식품의약품안전평가원 줄기세포치료제 심사평가 연구사업단

CONTENTS 1. 배경 2. 필요성 3. 현황 4. 세포유전학적방법 4.1. 염색체핵형분석법 4.2. 형광제자리부합법 5. 인시투염색체분석법 5.1. 상세시험방법 5.2. 분석법조건확립및적용사례 5 6 8 13 14 18 19 20 22 참고문헌 30

식품의약품안전평가원 01 배경 줄기세포는기존의치료제와는다른새로운작용기전으로치료가능한의료영역을확장하고있는추세에있다. 줄기세포치료제는보고서별로차이는있지만세계시장규모가 2011년에 262억달러에서, 2018년에는약 1200억달러에이를것으로예상되는등연 4~5% 의높은성장이예상되는고부가가치산업으로, 세계각국은국가차원의적극적인연구개발지원을아끼지않고있는상황이다. 새로운첨단기술에는새로운작용기전에따른유효성뿐만아니라기존의치료제에서는예상하지못한안전성에대한우려도함께수반될수밖에없다. 따라서, 과학계및의료계에서는줄기세포를이용한치료제가본격적으로임상에상용화되기까지는다양한방법을통한효능과안전성이우선검증되어야한다고보고있다. 본정보집은줄기세포치료제의안전성평가측면에서유전체안정성평가의필요성, 관련국외규제기관등의관리현황을살펴보고, 염색체핵형분석법등세포유전학적검사의종류와실제적용방법을상세히기재하였으며, 기존에사용되던 G-banding 핵형분석법을개선하여줄기세포의특성을고려한소량의검체를제자리 (in situ) 에서배양하여수행하는 인시투염색체분석법 에관한상세시험방법및분석법의확립및적용사례를소개하여, 줄기세포치료제심사자및연구개발자모두에게도움을주고자한다. 참고로, 이자료는식품의약품안전처의줄기세포치료제심사평가기반연구사업단의세부과제인 줄기세포치료제의유전학적안정성평가시험법연구 ( 서울대학교, 이동순교수 ) 의연구결과를바탕으로, 전문가협의체의검토를거쳐마련되었다. 제시한내용은식약처의정책이나심사방향과는다를수있음을이해바란다. 아무쪼록, 본정보집이줄기세포치료제의연구개발및심사평가과정에서유용하게활용 되어, 새로운치료제의안전성확보는물론국내산업의발전에도기여할수있기를기대한 다. 줄기세포치료제의유전체안정성평가시험 5

02 필요성 줄기세포의유전체불안정성 (genomic instability) 은세포의성장주기에걸쳐유전체에 변이가발생하는경향이증가되는것을말하며, 이로인하여발생된유전자변이의축적은 종양발생의가능성을예측할수있는주요요인이라고알려져있다. 줄기세포를치료목적으로투여하기위하여채취, 선별, 증식등을포함하는체외조작이라는과정을거치며, 모세포의유전정보는수백만개이상의딸세포에게전달된다. 이와같은체외조작과정 ( 여러계대에걸친체외증식등 ), 체외조작종류, 배양조건, 세포자체의분화잠재력, 사용하는지지세포 (feeder cells) 등여러환경이줄기세포의유전적불안정성을증가시킬수있는요인으로작용한다고알려져있다. 따라서, 줄기세포를이용한치료제개발과정에있어서유전정보가유해한손상을입지않은상태로얼마나안정적으로유지되는지확인하는것은줄기세포치료제의품질관리에있어서중요한부분으로간주되고있다. 일반적으로유전적불안정성은 1) 돌연변이획득, 2) 불일치복구결함 (mismatch repair deficiency), 3) 염색체불안정성 (chromosomal instability) 등세가지기전에기인하는것으로논의되고있다. 불일치복구결함은미소 DNA 복제오류를감시하고, 이를복구하는유전자들의돌연변이로인한결과로, 현미부수체 (microsatellites) 반복길이다양성검사로확인되며, 여러가지유전자들의과변이성 (genetic hypermutability) 상태를의미한다. 불일치복구결함의경우, 길이돌연변이 (length mutation) 중에서도염기서열반복이짧은현미부수체에서도높은빈도로발견된다. 반면, 염색체불안정성은염색체수나구조전반에걸쳐영향을미친다. 염색체불안정성은세포간의차이가있어세포마다염색체이상여부는다를수있고, 이와같은구조적결함이발생한경우딸세포에게전해질수있다. 결과적으로염색체이상세포로부터증식이반복될경우염색체이상을가진복제가발생할수있다. 염색체분석에는고전적인방법인 G-분염법 (G-banding) 이나다른종류의염색체분염법을이용해오기도했지만, 오늘날에는분자유전학의발달로인하여형광제자리부합법 (fluorescent in situ hybridization, FISH) 이나비교유전체부합법 (comparative genomic hybridization, CGH) 과같은분자세포유전학적기법까지포함하여활용되고있다. 다음의그림1 에서보는바와같이사람의염색체는 23쌍으로구성되어있으며, 22쌍의상염색체와 1쌍의성염색체로구성되어있으며, 염색체의크기에따라 1번부터 23번까지번호가 6 세포치료제시험정보집 Ⅳ

식품의약품안전평가원 매겨져있다. 정상염색체대비염색체길이의감소등이대표적인염색체이상으로알려져 있다. [ 그림 1.] 사람의염색체및대표적인염색체이상 줄기세포치료제의유전체안정성평가시험 7

03 현황 줄기세포치료제는 2011년세계최초로우리나라에서시판허가를받은제품이탄생하였을정도로다른국가보다앞선상용화단계에있는상태이다. 또한, 제품자체의특성이나작용기전이고전적치료제와는차이가있어기존에확립된평가기준을그대로적용하는것에도한계가있는것으로인식되고있다. 이와같은시각을반영하여, 2011년유럽연합의입장표명서발표에이어각국의규제기관들은줄기세포치료제의안전성및유효성평가를위한별도의지침을만들고있지만, 구체적인평가항목이나시험법에대한내용을규정하고있는지침은없는상황이다. 2011년유럽의약품청 (EMA, European Medicines Agency) 에서발표한줄기세포기반제제에관한입장표명서 (Reflection paper on stem cell-based medicinal products) 에서는품질, 비임상, 임상과관련된고려사항들을다루고있다. 이들중유전적안정성에관한사항은품질과관련된고려사항으로서, 광범위한체외조작을거치는줄기세포기반제제들의경우종양원성 (tumorigenicity) 과함께유전체안정성 (genomic stability) 을평가하는것이필수적이라고기술하고있다. 이를위해세포유전학적분석, 끝분절효소 (telomerase) 활성, 증식능및세포노화평가등을관련성이있는분석법으로제안하였다. 미국식품의약품안전국 (FDA, Food and Drug Administration) 에서는줄기세포치료제와관련된특이적지침을발간한바없지만, 체세포치료제로포괄된규정의적용을받는다. 체세포관련지침중 2008년에발간된인간체세포치료제의임상시험승인신청시화학, 제조, 품질관리정보의내용및평가지침 (Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control Information for Human Somatic Cell Therapy Investigational New Drug Applications) 에서는마스터세포은행 (MCB, master cell bank) 이있는경우, 핵형이상 (karyotypic alteration) 이없는지등을확인하는방법으로유전적안정성을입증하도록할것을권고하고있지만, 명확한관련규정은마련되어있지않다. 미국국립보건원 (NIH, National Institutes of Health) 이발간한줄기세포기본서 (StemBook) 에게재된줄기세포의유전적무결성분석 ( 참고문헌 16. 참고 ) 을통해줄기세포에서유전적불안정성이가지는의미와위험도, 유전체무결성 (genomic integrity) 을평가하기위하여사용되는일반적인시험방법을소개하고있다. 8 세포치료제시험정보집 Ⅳ

식품의약품안전평가원 국제적인학술단체인국제줄기세포연구학회 (ISSCR, International Society for Stem Cell Research) 에서는줄기세포를이용한임상중개연구지침 (Guidelines for the Clinical Translation of Stem Cells, 참고문헌 4. 참고 ) 을발간한바있다. 이지침에서는줄기세포의체외배양과정을거치면서유전학적및후성유전학적 (epigenetic) 변이가축적될가능성이있으며, 이와같은유전학적변형은종양발생과같은위험을유발하는요인이될수있다고지적하면서, 인체에투여시유전학적변형에따른위험도를최소화할수있도록해야한다고권고하고있다. 이와같은유전학적안정성에관하여과학적으로완전한규명이이루어지지않은상태이며검출을위한시험법들도발전하고있는단계에있다고지적하면서, 과학자들과규제관련자들간의협력을통해수용가능한최소변이범위에대한표준적인기준개발이필요하다고기술하고있다. 우리나라에서는줄기세포치료제의심사평가시식품의약품안전처고시 생물학적제제등의품목허가 심사규정 ( 식품의약품안전처고시제2013-193호, 2013.7.5.) 의적용을받으며, 동규정제30조제2항 ( 다 ) 호의 (1) 중 세포유전학적성질 에관한자료를제출하도록규정하고있다. 이처럼각국의규제기관들은줄기세포치료제에있어서종양발생가능성뿐만아니라, 치료제로일관되고균질한품질유지측면에서유전적불안정성의평가필요성에대하여는 공감하고있으나, 구체적인평가법과판정기준은제안되고있지못한실정이다. 그가운데서도유럽의약품청 (EMA) 의세포제제실무팀 (Cell Products Working Party) 과첨단제제위원회 (Committee for Advanced Therapies) 가중간엽기질세포 (MSC, mesenchymal stromal cell) 의세포변성 (transformation) 및종양원성 (tumorigenicity) 과관련된과학적지식과규제적관점간의격차를좁히기위한일환으로, 2011년유럽과학자들과회의를가진후 2년간의의견조율을거쳐 2013년에별도의논문 ( 참고문헌 6. 참고 ) 으로발표한것이주목을받고있다. 이내용은 EMA의첨단제제위원회위원들과각국의규제당국자들및과학자들이함께토의하고그를토대로형성된공통의견을발표한것이기때문에, 규제실무자의실질적인평가관점을더자세히다루고있다. 전문가회의에서는먼저제조과정이중간엽기질세포에서세포유전학적비정상을유발할수있는지와종양원성을증가시킬수있는위험인자에대한입장을정리하였다. 전문가들은장기간의체외배양과배양조건및생리학적스트레스등은염색체변이발생을유발할가능성이있는것으로보고있다. 염색체변이가발생한세포의대부분이세포사멸을겪지 줄기세포치료제의유전체안정성평가시험 9

만, DNA 손상은종양형성의중요한기전중하나로간주되고있으므로세포변성의위험도 를완전히배제하기는어렵다는견해에동의하였다. 염색체변이는자연발생적변이 (spontaneous abnormalities) 와반복변이 (recurrent abnormalities) 로구분된다. 자연발생적변이는배치 (batch) 별또는환자별로불균일하게발생하는것으로가능한경우 ( 냉동제품 ) 핵형분석을수행하는것으로도충분히판단할수있으며, 이때의판정기준은국제인간세포유전학명명시스템 (ISCN, International System for Human Cytogenetic Nomenclature) 의 2009년발간 (ISCN 2009) 자료를근거로, 20개중기 (metaphase) 세포들중 2개이상 (10%) 의동일한변형이관찰되는것을변이의기준으로할것을제안하고있다. 반복변이는동일환자에서유래한증식세포시료들중 2개이상에서변이가검출되는것을기준으로하며, 이경우에는임상적적응증과연계하여유익성-위험도에대해좀더면밀한평가가필요하다고기술하고있다. 유전적변이가관찰되지않은경우에는매배치별로세포유전학적검사를출하시험으로수행할필요는없지만, 이후필요할때검사할수있도록주요제조단계별로세포시료를냉동보존하는것이중요하다고권고하고있다. 유전적무결성을평가하기위한분석법은일반적으로세포유전학적검사법과 DNA 기반 검사법, RNA 기반검사법을포함하는분자유전학적검사법으로구분되며, 각검사법별 검사방법과, 특성은다음과같이알려져있다. 10 세포치료제시험정보집 Ⅳ

식품의약품안전평가원 [ 표 1.] 유전적무결성분석법비교분석 구분세포유전학적방법 DNA 기반방법 RNA 기반방법 분석법 G 밴딩핵형분석 (G banding karyotyping) 특수핵형분석 (Special karyotyping) acgh SNP 어레이 (SNP array) 전장유전체분석 (Whole-genome sequencing) 발현어레이 (Expression array) 검사방법 해상도 ~ 10Mb 비정상형의종류에따라다양함 1Mb 미만 1Mb 미만단일염기쌍 ~ 10Mb 민감도 ~ 5% ~ 5% 20% 이상 20% 이상 20% 이상 30% 이상 장점 검사가간편하고, 신뢰도가높다. Mosaic 배양에서민감도가높다. 균형전위 (balanced translocation) 와역위 (inversion) 검출도가높다. Mosaic 배양에서민감도가높다. 균형전위 (balanced translocation) 와복합핵형 (complex karyotype) 검출도가높다. 해상도가높다. 해상도가높다. LOH 검출이가능하다. 최고의해상도 점돌연변이 (point mutation) 검출이가능하다. Expression profiling 및 genomic integrity 분석과동일한검체사용 관련유전자확인이가능하다. 해상도가낮다. 단가대비해상도가낮다. Mosaic 배양에서민감도가낮다. Mosaic 배양에서민감도가낮다. 비용이너무고가이다. 성염색체의분석이용이하지않다. 단점 작은유전자중복 (small duplication) 과결손 (deletion) 검출율이낮다. 배수성 (polyploidy) 을검출할수없다. Mosaic 배양에서민감도가낮다. acgh: array-comparative genomic hybridization; SNP: single nucleotide polymorphism; LOH: loss of heterozygosity 줄기세포치료제의유전체안정성평가시험 11

EMA 전문가회의에서는제품개발시전임상단계에서핵형분석을통해염색체이상을검색해야하며, 이때여러다른배치로부터최소 20개중기세포들에대한분석이이루어져야한다고결론을내리고있다. 다만, 고전적핵형분석법은민감도나해상도가떨어져유전적안정성을완전하게예측하는데에한계가있지만시험법이간단하고균형전위검출이가능하다는장점이있다고간주하였다. CGH 어레이는민감도는높으나비정상세포의비율이낮을때에는검출이어렵고균형전위검출이어렵다는한계가있으므로, 핵형분석과 CGH 어레이는상호보완적으로함께사용되어야한다고보고있다. 면역형광및형광제자리부합법 (FISH, Fluorescence in situ hybridization) 을이용한분석법은부차적인구조적변형을검출할수있다. 따라서, 유전자형안정성 (genotypic stability) 에대한추가적정보를얻기위해핵형분석에면역형광및 FISH와같은분석법을추가로실시함으로써염색체변형의특성을규명할수도있다고의견을모았다. 이상에서기술된내용들을토대로하여보았을때유전체안정성은세포의기본적품질을보장할뿐만아니라, 인체내에투여된이후종양유발의잠재적위험성을낮추기위해필수적으로평가되어야하는사항으로간주되고있다. 현재로서는어떤한가지시험법도유전체안정성을확인하기위한목적으로는완벽하지않다고보고되고있으며, 시험방법별장단점을상호보완하여복합적으로평가해야할필요가있다는입장이다. 12 세포치료제시험정보집 Ⅳ

식품의약품안전평가원 04 세포유전학적방법 줄기세포의유전체안정성은거시적인관점의염색체이상을포함한전통적세포유전학 검사와미시적인분자적인단위에서의유전학적이상을유전자단위이상을포함하는분자 유전학검사로구분될수있다. 아직까지줄기세포제제의유전체안정성에대한검사는대개거시적관점에서의세포유전학적분석인핵형분석이주를이루고있고가장필수적이며기본적인검사이다. 이외의끝분절 (telomere) 효소의활성화, 끝분절의길이, 끝분절복합체의구성등분자유전학검사방법이있으나, 줄기세포제제의임상적용단계에서는아직적용되는예가드물고더많은연구가필요하다. 이정보집에서사용하는용어의정의는다음과같이기술한다. 세포유전학 (cytogenetics): 유전, 즉염색체와관계된세포요소를연구하는유전학의분야 핵형분석 (karyotype analysis): 세포핵의염색체구성으로 Denver의분류에따라서배열한염색체의현미경사진확대에의한것을분석하는행위 끝분절 (telomere): 염색체의끝, 단부를가리키는말. 여러특수한성질중염색체가파괴된후그파편의재결합을막음. 유사분열 (mitosis): 세포의간접적분열법으로서여러가지과정이복합되어있으며이것에의해서 2개의낭색이그종의체세포에특징적인염색체수과같은수를정상적으로받는다. 4 상으로구분되면전기, 중기, 후기, 종기로구분 중기 (metaphase): 유사분열중중기. 세포분열의제 2기로서, 두개의염색분체로구성된수축된염색체가분리하기전에방추체의적도면에배열 간기 (interphase): 세포분열의간기. 연속된두개의세포분열의중간기로, 염색체는개별적으로식별되지않고정상적인생리적과정이진행, 이전에는 resting phase라고함. 제자리 (in situ): 그위치그대로. 자연또는정상인장소 형광제자리부합법 (FISH, fluorescence in situ hybridization): 형광물질을붙인탐색자를이용한분자세포유적학적검사법 줄기세포치료제의유전체안정성평가시험 13

4.1. 염색체핵형분석법 염색체핵형분석법은유전체안정성평가에있어서기본적인검사법으로알려져있다. 핵형분석은 Karl Wihelm von Nageli가 1842년식물에서처음염색체를관찰한이후로 Walther Flemming이 1882년인간의염색체를기술한것에기원을두고있다. Levitsy가 1924년염색체를정렬하는법을핵형이라고기술한이후핵형분석이이뤄졌다. 전통이오래된만큼그단계나방법은표준화되어있다. 염색체핵형분석법은세포를배양하여분열중기의세포에서염색체의수적, 형태학적이상을관찰하는방법이다. 전통적으로세포의유전체안정성및발암성검사에염색체핵형분석법이사용되어왔다. 중간엽줄기세포의경우, 계대에따라염색체가안정하다는연구도있지만, 일부연구에서는초기또는진행된계대에서염색체이상이발견된다는보고도있어안정성에관한의견은합치되지않고있다. 고전적으로사용되고있는 G-banding 핵형분석법은단백질분해효소인트립신 (trypsin) 으로전처리한후, Giemsa 색소로염색체를염색하는방법으로, 진정염색질 (euchromatin) 은밝은색으로, 이형염색질 (heterochromatin) 은진한색으로염색된다. 이방법은염색대를많이생성하기때문에염색체분석시가장많이사용되는시험법이다. 그러나, 이분석법은시험과정에서많은수의세포를요구하고있고, 시험과정에세포의소실가능성이있는것으로알려져있다. 이러한한계를해결하고자소량의세포로도시험이가능하고, 시험중의 spreading 과정으로발생할수있는염색체소실등을예방할수있도록기존의원심분리및 spreading 과정을없앤시험방법을개발하였다. 즉, cover glass로제자리 (in situ) 에서배양한줄기세포의염색체의형태학적및수적변화를관찰하는 인시투염색체분석법 을개발하고, 이에대한분석법의확립및적용사례등을제 5항에별도로자세히기술하였다. 14 세포치료제시험정보집 Ⅳ

식품의약품안전평가원 참고 : 고전적인 G-Banding 핵형분석법 가. 시약및기구 1 도립현미경 (inverted microscope) 2 37, CO 2 incubator 3 배양액 ( 각줄기세포에맞게선택 ) 4 Colcemid (Gibco 15212-012) 5 Hypotonic solution: Potassium chloride solution (0.075M), 37 6 Ethidium bromide solution 7 Serological pipette 8 15mL conical tube 9 원심분리기 나. 시약조제 1 Carnoy s fixative solution (2-3:1(v/v) methanol/glacial acetic acid) 2 Leishmans stain: - Na 2 HPO 4 0.4732g / D.W. 50 ml ( 냉장보관 ) ( 분자량 142, stock 67 mm) - 0.5 % Trypsin-EDTA ( 냉동보관 ) - Gurr buffer tablets (Gibco 10582-013) in 1l D.W. ( 상온보관 ) 다. 시험방법 1) 세포배양 1 세포는적절한배양액이포함된용기에서배양하며 50%~70% confluence하게유지될때에핵형분석을실시한다. 2 세포는 trypsin으로처리하여새로운 flask에 reinoculation 시행한다. 3 배양은 37, 5% CO 2 에서시행한다. 2) 염색체의수확 (harvest) 1 0.075M KCl 용액은수확하는당일오전에제조하여 37 수조에가온해둔다. 2 배양 3일째각 flask당 EtBr 반응액 (EtBr, 10μg / ml ) 100μl를첨가하고 40분배양후에, 100μl colcemid ( 최종농도 0.1μg / ml ) 를첨가하여잘섞어주고, 37 배양기에 50분동안항온한다. 3 세포부유액을 15ml튜브에옮기고 200g (1000 rpm) 에서 8분간원심분리한다. 줄기세포치료제의유전체안정성평가시험 15

4 상층액을제거한후세포층을재부유시킨다. 5 미리가온한 KCl 용액 12ml을한방울씩서서히떨어뜨리며손으로튜브의옆면을치거나 vortex로천천히섞어준다. 6 37 수조에 20분을초과하지않고항온을시킨다. 7 고정액을 1ml첨가하여혼합한후에, 200 g (1,000 rpm) 에서 8분간원심분리하여상청액은버리고세포층을재부유한다. 8 고정액 7ml을한방울씩서서히떨어뜨리며손으로튜브의옆면을쳐준다. metaphase의상태를결정짓는가장중요한단계이다. 9 실온에 20~30분방치한다.( 습도가유지되는곳 ) 10 고정액을 10ml까지채운다. 11 276 g (1,200 rpm) 에서 8분간원심분리한다. 상층액을제거하고, conical tube의벽에붙어있는세포덩어리와각종찌꺼기를면봉을이용하여조심스럽게제거한다. 이때층의 cell pellet을건드리지않아야한다. 신선한고정액 12ml를더하여재부유한다. 12 위의 10 및 11의세척과정을세포부유액의갈색기가없어지고, 무색투명해질때까지 3~6회를반복한다. 3) 세포고정및 slide 제작가능하다면세포수확과정이시행되는당일에슬라이드표본제작을하는것이좋다. 만일냉장고에서하룻밤동안보관하였다면표본제작전에시험관을냉장고에서꺼내어상온이되게한후에고정액으로 1회더세척한다. 1 고정단계에서한검체당 2장씩 slide를준비한다 ( 미리 slide의 Frosted area에연필로검사번호환자이름및배양방법날짜를기록하여 D.W. 에담궈냉장고에보관해둔다 ). 2 세포부유액의농도를고정액으로적절히조절한다 ( 세포층 : 고정액 = 1:3). 슬라이드를하나씩제작하여 inverted microscopy로세포밀도를확인한후재조정한다. 3 실험온도는 23±1, 상대습도는 55±5% 가적당하다. 또한슬라이드의기울기와가습, 바람이세포의 spread 상태에도움이되기도한다. 4) 핵형분석 (G-banding, Karyotyping) 1 염색체수의계산 : 20개이상의분열중기상을판독한다. 2 분석 : 최소한 5개의분열중기세포를분석한다. 3 핵형분석 : 증례마다최소한 2개의핵형분석을시행하고, 클론성염색체의이상은 ISCN 2013에따른다. 4 평균해상도는 400 band 이상이다. 단, 400 band 정의에만족하려면다음의 4가지중 3 16 세포치료제시험정보집 Ⅳ

식품의약품안전평가원 가지가만족해야한다 ( 참고문헌 1. 참고 ). a. 3 dark bands on mid-4q (q22-q28) b. 3 dark bands mid-5q (5q14, 5q21,5q23) c. 2 dark bands on 9p (9p21 및 9p23) d. 뚜렷한 13q33 5 ISCN 2013 명명법에따라염색체핵형을명명하여판정한다. 줄기세포치료제의유전체안정성평가시험 17

4.2. 형광제자리부합법 (FISH, Fluorescence in situ hybridization) 세포유전학에분자유전학적기법을접목한시험방법으로, 세포배양이나핵산추출과정을거치지않고표적유전자에상보적인서열을가지는탐식자를반응시켜표적유전자의유무와위치를확인하는방법이다. 제자리에서염색체나핵의형태를유지한채세포를슬라이드도말하여염색체또는유전자의변이를확인하게되며탐식자는형광을띄기때문에이를쉽게구별할수있다. 전통적염색체분석법을통해서는해상도가 5~15Mb정도가되는반면 FISH을통해서는 200kb~1Mb 정도의해상도로유전자단위에서의이상을검색할수있다. 염색체분석의경우세포분열중기의염색체이상만을검출할수있는반면, FISH는세포분열중기또는세포분열간기모두에서시행할수있다. 줄기세포제제의경우에는특정위치에서이상소견이관찰되는경우가있어, 이 FISH는간편하고용이하게사용할수있고, 염색체검사와보완적으로유전체안정성을평가하는데유용할것으로생각한다. 특정부위의염색체이상이배양된세포에서자주관찰되는경우, 예를들어중간엽줄기세포에서 6, 7, 13, 17, 19번염색체, 분화다능성줄기세포의경우, 1, 3, 9, 12, 17, 20번염색체의이상이일부연구에서보고되고있다. 따라서, 이염색체들의이상을검출할수있는염색체장완또는단완의형광제자리부합탐식자를사용하거나, 특정유전자이상이자주관찰되는탐식자를사용할수있다. 모든탐식자에대해서는탐식자검증작업을거친후사용해야한다. 특히, 적용할종류의줄기세포에대해탐식자검증을하는것이권장된다. 결과를판독하는경우에는최소한 2명의판독자가판독을해야하며, 세포분열간기의 FISH의경우최소 200개정도의간기분석이권장되며, 중기의경우 20개이상의중기세포분석이필요하다. 검사결과에대한사진은 2장이상확보를해두는것이권장되며, 명명법은 ISCN 2013을따라기술을할수있다. 18 세포치료제시험정보집 Ⅳ

식품의약품안전평가원 05 인시투염색체분석법 줄기세포에있어서핵형분석을위하여세포를배양하는방법은세포의특성에따라부유액인경우플라스크배양이실시되고, 단층으로자라는경우에는제자리 (in situ) 배양법으로세포를 cover glass 위에배양하여세포수확 (harvest) 을한후염색을수행하여분석한다. 중간엽줄기세포도플라스크배양을이용한핵형분석이많이시행되고있지만, 플라스크로배양하는경우에는, 세포에특별한조작을가하는경우가많고, 많은양의검체를확보하기어려운면이있어, 최소한의조작및양으로핵형분석을할수있는검사법을개발하기위한연구가다수이루어지고있다. 이들중대표적인분석법으로, 1970년대부터양수검체로시행하던제자리배양법은소량의세포와최소한의조작으로핵형분석이가능하다는장점에서줄기세포의핵형분석에적용될수있을것으로본다. 이러한제자리배양법을통하여얻어진검체를이용하여염색체의핵형을분석하는 인시투염색체분석법 을소개하고자한다. 각실험실에서는각자의상황에맞게조건을조절하여시행할필요가있다. 표준화가중요하기는하나실험실의습도, 온도등에의해결과가좌우되며, 각세포별특성이다르기때문에기본적인시험조건은유지하되실험실및대상세포의특성을고려한시험조건설정이필요하다. 줄기세포치료제의유전체안정성평가시험 19

5.1. 상세시험방법 인시투염색체분석법은충분히성장한줄기세포를원심분리방법으로수확하는기존의방법대신에, cover glass를세포배양에사용되는 6-well plate ( 또는 35 mm dish) 에넣고, 줄기세포를제자리 (in situ) 에서배양한이후에추가적인시험을시행하도록고안된방법이다. 5.1.1. 시약및기구 1 22 x 22 mm cover glass 2 6-well plate ( 또는 35 mm dish) 3 현미경 4 37 CO 2 incubator 5 Colcemid (Gibco 15212-012) 6 Hypotonic solution: Sodium citrate (0.6%-0.8%) or Potassium chloride solution (0.075M) 7 Permount mounting medium (Fisher Scientific SP15-500) 5.1.2. 시약조제 1 Carnoy s fixative solution (2-3:1(v/v) methanol/glacial acetic acid) 2 Leishmans stain: - Na 2 HPO 4 0.4732g / D.W. 50ml ( 냉장보관 ) ( 분자량 142, stock 67 mm) - 0.5 % Trypsin-EDTA ( 냉동보관 ) - Gurr buffer tablets (Gibco 10582-013) in 1L DW ( 상온보관 ) 5.1.3. 시험방법 [5.1.3.1 세포배양 ] 1 22 x 22 mm cover glass를 6-well plate ( 또는 35 mm dish) 에 1장씩넣고, 그위에서 2~3 104개의세포를키운다. 2 세포를심은후 24~36시간후또는세포가충분히흡착하여자랐을때배양액을 1회교체해주는것이좋으며, 세포가 50%~70% 정도 confluent할때 G-banding을실시한다. 20 세포치료제시험정보집 Ⅳ

식품의약품안전평가원 [5.1.3.2. 세포고정및슬라이드제작 ] 1 배양액 2ml기준으로 colcemid (0.1μg/ ml ) 를넣고 37 CO 2 배양기에서 40~50 분간반응시킨다. 2 반응이끝난후용액을흡인하여버린다. 3 37 에서미리데운 hypotonic solution (sodium citrate or potassium chloride solution) 2ml을넣고 37 CO 2 배양기에서 30분간반응시킨다. 4 Carnoy s solution (methanol : acetic acid = 2-3:1) 약 200 μl ( 혈청분리관으로 8~10방울정도 ) 를 cover glass 가장자리로조심스럽게더하여상온에서 2분정도반응시킨후용액을 suction 하여버린다. 5 Carnoy s solution을 3~4ml정도넣은후상온에서 20분간반응시킨후용액을흡인하여버린다. 6 7번과정을 2회더반복실시한다. 7 Well을꼼꼼하게, 단세포가고정된커버글라스위를건드리지않게조심스럽게흡인하고현미경으로중기세포를찾아본다. 8 슬라이드에 mounting solution을적당량떨어뜨리고그위에 cover glass 의 cell 이붙어있는쪽이위로가도록해서기포가생기지않게재빨리고정시킨다. 9 56 dry oven에약 16시간동안반응시킨다 (85, 2시간 30분정도도가능 ). [5.1.3.3 염색방법 ] Leishman s G-banding staining 방법또는 Wright-Giemsa 방법에따라염색한다. [5.1.3.4 핵형분석 ] 1 염색체수의계산 : 적어도 2개의배양계로부터얻은분열중기세포를포함하는 15개의집락으로부터되도록 15개의세포에서염색체수를계산한다. 염색체를관찰하는세포는배양슬라이드별로균등하게나누어관찰한다. 가능하면세포가균일하게분포된곳에서염색체수를센다. 2 분석 : 최소한 5개의분열중기세포를분석한다. 3 핵형분석 : 증례마다최소한 2개의핵형분석과세포계마다적어도 1개의핵형분석을시행한다. 4 평균해상도는 400 band 이상이다. 5 ISCN 2013 명명법에따라염색체핵형을명명하여판정한다. 줄기세포치료제의유전체안정성평가시험 21

5.2. 분석법조건확립및적용사례 5.2.1. 조건확립 (I) [5.2.1.1. 실험시료 ] 1 중간엽줄기세포주또는중간엽줄기세포 [5.2.1.1. 실험시료 ] 1 중간엽줄기세포주또는중간엽줄기세포 [5.2.1.2. 목적 ] 1 전통적배양법을활용한경우와제자리에서배양하여실시하는인시투염색체분석법을실시한결과비교. 2 인시투염색체분석시사용되는방추체형성억제제 (colcemid, nocodazole), 저장성용액 (KCl, sodium citrate) 의변화에따라분열중기세포의질을평가함. [5.2.1.3. 방법 ] 1 전통적배양법을활용한염색체핵형분석및제자리배양법을이용한인시투염색체분석법을시행 2 염색체의겹침정도평가는핵형분석이이뤄진세포를대상으로염색체의겹침이몇개있었는지를계수 3 염색체길이는가장긴염색체인 1번염색체의길이를 Metafer system (MetaSystem, Altlusseheim, Germany) 를이용하여측정 [5.2.1.4. 결과 ] 1 전통적염색체핵형분석법및인시투염색체분석법의결과동일한골수유래중간엽줄기세포의 7 및 8 계대에서전통적염색체핵형분석및인시투염색체분석법을시행한결과 46,XY로동일하게판독되었으나판독한세포의수가달랐다. 골수유래중간엽줄기세포 전통적핵형분석 인시투염색체분석법 p7 46,XY[20] 46,XY[20] p8 46,XY[9] 46,XY[12] p : passage No.; [ 숫자 ] : 판독가능한세포의수 22 세포치료제시험정보집 Ⅳ

식품의약품안전평가원 2 인시투염색체분석시분석조건비교결과 [ 그림 2.] 분열중기세포의겹침정도. 좌 ) 염색체하나하나가떨어져있어구분이쉬움 우 ) 염색체가모여있어서로서로가구분이힘듦. 방추체형성억제제에따른비교실험결과제대혈유래중간엽줄기세포를이용하여방추체형성억제제인 colcemid와 nocodazole을사용하여더판독이쉬운중기세포를얻기위하여염색체의겹침정도및 1번염색체의평균길이를비교하였다. 1번염색체는다른염색체에비하여구분이쉽고긴염색체에속하여길이비교에용이하여선정하였다. 각조건에서겹침이적고염색체의길이가길수록판독이용이하다. 상기실험의결과, nocodazole은염색체의겹침이많은반면, 염색체의평균길이는길게측정되었다. [ 표 2.] 방추체형성억제제의조건에따른비교실험결과 검체 조건 염색체겹침정도 ( 개 ) Metaphase Quality P-value 염색체평균길이 Cord MSC Colcemid 0.1ug/ml 3.7±3.7 79.7 <0.001 Cord MSC Nocodazole 0.02ug/ml 12.1±8.5 132.9 Cord MSC Nocodazole 0.1ug/ml >30 측정불가 ( 겹침 ) P-value 0.002 염색체평균길이의단위 : 임의단위 (arbitrary unit) 저장성용액에따른비교실험결과 골수유래중간엽세포를이용하여각저장액 (KCl 또는 sodium citrate) 에 줄기세포치료제의유전체안정성평가시험 23

따른중기염색체의길이를비교하였고, 전통적핵형분석에서는두저장액에 따른 1 번염색체의평균길이의차이가없었으나, 인시투염색체분석에서는 sodium citrate 를사용한것이 1 번염색체의평균길이가길게측정되었다. [ 표 3.] 저장성용액에따른비교실험결과 검체실험조건염색체길이 P-value BM MSC ( 전통적핵형분석 ) BM MSC ( 전통적핵형분석 ) BM MSC ( 인시투염색체분석 ) BM MSC ( 인시투염색체분석 ) 0.075M KCl, 37 99.0 0.80% sodium citrate, 37 101.3 0.075M KCl, 37 97.1 0.80% sodium citrate, 37 118.1 0.758 <0.001 [5.2.1.5. 결론 ] ISCN 2013 명명법기준에따라검증한중간엽줄기세포의염색체분석결과는정상이며, 전통적배양법또는제자리배양법을이용한경우모두동일한핵형분석결과를얻을수있었다. 다만, 분석가능한세포의수에서는차이가있었다. 방추체형성억제제의경우, 제대혈유래중간엽줄기세포를이용하여실험하였고, colcemid를사용하는것이염색체겹침정도가적어적당하였다. Nocodazole은분열중기세포를많이형성하므로분열중기세포가잘형성되지않는줄기세포의경우유용할것으로생각된다. 저장성용액의경우제자리배양법을활용하는과정에서 sodium citrate를사용하는경우염색체길이가더길었다. 다만, 분열중기세포의질을평가하는방법으로염색체길이뿐만아니라, 겹침정도등다양한기준이있으므로실험실에서사용하는중간엽줄기세포에따라서방추체형성억제제, 저장성용액의농도, 종류등을검증하여사용해야할것으로생각된다. 분석된염색체 1번의길이는두방법에서통계적으로유의한차이를보이지않았다. 5.2.2. 분석법조건확립 (II) [5.2.2.1. 실험시료 ] 1 정상인의중간엽줄기세포주 (ATCC PCS-500-010( 제대혈유래 ), PCS-500-011( 지방유래 ) [5.2.2.2. 목적 ] 24 세포치료제시험정보집 Ⅳ

식품의약품안전평가원 1 인시투염색체분석법에사용되는저장성용액농도변화에따른분열중기세포 의질을평가함. [5.2.2.3. 방법 ] 1 0.075M KCl 및 0.054M KCl을이용하여분열중기세포슬라이드제작 2 각분열중기세포에서의염색체개수분석 (100개세포 ) 3 염색체의겹침정도평가는핵형분석이이뤄진세포를대상으로염색체의겹침이몇개있었는지계수함. (10개세포 ) 4 염색체길이는가장긴염색체인 1번염색체의길이측정. [5.2.2.4. 결과 ] 1 전통적배양법및제자리배양법을이용한염색체분석시형성된분열중기세포의염색체개수비교 >> 정상핵형을갖는중간엽줄기세포주를이용하여전통적배양및제자리배양법을시행하였으며, 전통적방법으로는각분열중기세포당관찰되는염색체의수의분포가다양했으나 (19~46개), 제자리배양법으로는그변이가적었다 (40~46개). 2 전통적배양및제자리배양법을이용한핵형분석시저장액농도별염색체겹침비교 >> 염색체겹침의경우전통적인염색체분석및인시투염색체분석에서저장액농도및핵형분석에따라서도통계적유의미한차이가없었다. (P = 0.139) 3 저장액농도별 1번염색체의길이비교 >> 0.075 M KCl을사용하였을때에는인시투염색체분석을사용한경우염색체가더길었으나 (107.4 vs. 97.2 임의단위 ) 0.054M 사용시에는전통적방법을사용한경우가더길게나타났다 (107.7 vs. 92.2 임의단위 ). [ 표 4.] 저장액의농도별염색체길이비교결과 저장액농도 전통적방법 (arbitrary unit, AR) 인시투염색체분석법 (AR) P -value 0.075 M KCl 97.2 107.4 0.012 0.054 M KCl 107.7 92.2 0.001 염색체길이의단위 : 임의단위 (arbitrary unit) 줄기세포치료제의유전체안정성평가시험 25

[5.2.2.5. 결론 ] 저장액농도에따라유의한차이는관찰되지않았으므로, 통상적으로사용하는농 도인 0.075M KCl 을사용해도무방할것으로생각된다. 5.2.3. 적용사례 [5.2.3.1. 골수기질세포의인시투염색체분석법의적용 ] 1 실험시료 >> 단층으로자라는골수기질세포 (n=13) 2 실험방법 >> 제자리배양법을시행하고두명의독립적판독자가핵형분석을실시하여결과를비교하였음. 3 결과 >> 핵형은 ISCN 명명법에따라서는 46,XY 또는 46,XX로모두정상으로판정되었다. 다만, 판독자간에판독가능한세포가달라그세포의수에차이가있기는하였으나 ( 판독자 1: 46,XY[10] 으로 46개의염색체가 10개의세포에서관찰된결과 vs. 판독자 2: 46,XY[7] 로 46개의염색체가 7개에서관찰된결과 ) 모든경우정상핵형으로판정되었다. [5.2.3.2. 중간엽줄기세포주의인시투염색체분석법의적용 ] 1 실험시료 >> 중간엽줄기세포주 (ATCC PCS-500-011) 2 목적 >> 인시투염색체분석법을중간엽줄기세포주를대상으로적용가능성을검증하고, 형광제자리부합법 (FISH) 을함께활용하여염색체이상여부를확인하고자함. 3 실험방법 >> 전통적배양법및제자리배양법을이용하여염색체의핵형을분석 >> 분열간기세포에서 FISH을이용하여추가적인유전적이상을검증 >> FISH의경우염색체의수적이상을보는탐식자 (Chromosome enumeration oligo-fish, Cellay) 를이용하여골수유래중간엽줄기세포에대한염색체수적이상을확인하였고, 염색체의특정부위이상을보는탐식자 (6q; Vysis LSI MYB Spectrum Aqua TM probe, 7q; Vysis D7S522/CEP 7 FISH, 17q; Vysis TOP2A/CEP17 FISH) 를사용하여분열간기세포 200개의신호를 26 세포치료제시험정보집 Ⅳ

식품의약품안전평가원 판독하여결과를분석하였음. 4 결과 >> 핵형분석전통적염색체분석법및인시투염색체분석법에대한핵형분석시모두 46,XY로나타났다. 다만분석가능한세포수의차이로 46,XY[11] 에서 46,XY[20] 까지관찰되었다. >> 형광제자리부합법 (FISH) FISH을활용한염색체수적이상분석확인결과 [ 그림 3.] 분열간기의 FISH 에의한결과 ( 예시 ), 각세포당 2 개씩의신호가관 찰되면정상으로판정 [ 표 5.] 지방조직유래의중간엽줄기세포에서의 FISH 에의한결과 Cell 1 2 3 4 Normal signal (%)* A-MSC-1 100.0 98.0 98.0 99.0 99.0 98.0 98.0 98.0 98.0 99.0 A-MSC-5 100.0 98.0 96.0 100.0 99.0 98.0 98.0 98.0 98.0 100.0 Cell 11 12 13/21 14/22 A-MSC-1 98.0 96.0 98.0 96.0 99.0 98.0 97.0 96.0 100.0 98.0 A-MSC-5 97.0 97.0 94.0 99.0 99.0 98.0 99.0 98.0 100.0 97.0 5 15 6 16 7 17 8 18 9 19 10 20 결과는 94% 인경우정상한계범위이내인것으로간주되었음 줄기세포치료제의유전체안정성평가시험 27

FISH 을이용하여특정부위 (6q, 7q, 17q) 이상유무를확인한결과정상결과를 보임. 5 결론전통적배양법을이용한핵형분석, 인시투염색체분석, 또는 FISH을이용한분석결과에서정상핵형으로, 수적이상은없는것으로확인되었다. FISH는염색체핵형분석에보완적인방법으로일부의경우에사용가능하며, 이상이빈번히발견되는것으로기존에보고된부위또는수적이상을확인할수있는탐식자를사용할수있을것으로사료된다. [5.2.3.3. 중간엽줄기세포의인시투염색체분석법의적용 ] 1 실험대상 >> 중간엽줄기세포 2 목적 >> 다양한중간엽줄기세포를대상으로인시투염색체분석법을이용하여대상줄기세포들의유전체안정성을평가함. 3 실험방법 >> 제자리배양법으로세포를배양시키고, 염색체분석을수행하였으며, 분석자에따른변이를알아보기위하여 2명이판독하도록하였음. 4 결과 >> 판독자에따라핵형의결과는차이를나타내지않았으나, 계수된세포의수에서차이를보이는경우가있었음. [ 표 6.] 세포종류에따른판독자별판독결과세포의종류 ( 계대수 ) 판독자 1 판독자 2 지방유래중간엽줄기세포 (1) 46,XY[20] 46,XY[20] 지방유래중간엽줄기세포 (2) 46,XY[20] 46,XY[20] 지방유래중간엽줄기세포 (3) 46,XY[20] 46,XY[20] 지방유래중간엽줄기세포 (4) 46,XY[20] 46,XY[20] 지방유래중간엽줄기세포 (5) 46,XY[20] 46,XY[20] 제대혈유래중간엽줄기세포 (1) 46,XY[20] 46,XY[20] 제대혈유래중간엽줄기세포 (2) 46,XY[20] 46,XY[20] 제대혈유래중간엽줄기세포 (3) 46,XY[20] 46,XY[20] 제대혈유래중간엽줄기세포 (4) 46,XY[20] 46,XY[20] 제대혈유래중간엽줄기세포 (5) 46,XY[15] 46,XY[11] 28 세포치료제시험정보집 Ⅳ

식품의약품안전평가원 [ 그림 4.] 인시투염색체분석법을이용한 karyogram( 예시 ) 5 결론 >> 여러종류의중간엽줄기세포를대상으로인시투염색체분석법을적용하였다. 판독자에따라핵형결과의차이는없었으나, 계수된세포의수의차이가보여, 가능한 2명이상의판독자가실험에관여하고판독함으로써결과의신뢰성을향상시킬수있을것으로판단된다. 줄기세포치료제의유전체안정성평가시험 29

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줄기세포치료제의유전체안정성평가시험 [ 염색체핵형분석법 ] 발 행 일 발 행 인 편집위원장 편집위원 2014년 5월 16일식품의약품안전평가원장왕진호의료제품연구부장강신정 [ 첨단바이오제품과 ] 백선영, 류승렬, 김재옥, 이보연, 엄준호, 김병철, 박지원 [ 외부전문가 ] 서울대학교이동순, 줄기세포치료제심사평가연구사업단 발행부서 연락처 식품의약품안전평가원첨단바이오제품과 식품의약품안전평가원첨단바이오제품과 TEL 043) 719-4751~7 FAX 043) 719-4750