(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2012-0114105 (43) 공개일자 2012년10월16일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 15/70 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01) C12N 15/52 (2006.01) C12P 17/18 (2006.01) (21) 출원번호 10-2011-0031891 (22) 출원일자 2011 년 04 월 06 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 3 항 2011 년 04 월 06 일 (71) 출원인 강원대학교산학협력단 강원도춘천시강원대학길 1 ( 효자동 ) (72) 발명자 김명동 강원도춘천시후석로 186 번길 9 ( 석사동 ) 서동완 강원도춘천시공지로 317 번길 11, 양우아파트 10 5 동 1203 호 ( 효자동 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 (54) 발명의명칭재조합대장균을이용한세피아프테린의제조방법 (57) 요약 특허법인태동 은재조합대장균을이용한세피아프테린의제조방법에관한것으로, GTP 사이클로하이드로라아제 (cyclohydrolase) 1 및 6- 파이루보일테트라하이드로프테린신타아제 (pyruvoyltetrahydropterin synthase) 를발현하도록형질전환된재조합대장균에, GMP 키나아제 (kinase) 및뉴클레오사이드다이포스페이트키나아제 (nucleoside diphosphate kinase) 을과발현하도록추가로형질전환하면, 대조군에비해약 4 배높은수율로세피아프테린을생산할수있다. 대표도 - 도 2-1 -
(72) 발명자 박은희 강원도춘천시춘천순환로 42, 삼익 1 차 102 동 202 호 ( 석사동 ) 이하연 강원도원주시가현로 52-2 ( 가현동 ) 박시은 강원도춘천시퇴계로 220-19, 퇴계주공 3 차 301 동 703 호 ( 석사동 ) 이종섭 강원도춘천시지석로 29, 퇴계주공 5 차 516 동 1204 호 ( 석사동 ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 KRF-2008-313-C00555 부처명 교육과학기술부 연구사업명 지역혁신인력양성사업 연구과제명 미생물의대사공학적개량을통한 sepiapterin의대량생산및신규효능발굴원천기술개 발인력양성사업 주관기관 강원대학교산학협력단 연구기간 2009.05.01 ~ 2012.04.30-2 -
특허청구의범위청구항 1 재조합대장균을배양하여세피아프테린 (sepiapterin) 을제조하는방법에있어서, 상기재조합대장균은, GTP 사이클로하이드로라아제 (cyclohydrolase) 1 및 6-파이루보일테트라하이드로프테린신타아제 (pyruvoyltetrahydropterin synthase) 를발현하도록형질전환되고, GMP 키나아제 (kinase) 및뉴클레오사이드다이포스페이트키나아제 (nucleoside diphosphate kinase) 를과발현하도록형질전환된재조합대장균인것을특징으로하는세피아프테린의제조방법. 청구항 2 제1항에있어서, GTP 사이클로하이드로라아제 (cyclohydrolase) 1 및 6-파이루보일테트라하이드로프테린신타아제 (pyruvoyltetrahydropterin synthase) 를발현하도록대장균을형질전환하는것은, GTP 사이클로하이드로라아제 (cyclohydrolase) 1 를암호화하는유전자및 6-파이루보일테트라하이드로프테린신타아제 (pyruvoyltetrahydropterin synthase) 를암호화하는유전자를동일한벡터에삽입하여대장균내에삽입시킴으로써수행하되는것을특징으로하는세피아프테린의제조방법. 청구항 3 제1항에있어서, GMP 키나아제 (kinase) 및뉴클레오사이드다이포스페이트키나아제 (nucleoside diphosphate kinase) 를과발현하도록대장균을형질전환하는것은, GMP 키나아제 (kinase) 를암호화하는유전자및뉴클레오사이드다이포스페이트키나아제 (nucleoside diphosphate kinase) 를암호화하는유전자를동일한벡터에삽입하여대장균내에삽입시킴으로써수행되는것을특징으로하는세피아프테린의제조방법. 명세서 [0001] 기술분야 은세피아프테린의제조방법에관한것으로, 더욱상세하게는재조합대장균을이용한세피아프테린의 제조방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] 배경기술세피아프테린 (sepiapterin) 은테트라하이드로비오프테린 ( tetrahydrobiopterin, BH4) 의전구체이다. 테트라하이드로비오프테린은고등생물의페닐알라닌하이드록시라아제 (phenylalanine hydroxylase), 타이로신하이드록시라아제 (tyrosin hydroxylase), 트립토판하이드록시라아제 (tryptophan hydroxylase) 와같은방향족아미노산의수산화효소와니트로옥사이드신타아제 (nitro oxide synthase) 에대한필수적인조효소로알려져있다. 테트라하이드로비오프테린은곰팡이를포함한진핵생물에서흔히나타나지만, 테트라하이드로비오프테린의배당체형태를생산하는클로로비움속 (Chlorobium sp.) 과시아노박테리아 (Cyanobacteria) 와같은일부박테리아를제외하고는원핵세포에테트라하이드로비오프테린이존재한다는보고는없다. 테트라하이드로비오프테린이결핍되면, 신생아간에서페닐알라닌하이드록시라아제의활성이 - 3 -
감소하여, 혈중페닐알라닌농도가증가하고, 뇌혈관장벽을통과하여중추신경계를손상시키며, 뇌에축적된 후지능저하, 경련및페닐케톤뇨증질환을야기시킨다. [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] 타이로신하이드록시라아제와트립토판하이드록시라아제는뇌에서신경전달물질인세로토닌, 도파민의생합성에관여하기때문에, 테트라하이드로비오프테린의결핍은도파반응성이긴장증과파킨슨병을포함한여러가지의신경질환을유발할수도있다. 또한, 테트라하이드로비오프테린는 NO 합성의필수조효소로서, 재관류손상과관련한혈관내피세포의기능장애및국소빈혈과도연관이있다. 테트라하이드로비오프테린의이용률이감소할때, NO 신타아제는 NO보다과산화음이온의생성을촉진하며, 과산화음이온은빠르게 NO와반응하여재관류손상을증가시키는독성의과산화질산염을생성시킨다. 상기에서언급한것과같은중요한역할을하는테트라하이드로비오프테린은테트라하이드로비오프테린생합성경로의유전자결핍으로인한환자들을치료하기위한의약품 ( 일반명, sapropterin hydrochloride) 으로이용되고있다. 하지만, 테트라하이드로비오프테린은불안정하여, 아스코르브산과같은안정제를첨가하는데, 이는테트라하이드로비오프테린의기능을방해할수도있기때문에, 테트라하이드로비오프테린의전구체로서테트라하이드로비오프테린보다안정성이좋은세피아프테린이테트라하이드로비오프테린대체물질로주목받고있다. 세피아프테린은 GTP(Guanosine triphosphate) 로부터 GTP 사이클로하이드로라아제 (cyclohydrolase) 1 (GCH1) (EC 3.5.4.16) 과 6-파이루보일테트라하이드로프테린신타아제 (pyruvoyltetrahydropterin synthase, PTPS) (EC 1.1.1.153) 에의해서생합성된다. 테트라하이드로비오프테린의생합성에관련하는효소들의반응메카니즘은많은논문을통하여보고되어왔다 (Osamu T, Ryotaro Y, Ryo K, Ansda MH. 1986. Tryptophan degradation in mice initiated by indoleamine 2,3-dioxygenase, J Biol Chem 261: 3648-3653; Milstein, Kaufman S. 1989. Immunological studies on the participation of 6-pyruvoyl-tetrahydropterin (2 -oxo) reductase: an aldose reductase, in tetrahydrobiopterin biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun 165: 845850; Beat T, Gunter A, Nenad B. 2000. Tetrahydrobiopterin biosynthesis, regeneration and function. J Biochem 347: 116). GCH1과 PTPS 를정제하여테트라하이드로비오프테린의생합성에성공한사례는있으나 (Ashida A, Hatakeyama K, Kagamiyama H. 1993. cdna cloning, expression in Escherichia coli and purification of human 6-pyruvoyltetrahydropterin synthase, Biochem Biophys Res Commun 195: 1386-93), 테트라하이드로비오프테린생합성에고가의기질인 GTP가필요하기때문에, 이를산업적으로적용한사례는아직까지없다. 발명의내용 [0010] 해결하려는과제 이에의목적은대사공학적개량을통해 GCH1, PTPS 및 GTP 합성유전자로형질전환된재조합대장균을 이용하여세피아프테린의생산공정을개발하는데있다. [0011] [0012] [0013] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여은, 재조합대장균을배양하여세피아프테린 (sepiapterin) 을제조하는방법에있어서, 상기재조합대장균은, GTP 사이클로하이드로라아제 (cyclohydrolase) 1 및 6-파이루보일테트라하이드로프테린신타아제 (pyruvoyltetrahydropterin synthase) 를발현하도록형질전환되고, GMP 키나아제 (kinase) 및뉴클레오사이드다이포스페이트키나아제 (nucleoside diphosphate kinase) 를과발현하도록형질전환된재조합대장균인것을특징으로하는세피아프테린의제조방법을제공한다. 세피아프테린은리보오스-5-포스페이트 (ribose-5-phosphate) 로부터생합성되는데, 생합성경로는도 1a 및 1b에서보는바와같이 GTP(Guanosine triphosphate) 를경유한다. 도 1a 및 1b에약어로기재된효소들의이해를돕기위해관련효소들의전체명칭을하기표 1 및 2에기재한다. - 4 -
표 1 [0014] 리보오스 -5- 포스페이트에서 GTP 생성경로에관여하는효소 No. 유전자명 효소명 1 prs Ribose phosphate pyrophosphkinase 2 purf Amidophosphoribosyl transferase 3 purd GAR synthetase 4 purn GAR transformylase 5 purl FGAM synthetase 6 purm AIR synthetase 7 ADE2 AIR carboxylase 8 purc SAICAR synthase 9 purb Adenylosuccinase lyase 10 purh AICAR transformylase 11 puro IMP cyclohydrolase 12 guab IMP dehydrogenase 13 guaa GMP synthetase 14 gmk GMP kinase 15 ndk Nucleoside diphosphate kinase 표 2 [0015] GTP 에서세피아프테린생합성에관여하는효소 No. 효소명 ( 줄임 ) 효소명 ( 전체 ) 1 GCH1 Guanosine triphosphaste cyclohydrolase 1 2 PTPS 6-Pyruvoyltetrahydropterin synthase 3 SR Sepiapterin reductase 4 DHFR Dihydrofolate reductase 5 BGluT BH 4 :UDP-glucose-α-glucosyltransferase [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] 에서는상기표 1 및 2에기재된효소들중 GCH1 및 PTPS를발현시킨기존의재조합모델에, GTP 생성에관여하는 guab, guaa, gmk, ndk 유전자를각각또는병합하여추가로재조합시킨후, 세피아프테린의생산수율에끼치는영향을확인해보고자하였다. 실험결과, GMP 키나아제 ( 유전자명 : gmk) 및뉴클레오사이드다이포스페이트키나아제 ( 유전자명 : ndk) 가세피아프테린합성경로 ( 더욱구체적으로 GTP 합성경로 ) 상에서생산수율을높이기위한매우중요한효소에해당하고, GMP 신테타아제 ( 유전자명 : guaa) 및 IMP 데하이드로지나아제 ( 유전자명 : guab) 는생산수율의향상과는크게관련이없는것으로확인되었다. 대사공학적해석및조절을통해미생물에서특정물질을생산할때, 병목점에해당되는효소를규명하는것은재조합모델을구축함에있어서매우중요한데, 에서는세피아프테린합성경로 ( 특히, GTP 합성경로 ) 에관여하는효소중 GMP 키나아제및뉴클레오사이드다이포스페이트키나아제가병목점에해당하는것을유의적으로확인한것이다. 에서특징적으로사용되는재조합대장균은 GTP 사이클로하이드로라아제 1 및 6-파이루보일테트라하이드로프테린신타아제를발현하도록형질전환되고, GMP 키나아제및뉴클레오사이드다이포스페이트키나아제를과발현하도록형질전환됨에특징이있는데, GTP 사이클로하이드로라아제 1 및 6-파이루보일테트라하이드로프테린신타아제를각각암호화하는유전자는대장균내에존재하지않아외부로부터새롭게도입하여발현시켰고, GMP 키나아제및뉴클레오사이드다이포스페이트키나아제를각각암호화하는유전자는대장균내에존재하기때문에과발현시켰다. 에서사용한 ' 발현 ' 이라는용어는호스트균주에존재하지않는유전자를호스트에도입하여그 - 5 -
유전자가코딩하는효소를생산하는것을의미하고, ' 과발현 ' 이라는용어는호스트균주에존재하는대상유전 자를호스트에도입하여대상효소를자연상태보다많이생산하는것을의미한다. [0021] [0022] [0023] [0024] 한편, 에서형질전환에사용되는기술은공지의유전공학적기술을사용하였기때문에이에대한구체적기재는생략하기로한다. 또한, 에서재조합대장균의배양은대장균배양에관련되는공지의배지및공지의배양조건을그대로사용하기때문에, 이에대한구체적기재도생략하기로한다. 한편, 상기의세피아프테린제조방법에있어서, GTP 사이클로하이드로라아제 1 및 6-파이루보일테트라하이드로프테린신타아제를발현하도록대장균을형질전환하는것은, GTP 사이클로하이드로라아제 1을암호화하는유전자및 6-파이루보일테트라하이드로프테린신타아제를암호화하는유전자를동일한벡터에삽입하여대장균내에삽입시킴으로써수행하는것이바람직하다. 한편, 상기의세피아프테린제조방법에있어서, GMP 키나아제및뉴클레오사이드다이포스페이트키나아제를과발현하도록대장균을형질전환하는것은, GMP 키나아제를암호화하는유전자및뉴클레오사이드다이포스페이트키나아제를암호화하는유전자를동일한벡터에삽입하여대장균내에삽입시킴으로써수행하는것이바람직하다. [0025] [0026] 발명의효과 GTP 사이클로하이드로라아제 1 및 6-파이루보일테트라하이드로프테린신타아제를발현하도록형질전환된재조합대장균에, GMP 키나아제및뉴클레오사이드다이포스페이트키나아제를과발현하도록추가로형질전환하면, BH4 의전구물질인세피아프테린을 124.36 mg/l의농도로생산할수있는데, 이는기존의 GTP 사이클로하이드로라아제 1 및 6-파이루보일테트라하이드로프테린신타아제만을발현하도록형질전환된재조합대장균의생산수율인 32.66 mg/l 보다약 4배더높은수율이다. [0027] 도면의간단한설명 도 1 은리보오스 -5- 포스페이트로부터세피아프테린의생합성경로를보여주는데, 도 1a 는그중리보오 스 -5- 포스페이트로부터 GTP 를생성하는경로이고, 1b 는 GTP 로부터세피아프테린을생합성하는경로이다. 도 2 는유전자조합별세피아프테린의생산수율변화를보여준다. [0028] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하, 의구성을하기실시예를들어상세히설명하고자한다. 다만, 의권리범위가하기실시예 에만한정되는것은아니고, 이와등가의기술적사상의변형까지를포함한다. [0029] [0030] [0031] [0032] 제조예 1: 형질전환용벡터의제조세피아프테린생산에관여하는유전자인 GCH1과 PTPS를포함하는플라스미드 'pet-28a/ GCH1, PTPS' 는인제대에서분양받아사용하였다. (Woo HY, Kang JY, Choi YK, Park YS. 2002. Production of sepiapteirn in Escherichia coli by coexpression of cyanobacterial GTP cyclohydrolase I and human 6- pyruvoyltetrahydropterin synthase. Applied and Enviromental Microbiology 68: 3138-3140). 한편, pacyc Duet-1을모벡터로사용하여이. 콜라이 (E. coli) K-12에서유래된 gmk, guaba, ndk 유전자를클로닝하였다. GMP를 GDP로전환시키는 gmk를 pacyc Duet-1 벡터에클로닝하기위하여이. 콜라이 (E. coli) K-12을 gmk_f 프라이머와 gmk_r 프라이머로 PCR하였다. PCR 반응조건은전처리변성단계 (94, 5분 ), 변성 (94, 30초 ), 어닐링 (58, 30초 ), 증폭 (72, 30초 ) 으로 30회를수행하였으며, 마지막으로 72 에서 5분간최종연장을하여 PCR반응을종결하였다. 증폭된 gmk 유전자는 pacyc Duet-1 벡터를 NcoI, PstI으로잘라클로닝하였다. 한편, IMP를 XMP로전환시키는유전자 guab와, XMP를 GMP로전환시키는유전자 guaa는이. 콜라이 (E. - 6 -
coli) K-12에서유전자사이의거리가매우짧기때문에동시에 guaba_f 프라이머와 guaba_r 프라이머로 PCR 하였다. PCR 반응조건은전처리변성단계 (94, 5분 ), 변성 (94, 30초 ), 어닐링 (62, 30초 ), 증폭 (72, 3 분 ) 으로 30회를수행하였으며, 마지막으로 72 에서 5분간최종연장을하여 PCR반응을종결하였다. 증폭된 guaba 유전자는 pacyc Duet-1 벡터를 NdeI, XhoI으로잘라클로닝하였다. [0033] [0034] [0035] 한편, guaba와 gmk를동시에발현시키기위하여 gmk 유전자를포함한 pme782 재조합벡터에 guaba를 PCR한절편을클로닝하였다. 한편, GDP를 GTP로전환시키는유전자 ndk를발현시키기위하여앞서만든 3개의재조합벡터와 pacyc Duet-1에각각클로닝하였다. 이. 콜라이 (E. coli) K-12을 ndk_f 프라이머와 ndk_r 프라이머로 PCR 하여 ndk 절편을얻었다. PCR 반응조건은전처리변성단계 (94, 5분 ), 변성 (94, 30초 ), 어닐링 (60, 30초 ), 증폭 (72, 30초 ) 으로 30회를수행하였으며, 마지막으로 72 에서 5분간최종연장을하여 PCR반응을종결하였다. 각각의벡터를 HindⅢ, NotI으로잘라수득한 ndk 절편을삽입하였다. 위와같은방법으로세피아프테린생성에관여하는 4개의유전자를이용하여 7개의플라스미드를만들었다. 구축된벡터및이때사용된프라이머는하기표 3에기재하였다. [0036] 표 3 에서사용한프라이머및구축된플라스미드 PCR 프라이머 gmk_f gmk_r guaba_f guaba_r ndk_f ndk_r 플라스미드 pet-28a/ GCH1, PTPS pacyc Duet-1 pme782 PME864 pme868 pme991 pme995 pme998 pme987 PCR 프라이머및플라스미드의특성 5-aaggccatgggcatggctcaaggcacgcttta-3 5-ccttctgcagtcagtctgccaacaatttgc-3 5-aaggcatatgatgctacgtatcgctaaagaag-3 5-ccttctcgagtcattcccactcaatggtag-3 5-aaggaagcttaaggagatataatggctattgaacgtacttttt-3 5- cctt gcggccgcttaacgggtgcgcgggca-3 pet-28a/gch1, PTPS, Kan r two IPTG inducible T7 promoters with two MCS, p15a replicon, Cm r pacycduet-1/gmk, Cm r pacycduet-1/guaba, Cm r pacycduet-1/gmk, guaba, Cm r pacycduet-1/ndk, Cm r pacycduet-1/gmk, ndk, Cm r pacycduet-1/guaba, ndk, Cm r pacycduet-1/gmk, guaba, ndk, Cm r 유래 Woo et al., 2002 Novagen [0037] [0038] [0039] 실시예 1: 재조합대장균을이용한세피아프테린의생산본실시예에서는 gmk, guaba, ndk 각각의유전자들이세피아프테린의생산에끼치는영향을알아보고자하였다. 상기제조예 1에서만들어진 7개의플라스미드 (pme782, PME864, pme868, pme991, pme995, pme998, pme987) 와 'pet-28a/gch1, PTPS' 플라스미드를각각동시에이. 콜라이 (E. coli) BL21(DE3) 에형질전환하였다. 대조군으로 'pet-28a/gch1, PTPS' 와 pacyc Duet-1이동시에형질전환된재조합대장균을사용하였고, 실험군으로 'pet-28a/gch1, PTPS' 와 pme782, pme854, pme858, pme991, pme995, pme998, pme987이각각동시에형질전환된재조합대장균을사용하였다. - 7 -
[0040] LB(cm, kan) 배지에세포를전배양한후세포흡광도가 1.0~1.5 가될때, NUCA(glycerol 20 g/l, yeast extract 4 g/l, KH 2 PO 4 4 g/l, K 2 HPO 4 4 g/l, Na 2 HPO 4 2.8 g/l, (NH 4 ) 2 SO 4, 1.2 g/l, NH 4 Cl 0.2 g/l, MgSO 4?7H 2 O 2 g/l, casein hydrolysate 10 g/l, FeSO 4?7H 2 O, 40 mg/l, CaCl 2?2H 2 O, 40 mg/l, MnSO 4?5H 2 O, 10 mg/l, AlCl 3?6H 2 O 10 mg/l, CoCl 2?6H 2 O 4 mg/l, ZnSO 4?7H 2 O 2 mg/l, Na 2 MoO 4?H 2 O 2 mg/l, CuCl 2?H 2 O 1 mg/l, H 3 BO 3 0.5 mg/l) 배지 (Chloramphenicol 34 μg/ml, Kanamycin 30 μg/ml 첨가 ) 100 ml에초기농도 OD 600 =0.05 가되도록접종하였다. 세포흡광도가 0.6일때 0.1 mm IPTG를첨가하여재조합단백질을과발현시켰으며, 진탕배양기 (HB-201SF, HANBAEK scientific co., Bucheon, Korea) 를이용하여 200 rpm에서 24시간동안 37 로배양하였다. 배양후회수한세포는 1분간원심분리 (5415R, Eppendorf, Hamburg, Germany) 하여세포와상등액을분리하였다. 분리한상등액을가지고 HPLC로세피아프테린을정량분석하였다. [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] 분석조건은 Inertsil ODS-3 역상컬럼 (C18, 5 μm, 4.6 250 mm), 용매 12% 메탄올, 시료분석온도 40, 검출기 SPD-20A(420 nm), 용매유속 1.2 ml/min이었다. 세피아프테린의농도는구입한표준시료 (SIGMA, USA) 를기준으로결정하였다. 24시간배양결과 gmk, guaba, ndk 유전자가단독으로작용했을때는대조군에비해오히려세피아프테린의생성에저해를가져오는결과를가져왔다. ( 도 2). 그러나, 유전자가 2개이상클로닝된 pme995와, pme987는각각 124.36 mg/l, 128.54 mg/l의세피아프테린을생성하여대조군에비해세피아프테린의생성을촉진하는결과를보였다. 이는기존에알려진 GCH1 및 PTPS의발현을증대하여세피아프테린을생성하였을때 (32.66 mg/l) 보다약 4배더높은수율이다. pme995와 pme987의차이를보기위하여 PASW Statistics 18 프로그램을사용하여 Ducan의유의성검증을실시하였다. 그결과, 'pet-28a/gch1, PTPS' 및 'pme995' 이삽입된형질전환체와 'pet-28a/gch1, PTPS' 및 'pme987' 이삽입된형질전환체의세피아프테린의생성농도가유의적으로차이가나지않았다. 따라서, 생산성증대를위해굳이 guaba 유전자까지과발현시킬필요는없는것으로결론낼수있었다. 결국, 세피아프테린의최적생산을위해서는 'pet-28a/gch1, PTPS' 와 'pme995' 가동시발현된재조합대장균이가장적합한것이라할수있었다. 도면 도면 1a - 8 -
도면 1b 도면 2-9 -