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Young Uh, et al. : MLS B Resistance of GBS 175 GBS 보균율은점차로증가하는것으로판단된다. 이에본연구에서는최근의임신부의 GBS 보균율과함께임신부에서분리되는 GBS의혈청형의분포와항균제감수성결과를얻고자하였다. 재료및방법 1. 보균자배양검사 2008년 8월부터 2009년 6월까지원주기독병원에내원한분만직전의임신부 234명을대상으로질, 요도구및항문주위에서각각 2개의멸균된면봉으로검체를채취하여 Stuart 수송배지에접종하여운반하였으며, 검체접수후 24시간내에세균학적검사를시행하였다. 한개의면봉검체는자가제조한 New Granada Medium (NGM) 평판배지와상품화된 NGM 평판배지 (biomérieux, Marcy-l'Etoile, France) 에접종한후 Todd-Hewitt broth (Difco, Detroit, MI., USA) 선택배지에접종하였다. 다른한개의면봉은자가제조한 NGM 튜브배지에접종하였다. Todd-Hewitt broth (Difco) 선택배지 (S-THB) 는 THB에 8μg/ ml의 gentamicin (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo., USA) 과 15μg/mL의 nalidixic acid (Sigma) 를첨가하여제조하였다. 자가제조한 NGM 배지는 1 L의멸균수용액에한천을액체배지에는 3 g, 고체배지에는 10 g을넣고여기에 proteose peptone no. 3 (Difco) 25 g, soluble starch 20 g (Merck & Co., NJ, USA), morpholinepropanesulfonic acid hemisodium salt 11 g (Sigma), anhydrous Na 2HPO 4 8.5 g을넣은후서서히열을가하여녹인배지를 1기압에서 7분간멸균한다음 50 55 o C로식힌후 1 L에 250 g glucose, 100 g sodium pyruvate, 20 g anhydrous MgSO 4, 0.6 g methotrexate sodium salt, 0.02 g crystal violet, 0.5 g colistin sulfate, 1 g metronidazole을첨가하여여과멸균한용액 10 ml와멸균된말혈청 50 ml를첨가하여 NGM 평판 (NGM-H) 및액체배지 (NGM-T) 를제조하였다 [13]. S-THB 는 35 o C에서 18 24시간배양한후 0.01 ml 백금이를이용하여 5% 면양혈액한천배지에계대배양을한뒤 γ 또는 β 용혈을보인집락을 CAMP 반응과 latex 응집시험 (Streptex; Murex Biotech Ltd., Dartford, England) 으로확인하였다. 3종류의 NGM 배지는 35 o C CO 2 배양기에서 24시간까지배양하였고 NGM 배지에서주황색이면계대배양하여 GBS를확인하였다. 2. 항균제감수성검사 GBS의항균제감수성검사는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 의한천희석법 [14] 으로 penicillin (Sigma), vancomycin ( 대웅제약, 서울 ) ceftriaxone (Sigma), erythromycin (Sigma), clindamycin (Sigma), chloramphenicol ( 종근당, 서울 ), tetracycline (Sigma) 에대하여시험하였다. 3. MLS B 내성표현형검사 GBS의 macrolide-lincosamide-streptogramin B (MLS B) 내성표현형검사는 5% 면양혈액을첨가한 Mueller-Hinton 한천배지에 0.5 McFarland 탁도로맞춘균접종액을면봉으로골고루바른후 15μg이함유된 erythromycin 디스크 (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD., USA) 와 2μg의 clindamycin 디스크 (BBL) 를디스크분배기 ( 두디스크가장자리와의거리는약 15 mm) 를이용하여놓은다음 35 o C CO 2 배양기에서 20 24시간배양하였다. 결과판독은 erythromycin에인접한 clindamycin의억제대가무뎌져 D자형태를보이면유도성내성으로, 한천희석법에서 clindamycin에내성이었으나 D 형태가없는경우는구성적내성으로, clindamycin에감수성이면서 D 형태가없는경우는 M 형으로각각해석하였다. 4. MLS B 내성유전형검사 GBS의 MLS B 내성유전자는 polymerase chain reaction (PCR) 법으로검출하였다. GBS의 DNA는 proteinase K와페놀 / 클로로포름법을이용한상용화된제품 (Easy-DNA kit, Invitrogen Co., USA) 을사용하여순수분리된 1 2개의집락에서추출하였다. MLS B 내성유전자인 erm(a), erm(b), erm(c), erm(tr) 및 mef(a) 검출을위한 oligonucleotide 시발체의염기서열은이전의연구 [9] 와같다. MLS B 내성유전자인 erm(a), erm(b) 및 erm(c) 검출을위한 PCR 반응혼합물은 GBS의 DNA 추출액 5μL, PCR 완충액 (10 mm tris-hcl ph 8.3, 50 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2) 5μL, Taq DNA polymerase (Behringer Mannheim, Germany) 2.5 U, 각각의 dntp 200μM 및시발체 20 pmol을첨가한후탈이온증류수 (DDW) 를가하여총부피가 50μL되게한후 thermocycler (GeneAmp R PCR System 9700, Applied Biosystems Inc., CA, USA) 를이용하여 94 o C에서 5분간가온한후 main cycle로 94 o C 60초, 52 o C 60초, 72 o C 60초를 35회반복하고끝으로 72 o C에서 10분간연장반응시켰다. MLS 내성유전자 erm(tr) 및 mef(a) 검출을위한 PCR 반응혼합물은 erm(a) 와동일하게조성하고, PCR main cycle 조건만달리하였다. MLS 내성유전자 erm(tr) 의 PCR main cycle은 94 o C 30초, 42 o C 60초, 72 o C 60초를 30회반복하고, mef(a) 는 95 o C 30초, 56 o C 60초, 72 o C 60초를 30회반복하였다. PCR 반응산물은 agarose gel에서전기영동 (100 V, 30분 ) 한후자외선하에서 DNA 분획을확인하였고 marker는 100 bp DNA ladder (Gibco/BRL, LifeTechnologies Inc., Gaithersburg, MD., USA) 를사용하였다. 또한 GBS-R ACE detection kit (Seegene, 서울 ) 를이용한 multiplex PCR로내성형을확인하였다. 5. 혈청형검사 GBS의혈청형은 Hemolytic Streptococcus Group B Typing

176 Korean J Clin Microbiol 2009;12(4):174-179 Sera (Denka Seiken Co., Ltd., Tokyo, Japan) 와 coagglutination (ESSUM Group B Streptococcus Serotyping Test; Bacterum AB, Umeå, Sweden) 을병행하여검사하였다. 결과 234명임신부의연령은 17세부터 43세까지로평균연령은 32세였다. 임신부의 GBS 보균율은 11.5% (27/234) 였으며, 검체별 GBS 검출률은항문주위 9.8%, 요도구 8.1% 및질 7.3% 의순이었다. 각검체에서배지별 GBS 검출률은항문주위에서 S-THB 9.4%, NGM-B 9.0%, NGM-T 9.0%, NGM-H 8.5% 였고, 요도구는 S-THB 8.1%, NGM-B와 NGM-H가각각 7.3%, NGM-T 6.8% 였으며, 질에서는 S-THB 7.3%, NGM-B 와 NGM- T가각각 6.0%, NGM-H 5.6% 의순이었다 (Table 1). 임신부에서분리된 27균주의 GBS는 penicillin, vancomycin, ceftriaxone과 chloramphenicol에모두감수성이었고, erythromycin, clindamycin과 tetracycline 내성률은각각 33.3%, 44.4% 와 85.2% 였다 (Table 2). Erythromycin에는감수성이고 clindamycin에내성인균주는 4균주로서 clindamycin 최소억제농도가모두 4μg/mL였다. Erythromycin 내성인 9균주의 GBS의 MLS B 내성유전자는 mef(a) 가 11.1% (1/9) 였고, 나머지는모두가 erm(b) 유전자를가지고있었다. mef(a) 유전자를가진 1균주의 erythromycin과 clindamycin의최소억제농도는각각 2μg/mL과 0.06μg/mL으로 M 표현형의 MLS B 내성이었고, erm(b) 유전자를가진 8균주는 erythromycin 과 clindamycin 최소억제농도가 256μg/mL 이상으로서구성적 MLS B 내성이었다. GBS의혈청형분포비율은 III이 29.6% (8/27) 로가장높았고, V와 VI는 22.2% (6/27) 로동일하였으며, Ib와 II도 11.1% (3/27) 로동일하였고, Ia는 3.7% (1/27) 로가장낮았다. erm(b) 유전자가양성인 8균주의 GBS는각각 4주가혈청형 V와 VI이었고, mef(a) 유전자양성인 1균주는혈청형이 III이었다 (Table 3). 고찰미국과유럽에서는 GBS에의한신생아감염병의유병률과사망률이매우높기때문에일찍부터이균종의역학과병원성에대한연구가많았으며, GBS 보균임신부를신속하고정확하게찾아내는검사방법과항균제의예방적투여또는면역제제를이용한신생아 GBS 감염병의예방에초점을두고연구를진행하고있다 [10,15,16]. 1990년대들어미국에서는 GBS 임신부에대한예방적항균제의사용에힘입어신생아 GBS 감염빈도가 70% 감소되었음에도불구하고, 미국에서의신생아 GBS 조기감염은매년 1,600명이발병하며, 80명이사망하는신생아사망의가장주요한감염질환으로남아있고, 신생아 GBS 감염은정신지체와시각과청력감소와같은성장장애를 Table 1. Colonization incidence of 234 pregnant women by GBS according to specimen type and culture method Specimen type No. (%) of positive samples detected by NGM-B plates NGM-H plates NGM tubes Selective THB Any method Vaginal 14 (6.0) 13 (5.6) 14 (6.0) 17 (7.3) 17 (7.3) Urethral 17 (7.3) 17 (7.3) 16 (6.8) 19 (8.1) 19 (8.1) Anorectal 21 (9.0) 20 (8.5) 21 (9.0) 22 (9.4) 23 (9.8) Total 25 (10.7) 24 (10.3) 23 (9.8) 26 (11.1) 27 (11.5) Abbreviations: NGM, new Granada medium; NGM-B, commercial NGM, NGM-H, housemade NGM, THB, Todd-Hewitt broth. Table 2. Activities of antimicrobial agents against 27 isolates of group B streptococci from pregnant women Antimicrobials MIC (μg/ml) Percent Range MIC 50 MIC 90 S I R Penicillin G 0.03 0.06 0.03 0.03 100 0 0 Ceftriaxone 0.06 0.12 0.06 0.06 100 0 0 Clindamycin 0.06 256 0.06 256 55.6 0 44.4 Erythromycin 0.06 256 0.06 256 66.7 0 33.3 Chloramphenicol 2 4 2 2 100 0 0 Tetracycline 1 64 32 64 14.8 0 85.2 Vancomycin 0.5 0.5 0.5 100 0 0 Abbreviations: I, intermediate; R, resistant; S, susceptible.

Young Uh, et al. : MLS B Resistance of GBS 177 Table 3. Distribution of MLS B gene and serotypes of GBS isolated from pregnant women MLS B gene No. (%) of serotype Ia Ib II III V VI Total erm(b) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 4 (50.0) 4 (50.0) 8 mef(a) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (100) 0 (0) 0 (0) 1 ND* 1 (5.6) 3 (16.7) 3 (16.7) 7 (38.9) 2 (11.1) 2 (11.1) 18 Total 1 (3.7) 3 (11.1) 3 (11.1) 8 (29.6) 6 (22.2) 6 (22.2) 27 *No. of isolates that MLSB resistant gene was not detected. 초래할수있다 [15]. 이런이유로미국질병관리본부에서는 2002년에기존의지침을강화하여임신 35 37주의모든임신부를대상으로질과직장에서 GBS 선별검사를실시하도록권고하였다 [15]. 그러나국내에서는전국적인신생아 GBS 감염에관한역학조사가없을뿐만아니라임신부의 GBS 보균율에대한정확한자료가적어신생아 GBS 감염예방을위한방향설정이없는실정이다. 본연구에의하면국내임신부의 GBS 보균율은 11.5% 로과거에비해현저하게높아졌으며이러한증가추세가향후지속되는지를확인하기위한지속적인보균율조사가필요함을느꼈다. 더욱이출산율이매우낮은국내의현실에서임신부의 GBS 보균율이높아지고있다는사실은이에대한대책마련이시급함을시사한다. 본연구를시행한지역에서임신부의 GBS 보균율이과거에비해크게증가한이유는정확히알수는없으나검체채취방법과부위및배양법이이전의연구와동일하였으므로검사상의기술적인요인보다는사회경제적수준또는식생활양식과같은요인들이관여할것으로추측되었다. 또한 GBS 보균자배양검사를토대로예방적항균제사용의결정과그효과를분석하기위해서는국내의산전검사가이드라인에임신 35 37주에 GBS 선별검사를시행하는내용을포함시킬필요성이있다고생각되었다. GBS 보균임신부를찾아내기위해서는 GBS 배양양성률이높은부위를선택해야하지만임신부의 GBS 보균율을정확히알수있는단일부위는없으며, 질과직장검체가 GBS 양성률이가장높다 [15,16]. 본연구에서도항문주위에서의검출률이가장높았다. Dillon 등 [17] 은 Escherichia coli와사슬알균이외의균종에의한신생아감염병은임신부의장내상재균에의하여발생되므로임신부의생식기계에서분리되는 GBS도장내 GBS의오염균일가능성이높다고주장하였다. Boyer 등 [18] 은질배양에서 GBS가분리되지않았으나직장에서 GBS가분리된임신부의 17% 가신생아에 GBS를전파함을보고하여직장에존재하는 GBS가여성생식기의 GBS의근원일뿐아니라신생아에전파되는근원으로작용한다고하였다. 여성의비뇨생식기계와직장은다양한세균이상재균으로존재한다. 그러므로임신부에서 GBS 보균자검출을위한배지 는 THB 배지를기초로하여 nalidixic acid와 gentamicin을첨가하거나 colistin과 nalidixic acid를첨가한배지를 1차배지로권장한다 [15,16]. 이러한선택액체배지는임신부의 GBS 검출에가장우수한방법이지만 Staphylococcus가증식되는경우가많으며, 면양혈액한천평판배지에다시계대배양해야하는단점이있다. 이에반해 NGM은육안으로 GBS 증식을쉽게확인할수있고, 배양후 6시간내에 44.4%, 12시간내에는 81.5% 를검출할수있는신속선별법으로서위양성이없다 [13]. 임신부의 GBS 보균자검출에평판배지만을사용할때는보균자의 50% 까지위음성결과를보일수있다고하나 [16] 본연구에의하면 NGM은 S-THB와유사한검출률을보였다. GBS는 penicilln에감수성이며, penicilln의항균역 (antimicrobial spectrum) 이좁기때문에임신부 GBS 보균자의예방적항균제의선택약제로 penicillin을권장하고있다 [15]. Penicillin 과민증은매우드물지만과거력이있거나의심될때는대체약제로 clindamycin이나 erythromycin 을권장한다. 그러나 1990 년대중반이후로 GBS의 erythromycin과 clindamycin 내성률이증가하여이들약제에대한항균제감수성검사가필요하게되었다 [9,15]. 저자등이 1995년도임신부에서분리한 GBS의 clindamycin과 erythromycin 내성률은 13.3% 와 5% 였으나 [11] 본연구에서는 44.4% 와 33.3% 로크게증가하였다. 또한임신부의 GBS 혈청형은이전의연구 [11] 에서는 Ib 48.3%, Ia 24.1%, III 20.7% 의순서였으나본연구에서는혈청형 III이 29.6% 로가장높았고, 이전에는없었던혈청형인 V와 VI이각각 22.2% 로높게증가하였으며, Ia와 Ib는 3.7% 와 11.1% 로급격히감소하였다. 일본에서도건강한임신부에서분리된 GBS 에서 VIII와 VI이각각 36% 와 25% 로가장흔한혈청형으로보고한바있다 [19]. GBS 혈청형은 MLS B 내성과연관성이있는데특히 V와 III은구성형의 MLS B 내성을나타내는빈도가높다 [20]. 본연구에서는혈청형 V와 VI인 GBS는각각 66.7% 가 erythromycin 과 clindamycin에고도내성인구성형의 MLS B 표현형으로 erm(b) 유전자를갖고있었다. 이와는반대로혈청형 Ia, Ib와 II에는 erythromycin 내성인균주가없었고, 혈청형 III 도 1균주만이 M형의 MLS B 내성형이었다. 이상의결과로볼때한국인임신부에서의 GBS 분리율과 er-

178 Korean J Clin Microbiol 2009;12(4):174-179 ythromycin 및 clindamycin에대한내성률은예전에비해크게높아졌으며, 혈청형분포또한많은변화가있었다. 이러한변화들의정확한원인은알수없었으나구성적 MLS B 내성유전자를갖고있는혈청형 V와 VI의분리빈도가증가한것이하나의원인으로생각되었다. 앞으로국내여러지역에서의 GBS 의역학과항균제감수성양상, 혈청형등에대한연구를토대로국내신생아 GBS 감염예방에대한지침마련이필요할것으로생각되었다. 감사의글 이연구는 2008년도대한임상미생물학회연구비지원에의한것임. 참고문헌 1. Boyer KM, Gadzala CA, Burd LI, Fisher DE, Paton JB, Gotoff SP. Selective intrapartum chemoprophylaxis of neonatal group B streptococcal early-onset disease. I. Epidemiologic rationale. J Infect Dis 1983;148:795-801. 2. Gray BM, Pass MA, Dillon HC Jr. Laboratory and field evaluation of selective media for isolation of group B streptococci. J Clin Microbiol 1979;9:466-70. 3. Pasnick M, Mead PB, Philip AG. Selective maternal culturing to identify group B streptococcal infection. Am J Obstet Gynecol 1980;138:480-4. 4. Gjerdingen DK. Premature labor, Part I: Risk assessment, etiologic factors, and diagnosis. J Am Board Fam Pract 1992;5:495-509. 5. Wilkinson HW. Group B streptococcal infection in humans. Ann Rev Microbiol 1978;32:41-57. 6. Burman LG, Christensen P, Christensen K, Fryklund B, Helgesson AM, Svenningsen NW, et al. Prevention of excess neonatal morbidity associated with group B streptococci by vaginal chlorhexidine disinfection during labour. Lancet 1992;340:65-9. 7. Campbell JR, Baker CJ, Edwards MS. Influence of serotype of group B streptococci on C3 degradation. Infect Immun 1992;60: 4558-62. 8. Uh Y, Jang IH, Hwang GY, Yoon KJ. Antimicrobial resistance and serotypes in the clinical isolates of group B streptococci. Korean J Clin Microbiol 1999;2:64-70. 9. Uh Y, Jang IH, Hwang GY, Lee MK, Yoon KJ, Kim HY. Serotypes and genotypes of erythromycin-resistant group B streptococci in Korea. J Clin Microbiol 2004;42:3306-8. 10. Uh Y, Kwon JY, Jang IH, Yoon KJ, Kim HG. Colonization rate of group B Streptococcus in pregnant women and neonates. Korean J Clin Pathol 1994;14:447-53. 11. Uh Y, Jang IH, Yoon KJ, Lee CH, Kwon JY, Kim MC. Colonization rates and serotypes of group B streptococci isolated from pregnant women in a Korean tertiary hospital. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1997;16:753-6. 12. Uh Y, Jang IH, Yoon KJ, Kwon JY. Colonization rate and serotypes of group B streptococci in first trimester of pregnancy. Korean J Clin Pathol 1998;18:183-6. 13. Uh Y, Jang IH, Kwon JY, Kim NS, Kim MC, Park DW, et al. Studies on the usefulness of new Granada selective medium for the detection of group B streptococci in pregnant women. J Wonju Med Coll 1996;9:7-15. 14. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. 8th ed., Approved standard M07-A8. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA., 2009. 15. CDC. Prevention of perinatal group B streptococcal Disease. MMWR 2002;51:1-22. 16. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Laboratory practices for prenatal group B streptococcal screening and reporting-connecticut, Georgia, and Minnesota, 1997-1998. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1999;48:426-8. 17. Dillon HC Jr, Gray E, Pass MA, Gray BM. Anorectal and vaginal carriage of group B streptococci during pregnancy. J Infect Dis 1982;145:794-9. 18. Boyer KM, Gadzala CA, Kelly PD, Burd LI, Gotoff SP. Selective intrapartum chemoprophylaxis of neonatal group B streptococcal early-onset disease. II. Predictive value of prenatal cultures. J Infect Dis 1983;148:802-9. 19. Lachenauer CS, Kasper DL, Shimada J, Ichiman Y, Ohtsuka H, Kaku M, et al. Serotypes VI and VIII predominate among group B streptococci isolated from pregnant Japanese women. J Infect Dis 1999;179:1030-3. 20. Uh Y, Kim HY, Jang IH, Hwang GY, Yoon KJ. Correlation of serotypes and genotypes of macrolide-resistant Streptococcus agalactiae. Yonsei Med J 2005;46:480-3.

Young Uh, et al. : MLS B Resistance of GBS 179 = 국문초록 = 임신부의 Group B Streptococci 보균율, 혈청형및 Macrolide-Lincosamide-Streptogramin B 내성형의분포 연세대학교원주의과대학 1 진단검사의학교실, 2 산부인과학교실어영 1, 최성진 2, 장인호 1, 이관수 1, 조현미 1, 권오건 1, 윤갑준 1 배경 : 신생아 GBS 감염유병률은임신부의 GBS 보균율이가장중요한결정요인이다. 우리나라임신부의 GBS 보균율은외국에비해낮은것으로알려져있으나이에대한최근의자료가없는실정이다. 방법 : 2008년 8월부터 2009년 6월까지분만직전의임신부를대상으로질, 요도구및항문주위에서채취한면봉검체를자가제조한 new Granada 평판배지 (NGM-H) 와 NGM 튜브배지 (NGM-T), 상품화된 NGM 평판배지 (NGM-B) 및 Todd-Hewitt broth (THB) 선택배지에접종하여 18 24시간배양하였다. 분리한 GBS 균주는한천희석법, 혈청형시험및 polymerase chain reaction 검사를시행하였다. 결과 : 임신부의 GBS 보균율은 11.5% (27/234) 였으며, 검체별로는항문주위 9.8%, 요도구 8.1%, 질 7.3% 의순이었다. 배지에따른 GBS 검출률은 S-THB 96.3%, NGM-B 92.6%, NGM-H 88.9%, NGM-T 85.2% 의순서였다. GBS 혈청형분포비율은 III (29.6%), V와 VI (22.2%), Ib와 II (11.1%) 및 Ia (3.7%) 의순서였다. Erythromycin과 clindamycin 내성률은 33.3% 와 44.4% 였으며 erythromycin 내성인 9균주에서 8균주는혈청형 V와 VI으로 erm(b) 내성유전자를갖고있었다. 결론 : 국내의임신부 GBS 보균율과 erythromycin과 clindamycin 내성률은예전에비해매우높아졌으며, erm(b) 유전자를갖고있는 V와 VI 혈청형이새롭게출현하였다. [ 대한임상미생물학회지 2009;12:174-179] 교신저자 : 어영, 220-701, 강원도원주시일산동 162 연세대학교원주의과대학진단검사의학교실 Tel: 033-741-1592, Fax: 033-731-0506 E-mail: u931018@yonsei.ac.kr