13.fm

pissn 1229-1153 / eissn 2465-9223 J. Fd Hyg. Saf. Vl. 32, N. 4, pp. 336~340 (2017) https://di.rg/10.13103/jfhs.2017.32.4.336 Jurnal f Fd Hygiene and Safety Available nline at http://www.fdhygiene.r.kr Escherichia cli O157:H7 에감염된마우스에대한정향추출물의항균효과 이수미 1 손송이 2 이후장 1,2 * 1 경상대학교보건대학원환경보건학과, 2 경상대학교수의과대학 동물의학연구소 Antimicrbial Activity f Fls Syzygii Armatici Extracts against Mice Infected with Escherichia cli O157:H7 S-Mi Lee 1, Sng Ee Sn 2, and Hu Jang Lee 1,2 * 1 Department f Envirnmental Health, Graduate Schl f Public Health, Gyengsang Natinal University, Chinju, Krea 2 Institute f Animal Medicine, Cllege f Veterinary Medicine, Gyengsang Natinal University, Chinju, Krea (Received May 19, 2017/Revised June 3, 2017/Accepted July 9, 2017) ABSTRACT - The present study evaluated the antibacterial effect f Fls syzygii Armatici methanlic extracts (FSAE). In additin, the effectiveness f FSAE against Escherichia cli O157:H7 infectin was studied using ICR female mice. At 24 h after incubatin f E. cli O157:H7, FSAE at the cncentratin f 0.269 (p < 0.05), 0.538 (p < 0.001) and 1.075 mg/ml (p < 0.001) significantly inhibited the grwth f E. cli O157:H7 cmpared t the cntrl grup. After single challenge with E. cli O157:H7, frty female ICR mice were divided int fur experimental grups which were rally administered with saline (cntrl), 0.538 (grup 1), 1.075 (grup 2) and 2.15 mg/ml (grup 3) f FSAE, respectively. On the 3rd day, the number f fecal E. cli O157:H7 in grup 2 (p < 0.05) and grup 3 (p < 0.01) was significantly decreased cmpared t that in the cntrl grup. On the 7th day pst-treatment, the number f fecal E. cli O157:H7 in all FSAE-treated grups was significantly decreased cmpared t that in the cntrl grup (grup 1, p < 0.05; grup 2 and 3, p < 0.001). Accrding t the results f the present study, administratin f FSAE t mice can reduce the severity f E. cli O157:H7 infectin. Therefre, the current study suggests that FSAE culd be a gd candidate fr the treatment f enteric infectins in dmestic animals. Key wrds : Fls syzygii Armatici, Antibacterial Activity, E. cli O157:H7 최근우리경제의급속한발달로집단급식이나외식문화의확산으로인한식중독의발생건수나규모가점점대형화되고있다. 2016 식품의약품통계연보에따르면, 국내에서발생하고있는세균성식중독의발생원인중병원성대장균이발생건수와환자수에있어서제일높은비중을차지하고있는것으로나타나있다. 1) 병원성대장균의인체감염은, 덜익힌고기혹은오염된샐러드와같은신선제품의섭취, 오염된음용수섭취, 그리고비위생적인생활을통해사람과사람사이에직접적인전파를통해발생하는것으로알려져있다 2). Escherichia cli O157:H7 (E. cli O157:H7) 은시가톡신 -생성대장균 (Shiga txin-prducing E. cli) 의일종으로낮 *Crrespndence t: Hu Jang Lee, Cllege f Veterinary Medicine, Gyengsang Natinal University, Chinju 52828, Krea Tel: 82-55-772-2352, Fax: 82-55-772-2308 E-mail: hujang@gnu.ac.kr 은균량으로도감염을일으킬수있고, 오염된우유, 육류, 유제품그리고신선제품들과같은다양한제품들에의해인체감염이일어날수있기때문에식품위생에있어서주요한문제로인식되어지고있다. 3,4) 미국의경우, 매년 E. cli O157:H7에오염된식품에의해 63,000명의환자가발생하고있으며, 이중 2,138명이병원에입원하고, 20여명이사망하고있는것으로보고되고있다 5). 우리나라의경우, 식중독통계자료에따르면, 2012~2016년동안발생한세균성식중독중병원성대장균이전체발생건수의 11.9% 를차지하였으며, 전체발생환자수의 25% 를차지하고있는것으로나타났다. 6) 최근, 항생물질과살생물제에대한내성균들이먹이사슬을통해확산되고있어, 인류의건강을위협하고있다 7). 살생물제의내성기전은항생물질과유사한것으로알려져있으며, 항생물질과살생물제에대한교차내성을갖는병원성세균들이출현하고있다. 8) 2015년국가항생제사용및내성모니터링에따르면, 9) 336

Antibacterial Effects f Fls Syzygii Armatici Extracts 337 가축및도축장도체로부터채취한시료에서분리한균주들에대한항생제감수성검사를실시한결과, 대장균의내성률은소, 돼지모두에서테트라사이클린이각각 43.7% 와 71.6% 로가장높았으며, 분리된대장균균주들의 3종이상의항생제에대한다제내성률은, 소, 돼지그리고닭에서각각분리한균주의 18.4% (38/206), 73.4% (160/ 218), 84.7% (160/189) 로나타났다. 또한, 최근에식품보존제에대한저항성세균에대한많은연구들이보고되고있다. Streptcccus thermphilus, Lactbacillus plantarum, 그리고일부 Bacillus spp. 는가공식품의보존제로사용되는 nisin에대해저항성을갖는것으로보고되었으며, E. 10) cli O157:H7이식품의산미료혹은보존제로사용되는구연산에대해저항성을갖는것으로보고되었다. 11) 오늘날, 전세계적으로항생물질과식품보존제에대한내성균의출현에따른위해를최소화하고기존의항생물질과합성식품보존료를대체하기위해천연물들에서항균활성물질을탐색하기위한연구가활발히진행되고있다. 12-14) 향신료의일종인정향 (Fls syzygii Armatici) 은정향나무 (Eugenia caryphyllata Thumb) 의꽃봉오리를말린것으로서오래전부터유럽의각국에서각종육류와야채요리에널리이용되고있으며, 우리나라에서도본래의향미강화, 나쁜향미억제, 방충및곰팡이방제등의목적으로널리이용되고있다 15). 최근까지, 정향의항균효과에관한많은연구가이루어져왔다. 16-18) 정향추출물을이용한식중독균에대한항균효과에관한많은연구들이진행되었으나, 정향추출물의 E. cli O157:H7 에대한항균효과및 E. cli O157:H7 감염실험동물에대한치료효과에관한연구는미미한실정이다. 따라서본연구는정향추출물을이용하여식중독균인 E. cli O157:H7에대한항균활성및 E. cli O157:H7에감염된마우스에서의치료효과를평가하고자하였다. Materials and Methds 공시제제정향은동물생리활성자원은행 ( 진주 ) 으로부터구입하여, 세척하여건조한후, 세절하여분말화하였다. 추출은 Kim 등의방법을변형하여사용하였으며, 추출용매는 Lee 등 19) (2004) 의연구결과를참고하여메탄올을사용하였다. 분 20) 말화한정향 100 g에메탄올 1,000 ml을가한다음, 교반하면서 24시간동안실온에서추출한다음, 상층액을모아회전증발농축기 (N-1000S, EYELA C, Tky, Japan) 를이용하여메탄올을제거하고, 감압농축하였다. 이후에, 농축액을여과지 (Whatman N. 1) 를이용하여여과한다음, 여과액을동결건조기 (LABCONCO, Kansas, MO, USA) 를이용하여동결건조하였다. 회수율은 13.7% 이었다. In vitr에서의항균시험을위해, 정향동결건조분말 2g 를 10 ml 증류수에용해시켜 0.2 μm syringe filter (Crning Cstar, USA) 로여과한다음, 필요한농도로희석하여사용하였다. 마우스접종시험에서는정향추출물 (FSAE) 을여러농도로하여군별로마우스에경구로투여하였다. 사용균주및배양본실험에사용한균주, E. cli O157:H7 (ATCC 43895) 은농림축산검역본부 ( 김천 ) 로부터분양받아사용하였다. E. cli O157:H7을 bld agar (Kmed, Krea) 에서배양하여증식여부를확인한후, Tryptic Sy Brth (TSB, Difc BRL, USA) 에접종하여 37 C에서 24시간배양하여실험 에사용하였다. 마우스접종시험에서는, E. cli O157:H7을 TSB (Difc BRL, USA) 에접종하여 shaking incubatr를이용하여 37 C 에서 24시간배양한후, 2,500 rpm에서 30분간원심분리하여균체를회수한다음, phsphate buffered saline (PBS) 으로세척하고 PBS에재부유하여균수를 1.0 10 CFU/ 6 ml로하여마우스개체 ( 체중평균, 26.4 ± 1.5) 당 catheter (Znde, 18G) 를이용하여 0.5 ml씩경구로접종하였다. 항균력시험한천배지를이용한한약재추출물에대한항균력검색에서 FSAE 시료에대하여 dilutin test를통해시간경과에따른 E. cli O157:H7에대한증식억제효과를측정하였다. 125 ml 삼각플라스크에, 30 ml TSB, E. cli O157: H7을 10 6 CFU/ml 농도로희석한배양액 0.1 ml, 그리고 FSAE의최종농도가 0.269, 0.538 그리고 1.075 mg/ml이되도록가하여 37 C에서 24시간동안배양하면서 4, 8, 16 그리고 24시간에각각생균수를측정하였다. FSAE의농도는본연구에앞서수행한 FSAE의 E. cli O157:H7에대한최소억제농도 (0.269 mg/ml) 와최소살균농도 (1.075 mg/ ml) 를참고하여설정하였다. 생균수측정은배양액시료 0.1 ml을채취하여 Tryptic Sy Agar (TSA, Difc BRL, USA) 에접종하여 37 C에서 24시간배양한후, 형성된집 락수를구한다음, 세균의생존율을다음공식에의해구하여나타내었다. 생존율 (%)= 각농도별시간대별집락수 100 각농도별 0 시간에서의집락수 실험동물 5주령, 평균체중 19±1.4g의 Specific Pathgen Free (SPF) ICR 마우스암컷 40마리를 ( 주 ) 샘타코 ( 오산 ) 로부터구입하여, SPF 마우스임을확인하기위한미생물학적검사를실시하여특정병원체가없는것을확인한후, 실험에사용하였다. 마우스는대조군과실험군각각 10마리씩

338 S-Mi Lee, Sng Ee Sn, and Hu Jang Lee 을임의로선택하여케이지에분리하여, 1주일간의적응기간을거친후실험에사용하였다. SPF 상태를유지하기위해음수, 사료, 깔짚등은모두고압멸균후사용하였으며, 사육온도와습도는각각 22 ± 1.0 C과 50 ± 10% 로하 였으며, 12시간간격으로조명을조절하였으며, 환기는자동으로조절되는실험동물사육장치 (( 주 ) 쓰리샤인, 대전 ) 에서사육하였다. 마우스접종및약제투여대조군과실험군모두에대하여, E. cli O157:H7을 1 10 CFU/ml로함유하도록 PBS에현탁시켜이용액 7 0.5 ml를경구투여하여공격접종을한후, 대조군에는증류수를투여하였고, 실험군은각각 0.538, 1.075 그리고 2.15 mg/ml의 FSAE를 catheter (Znde, 18G) 를이용하여 0.5 ml씩경구로 1일 1회로하여 7일동안투여하였다. 음용수와사료는자유롭게섭취하도록하였다. 마우스분변중 E. cli O157:H7 균수의변화 E. cli O157:H7을접종한마우스에대하여, 대조군은증류수를, 그리고실험군은각각군별로 0.538, 1.075 그리고 2.15 mg/ml의 FSAE를투여하면서, 투약후, 1, 3, 5, 그리고 7일에각군의마우스로부터분변을채취하였다. 채취한마우스의분변을 0.85% 생리식염수에십진희석하고, xylse lysine desxychlate agar (XLD, Difc BRL, USA) 를사용하여 37 C에서 24시간배양한후집락수를측정하여, clny frming unit (CFU)/g feces로환산하여나타내었다. 통계학적분석결과에대한통계적처리는 Sigma plt (Systat Sftware Inc., USA) 을이용하여 Student's t-test로실시하였으며, p <0.05일때유의한차이가있는것으로간주하였다. Results and Discussin 항균력시험 Fig. 1은한천배지를이용하여다양한 FSAE 농도에서 E. cli O157:H7에대한항균력시험결과를나타낸것이다. FSAE 처리후 4시간째에는, 1,075 μg/ml을처리한군에서무처리대조군과비교하여통계적으로유의성있게 E. cli O157:H7의생존율이감소하였다 (p < 0.01). FSAE 처리후 8시간째에는, 538 (p < 0.05) 와 1,075 μg/ml (p < 0.01) 을처리군군들에서대조군과비교하여통계적으로유의성있게 E. cli O157:H7의증식을억제하는것으로나타내었다. FSAE 처리후 16시간째에는, 538 (p < 0.01) 와 1,075 μg/ml (p < 0.001) 을처리군군들에서대조군과비교하여통계적으로유의성있게 E. cli O157:H7의생존율 Fig. 1. The inhibitin effect f Fls Syzygii Armatici methanlic extracts against E. cli O157:H7., cntrl grup treated with phsphate buffer slutin (PBS);, the grup treated with 269 µg/ml (MIC) f Fls Syzygium Armatici methanlic extract (FSAE);, the grup treated with 538 µg/ml (2 MIC) f FSAE;, the grup treated with 1,075 µg/ml (MBC) f FSAE. All experiments were independently dne in triplicate. * p < 0.05, ** p < 0.01, ** p < 0.001, cmpared t cntrl. 이감소하여 FSAE의높은증식억제효과를나타내었다. FSAE 처리후 24시간째에는, 모든처리군이대조군과비교하여통계적으로유의성있게 E. cli O157:H7에대한증식억제효과를보였다 (269 μg/ml, p < 0.05; 538 μg/ml, p < 0.001; 1,075 μg/ml, p < 0.001). Lee와 Stein 은오매, 오미자, 그리고황련의메탄올추 21) 출물합제 (5:2:3) 를이용하여, E. cli O157:H7에대한증식억제효과를조사한결과, 배양후 18시간까지대조군에비해감소하는결과를나타내었으나, 통계적으로는유의한차이를보이지않았다고보고하였다. 이등은마 22) 늘물추출물을이용하여 E. cli O157:H7에대한증식억제효과를조사한결과, 마늘물추출물을 24 mg/ml의농도로첨가한경우, 배양후 8시간부터 24시간까지대조군에비해통계적으로유의성있게감소하는결과를나타내었다고보고하였다 (p < 0.01). 또한, Park 은정향의건조 18) 분말을액체배지에 0.1~0.3% 로첨가한후, E. cli O157:H7 를 48시간동안배양한결과, 정향분말을 0.1~0.3% 로첨가한모든군들에서무첨가대조군과비교하여통계적으로유의적인차이를보이지않았다고보고하였다. 본연구에서사용한 FSAE의 E. cli O157:H7에대한증식억제효과는앞서언급한선행연구들의결과와비교하여매우뛰어난것으로나타났다. 정향에함유된대표적인생리활성물질인 eugenl, chavicl, β-caryphyllene, kaempferl, flavnid류와 eugeniin, 1-desgallyleugeniin 등의 tannin류, 일부수용성페놀성물질들이메탄올과같은극성에가까운유기용매에쉽게용출되는것으로알려져있다 23). 따라서본연구에서 FSAE가 E. cli O157:H7에대해강한항

Antibacterial Effects f Fls Syzygii Armatici Extracts 339 Fig. 2. Fecal E. cli O157:H7 cunts in each muse grup during the experiment (means ± SD, n = 10)., cntrl grup treated with phsphate buffer slutin (PBS) (n = 10);, the grup treated with 538 µg/ml (2 MIC) f Fls Syzygii Armatici methanlic extract (FSAE) (n = 10);, the grup treated with 1,075 µg/ml (MBC) f FSAE (n = 10);, the grup treated with 2,150 µg/ml (2 MBC) f FSAE (n = 10). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, cmpared t cntrl. 균활성을보인것은 FSAE에항균활성이강한다양한생리활성물질들이다량으로함유되어강한항균력을보인것으로사료된다. 마우스분변중 E. cli O157:H7의검출 Fig. 2는마우스에 E. cli O157:H7을공격접종한후, FSAE를 0.538, 1.075 그리고 2.15 mg/ml의농도로 7일동안경구투여하면서, 마우스의분변을채취하여 E. cli O157:H7 균수의경시적변화를관찰한것을나타낸것이다. FSAE 투여후 3일째에는 1.075 (p < 0.05) 와 2.15 mg/ ml (p < 0.001) 을투여한군들의경우, 무처리대조군과비교하여유의성있게 E. cli O157:H7 균수가감소하였다. FSAE 투여후 5일째에는 1.075 (p < 0.01) 와 2.15 mg/ml (p < 0.001) 을투여한군들의경우, 무처리대조군과비교하여유의성있게 E. cli O157:H7 균수가감소하는결과를나타내었다. FSAE 투여후 7일째에는 FSAE를투여한모든군들에서무처리대조군과비교하여통계적으로유의성있게 E. cli O157:H7 균수가감소하는결과를나타내었다 (2 MIC 투여군, p < 0.05; MBC와 2 MBC 투여군, p < 0.001). Cha 등 24) 은 E. cli O157:H7을감염시킨마우스에황련, 감초, 오미자, 산수유합제 (1:1:1:1, w/w) 를열수추출한추출물을 7일동안 10% 농도로음수에혼합하여투여한결과, 분변중의 E. cli O157:H7의균수가대조군에비해통계적으로유의성있게감소하였다고보고하였다 (p < 0.01). 또한, Itelima와 Agina 25) 는여러가지식물의에탄올추출물을 3 mg/kg bdy weight의농도로 E. cli O157: H7을감염시킨랫드에매일경구투여한결과, 마늘과생강추출물을투여한군의경우각각투여후 5일째와 7일째에분변으로부터 E. cli O157:H7이검출되지않았다고보고하였다. 앞선연구결과들에서투여용량을고려할경우, 본연구에서사용한 FSAE의 E. cli O157:H7에감염된마우스에대한치료효과가 Cha 등의한약재합제보 24) 다뛰어났으며, Itelima와 Agina 25) 의마늘과생강의에탄올추출물과는유사한치료효과를보였다. 결론적으로, 본연구에사용된 FSAE는 E. cli O157:H7 에대하여강력한항균활성과 E. cli O157:H7에감염된마우스에대하여뛰어난치료효과를나타내었다. 따라서향후, FSAE에대하여가축에있어서 E. cli O157:H7 감염증치료를위한치료제와식품보존제로써의적용연구와안전성연구가추가적으로수행되어야할것으로사료된다. 국문요약 본연구는정향추출물의 E. cli O157:H7에대한항균효과와 E. cli O157:H7 감염마우스에대한치료효과를평가하기위해수행되었다. 정향메탄올추출물 (FSAE) 을이용하여 E. cli O157:H7 에대한항균효과확인시험을수행한결과, 배양후 24 시간째에, FSAE를첨가한모든군들에서 E. cli O157:H7 의생존율이무투여대조군에비해통계적으로유의성있게감소하는결과를보여 (0.269 mg/ml, p < 0.05; 0.538과 1.075 mg/ml, p < 0.001), FSAE가 E. cli O157:H7의증식억제효과가뛰어난것으로확인되었다. 또한, E. cli O157:H7을감염시킨마우스에 FSAE를경구로투여한결과, 투여후 3일째에, FSAE를 1.075 (p < 0.05) 와 2.15 mg/ ml (p < 0.01) 로투여한군들에서대조군과비교하여분변내 E. cli O157:H7의균수가유의성있게감소하였으며, 투여 7일째에는, 모든 FSAE 투여군들에서대조군과비교하여 E. cli O157:H7의균수가통계적으로유의성있게감소하였다 (0.538 mg/ml, p < 0.05; 1.075와 2.15 mg/ml, p < 0.001). 이상의연구결과로부터, FSAE를 E. cli O157: H7에감염된마우스에경구로투여할경우, 감염증상을완화시킬수있을것으로기대된다. References 1. Ministry f Fd & Drug Safety: 2016 Fd & Drug Statistical Yearbk. II. Fd and Nutritin. 8. Fdbrne utbreaks. Ministry f Fd & Drug Safety, Chengju, pp. 230-231 (2016). 2. Berger, C.N., Sdha, S.V., Shaw, R.K., Griffin, P.M., Pink, D., Hand, P. and Frankel, G.: Fresh fruit and vegetables as vehicles fr the transmissin f human pathgens. Envirn. Micrbil., 12, 2385-2397 (2010).

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