(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C07K 7/06 (2006.01) A61K 38/08 (2006.01) (52) CPC 특허분류 C07K 7/06 (2013.01) A61K 38/08 (2013.01) (21) 출원번호 10-2015-0059648 (22) 출원일자 2015 년 04 월 28 일 심사청구일자 (56) 선행기술조사문헌 KR1020070091568 A US06693076 B1* 2015 년 04 월 28 일 * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2016년10월26일 (11) 등록번호 10-1669140 (24) 등록일자 2016년10월19일 (73) 특허권자 ( 주 ) 케어젠 경기도안양시동안구엘에스로 91 번길 46-38 (72) 발명자 정용지 경기도용인시수지구성복 2 로 86, 성동마을 LG 빌리지 1 차 101-1202 김은미 경기도용인시수지구성복 1 로 157 105 동 1103 호 ( 성복동, 버들치마을경남아너스빌 1 차아파트 ) (74) 대리인 양부현 전체청구항수 : 총 14 항심사관 : 김정아 (54) 발명의명칭항비만및항당뇨효능을갖는펩타이드및이의용도 (57) 요약 본발명의펩타이드및펩타이드복합체는지방축적을억제하고, 이미축적된지방을분해하여항비만효과를나타낼뿐만아니라, 혈당을효과적으로감소시켜당뇨병에대하여우수한효과를나타낸다. 본발명의펩타이드및펩타이드복합체는지질생성표지인자인 PPARγ, ACC 및 ap2의발현의감소시키고, 지방분해인자인 phsl, AMPK-α1, CGI-58 및 ATGL의발현을증가시키며지방세포의크기및혈중콜레스테롤수치를감소시킨다. 본발명의펩타이드및펩타이드복합체의우수한활성및안정성은의약및의약외품에매우유리하게적용될수있다. 대표도 - 도 2-1 -
명세서청구범위청구항 1 서열목록제1서열내지서열목록제5서열및서열목록제7서열에기재된아미노산서열로구성된군으로부터선택되는 1종의아미노산서열로이루어진펩타이드. 청구항 2 서열목록제 1 서열, 제 3 서열및제 5 서열의아미노산서열로구성된군으로부터선택되는 1 종의아미노산서열로 이루어진항비만또는항당뇨활성을갖는펩타이드. 청구항 3 제 2 항에있어서, 상기펩타이드는지질생성을억제시키는것을특징으로하는펩타이드. 청구항 4 제 2 항에있어서, 상기펩타이드는 PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma), ACC(Acetyl- CoA carboxylase) 또는 ap2(adipose-specific fatty acid-binding protein 2) 의발현을감소시키는것을특징으로하는펩타이드. 청구항 5 제 2 항에있어서, 상기펩타이드는지방분해를증가시키는것을특징으로하는펩타이드. 청구항 6 제 2 항에있어서, 상기펩타이드는 phsl(phospho-hormone-sensitive lipase), AMPK-α1(AMP-activated protein kinase α1), CGI-58(Comparative Gene Identification-58) 또는 ATGL(Adipose triglyceride lipas e) 의발현을증가시키는것을특징으로하는펩타이드. 청구항 7 서열목록제 7 서열의아미노산서열로이루어진항당뇨활성을갖는펩타이드. 청구항 8 다음의펩타이드조합으로구성된항비만또는항당뇨활성을갖는펩타이드복합체 : (a) 서열목록제1서열로이루어진펩타이드 ; (b) 서열목록제3서열로이루어진펩타이드 ; 및 - 2 -
(c) 서열목록제 7 서열로이루어진펩타이드. 청구항 9 제 8 항에있어서, 상기펩타이드복합체는지방세포의크기를감소시키는것을특징으로하는펩타이드 복합체. 청구항 10 제 8 항에있어서, 상기펩타이드복합체는혈중콜레스테롤을감소시키는것을특징으로하는펩타이드 복합체. 청구항 11 제 2 항내지제 6 항중어느한항의펩타이드를유효성분으로포함하는비만또는당뇨의예방또는치료용 약제학적조성물. 청구항 12 제 8 항내지제 10 항중어느한항의펩타이드복합체를유효성분으로포함하는비만의예방또는치료용약 제학적조성물. 청구항 13 제 7 항의펩타이드를유효성분으로포함하는당뇨의예방또는치료용약제학적조성물. 청구항 14 제 8 항내지제 10 항중어느한항의펩타이드복합체를유효성분으로포함하는당뇨의예방또는치료용약 제학적조성물. 발명의설명 [0001] 기술분야 본발명은항비만및항당뇨효능을갖는펩타이드및이의용도에관한것이다. [0002] [0003] 배경기술최근우리나라에서는경제성장과식생활의서구화로인하여음식물에서얻는지방분의섭취량에증가하였으며운동부족등으로인해비만, 당뇨병, 고지혈증, 고혈압, 동맥경화증및지방간과같은대사성질환이증가되고있는추세이다. 또한, 비만은젊은이들에게있어서마른체형을좋아하는미용적인모습을해칠뿐만아니라비만이지속됨으로써여러가지질환들이취급되고있다. 현재비만을치료하는치료제로는크게중추신경계에작용하여식욕에영향을주는약제와위장관에작용하여흡수를저해하는약물로나누어볼수있다. 중추신경계에작용하는약물로는각각의기전에따라세로토닌 (5-HT) 신경계를저해하는펜플루라민, 덱스펜플루라민등의약물, 노르아드레날린신경계를통한에페드린및카페인등의약물및최근에는세로토닌및노르아드레날린신경계에동시작용하여비만을저해하는시부트라 - 3 -
민등의약물들이시판되고있다. 이외에도, 위 / 장관에작용하여비만을저해하는약물로장관리파제를저해하여지방의흡수를줄여주는비만치료제로허가된오를리스타트등이대표적인약물로사용되고있다. 그러나기존에사용되어온약물중펜플루라민등의약물은부작용으로원발성폐고혈압이나심장판막병변을일으켜최근에사용이금지되었으며, 다른약물들도혈압감소나유산산혈증등의문제점이발생하여심부전, 신장질환등의환자에는사용하지못하는문제점이있다. [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] 당뇨병은인슐린의분비량이부족하거나정상적인기능이이루어지지않는등의대사질환의일종으로 (DeFronzo, 1988), 혈중포도당의농도가높아지는고혈당을특징으로하며, 고혈당으로인하여여러증상및징후를일으키고소변에서포도당을배출하게되는질환이다. 최근비만률, 특히복부비만의증가로인하여당뇨의발생률이폭발적으로증가하고있는추세이다. 당뇨환자의수는 2000년전세계적으로 1억 7천만명으로평가되었고, 2030년에 3억 7천만명에이를것으로예상되었으나, 최근분석에의하면 2008년에이미전세계적으로약 3억 5천만명에이르렀다고보고되어 (Danaei et al.. 2011), 예상보다훨씬심각한수준이다. 이형당뇨환자의약 80% 이상이비만인것에비해비만환자의단지 10% 미만이당뇨로보고되어 (Harris et al.. 1987) 있다. 이런당뇨와비만의연관성은아디포카인들 (adipokine) 과유리지방산 (free fatty acid) 의불규칙적인분비로인하여지방산이베타세포나신장, 간, 심장등인슐린민감성조직내에쌓여지방독성 (lipotoxicity) 을나타내기때문이다. 만성적인고혈당상태에적절한치료가되지않으면, 신체에서여러병적증상이수반되는데, 대표적인것이망막병증, 신기능장애, 신경병증, 혈관장애로인한합병증을예방하기위해서는효과적인혈당관리가필수적이다. 현재혈당을조절하는방법으로는생활습관고정 ( 식이요법, 운동요법 ) 및약물요법등이사용되고있다. 하지만식이요법이나운동요법은엄격한관리및실시가곤란하며, 그효과에있어서도한계가있다. 따라서대부분의당뇨환자들은생활습관의교정과더불어인슐린, 인슐린분비촉진제, 인슐린감수성개선제, 그리고혈당강하제등의약물에혈당조절에의존하고있다. 재조합방법에의해생산되고있는인슐린은일형당뇨환자및혈당조절이되지않는이형환자에필수적인약물로혈당조절에있어서유리하지만, 주사침에대한거부감, 투여방법의어려움, 저혈당위험, 그리고체중증가등의단점을가지고있다. 인슐린분비촉진제의일종인메글리티나이드계는약효가매우빠른제제로식전에복용하며, 노보넘 ( 레파글리나이드 ), 파스틱 ( 나테글리나이드 ), 글루패스트 ( 미티글리나이드 ) 등이있다. 인슐린감수성개선제는단독으로복용시저혈당이거의없는것이특징이며, 바이구아나이드 (biguanide) 계열약물인메트포르민 (metformin) 과치아졸리딘다이온 (thiazolidinedione) 계열의아반이다 ( 로지글리타존 ), 액토스 ( 피오글리타존 ) 등이있다. 최근개발되고있는약물로는인슐린분비를촉진시키는호르몬인글루카곤유사펩타이드-1(Glucagon-like peptide-1) 의작용을이용하여개발된 GLP-1 아고니스트 (agonist) 가있으며, 엑센나타이드 (exenatide) 와빅토자 (liraglutide) 가여기에해당된다. 또한 GLP-1을신속하게불활성화시키는효소인 DPP-4(Dipeptidyl peptidase-4) 의작용을억제하는 DPP-4 억제제 (Inhibitor) 도최근개발된신약이며, 자누비아 ( 성분명 : 시타글립틴 sitagliptin) 가대표적이다. 그러나이들약제는간독성, 위장장애, 심혈관계질환및발암성등의부작용들이보고되고있으며, 연간치료비용또한높아당뇨병의치료에있어서장애가되고있다. 실제로전당뇨병 (pre-diabetes) 및당뇨병관련비용은 2007년을기준으로미국에서만약 200조원에육박하며 (Dall et al., 2010), 비만관련비용또한 2008년기준으로미국에서만 150조원에육박한다 (Finkelstein et al., 2009). 따라서체중을감소시키고, 혈당을효과적으로낮추어서당뇨병및비만성당뇨병의치료에동시에사용할수있으면서부작용이적은약제의개발은시급한실정이다. 우선, 비만치료를위한보다개선된방법을찾기위해여최근에너지대사를조절하는기전에관심을갖게되고, 이쪽계열의화합물이보다높은안전성 ( 낮은독성 ) 을가져야한다는전제하에인간이고지방식이를섭취하였을때지방으로축적되는시그널과지방축적에영향을끼치는단백질들의연구를진행하였으며, 이런지방축적의단백질의발현을억제하고, 이미축적된지방을분해시키기위한시그널연구및관여단백질의연구를통해지방분해를촉진하는연구및펩타이드를개발하게되었다. 또한본발명의펩타이드들은당뇨병및비만으로유도되는당뇨병에탁월한효능을보인다. 고지방식이로인해유발되는지방축적, 간이나, 근육등의지방축적으로인해나타나는인슐린의시그널억제, 이로인해유발되는인슐린의내성이당뇨병의원인이되는데, 본발명의펩타이드각각, 그리고복합체는이런당뇨병및비만성당뇨병치료에효과를보인다. - 4 -
[0011] 본명세서전체에걸쳐다수의논문및특허문헌이참조되고그인용이표시되어있다. 인용된논문및특허문헌의개시내용은그전체로서본명세서에참조로삽입되어본발명이속하는기술분야의수준및본발명의내용이보다명확하게설명된다. 발명의내용 [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] 해결하려는과제본발명자들은생물학적으로유효한활성을갖는다수의우수한펩타이드를개발하고자노력한결과, 서열목록제1서열내지서열목록제7서열의아미노산서열을갖는펩타이드가고지방식이에의해유도된지방축적을억제하고, 이미축적된지방의분해하여항비만효과를나타낼뿐만아니라, 당뇨병및비만성당뇨병, 또는당뇨합병증에대하여우수한효과를나타낸다는것을규명함으로써본발명을완성하게되었다. 따라서, 본발명의목적은서열목록제1서열내지서열목록제7서열에기재된아미노산서열로이루어진펩타이드를제공하는데있다. 본발명의다른목적은항비만또는항당뇨활성을갖는펩타이드를제공하는데있다. 본발명의다른목적은항비만또는항당뇨활성을갖는펩타이드복합체를제공하는데있다. 본발명의다른목적은비만의예방또는치료용약제학적조성물을제공하는데있다. 본발명의다른목적은당뇨의예방또는치료용약제학적조성물을제공하는데있다. [0018] 본발명의다른목적및이점은하기의발명의상세한설명, 청구범위및도면에의해보다명확하게된다. [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] 과제의해결수단본발명의일양태에따르면, 본발명은서열목록제1서열내지서열목록제7서열에기재된아미노산서열로구성된군으로부터선택되는 1종의아미노산서열로이루어진펩타이드를제공한다. 본발명의다른양태에따르면, 본발명은서열목록제1서열내지서열목록제7서열의아미노산서열로구성된군으로부터선택되는 1종의아미노산서열로이루어진항비만및항당뇨활성을갖는펩타이드를제공한다. 본발명의다른양태에따르면, 본발명은다음의펩타이드조합으로구성된항비만또는항당뇨활성을갖는펩타이드복합체를제공한다 : (a) 서열목록제1서열로이루어진펩타이드 ; (b) 서열목록제2서열또는서열목록제3서열로이루어진펩타이드 ; 및 (c) 서열목록제6서열또는서열목록제7서열로이루어진펩타이드. [0025] [0026] [0027] 본발명자들은생물학적으로유효한활성을갖는다수의우수한펩타이드를개발하고자노력한결과, 서열목록제1서열내지서열목록제7서열의아미노산서열을갖는펩타이드가고지방식이에의해유도된지방축적을억제하고, 이미축적된지방을분해하여항비만효과를나타낼뿐만아니라, 당뇨병및비만성당뇨병, 또는당뇨합병증에대하여우수한효과를나타낸다는것을규명하였다. 본명세서에서사용되는용어 펩타이드 는펩타이드결합에의해아미노산잔기들이서로결합되어형성된선형의분자를의미한다. 본발명의펩타이드는당업계에공지된화학적합성방법, 특히고상합성기술 (solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는액상합성기술 (US 등록특허제5,516,891호 ) 에따라제조될수있다. 본발명의펩타이드는아미노산서열의일부부위를선정하고그활성을증가시키기위해 N-말단또는 C-말단에 - 5 -
변형을유도할수있다. 반감기를가질수있다. 이러한변형을통해본발명의펩타이드는생체내투여시의반감기를증가시킨높은 [0028] 또한, 본발명의펩타이드의 C- 말단은히드록시기 (-OH), 아미노기 (-NH 2 ), 아자이드 (-NHNH 2 ) 등으로변형되어있 으며, 펩타이드의 N- 말단은아세틸기, 플루오레닐메톡시카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테 아릴기및폴리에틸렌글리콜 (PEG) 로구성된군으로부터선택되는보호기가결합될수있다. [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] 상술한아미노산의변형은본발명의펩타이드의안정성을크게개선하는작용을한다. 본명세서에서용어 안정성 은인비보안정성뿐만아니라, 저장안정성 ( 예컨대, 상온저장안정성 ) 도의미한다. 상술한보호기는생체내의단백질절단효소의공격으로부터본발명의펩타이드를보호하는작용을한다. 본발명의일구현예에따르면, 본발명의펩타이드는고지방식이에의해유도된유도하였을때지방축적을억제하고, 이미축적된지방의분해하는효과를나타내며, 지질생성표지인자인 PPARγ, ACC 및 ap2의발현의감소시키고, 지방분해인자인 phsl, AMPK-α1, CGI-58 및 ATGL의발현을증가시키며지방세포의크기및혈중콜레스테롤수치를감소시킨다. 또한, 본발명의펩타이드는혈당을효과적으로감소시킨다. 이러한결과는본발명의펩타이드가비만, 당뇨병및비만성당뇨병치료에매우우수한효능을가진다는것을의미한다. 본발명의펩타이드는서열목록제1서열내지서열목록제7서열의아미노산서열로표시되는각펩타이드뿐만아니라이들의복합체도우수한항비만및항당뇨활성을나타낸다. 본발명에따르면, 서열목록제3서열, 서열목록제5서열및서열목록제7서열로이루어진펩타이드는각각서열목록제2서열, 서열목록제4서열및서열목록제6서열로이루어진펩타이드의 Cys가 Ser으로치환된펩타이드로서이들두펩타이드의항비만및항당뇨활성의거의동일하다. 본발명의일구현예에따르면, 본발명의항비만또는항당뇨활성을갖는펩타이드복합체는서열목록제1서열로이루어진펩타이드 ; 서열목록제2서열또는서열목록제3서열로이루어진펩타이드 ; 및서열목록제6서열또는서열목록제7서열로이루어진펩타이드의조합으로구성된다. 본발명의다른구현예에따르면, 본발명의펩타이드복합체는서열목록제1서열, 서열목록제3서열및서열목록제7서열의조합으로구성된다. 본발명의또다른양태에따르면, 본발명은본발명의펩타이드또는펩타이드복합체를유효성분으로포함하는비만의예방또는치료용약제학적조성물을제공한다. 본발명의펩타이드또는펩타이드복합체는지방생성을억제하고, 지질을분해하는기능이탁월하여비만의예방또는치료에이용될수있다. 본발명의또다른양태에따르면, 본발명은본발명의펩타이드또는펩타이드복합체를유효성분으로포함하는당뇨의예방또는치료용약제학적조성물을제공한다. 본발명의펩타이드또는펩타이드복합체는당뇨병동물모델에서증가된혈당을효과적으로감소시키는효능을나타내어당뇨의예방또는치료에이용될수있다. 본발명의바람직한구현예에따르면, 본발명의조성물은 (a) 상술한본발명의펩타이드또는펩타이드복합체의약제학적유효량 ; 및 (b) 약제학적으로허용되는담체를포함하는약제학적조성물이다. 본명세서에서용어 약제학적유효량 은상술한펩타이드의효능또는활성을달성하는데충분한양을의미한다. 본발명의약제학적조성물에포함되는약제학적으로허용되는담체는제제시에통상적으로이용되는것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산마그네슘및미네랄오일등을포함하나, 이에한정되는것은아니다. 본발명의약제학적조성물은상기성분들이외에윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제등을추가로포함할수있다. 적합한약제학적으로허용되는담체및제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995) 에상세히기재되어있다. 본발명의약제학적조성물은경구또는비경구, 바람직하게는비경구로투여할수있고, 비경구투여인경우에는근육주입, 정맥내주입, 피하주입, 복강주입, 국소투여, 경피투여등으로투여할수있다. - 6 -
[0043] [0044] 본발명의약제학적조성물의적합한투여량은제제화방법, 투여방식, 환자의연령, 체중, 성, 병적상태, 음식, 투여시간, 투여경로, 배설속도및반응감응성과같은요인들에의해다양하게처방될수있다. 한편, 본발명의약제학적조성물의바람직한투여량은 1일당 0.0001-1000 μg이다. 본발명의약제학적조성물은당해발명이속하는기술분야에서통상의지식을가진자가용이하게실시할수있는방법에따라, 약제학적으로허용되는담체및 / 또는부형제를이용하여제제화함으로써단위용량형태로제조되거나또는다용량용기내에내입시켜제조될수있다. 이때제형은오일또는수성매질중의용액, 현탁액또는유화액형태이거나엑스제, 분말제, 과립제, 정제또는캅셀제형태일수도있으며, 분산제또는안정화제를추가적으로포함할수있다. [0045] [0046] [0047] [0048] 발명의효과본발명의특징및이점을요약하면다음과같다 : (i) 본발명의펩타이드및펩타이드복합체는지방축적을억제하고, 이미축적된지방을분해하여항비만효과를나타낼뿐만아니라, 혈당을효과적으로감소시켜당뇨병에대하여우수한효과를나타낸다. (ⅱ) 본발명의펩타이드및펩타이드복합체는지질생성표지인자인 PPARγ, ACC 및 ap2의발현의감소시키고, 지방분해인자인 phsl, AMPK-α1, CGI-58 및 ATGL의발현을증가시키며지방세포의크기및혈중콜레스테롤수치를감소시킨다. (ⅲ) 본발명의펩타이드및펩타이드복합체의우수한활성및안정성은의약및의약외품에매우유리하게적용될수있다. [0049] 도면의간단한설명 도 1 은본발명의펩타이드를처리하였을때축적된지방을 Oil red O 염색을통해확인한결과이다. 열목록제 1 서열의펩타이드, (b) 서열목록제 3 서열의펩타이드, (c) 서열목록제 5 서열의펩타이드. (a) 서 도 2는본발명의펩타이드복합체를농도별로처리하였을때축적된지방을확인하기위해 Oil red O 염색을통해확인한결과이다. 도 3은본발명의펩타이드를처리하였을때지방생성에관여하는유전자인 ap2 의발현양을측정한결과이다. (a) 서열목록제1서열의펩타이드, (b) 서열목록제3서열의펩타이드, (c) 서열목록제5서열의펩타이드. 도 4는본발명의펩타이드복합체를농도별로처리하였을때지질합성시중요한유전자인 PPARγ, ACC, ap2 유전자의발현양을측정한결과이다. 도 5는본발명의펩타이드복합체를농도별로처리하였을때지질합성시중요한단백질인 PPARγ, phospho- HSL 단백질의발현양을측정한결과이다. 도 6은본발명의펩타이드및펩타이드복합체를처리하였을때축적된지방을분해하는과정에관여하는유전자인 AMPK-α1과 CGI58의발현양을측정한결과이다. (a) 서열목록제1서열의펩타이드, (b) 서열목록제3서열의펩타이드, (c) 서열목록제5서열의펩타이드, (d) 서열목록제1서열, 서열목록제3서열및서열목록제7서열의아미노산서열로표시되는펩타이드의복합체. 도 7은본발명의펩타이드복합체를농도별로처리하였을때축적된지방을분해하는과정에관여하는단백질인 ATGL의발현양을측정한결과이다. 도 8은본발명의펩타이드를처리하였을때축적된지방을분해하는과정에관여하는단백질인 Phospho-HSL의발현양을면역염색을이용하여측정한결과이다. (a) 서열목록제1서열의펩타이드, (b) 서열목록제3서열의펩타이드, (c) 서열목록제5서열의펩타이드, (d) 서열목록제1서열, 서열목록제3서열및서열목록제7서열의아미노산서열로표시되는펩타이드의복합체. 도 9는본발명의펩타이드복합체를농도별로처리하였을때글라이세롤의생성양을측정한결과이다. 도 10a는본발명의펩타이드복합체를비만생쥐실험모델에농도별로처리한후분해되는지방조직을측정한 - 7 -
결과이다. 도 10b는본발명의펩타이드복합체를비만생쥐실험모델에처리한후분해되는지방조직의크기및수치를측정한결과이다. 도 11은본발명의펩타이드복합체를처리하였을때축적된지방을분해하는과정에관여하는단백질인 Phospho-HSL의발현양을면역염색을이용하여측정한결과이다. 도 12는본발명의펩타이드복합체를처리하였을때비만생쥐에서몸무게변화 (a) 및사료섭취변화 (b) 를측정한결과이다. 도 13은본발명의펩타이드복합체를처리하였을때비만생쥐의모습을측정한결과이다. 도 14는실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에기름진사료를섭취시켜비만생쥐모델을제작하여본발명의펩타이드복합체를처리한후마이크로시티촬영을통해지방의분포를측정한결과이다. 도 15는실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에기름진사료를섭취시켜비만생쥐모델을제작하여본발명의펩타이드복합체를처리한후지방세포조직을채취하여관찰한결과이다. 도 16a는실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에기름진사료를섭취시켜비만생쥐모델을제작하여본발명의펩타이드복합체를처리한후지방세포조직을채취하여지방세포모양을관찰한결과이다. 도 16b는실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에기름진사료를섭취시켜비만생쥐모델을제작하여본발명의펩타이드복합체를처리한후지방세포조직을채취하여지방세포크기를관찰한결과이다도 17은실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에기름진사료를섭취시켜비만생쥐모델을제작하여본발명의펩타이드복합체를처리한후지방세포조직을채취하여지방세포내의지방분해에작용하는단백질인 phospho- HSL의발현양을관찰한결과이다도 18은실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에기름진사료를섭취시켜비만생쥐모델을제작하여본발명의펩타이드복합체를처리한후혈액을채취하여콜레스테롤의양을측정한결과이다. 도 19는실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에기름진사료를섭취시켜비만생쥐모델을제작하여본발명의펩타이드복합체를처리한후혈액을채취하여혈당을측정한결과이다. 도 20은당뇨가유발된 DBDB 생쥐모델에본발명의펩타이드복합체를처리한후혈액을채취하여혈당의변화를측정한결과이다. 도 21은당뇨가유발된 DBDB 생쥐모델에본발명의펩타이드복합체를처리한후혈액을채취하여콜레스테롤의변화를측정한결과이다. 도 22는당뇨가유발된 DBDB 생쥐모델에본발명의펩타이드를처리한후혈액을채취하여혈당의변화를측정한결과이다. (a) 서열목록제1서열의펩타이드, (b) 서열목록제3서열의펩타이드, (c) 서열목록제5서열의펩타이드. 도 23은본발명의서열목록제7서열의펩타이드를처리하였을때 IGF-1과인슐린의발현양을측정한결과이다. 도 24는당뇨가유발된 DBDB 생쥐모델에본발명의서열목록제7서열의펩타이드를처리한후혈액을채취하여혈당의변화를측정한결과이다. 도 25a-d는혈당이높은당뇨병환자에본발명의펩타이드복합체를처리한후혈액을채취하여혈당의변화를측정한결과이다. [0050] 발명을실시하기위한구체적인내용이하, 실시예를통하여본발명을더욱상세히설명하고자한다. 이들실시예는오로지본발명을보다구체적으로설명하기위한것으로, 본발명의요지에따라본발명의범위가이들실시예에의해제한되지않는다는것은당업계에서통상의지식을가진자에있어서자명할것이다. [0051] [0052] [0053] 실시예 합성예 1: 펩타이드합성 클로로트리틸클로라이드레진 (Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) - 8 -
700 mg을반응용기에넣고메틸렌클로라이드 (MC) 10 ml를가하여 3분간교반하였다. 용액을제거하고디메틸 포름아마이드 (DMF) 10 ml를넣어 3분간교반한후다시용매를제거하였다. 반응기에 10 ml의디클로로메탄 용액을넣고 Fmoc-Asn(Trt)-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole 및디이소프로필에틸아민 (DIEA) 400 mmole을넣은 후교반하여잘녹이고, 1시간동안교반하면서반응시켰다. 반응후세척하고메탄올과 DIEA(2:1) 를 DCM(dichloromethane) 에녹여 10분간반응시키고과량의 DCM/DMF(1:1) 로세척하였다. 용액을제거하고디메 틸포름아마이드 (DMF) 를 10 ml 넣어 3분간교반한후다시용매를제거하였다. 탈보호용액 (20% 의피페리딘 (Piperidine)/DMF) 10 ml를반응용기에넣고 10분간상온에서교반한후용액을제거하였다. 동량의탈보호 용액을넣고다시 10분간반응을유지한후용액을제거하고각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회세척 하여 Asn-CTL 레진 (Resin) 을제조하였다. 새로운반응기에 10 ml의 DMF 용액을넣고 Fmoc-Arg(Pbf)- OH(Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을넣은후교반하여잘녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를분획으로 2번에걸쳐넣은후모든고체가녹을때까지최소한 5분간교반하였다. 녹인아 미노산혼합용액을탈보호된레진이있는반응용기에넣고 1시간동안상온에서교반하면서반응시켰다. 반응 액을제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩교반한후제거하였다. 반응레진을소량취하여카이저테스트 (Nihydrin Test) 를이용하여반응정도를점검하였다. 탈보호용액으로상기와같이동일하게 2번탈보호반 응시켜 Arg-Asn-CTL 레진을제조하였다. DMF와 MC로충분히세척하고다시한번카이저테스트를수행한다 음상기와동일하게아래의아미노산부착실험을수행하였다. 선정된아미노산서열에의거하여 Fmoc- Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, 및 Fmoc-Leu-OH 순으로연쇄반응을시켰다. Fmoc-보호기를탈보호용액으로 10분씩 2번반응시킨후잘세척하여제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt를넣어한시간동안아세틸화를수 행한뒤제조된펩티딜레진을 DMF, MC 및메탄올로각각 3번을세척하고, 질소공기를천천히흘려건조한후, P 2 O 5 하에서진공으로감압하여완전히건조한뒤탈루용액 [ 트리플로로화초산 (Trifluroacetic acid) 81.5%, 증 류수 5%, 티오아니졸 (Thioanisole) 5%, 페놀 (Phenol) 5%, EDT 2.5% 및 TIS 1%] 30 ml을넣은후상온에서가끔 흔들어주며 2시간반응을유지하였다. 필터링을하여레진을거르고, 레진을소량의 TFA 용액으로세척한후 모액과합하였다. 감압을이용하여전체볼륨이절반정도남도록증류하고 50 ml의차가운에테르를가하여 침전을유도한후, 원심분리하여침전을모으고, 2번더차가운에테르로세척하였다. 모액을제거하고질소 하에서충분히건조하여정제전 NH 2 -Leu-Lys-Thr-Arg-Asn-COOH 펩타이드 1을 0.85 g 합성 ( 수율 : 92%) 하였다, 서열목록 2는 NH 2 -Lys-Gly-Ala-Cys(Ser)-Thr-Gly-Trp-Met-Ala-COOH로 0.78 g 합성하였으며 ( 수율 : 82%), 서열목 록 3은 NH 2 -Ala-Cys(Ser)Thr-Leu-Pro-His-Pro-Trp-Phe-Cys(Ser)-COOH 을 0.92 g 합성하였다 ( 수율 : 85%). 서 열목록 4는 NH 2 -Cys(Ser)-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys(Ser)-COOH 을 0.76 g 합성하였다 ( 수율 : 88%) 분자량측정기를이용하여측정시서열목록 1 펩타이드의분자량 630.7 ( 이론값 : 630.7), 서열목록 2 펩타이드 의분자량 924.5( 이론값 : 924.1), 서열목록 3펩타이드의분자량 1236 ( 이론값 : 1236.5), 서열목록 4 펩타이드 의분자량 1301.5( 이론값 : 1301.5를얻을수있었다. [0054] [0055] 펩타이드 아미노산서열 분석값 ( 질량분석기 ) 분석치 이론치 서열 1 LKTRN 630.7 630.7 서열 2 KGACTGWMA 924.5 924.1(908.0) 서열 3 KGASTGWMA 서열 4 ACYLPHPWFC 1236 1236.5 (1269.4) 서열 5 ASYLPHPWFS 서열 6 CDLRRLEMYC 1301.5 1301.5 서열 7 SDLRRLEMYS 표 1 [0056] 한편, 서열목록제 1 서열, 서열목록제 3 서열및서열목록제 7 서열의펩타이드를동량섞어펩타이드복합체를만 들고이에대한효능을평가하였다. [0057] 실시예 1: 지질생성억제활성평가 - 9 -
[0058] [0059] [0060] [0061] 1-1. 지방전구세포를이용한지질축적억제 (Oil red O staining) 지방전구세포 (pre-adipocyte) 인 3T3-L1 세포를 Confluent 상태까지배양한후 10 μg/ml 인슐린, 0.1 μm 덱사메타손및 0.5 μm IBMX가포함된분화배지로교환및펩타이드를농도별로처리하여 2일간배양하였으며, 그후매 2일마다 10 μg/ml 인슐린이포함된배지로교환하였으며, 10일간분화를유도한후세포내방울 (droplet) 생성을확인하기위하여 Oil Red O 염색을실시하였다. 준비된 3T3-L1 지방전구세포를 PBS로세척한후 3.7% 포르말린으로 1시간동안고정하고 60% 이소프로파놀을이용하여세척한다음 Oil Red O 용액을처리하여실온에서 20분간염색하였다. 염색후 Oil Red O 용액을제거하고증류수로 3회세척한다음염색된세포를위상차현미경을이용하여관찰하였다. 또한정량적분석을위하여 100% 이소프로파놀을이용하여지방을추출한후 96웰플레이트에 200 μl씩옮겨서 ELISA 리더로 500 nm에서흡광도를측정하였다. 실험결과, 서열목록제1서열, 제3서열및제5서열의펩타이드를처리하였을때세포내지방축적정도가감소하는것을 Oil Red O 염색을통해확인할수있었다 ( 도 1a-c). 또한, 서열목록제1서열, 제3서열및제7서열의펩타이드복합체를농도별로처리하였을때세포내지방축적정도가감소하는것을확인할수있었다 ( 도 2). [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] 1-2. 지질생성에관여하는유전자들의발현억제 3X10 5 세포 / 웰의세포밀도로 6웰플레이트에 3T3-L1( 지방전구세포 ) 를시딩하였다. 24시간배양한후펩타이드를농도별 (0.1, 1, 10 μg/ml) 로처리하고 14일간 37 배양기에서배양하였다. 배양완료된세포를회수한후 RNA 추출용액 (Easy Blue, Intron) 을처리하여 RNA를준비한후 RT 프리믹스 (Intron) 를사용하여 cdna를합성하였다. 각표지인자 (PPARγ, ACC, ap2) 에대한프라이머와 PCR 프리믹스 (Intron) 를사용하여 PCR 진행하였다. 지질생성표지인자 PCR에이용된타겟-특이적프라이머서열은다음과같다 : PPARγ 정방향프라이머서열, 5 -TTTTCAAGGGTGCCAGTTTC-3 및 PPARγ 역방향프라이머, 5 -AATCCTTGGCCCTCTGAGAT-3 ( 어닐링온도, 60 ); ACC 정방향프라이머서열, 5 -ACCTTACTGCCATCCCATGTGCTA-3 및 ACC 역방향프라이머, 5 -GTGCCTGATGATCGCACGAACAAA-3 ( 어닐링온도, 60 ); ap2 정방향프라이머서열, 5 -CATCAGCGTAAATGGGGATT- 3 및 ap2 역방향프라이머, 5 -ACACATTCCACCACCAGCTT-3 ( 어닐링온도, 60 ). 1% 아가로오스겔에 PCR 산물을 5 μl씩로딩하여전기영동한후 Gel-Doc에서밴드를확인하였다. 마우스골모세포주 3T3-L1에서열목록제1서열, 제3서열또는제5서열의펩타이드를처리하고 3일간배양한결과, 지질생성표지인자인 ap2의발현이감소되는것을관찰할수있었다 ( 도 3a-c). 마우스골모세포주 3T3-L1에서열목록제1서열, 서열목록제3서열및서열목록제7서열의펩타이드복합체를 0.1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml의농도로처리하고 3일간배양한결과, 지질생성표지인자인 PPARγ, ACC, ap2의발현이양성대조군 TNFα 100 ng/ml 처리군과펩타이드복합체처리군에서모두감소되는것을관찰할수있었다 ( 도 4). [0068] [0069] [0070] 1-3. 지방전구세포를이용한지질생성및분해유도단백질발현관찰 3X10 5 세포 / 웰의세포밀도로 6웰플레이트에 3T3-L1( 지방전구세포 ) 를시딩하였다. 24시간배양한후펩타이드복합체를농도별 (0.1, 1, 10 μg/ml) 로처리하고 14일간 37 배양기에서배양하였다. 세포용해버퍼를처리하여용해물을확보후단백질정량하고지방생성인자인항-PPARγ 항체 (Santa Cruz Biotechnology, US A) 와지방분해인자인항-pHSL 항체 (Santa Cruz Biotechnology, USA) 를이용하여웨스턴블롯팅을수행하였다. 지방생성표지인자인 PPARγ 단백질의발현이펩타이드복합체를농도별로처리하였을때농도의존적으로모두감소되는것을관찰할수있었으며, 지방분해표지인자인 phsl 단백질의발현양을관찰하였을때펩타이드복합체처리군에서모두증가되는것을관찰할수있었다 ( 도 5). [0071] 실시예 2: 지질분해활성평가 - 10 -
[0072] [0073] [0074] [0075] [0076] 2-1. 지질분해에관여하는유전자들의발현증가 3X10 5 세포 / 웰의세포밀도로 6웰플레이트에 3T3-L1( 지방전구세포 ) 을시딩하였다. 24시간배양한후펩타이드를농도별 (0.1, 1, 10 μg/ml) 로처리하고 14일간 37 배양기에서배양하였다 ( 양성대조군 : 100 ng/ml TNFα (SIGMA)). 배양완료된세포를회수한후 RNA 추출용액 (Easy Blue, Intron) 을처리하여 RNA를준비한후 RT 프리믹스 (Intron) 를사용하여 cdna를합성하였다. 각표지인자 (AMPK-α1, CGI58) 에대한프라이머와 PCR 프리믹스 (Intron) 를사용하여 PCR 진행하였다. 지질생성표지인자 PCR에이용된타겟-특이적프라이머서열은다음과같다 : AMPK-α1 정방향프라이머서열, 5 -TGACCGGACATAAAGTGGCTGTGA-3 및 AMPK-α1 역방향프라이머, 5 -TGATGATGTGAGGGTGCCTGAACA-3 ( 어닐링온도, 60 ); CGI58 정방향프라이머서열, 5 -TGTGCAGGACTCTTACTTGGCAGT-3 및 CGI58 역방향프라이머, 5 -GTTTCTTTGGGCAGACCGGTTTCT-3 ( 어닐링온도, 60 ). 1% 아가로오스겔에 PCR 산물을 5 μl씩로딩하여전기영동한후 Gel-Doc에서밴드를확인하였다. 지방전구세포 (3T3-L1) 에펩타이드를처리하고배양한결과, 지질분해표지인자인 AMPK-α1과 CGI-58의발현이각펩타이드처리군에서모두증가되는것을관찰할수있었다 ( 도 6a-c). 또한, 펩타이드복합체를처리한경우, AMPK-α1 과 CGI-58의발현이농도의존적으로증가하는것을확인할수있었고양성대조군인 TNFα 100 ng/ml 처리군과비교하였을때에도지방분해인자들의발현증가가높게나타나는것을관찰할수있었다 ( 도 6d). [0077] [0078] [0079] 2-2. 지방전구세포를이용한지질분해유도단백질발현관찰 3X10 5 세포 / 웰의세포밀도로 6웰플레이트에 3T3-L1( 지방전구세포 ) 를시딩하였다. 24시간배양한후펩타이드를농도별 (0.1, 1, 10 μg/ml) 로처리하고 14일간 37 배양기에서배양하였다 ( 양성대조군 : 100 ng/ml TNFα (SIGMA)). 세포용해버퍼를처리하여용해물을확보후단백질정량하고지방분해인자인항-ATGL 항체 (Santa Cruz Biotechnology, USA) 를이용하여웨스턴블롯팅을수행하였다. 지방분해인자인 ATGL의발현이펩타이드복합체에의해증가하는것을확인할수있었다 ( 도 7). [0080] [0081] [0082] 2-3. 지방전구세포를이용한지질분해유도단백질발현형광현미경관찰 3X10 5 세포 / 웰의세포밀도로 6웰플레이트에 3T3-L1( 지방전구세포 ) 를시딩하였다. 24시간배양한후각펩타이드또는펩타이드복합체 (1 μg/ml) 를처리하고 14일간 37 배양기에서배양하였다 ( 양성대조군 : 100 ng/ml TNFα(SIGMA)). 배양이완료된세포를 70% 에탄올을이용하여세포를고정한후항-phospho-HSL 항체 (Santa Cruz Biotechnology, USA) 를이용하여세포면역염색법을통해지방분해유도인자인 phospho-hsl의세포내발현을관찰하였다. 실험결과, 각펩타이드 ( 도 8a-c) 및펩타이드복합체 ( 도 8d) 에의해지방분해유도인자인 phospho-hsl의발현이증가되는것을확인할수있었다. [0083] [0084] [0085] 2-4. 지방분해산물인글라이세롤의양측정비만유도생쥐동물의복부에서지방조직을채취후 24웰배양플레이트에웰당 100 mg씩지방조직을넣은후배양배지 (1 ml Krebs-Ringer buffer containing 25 mm HEPES, 5.5 mm glucose, and 2 % (w/v) bovine serum albumin) 에배양하였다. 배양시펩타이드복합체를 0.1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml의농도로처리하였고, 양성대조군으로 TNFα 100 ng/ml을처리하여, 48시간동안배양한후지방이분해되면서나온글라이세롤의양을측정하였다. 실험결과, 펩타이드복합체를농도별로처리하였을때지방이분해되면서나온글라이세롤의양이펩타이드복합체처리농도의존적으로증가하는것을관찰할수있었다. 양성대조군인 TNFα 처리군에비해많은양의글라이세롤양이검출되는것을확인하였다 ( 도 9). - 11 -
[0086] [0087] [0088] 2-5. 비만마우스분리지방조직에대한분해효과확인지방조직은색깔에따라백색지방 (White Fat), 갈색지방 (Brown Fat) 으로나뉘고, 부위에따라피하지방, 복막지방, 장간막지방 ( 내장지방 ) 및부고환지방으로나뉜다. 해부후각지방을적출하여백색지방을분리후각 100 mg/ 웰의무게로 24웰플레이트에복합제농도별처리후배양배지 (1 ml Krebs-Ringer buffer containing 25 mm HEPES, 5.5 mm glucose, and 2 % (w/v) bovine serum albumin) 에서 72시간배양후조직을절편하여헤마톡실린및에오신으로염색하고 200배에서현미경 (TS100, Nicon) 관찰을하여지방세포의크기를비교하였다. 실험결과, 펩타이드복합체를농도별로처리하였을때대조군에비해지방세포의크기를비교한결과, 지방세포의크기가작아지는것을확인하였다 ( 도 10a). 또한염색후지방세포의크기를측정하기위해프로그램을사용하여지방세포의크기를측정한결과펩타이드복합체처리군에서뚜렷한세포막구획을가지는지방조직내의세포크기의감소가관찰되었다 ( 도 10b). [0089] [0090] [0091] 2-6. 지방조직에대한지방분해인자관찰비만유도생쥐동물의복부에서지방조직을채취후 24웰배양플레이트에웰당 100 mg 씩지방조직을넣은후배양배지 (1 ml Krebs-Ringer buffer containing 25 mm HEPES, 5.5 mm glucose, and 2 % (w/v) bovine serum albumin) 에배양하였다. 배양시펩타이드복합체를처리하였고, 양성대조군으로 TNFα 100 ng/ml을처리하여, 48시간동안배양한후지방분해인자인 phospho-hsl( 녹색형광물질 ) 의발현을확인하였다. 실험결과, 지방조직에서의지방분해인자인 phospho-hsl의발현을확인한결과, 펩타이드복합체를처리하였을때지방분해인자인 phospho-hsl의발현이증가되는것을확인할수있었다 ( 도 11). [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] 실시예 3: 실험동물을통한지방생성억제및지방분해촉진효과고지방식이에의한체중감소및지방생성억제정상 C57BL/6 마우스에고지방식이를하여유도한비만유도모델 DIO(Diets induced obesity) 를이용하여항비만효능실험을수행하였고, 양성대조군약물로서 TNFα 5 μg/ml를사용하였다. 대조군은고지방식이가아닌일반식이로진행하였고, 실험은고지방식이를 12주동안진행하면서, 펩타이드복합체를처리하고양성대조군을처리하여체중의감소를확인하였다. TNFα 및항비만효능화합물은 12주간매주오후 3시-4시에 84일간강제로복강주사하였고체중과식이량은처음약물투여직전에측정하였으며, 이후에일주일간격으로체중과식이량을측정하였다. 혈당은약물투약실험종료후꼬리정맥에서채혈후아큐첵액티브 (Accu-Check Active)(Roche) 를이용하여측정하였고 Cholesterol 또한꼬리정맥에서채혈된혈청을 Cholesterol calculation Kit(BioVision) 을이용하여분석을수행하였다. 지방조직은색깔에따라백색지방 (White Fat), 갈색지방 (Brown Fat) 으로나뉘고, 부위에따라피하지방, 복막지방, 장간막지방 ( 내장지방 ) 및부고환지방으로나뉜다. 해부후각지방을적출하여관찰하였으며, 조직학적검사를위하여지방을 10% 중성완충포르말린에고정한후파라핀블록에심어서 5 μm로섹션하여헤마톡실린 (Hematoxylin) 과에오신 (eosin) 염색을하였다. 지질분해인자인 HSL 의인산화정도를 Anti-pHSL 항체를이용한형광염색을진행하였다. 조직샘플제작후글리세린젤마운팅미디어 (glycerine Jell mounting Media) 로마운팅하였고커버글라스를덮어현미경 (Nicon, TS100) 으로관찰하였으며현미경에내장되어있는디지털카메라로조직을촬영하였다. 일반식이를 12주동안한생쥐의체중은실험초기 20.9 g에서 12주후 28.74 g의체중을보였고, 고지방식이를한생쥐는초기 20.99 g의체중이 12주후 49.5 g 까지체중의증가가있는것을확인하였다. 그러나고지방식이와병행하면서처리한펩타이드복합체군에서는초기 21.1 g에서 12주후 36.76 g으로고지방식이만진행된대조군 (235.8%) 에비해높은체중감소 (174.2%) 가일어나는것을확인할수있었다 ( 표 2 및도 12). 표 2 는비만생쥐모델에펩타이드복합체를처리한후몸무게측정결과를나타낸다. - 12 -
표 2 [0097] [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] 또한 12주동안실험이완료된동물의사진을측정한결과, 펩타이드복합체처리군이고지방식이만을한군에비해생쥐의몸이정상생쥐 ( 일반식 ) 와유사한몸의크기로유지되는것을관찰할수있었다 ( 도 13). 12주동안실험을진행한생쥐에, 마이크로-CT 촬영을하여몸전체의지방의분포를확인하였다. 몸전체에분포되어있는지방 ( 노란색을띄고있음 ) 을확인한결과, 일반식이를진행한대조군에비해고지방식이를한대조군의생쥐에서몸전체에분포된지방의양이급격히증가되어있음을확인할수있었으며, 펩타이드복합체를고지방식이와함께처리한군에서는몸전체에분포되어있는지방의양이급격히감소되어있음을확인할수있었다 ( 도 14). 위의마이크로-CT 촬영이끝낸생쥐를해부하여몸전체에분포되어있는지방조직을채취하여지방조직의양을관찰하였다. 결과, 일반식이를진행한대조군에비해고지방식이를한대조군의생쥐에서지방의양이많은것을확인할수있었고, 고지방식이와함께펩타이드복합체를처리한군에서지방의양이급격히감소되어있는것을확인하였다 ( 도 15). 지방을분리하여 H&E 염색을통해지방의크기를관찰한결과, 고지방식이대조군에비해고지방식이와함께펩타이드복합체처리군에서지방의크기가작아지는것을확인할수있었다 ( 도 16a). 지방의크기를프로그램을통해분석한결과, 일반식의대조군지방의크기를 100% 로계산하였을때, 고지방식이의대조군의지방의크기는 127% 로지방의크기가커져있는것을확인하였으며, 고지방식이에펩타이드복합체를같이처리한군의지방의크기는 97% 로감소한것을확인하였다 ( 도 16b). 지방을분리하여지방조직내에발현되어있는지방분해인자인 Phospho-HSL 의발현양을확인한결과, 고지방식이와함께펩타이드복합체를처리한군에서 phospho-hsl의발현이증가되어있는것을확인하였다 ( 도 17). 실험이끝난생쥐의혈액속의콜레스테롤의양을확인한결과, 일반식의콜레스테롤양은 2.52 μg/ml, 고지방식이의대조군의콜레스테롤의양은 3.5 μg/ml, 고지방식이와함께펩타이드복합체처리한군에서는 2.86 μ g/ml 의콜레스테롤의양이검출되는것을확인할수있었다. 펩타이드복합체처리군에서비만시올라가는콜레스테롤의수치를낮춰주는것을확인할수있었다 ( 도 18). 실험이끝난생쥐의혈액속의혈당의수치를확인한결과, 일반식을진행한대조군의생쥐의혈당은 174 mg/dl, 고지방식이의대조군의혈당은 235 mg/dl로혈당수치가올라가는것을확인할수있었으며, 고지방식이와함께펩타이드복합체를처리한군에서의혈당의수치는 183 mg/dl 로일반식대조군과유사한혈당의수치가감소되어있는것을확인하였다 ( 도 19). - 13 -
[0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] 실시예 4: 혈당조절혈당조절효과본동물실험에는 C57BL/6( 정상쥐 )( 샘타코 ) 와 C57BLKS/JLepr( 당뇨모델마우스, db/db 마우스 )( 중앙실험동물에서구입 ) 수컷을사용하였고, 항당뇨및 / 또는항비만효능물질로는복합제를사용하였고양성대조군약물로는시타클립틴 (sitagliptin) 을사용하였다. 본실시예에서는정상마우스모델과유전적으로당뇨의가능성이있는모델에대한급성항당뇨효능 ( 단회투여 ) 을대표적인당뇨병진단검사방법인 GTT(Glucose Tolerance Test) 방법을사용하여항당뇨및 / 또는항비만효능복합제에대해평가하였다. 마우스의사육환경조건은 22-24, 상대습도 50-30% 로설정하였고, 사육상자당 4마리씩사육하였다. 오전 8시-오후 8시까지 150-300 룩스 (Lux) 의조명을주었고, 하루에 12시간점등, 12시간소등하였다. 사료는일반식이 (18% 단백질, 2018, Harlan Laboratories Inc, USA 제조 ) 를사용하여자유섭취시켰고, ITT 실험진행전 4시간이상절식시켰고, GTT 실험진행 12시간전부터절식시켰다. GTT 실험 1시간전에복합제를각각경구투여용일회용주사기를이용하여강제경구투여하였고, GTT 실험을위하여실험 0시간째에고지방식이를 40분간자유식이하였다. 고지방자유식이 40분후에각각혈액내글루코스레벨검사를위하여 0분, 30분, 60분, 90분, 120분및 180분간격으로꼬리정맥에서채혈하였고아큐첵액티브 (Accu-Chek active)(roche) 를이용하여혈당수준을측정하였다. 한편, 양성대조군약물로는현재당뇨치료제로사용되고있는시타클립틴 (sitagliptin) 으로선정하였으며, 100 mg/kg의투여량으로투여하였다. 항당뇨및 / 또는항비만효능후보물질로선정한복합제를 100 mg/kg 의투여량별로실험군을나누었고, 각실험군당 4수의마우스를사용하였다. 실험결과고지방식이에의해증가된혈당의수치가펩타이드복합체처리에의해혈당감소효과를관찰하였다. 당뇨병유발생쥐모델에서당뇨병의높은혈당이감소되는것을확인하였다 ( 도 20a-b). 또한콜레스테롤의양이고지방식이의대조군에비해고지방식이와함께펩타이드복합체처리군에서콜레스테롤의양이낮아지는것을확인하였다 ( 도 21). 또한, DB/DB 당뇨병이유도된생쥐에 16시간공복을준후 30분간식이를준후, 펩타이드를섭취하도록하고시간별로혈당의수치를측정하였다. 실험결과, 서열목록제1서열, 제3서열및제5서열의펩타이드를처리한군에서고혈당의수치가시간의존적으로낮아지는것을관찰하였다 ( 도 22a-c). [0111] [0112] [0113] [0114] 실시예 5: 인슐린과인슐린유사성장인자의발현촉진인슐린과인슐린유사성장인자의별현촉진 3X10 5 세포 / 웰의세포밀도로 6웰플레이트에 3T3-L1( 지방전구세포 ) 를시딩하였다. 24시간배양한후펩타이드를농도별 (10 ng - 1 μg/ml) 로처리하고 14일간 37 배양기에서배양하였다. 세포용해버퍼를처리하여용해물을확보후단백질정량하고지질분해인자인항-IGF-1, 인슐린항체 (Santa Cruz Biotechnology, USA) 를이용하여웨스턴블롯팅을실시하여관찰하였다. 실험결과, 서열목록제7서열의펩타이드에의해 IGF-1과인슐린의발현이농도의존적으로증가하는것을관찰하였다 ( 도 23). [0115] [0116] [0117] [0118] 실시예 6: 임상실험을통한혈당감소효과관찰복합제복용에의한혈당감소공복혈당 170 mg/dl 이상 45-65세대상으로간이임상실험진행공복혈당기준으로식후 30분복합제제섭취하여 30, 60, 90, 120, 150, 180분간격으로채혈하였고아큐첵액티브 (Accu-Chek active)(roche) 를이용하여혈당수준을측정하였다. 실험결과복합제제에의한혈당감소가각각의실험자에서모두관찰되었다 ( 도 25a-d). [0119] 이상으로본발명의특정한부분을상세히기술하였는바, 당업계의통상의지식을가진자에게있어서이러한 - 14 -
구체적인기술은단지바람직한구현예일뿐이며, 이에본발명의범위가제한되는것이아닌점은명백하다. 따라서, 본발명의실질적인범위는첨부된청구항과그의등가물에의하여정의된다고할것이다. 도면 도면 1a 도면 1b 도면 1c - 15 -
도면 2 도면 3a 도면 3b - 16 -
도면 3c 도면 4 도면 5-17 -
도면 6a 도면 6b 도면 6c - 18 -
도면 6d 도면 7-19 -
도면 8a 도면 8b - 20 -
도면 8c 도면 8d - 21 -
도면 9 도면 10a - 22 -
도면 10b 도면 11 도면 12-23 -
도면 13 도면 14-24 -
도면 15 도면 16a - 25 -
도면 16b 도면 17-26 -
도면 18 도면 19 도면 20a - 27 -
도면 20b 도면 21-28 -
도면 22a 도면 22b - 29 -
도면 22c 도면 23-30 -
도면 24 도면 25a - 31 -
도면 25b 도면 25c - 32 -
도면 25d 서열목록 <110> CAREGEN CO., LTD. <120> Peptides having Anti-obesity and Anti-Diabetes Effects and Use Thereof <130> PN150179 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Peptide 1 <400> 1 Leu Lys Thr Arg Asn 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Peptide 2 <400> 2 Lys Gly Ala Cys Thr Gly Trp Met Ala - 33 -
1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Peptide 3 <400> 3 Lys Gly Ala Ser Thr Gly Trp Met Ala 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Peptide 4 <400> 4 Ala Cys Tyr Leu Pro His Pro Trp Phe Cys 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Peptide 5 <400> 5 Ala Ser Tyr Leu Pro His Pro Trp Phe Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Peptide 6 <400> 6 Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys 1 5 10-34 -
<210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Peptide 7 <400> 7 Ser Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Ser 1 5 10 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>< 223> PPARgamma F <400> 8 ttttcaaggg tgccagtttc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> PPARgamma R <400> 9 aatccttggc cctctgagat 20 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> ACC F <400> 10 accttactgc catcccatgt gcta 24 <210> 11 <211 > 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence - 35 -
<220><223> ACC R <400> 11 gtgcctgatg atcgcacgaa caaa 24 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> ap2 F <400> 12 catcagcgta aatggggatt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> ap2 R <400> 13 acacattcca ccaccagctt 20 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> AMPK-a1 F <400> 14 tgaccggaca taaagtggct gtga 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> AMPK-a1 R <400> 15 tgatgatgtg agggtgcctg aaca 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA - 36 -
<213> Artificial Sequence <220><223> CGI58 F <400> 16 tgtgcaggac tcttacttgg cagt 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> CGI58 R <400> 17 gtttctttgg gcagaccggt ttct 24-37 -