제 5 장 폴리오 폴리오 (poliomyelitis 혹은 polio) 는중추신경계를침범하는급성전염병으로서심각한질환이다. 폴리오바이러스는사람에게만유일하게병증을나타내며감염시증상은불현성감염에서부터미미한증상, 무균성수막염혹은마비증상까지다양한양상을보인다. 대부분의폴리오바이러스감염은무증상이나감염자의약 1% 에서는바이러스가척수전각의운동신경 (motor neuron) 을침범하여급성이완성마비증상 (acute flaccid paralysis, AFP) 을일으킨다. 폴리오바이러스에의한마비는주로비대칭적으로나타나지만, 대표적으로급성이완성마비증상을보이는 Guillain-Barré syndrome (GBS) 의비대칭성마비와는차이가있다. 폴리오바이러스는 RD (human rhabdomyosarcoma) 또는 HEp-2 (human epidermoid carcinoma No.2) 등의세포주에서배양이가능하며, 최근개발된폴리오바이러스수용체를가진세포주인 L2B 세포에특이적으로세포병변을일으켜다른장내바이러스와쉽게감별이가능하다. 폴리오바이러스는장내바이러스중가장많이연구가진행된 prototype 바이러스로장내바이러스의일반적인특성을모두가지며 1, 2, 3의세가지혈청형으로구분된다. 세가지혈청형사이에는교차반응이거의없어면역을위해서는세가지형을모두적당한역가로포함시켜백신을제조한다. 73 감염병실험실진단제 4 부바이러스질환
병원체 Picornaviridae 과의 Enterovirus 속에속하는바이러스로 24~3 nm크기이며, 정 2면체의단일가닥 RNA 게놈을가지는피막이없는바이러스이다. 폴리오바이러스캡시드는 12개의펜타머 (pentamer) 로구성되어있으며, 각각의펜타머는 VP1, VP2, VP3, VP4 등네가지폴리펩티드로이루어진 5개의프로토머 (protomer) 로구성되어있다. 폴리오바이러스는 55 에서 3분, 포름알데하이드, 염소, 자외선등에의해불활성화되나, 에테르또는 sodium deoxycholate에의해서는영향을받지않는다. 알코올과크레졸같은실험실소독제에의해불활성화되지않지만, 5 이상의온도나고압멸균, 소각에의해쉽게파괴된다. 폴리오바이러스실험실에서는.5% 클로린표백제를소독제로사용하도록권장하고있다 [1]. 임상검체혹은환경에서분리한폴리오바이러스는실험실조건이양호한상태에서는수년에서수십년동안냉동상태하에서생존이가능하며, 몇달동안냉장상태, 그리고수일에서수주일동안상온에서생존이가능하다. 자연계에서폴리오바이러스불활성화비율은환경변화에크게영향을받는다. 즉겨울철토양에서는 2일, 여름철토양에서는 1.5일, 오수 26일, 정수 5.5일, 바닷물에서는 2.5일마다폴리오바이러스감염성이 9% 감소된다. 폴리오바이러스는매우제한적인숙주범위를가지며대부분의폴리오바이러스주는원숭이의뇌또는척수에직접접종시감염이가능하다. 침팬지나사이노몰거스원숭이 (cynomolgus monkey) 도구강전염에의해감염될수있다. 침팬지감염은보통무증상이며동물은바이러스의장내보균자가된다. 대부분의폴리오바이러스주는다양한사람조직또는원숭이신장, 고환, 근육등의세포주에서증식된다. 폴리오바이러스는폴리오바이러스수용체 (poliovirus receptor, PVR) 를가진감수성세포를감염시키며폴리오바이러스수용체를비감수성세포에삽입시감수성세포로전환되며, 폴리오바이러스수용체를보유하고있는유전자이식생쥐 (transgenic mice) 가개발되어폴리오바이러스연구에사용된다. 폴리오바이러스는세가지혈청형 (poliovirus type 1, 2, 3) 으로구분되고 ( 표 1), 이들간에는교차반응이거의일어나지않아감염을일으킨혈청형에대해서만평생면역을유발한다. 수동적인면역은산모로부터태아에게전달되며태아가모체로부터수동적으로받은항체는 3~5주간지속된다. 바이러스중화항체는바이러스에노출직후 제 5 장폴리오 731
나발병초기에형성되며평생동안지속된다. 표 1. 폴리오바이러스종류 혈청형 Type 1 Sabin type 1 Mahoney Type 2 Sabin type 2 MEF type Type 3 Sabin type 3 Saukett 바이러스주 LS-c/2ab, CHAT, Cox (attenuated vaccine strains) Mahoney, Brunhilde (wild poliovirus) P712/Ch/2ab, W-2 (attenuated vaccine strains) MEF-1, Lansing (wild poliovirus) Leon 12ab (attenuated vaccine strains) Saukett, P3/Leon/37 (wild poliovirus) 임상증상 경구적경로로감염되어인후나위장관에서일차적인바이러스증식이일어나며증상이나타나기이전에이미바이러스가배출된다. 바이러스는사람의편도선, 목의임파선, Peyer s patches, 소장에서증식하여국소림프절을침범하고혈류를통해중추신경계에들어와운동신경세포를파괴하여소아마비증상을일으키나, 임상증상을보이지않는감염자도분변으로바이러스를배출하여바이러스를전파시킨다. 바이러스에감염되면불현성감염으로부터약한발열증상에서심각한영구마비증상까지다양한임상증상을나타낸다. 잠복기는보통 7~14일이며초기임상증상은열, 피로, 두통, 구토, 변비, 목의뻣뻣함, 사지통증등을포함한다. 폴리오바이러스감염의 95% 는무증상 / 불현성으로나타나며, 감염자의 4~8% 는신경계침범으로실험실진단이되지않는경미한비특이성질환으로지나가며 1주일이내에완전하게회복되는데상기도감염, 장관계이상또는독감과같은세가지형태로나타나다른바이러스질환과임상적구별이어렵다. 이외에도마비증상이없는무균성수막염을일으키기도하며이완성마비는약 1~2% 에서나타나 2~3일간마비증상이진전되다가열이떨어지면서회복된다. 대부분의마비증상을보이는환자는완전히회복되나 12개월이후에도마비가남아있는경우영구적으로마비를갖게된다. 마비성폴리오에의한사망은소아의경우 2~5%, 성인의경우 15~3% 이며, 연수를침범하는경우사망률이 25~75% 까지증가한다. 732 감염병실험실진단제 4 부바이러스질환
1 부전형회백수염 (abortive poliomyelitis): 폴리오중가장보편적인형태이며환자는발열, 오한, 기면상태, 두통, 오심, 구토, 변비, 인후염등의증상을보이고수일내에회복된다. 2 비마비성회백수염 (nonparalytic poliomyelitis, aseptic meningitis): 부전형회백수염증상과더불어마비증상은없으나등과목에서뻣뻣함과통증을동반하게된다. 증상은 2~1일간지속되고회복은빠르고완전하나아주드문경우증세가마비로진전된다. 3 마비성회백수염 (paralytic poliomyelitis): 뚜렷한증상은하위운동신경의파괴로인한이완성마비이며, 이어서마비근육의경련이일어나거나뇌를침범하게된다. 회복기간은보통 6개월정도이며, 후유증으로인한마비증세는훨씬더오래지속된다. 4 진행성회백수염근육허약증 (progressive postpoliomyelitis muscle atrophy): 마비와근육소진은마비성회백수염증상후몇십년뒤에도나타날수있다. 진행성회백수염근육허약증은드물게일어나는데, 이는지속적인감염의결과이기보다는마비환자에서신체적인노화현상으로인한신경기능손상에의한결과로추정된다. 역학 폴리오바이러스감염은과거에전세계적으로발생하였으나예방백신보급이후급격히감소하였고세계보건기구주도로시작된폴리오박멸사업에의해 25년현재전세계국가중나이지리아, 인도, 파키스탄, 니제르, 아프가니스탄, 이집트의 6개국가에서만발생이보고되고있다 [3, 8]. 세계보건기구는전세계에서두창 (smallpox) 을퇴치한것처럼 28년까지폴리오박멸을목표로주도적으로사업을진행중이다. 국내에서는 1983년에마지막다섯사례가보고된이후발생보고가없으며우리나라를포함한서태평양지역은 2년 1월에폴리오박멸을선언한바있다. 한편미국대륙은 1994년, 유럽은 22년에야생폴리오바이러스박멸을선포했다. 그러나 24년현재야생폴리오바이러스에의한폴리오가아프리카와인도대륙에서여전히발생하고있어전세계적인폴리오박멸을위해서는지속적인감시와예방접종이요구된다 [2, 4]. 제 5 장폴리오 733
전세계적인박멸사업이시작되기전에폴리오는열대지역에서는일년내내, 온대지역에서는주로여름동안발생하며겨울에는유행이거의없었다. 사람이유일한감염원이며주로경구적경로로전파된다. 폴리오바이러스는위생상태가불량한환경하에서감염성이있는분변의섭취를통해서혹은감염초기에상위호흡기관지의비말을통해사람에서사람에게로전파된다. 전파는가족내에서가장높으며, 첫감염자가가족내에서발견되면가족내감수성이있는사람은감염될확률이높다. 폴리오는모든연령층에서발생가능하나성인보다소아가더감수성이높으며, 폴리오백신도입이전선진국에서의폴리오감염연령분포를분석해보면대부분의환자가 5세이상이었고, 15세이상도 25% 이었다. 치사율은다양하나노인층에서매우높아 5~1% 에달한다. 국내에서경기도지역초등학생 5명을대상으로실시한폴리오바이러스항체가조사연구에의하면 [6], 어린이의 82.2% 가폴리오바이러스세가지혈청형에대한항체를가지고있었으며, 폴리오바이러스 1, 2, 3형에대한각각의항체양성율은 94.4%, 96.6%, 86.8% 로폴리오바이러스 3형에대한항체양성율이 1형과 2형에대한양성율보다상대적으로낮음이확인되었다. 현재국내에서는대한소아과학회와질병관리본부가공동으로전국소아과전공의수련병원 11개를 AFP 보고병원으로지정하여폴리오유사증상환자에대한급성이완성마비감시체계 (acute flaccid paralysis surveillance) 운영하고있다. AFP 감시체계운영을통해야생폴리오바이러스유행지역으로부터의국내유입과백신유래폴리오바이러스 (vaccine-derived poliovirus, VDPV) 유행및백신주바이러스에의한백신관련마비 (vaccine-associated paralytic poliomyelitis, VAPP) 발생을감시하고있으며 25년 3월웹기반보고시스템 (web-based reporting system) 을도입하였다. 예방및관리 폴리오바이러스감염의치료를위한항바이러스제제는현재까지없으며이환된신경의급성증상에대해서는보존적요법을행하고, 증상이호전된후에는치유되지않는마비에대한재활훈련을한다. 폴리오에대한면역은예방접종이나자연적인폴리오바이러스감염에의해이루어진다. 현재사용하고있는경구용생백신 (live attenuated oral polio vaccine, OPV) 과주사용불활성화사백신 (inactivated polio vaccine, IPV) 은모두항체생성을유도하 734 감염병실험실진단제 4 부바이러스질환
고야생바이러스에의한침입으로부터보호한다. 생백신은혈액내에서 IgM과 IgG 항체를생산할뿐아니라장에서 IgA 항체를생산하여재감염을방지한다. 장에서증식하는생바이러스를포함하는생백신은장에서바이러스증식을저해하는점액성면역도유도하며접종이용이하고가격이저렴하여 WHO의폴리오박멸사업에사용되어야생폴리오바이러스전파를효과적으로차단하여왔다. 그러나생백신은면역결핍자나면역억제자혹은가족접촉자에게는생백신을접종해서는안되며이런경우사백신을접종해야한다 [5]. 생백신은접종이후바이러스가장관을통해배출되기때문에접종자뿐아니라주위사람을감염시킬수있으며, 백신접종과관련된마비 (VAPP) 발생이문제가되고있다. 경구용생백신투여후 4~3일내에혹은경구용생백신투여자와접촉한경우 4~75일내에급성이완성마비증상이나타나거나발병후 6일내에신경계손상이나타났을때백신관련마비에해당된다. WHO 통계에따르면 3만명중 1명꼴로발생하며영아에서는 5만명중 1명이발생하고있다. 국내에서도급성이완성마비감시체계운영을통해경구용폴리오백신접종후백신관련마비사례가 23년도에 1건이확인된바있다. 사백신은혈액 ( 순환면역 ) 내의생성을유도하여장에있는폴리오바이러스가중추신경계로의진입과증식을막는다. Salk 사백신은 1955년부터 196년대초반까지전세계적으로널리사용되다가그후경구용생백신으로대체되었으나, 1988년에보다효과적인사백신 (enhanced-potency IPV, eipv) 이도입되었다. 미국, 캐나다, 북유럽국가에서는생백신대신 eipv를사용하여야생폴리오바이러스전파를효과적으로차단하는데성공했다. 국내에서는대한소아과학회의예방접종지침에 22년부터 eipv 사용이포함되었으며 25년부터는국가예방접종에서도 eipv가포함되었다. 생백신과사백신은각각장단점이있으며 ( 표 2), 대한소아과학회예방접종지침서에따르면경구용생백신이나주사용사백신중선택하도록하고있다. 예방접종은백신종류에상관없이 3회기본접종 (2, 4개월에 2회, 6~18개월사이에 3회 ) 과 4~6세에 1회추가접종한다. 안정화된경구용백신은 4 에서 1년동안그리고상온에서수주동안보관될수있으며비안정화된백신은사용시까지냉동보관되어야한다. 제 5 장폴리오 735
표 2. 폴리오생백신과사백신의장단점 장점 생백신 효과적인체액성면역유발효과적인점액성면역유발집단면역획득경구투여로접종이간편가격저렴 단점백신과관련된마비발생 (VAPP *, VDPV 위험 ) 면역결핍환아에게사용불가 사백신 안전함 (VAPP, VDPV 위험없음 ) 면역결핍환아도접종가능면역력높음운반혹은보관용이 낮은장면역유발가격이비싸고공급이제한됨집단면역이형성안됨투여방법이주사이기때문에다소불편 * VAPP:vaccine-associated paralytic poliomyelitis VDPV:vaccine-derived poliovirus 실험실진단 1. 검체 1) 검체의종류폴리오바이러스는발병직후인후로배출되나분변을통해배출되는기간이길기때문에분변검체가유용하게진단에사용된다. 질병이진행되는동안급성기와회복기혈청을채취하면항체가시험을통해감염여부를확인할수있다. 2) 검체채취방법및보관환자로부터배출되는바이러스양이일정하지않기때문에바이러스분리율을높이기위해서는발병후 2주이내에적어도 2회의분변검체를 24~48 시간간격으로채취하여배양검사를실시한다. 검체의양은분변은 3~5 g, 뇌척수액은 1~2 ml가필요하며, 운송시에는 4 를유지하고, 보관온도는 -7 가가장좋으나, 1주일이내에검사가가능할때에는 -2 보관도가능하며해동과동결과정을반복하지않는것이좋다. 급성기와회복기혈청을이용한항체에의한진단도가능하나흔히사용되지는않는다. 736 감염병실험실진단제 4 부바이러스질환
3) 검체처리분변의양을측정하여 1배의 PBS를혼합한후 2여분동안강하게진탕한다. 3, rpm 에서 2분동안원심한후상층액을취하여새로운시험관에옮기고최종부피 1% 가되도록클로로포름 (1% 에탄올포함 ) 을첨가한다음진탕한다. 다시 3, rpm에서 2분동안원심분리후상층액을취하여새로운시험관에옮기고검체번호를표시한다. 검체는사용직전까지 -7 에보관하거나단층세포에직접접종한다. 2. 검사방법 폴리오바이러스의실험실진단은세포배양 / 중화시험에의한바이러스분리동정검사 ( 그림 1) 와폴리오바이러스에특이한 primer를사용한 RT-PCR 검사에의해이루어진다. 세포배양과중화시험에의한분리동정검사는바이러스의감염력을확인할수있는방법으로 WHO에서권장하고있는확인검사방법이나동정과정이복잡하고오랜시일이소요되는단점이있다. 분변, 뇌척수액, 인후도찰물, 혈청등 세포접종 RD, L2B 세포바이러스분리 - 양성 음성 중화시험 WHO 중화항체사용바이러스혈청형결정 유전자분석 RT-PCR: 5 NCR VP1 PCR/ Sequencing 염기서열분석 추가검사 폴리오바이러스최종확인동정 그림 1. 세포배양 / 중화시험에의한폴리오바이러스분리동정검사흐름도 제 5 장폴리오 737
폴리오바이러스유전자검색을위해서는폴리오바이러스 VP1에특이한 primer를사용한검색을실시하며세포배양 / 중화시험을통한검사보다민감도가높고신속한진단이가능한장점이있다. 그러나유전자검색방법은바이러스의감염력을확인할수없고분변가검물의경우실제로임상적인증상이나질환과관계없이바이러스가검출되는경우도있다는단점이있다. 국내에서의폴리오바이러스시험결과는반드시 WHO 에보고하며폴리오바이러스형확인을위해아형분석 (intratypic differentiation, ITD) 을실시한다. WHO에서는아형분석을위해 5가지검사 (ELISA, probe hybridization, PCR, PCR-RFLP, monoclonal antibody assay) 를수행하도록권고하고있으며현재국내에서는 PCR-염기서열분석방법을사용하고있다 [9]. 1) 바이러스분리폴리오바이러스는다양한인간유래세포주에서빠른증식이가능하나폴리오바이러스가의심되는모든검체는반드시 L2B와 RD 세포에접종해서세포병변을보이는지확인해야한다. L2B 세포주는폴리오바이러스에대한수용체를가지고있어다른장내바이러스는자라지않고폴리오바이러스만을선택적으로자라게하여수일내에폴리오바이러스의존재를확인할수있다. 바이러스형확인을위해서는중화시험을실시해야폴리오바이러스 1, 2, 3형을구분할수있다. RD 세포주는인간횡문근육종 (human rhabdomyosarcoma) 에서유래된세포주로서폴리오바이러스뿐아니라다른장내바이러스에대해서도높은감수성을보인다. 두가지세포의사용시폴리오바이러스검출을위한특이성과민감도를높일수있으며일반적인접종방법은다음과같다. 1 단층을형성한세포 (monolayered cell) 의증식배양액은검체를접종하기위하여유지배양액으로교환한다. 2 처리한검체의상층액을각각 2개의세포배양시험관에.2 ml씩접종하여 37 에서약간경사진 ( 약 5 ) 위치로배양한다. 접종하지않은세포배양시험관 1개를음성대조로둔다. 3 매일세포병변이나타나는지를현미경으로관찰하며기록한다. 1주간관찰후세포병변이없으면 1차배양액을새로운세포에재접종하는맹목계대 (blind passage) 를통해 2주동안관찰하여세포병변이없으면음성으로처리한다. 2) 바이러스중화시험 감염세포에세포병변효과가관찰된검체에대해서는 WHO/RIVM (Rijksinstituut 738 감염병실험실진단제 4 부바이러스질환
voor Volksgenzonheid en Milieu; National Institute of Public Health and Environment, The Netherlands) 표준항혈청을사용하여바이러스형동정을실시한다. 중화시험에사용하는 WHO/RIVM 표준항혈청은 polio pool (polio 1, 2, 3), coxsackievirus pool (B1~6), echovirus 및 coxsackievirus A9를감별할수있는 7개의 pool (A~G) 로구성되며 polio pool에세포병변효과가중화된경우다시 polio 1, 2, 3형을감별할수있는특이항체를사용하여형을동정한다 ( 그림 2, 표 3). 장내바이러스중화용혈청 (horse/rabbit antiserum-rivm) 과 1-3 ~1-4 TCID 5 / ml정도의바이러스액을 37 에서 1시간~1시간 3분동안중화시킨후, 준비한세포부유액 (2 1 5 cells/ ml ) 을가하고 37 에서 7일이상세포병변효과를관찰한다. 그림 2. 폴리오바이러스중화시험 표 3. 폴리오바이러스중화시험에대한결과해석 Pool P1P2P3 Pool P1P2 Pool P1P3 Pool P2P3 바이러스동정 Poliovirus type 1 Poliovirus type 2 Poliovirus type 3 Mixture of poliovirus types 1 & 2 Mixture of poliovirus types 1 & 3 Mixture of poliovirus types 2 & 3 Mixture of all 3 poliovirus types No poliovirus or mixture of poliovirus with other enterovirus :CPE positive, :no CPE 제 5 장폴리오 739
3) 유전자검색유전자검색법은세포배양을이용한바이러스분리검사방법보다빠른시간내에결과를알수있으며민감도가높기때문에바이러스분리동정검사와병행하여사용한다. 세포배양을통해바이러스형이확인된폴리오바이러스라도백신주인지를확인하기위한아형분석을반드시수행해야하며, 최근에는백신주와비교하여 VP1 유전자부위에서염기서열상동성을보이는백신유래폴리오바이러스의감별을위해반드시 VP1 부위에대한염기서열분석을수행한다. 1 RNA 추출 PBS에부유된분변가검물 2 μl에 Trizol reagent (Gibco BRL) 6 μl를가한후클로로포름 2 μl를첨가하여진탕한후상온에서 1분간정체시킨다. 14, rpm으로 4 에서 15분간원심하여상층액을취하고다시상층액과동량의클로로포름을넣은후진탕한다. 1분간상온에서방치한후 14, rpm으로 4 에서 15분간원심하여상층액에동량의 isopropranol을첨가하고상온에서 3분간핵산을침전시킨다. 14, rpm에서 3분간원심하여침전된바이러스의 RNA를수거하고에탄올세척및건조과정을거친후 DEPC 처리된증류수 2 μl를첨가하여완전히녹인후 cdna의합성을위한주형으로사용한다. 2 Reverse transcription에의한 cdna 합성 Random hexamer와 oligo dt primer나 ENTR primer (5 NCR 부위 ), 222R primer (VP1 부위 ) 를사용하여 cdna를합성하며반응을위해서는 5X buffer 4 μl, RNase inhibitor.5 μl, 2.5 mm dntp 4 μl, 1 pm primer 1 μl, AMV RT (reverse transcriptase) 1 μl, RNA 5 μl를사용하여총부피를 DEPC 처리증류수로 2 μl로조정하여 2 에서 1분, 42 에서 9분간반응시킨후 95 에서 5분간효소를불활성화시킨다 ( 표 4). 3 PCR을이용한유전자증폭 1X buffer 2.5 μl, 2.5 mm dntp 3 μl, 1 pm forward primer 1 μl, 1 pm reverse primer 1 μl, Taq polymerse.25 μl, cdna 2 μl를넣고 DEPC 처리증류수로총부피를 25 μl로맞춘후 95 에서 5분간변성후, 95 1분, 52 1분 3초, 72 1분 3초동안 35회반복하여실시한다. 증폭된산물을전기영동하여확인한다 ( 그림 3, 4). 74 감염병실험실진단제 4 부바이러스질환
4 RT-PCR One-step kit을이용한유전자증폭 RT-PCR One-step kit (CS-EVD1, 국립보건연구원제조 ) 에포함되어있는 RT-PCR one-step mastermix 17 μl에추출한바이러스의 RNA 3 μl를넣은후반응액을간단하게흔들어섞고원심한후 PCR을수행한다. 반응조건은 48 에서 4분간 cdna 합성후, 94 에서 3분간변성후, 94 3초, 52 3초, 72 45초동안 35회반복하여실시한다. 증폭된산물 436 bp를전기영동하여확인한다 ( 그림 3). 표 4. 장내바이러스 5 NCR 부위및 VP1 부위의 PCR 증폭에사용되는 primers 표적유전자 Primer 염기서열 (5 3 ) 산물크기 (bp) 5 NCR ENTF ENTR CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG ATTGTCACCATAAGCAGCCA 436 VP1 292F 222R MIGCIGYIGARACNGG CICCIGGIGGIAYRWACAT 358 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 436 bp 그림 3. RT-PCR 에의한엔테로바이러스 5 NCR 부위검출 M:1 Kb Plus DNA Ladder, lanes 1~1: 엔테로바이러스양성대조 (Polio 1, 2, 3, E6, E13, E3, CA9, CB2, CB3, CB4), lane 11: 음성대조 제 5 장폴리오 741
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 358 bp 그림 4. RT-PCR 에의한엔테로바이러스 VP1 부위검출 M:1 Kb Plus DNA Ladder, lane 1: 음성대조, lanes 2~1: 엔테로바이러스양성대조 (Polio 1, 2, 3, E6, E13, E3, CA9, CB2, CB3, CB4) 5 RFLP PCR 반응후제한효소를처리하고일정한크기의산물로각각의바이러스형을확인하는 RFLP (restriction fragment length polymorphism) 법이있다. 증폭된 PCR 산물을 DdeI, HaeIII, HpaII 등 3개의제한효소로절단시켜 restiction pattern 을확인하는 RFLP 방법을사용하여아형분석을실시한다. 즉 PCR 산물 1 μl, 1X buffer 2 μl, DdeI 1 μl, 증류수 7 μl로 2 μl반응액을 37 에서 1시간 3분간반응시킨후나타나는양상은그림 5와같다. Type 1 Type 2 Type 3 Type 3 그림 5. 제한효소 (DdeⅠ, HaeⅢ, HpaⅡ) 처리후폴리오바이러스의 RFLP 742 감염병실험실진단제 4 부바이러스질환
4) 효소면역측정법이방법은폴리오바이러스가한가지형일경우적용이가능하며두가지혹은세가지바이러스형이혼합되어있을경우에는중화반응을이용하여단일혈청형으로분리하여사용하여야한다. 폴리오바이러스각각의형에대한 IgG 항체로코팅된플레이트나스트립에동정하고자하는폴리오바이러스분리주와반응시켜혈청형을동정한다. RIVM (Rijksinstituut voor Volksgenzonheid en Milieu, 네덜란드국립보건환경연구원 ) 에서 ELISA 키트를공급하고있다 ( 원리는감염병실험실진단일반시험법 8장참조 ). 5) Probe hybridization 폴리오바이러스로부터 RNA를추출하고필터에고정시킨후 digoxygenin-labelled RNA probes (Sabin 1, Sabin 2, Sabin 3, enterovirus group) 와상호반응시키며, 상호결합되는 probe는발색반응을통하여알수있다. 미국 CDC에서키트를공급하고있다. 6) 항체가검사혈청학적검사 ( 중화시험, 보체결합시험, 혈구응집억제시험, 면역형광시험등 ) 로급성기와회복기혈청에서 IgG 항체가가 4배이상증가시진단이가능하나, 마비가나타났을때는이미항체가상승하기때문에실제로는진단에이용하기어렵다. 참고사항급성이완성마비감시체계운영을통하여 15세이하소아에서전형적인급성이완성마비증상을보이는환자는일단폴리오의사환자로판단하여질병관리본부에바이러스검사를의뢰해야한다. 기타자세한사항은 24년도에대한소아과학회와질병관리본부가공동으로발행한폴리오박멸을위한급성이완성마비감시사업안내책자에기술되어있다. 제 5 장폴리오 743
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