지아니하고뇌허혈을유발시킨대조군 (Vehicle, 도 1의 C 및 D) 의경우, 뇌허혈에의한지연성신경세포사로인해해마의영역중 CA1 영역에서신경세포사가일어남으로써신경세포의염색이거의관찰되지않았고, CA1 영역중피라미드층에대부분의신경세포가소실되었음이확인되었다. 한편, 20 mg / kg의알파리포익산 (LA, 도 1의 E 및 F) 또는데커시놀 (DA, 도 1의 G 및 H) 을투여한실험군의경우대조군과유사하게해마의영역중 CA1 영역에서신경세포사가일어나신경세포의염색이거의관찰되지않았고, CA1 영역중피라미드층에대부분의신경세포가소실되었음이확인되었다. 하지만, 20 mg/kg의상기화학식 1의화합물 (LA+DA) 을투여한실험군 ( 도 1의 I 및 J) 의경우대조군이나리포익산또는데커시놀을투여한군과비교하였을때해마의영역전체에서많은수의신경세포가보라색으로진하게염색되고, CA1 영역의피라미드층에서도신경세포가밀집하여있는것이관찰되었다. 상기결과로부터, 알파리포익산또는데커시놀과구분되는상기화학식 1의화합물 (LA+DA) 의신경세포보호효과를확인하였다. 또한, 상기도 2에서알수있는바와같이, 대조군은정상군에비하여해마의 CA1 영역신경세포의수가약 16.7% 정도로관찰되었고, 알파리포익산또는데커시놀을투여한경우도대조군과유사하게관찰된반면, 상기화학식 1의화합물 (LA+DA) 을투여한군 (20 mg) 의경우, 약 60.2% 의신경세포가생존한것으로확인되어, 상기화학식 1의화합물 (LA+DA) 은신경세포보호에탁월한효과를가지고있는것으로확인되었다. 상기 20 mg의상기화학식 1의화합물 (LA+DA) 의경우정상군대비각각 60.2% 의신경세포가계수되어, 뇌허혈등이발생하는경우에도정상군과유사한정도의신경세포가유지되는것으로확인되었다. 따라서, 상기화학식 1의화합물 (LA+DA) 의경우, 뇌의일정부분또는전체의신경세포의사멸을억제할수있어서, 뇌허혈이일어난경우에도운동, 언어, 시각또는후각등의관련부위의신경세포손상을최대한으로억제하여, 뇌허혈에 - 14 -
의한허혈성뇌혈관질환이나운동손실, 감각의마비, 언어장애, 시각및후각장애와같은뇌기능저하를예방 또는개선할수있으므로, 상기화학식 1 의화합물은신경세포보호효과가매우탁월한것으로평가될수있다. [0112] [0113] [0114] [0115] [0116] [0117] 실시예 3. 실험동물을통한신규한화합물의뇌허혈시신경세포보호효능측정2 상기실시예 1에서제조된상기화학식 1의화합물의신경세포보호효과, 보다구체적으로뇌허혈에의한신경세포의사멸방지효과를추가적으로확인하기위하여, 상기실시예 2에서우수한것으로확인된상기화학식 1 의화합물의신경세포보호효과를추가로확인하기위하여, 사멸된신경세포에대한표지자인 Fluoro-Jade B를이용하여조직형광염색을수행하였다. 보다구체적으로, 상기실시예 2의방법으로준비된실험동물체중 1 kg 당 10 mg 또는 20 mg이되도록 1% DMSO 에용해한것을투여한후, 뇌허혈을유도한실험동물의조직절편중해마복합체가잘나타난조직절편을선택하여실험에사용하였으며, 퇴행신경세포의표지자인 Fluoro-Jade B(F-J B) 를이용하여조직형광염색을수행하였다. 상기조직절편을증류수를이용하여 5분간 3회세척한후, 0.06% potassium permanganet 용액에 15분간담구었다. 이후, 증류수로 2분간세척하고 0.1% 아세트산 (acetic acid) 이포함된 0.001% F-J B(Histochem, Jefferson, AR, USA) 용액에 30분간담그어염색을수행하였다. 상기염색된조직은 1분씩 3회증류수로세척하고, 50 slide warmer에서 20분간건조한후, 자일렌 (xylen) 에담근다음, DPX(Sigma, USA) 로봉입하였다. 상기봉입된조직을형광현미경 (Ex : 385 nm, Em : 425 nm) 을이용하여관찰하였으며, 그결과를촬영한사진을촬영하여도 3에나타내었다. 또한, 상기촬영한사진에대해상기실시예 2-2와같이이미지분석기프로그램을이용하여염색된신경세포를계수하였으며, 상기계수한결과를대조군 (Vehicle) 에대한상대적인수치로도 4에나타내었다. 상기도 3에나타낸바와같이, 정상군 (Sham, 도 3의 A) 은해마의 CA1 영역전체가사멸된신경세포또는사멸중인신경세포에대한표지자인 Fluoro-Jade B에의해거의염색되지아니한반면, 대조군 (Vehicle, 도 3의 B) 의경우에는해마의 CA1 영역전체에서진하게형광염색되어, 다수의신경세포가사멸또는사멸중인것으로확인되었으며, 10 mg/kg의상기화학식 1의화합물을투여한군의경우, 대조군과유사하게해마의 CA1 영역전체에서진하게형광염색되어, 다수의신경세포가사멸또는사멸중인것으로확인되었다. 하지만, 20 mg/kg의상기화학식 1의화합물을투여한군의경우해마의 CA1 영역전체에서상기사멸된신경세포또는사멸중인신경세포에대한표지자인 Fluoro-Jade B에의해형광염색된세포들이소수관찰되었다. 상기결과로부터, 20 mg/kg의상기화학식 1의화합물을처리한경우허혈발생에의해서도신경세포사멸정도가현저하게감소되는것으로확인되었다. 또한, 상기도 4에서알수있는바와같이, 20 mg/kg의화학식 1의화합물을처리한실험군의경우, 사멸된신경세포또는사멸중인신경세포에대한표지자인 Fluoro-Jade B로염색된신경세포의수는정상군의약 39.7% 정도에불구하여, 20 mg/kg의함량으로화학식 1의화합물을처리하는경우, 신경세포보호효과가현저하게우수한것으로확인되었다. [0118] [0119] [0120] [0121] 실시예 4. 실험동물을통한신규한화합물의뇌허혈시신경세포보호효능측정3( 아교세포활성변화측정 ) 상기실시예 1에서제조된상기화학식 1의화합물의신경세포보호효과, 보다구체적으로뇌허혈에의한신경세포의사멸방지효과를추가적으로확인하기위하여, 상기화학식 1의화합물을투여시킨투여군에대하여추가적으로별아교세포와미세돌기아교세포의활성변화를면역조직화학 (immunohistochemistry) 염색을수행하였다. 보다구체적으로, 상기실시예 3과같이상기실시예 2의방법으로준비된실험동물체중 1 kg 당 10 mg 또는 20 mg이되도록 1% DMSO에용해한것을투여한후, 뇌허혈을유도한실험동물의조직절편중해마복합체가잘나타난조직절편중해마복합체가잘나타난조직절편을선택하여실험에사용하였으며, 상기선택된조직절편은상기실시예 2에기재된방법을응용하여면역조직화학염색을수행하였다. 상기면역조직화학염색과정에서, 별아교세포의변화를확인하기위한 1차항체로는 1:1000으로희석한항- GFAP(rabbit anti-gfap, Chemicon, USA) 와반응시켰고, 미세돌기아교세포의변화를확인하기위한 1차항체로는 1:1000으로희석한항-Iba-1(rabbit anti-iba-1, Wako, Japan) 를사용하였다. 상기 1차항체를사용하여상기실시예 2에기재된방법을응용하여면역조직화학염색과정을수행한후, 봉입한조직절편을전자현미경을 - 15 -
이용하여관찰하였으며, 그관찰결과를촬영한사진을도 5 에나타내었다. [0122] [0123] [0124] [0125] [0126] [0127] 상기도 5에나타낸바와같이, 10 mg/kg이아닌 20 mg/kg의화학식 1의화합물을투여한실험군의경우용매를투여한대조군에비해별아교세포의표지자로알려진항-GFAP(GFAP) 의발현및미세돌기아교세포의표지자로알려진항-Iba-1(Iba-1) 의발현이상당히감소하는것을확인할수있었다. 또한, 상기촬영한사진에대해상기실시예 2와같이이미지분석기프로그램을이용하여염색된신경세포를계수하였으며, 상기계수한결과를대조군 (Vehicle) 에대한상대적인수치로도 6에나타내었다. 또한, 도 6a에나타낸바와같이, 상기별아교세포에대한 1차항체인 GFAP에의해염색된세포즉, GFAP에대한면역반응성이확인된별아교세포는대조군의경우정상군에대비하여약 168.3% 로확인되었으나, 10 mg/kg의화학식 1의화합물을투여한실험군의경우정상군에대비하여약 163.5% 로확인되었으며, 20 mg/kg의화학식 1 의화합물을투여한실험군의경우정상군에대비하여약 127% 로확인되었다. 또한, 상기도 6b에서알수있는바와같이, 상기미세돌기아교세포에대한 1차항체인 Iba-1에의해염색된세포즉, Iba-1에대한면역반응성이확인된미세돌기아교세포는대조군의경우정상군에대비하여약 205.7 확인되었으나, 10 mg/kg의화학식 1의화합물을투여한실험군의경우정상군에대비하여약 195.7% 로확인되었으며, 20 mg/kg의화학식 1의화합물을투여한실험군의경우정상군에대비하여약 134.3% 로확인되었다. 따라서, 20 mg의화학식 1의화합물을투여한실험군에서는정상군에비해서별아교세포와미세돌기아교세포가활성화되기는하였으나, 대조군과비교하여비정상적인활성화를최대한억제하여, 상기화학식 1의화합물이신경세포보호에탁월한효과를가지고있다는것을확인할수있었다. 상기한바와같이, 본발명의상기화학식 1의화합물은허혈을유발시킨경우에서도신경세포특히, 해마영역을염색한신경절편을관찰한결과해마의전체영역, 해마의 CA1 영역에서의신경세포사를억제하는것으로확인되었고, 사멸된신경세포에대한표시자인 F-J B를통해확인한결과신경세포사의사멸이현저하게억제됨이확인되었으며, 항-GFAP, 항-Iba-1 항체를통하여확인한결과아교세포의활성화를매우우수하게억제할수있음이확인되었으므로, 상기화학식 1의화합물은신경세포보호에탁월한효과가있을뿐만아니라, 아교세포의활성화억제효과도우수한것으로평가되었다. 따라서, 상기화학식 1의화합물은허혈에의해발생되는지연성신경세포사를현저하게억제할수있으므로, 뇌허혈이일어난경우에도운동, 언어, 시각또는후각등의관련부위의신경세포손상을최대한으로억제하여, 뇌허혈에의한허혈성뇌혈관질환이나운동손실, 감각의마비, 언어장애, 시각및후각장애와같은뇌기능저하를예방또는개선할수있을것이다. - 16 -
도면 도면 1 도면 2 도면 3-17 -
도면 4 도면 5 도면 6a - 18 -
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