RESEARCH ARTICLE 선학초에탄올추출물의미용기능성소재개발을위한연구 유민정 1 *, 정은숙 2 1 영남이공대학교박승철헤어과, 2 서울벤처정보대학원대학교뷰티산업학과 A Research for the Development of Beauty Functional Materials of Ethanol Extract of Agrimonia pilosa Min-Jeong Ryu 1 *, Eun-Suk Jeong 2 1 Department of the Park Seung Chol Hair, Yeungnam College of Science & Technology 2 Department of Beauty Industry, Seoul University of Venture & Information Abstract The development of a variety of cosmetic and beauty is being promoted as our understanding of the dermatology in differentiation of skin cells, the identification of aging, and the development of artificial skin cells, has advanced with the brilliant development of biotechnology. In this study, we examined the function of physiological act from outposts of Agrimonia pilosa extracted by ethanol. Electron donating ability was increased in proportion to the concentration of the antioxidant activity. When we measured polyphenols and flavonoids contents of Agrimonia pilosa, the result was respectively 15.1±1.5, 32.8±2.7 mg/ml. Cytotoxicity was not found under 5 μg/ml in concentration. The protective effect about damaged HaCaT cells by hydrogen peroxide increased in a dose dependent. And measuring anti-inflammatory activity, we could also know that NO production was significantly reduced within the concentration range. Thus, ethanol extract of Agrimonia pilosa was identified as a beauty functional material. Keywords: Agrimonia pilosa, Cosmetic, Antioxidant, Hydrogen peroxide, Anti-inflammatory 최근생명공학의발전과생활수준의향상으로평균수명이 증가된노령화사회로접어들면서아름답게나이를먹는것에 대한 ( 김태혁등, 11; 손은수등, 4) 미의욕구가강해지 고이러한추세에부응하여기능성화장품, 미용식품등의시장 규모가확대되어천연물을활용한미용기능소재분야의연구 는급속히진행되고있다. 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 은산소에서유 래된것들로서안전한분자상태인 triplet oxygen ( 3 ) 이체 내효소계, 환원대사, 화학약품, 공해물질, 광화학반응등의각 *Corresponding author: Min-Jeong Ryu, Department of the Park Seung Chol Hair, Yeungnam College of Science & Technology, Daegu 17 Hyeonchunh-ro, Nam-gu, 75-73, Republic of Korea Tel.: 82 53 65 9431, Fax: 82 53 626 583 E-mail: jemine6@hanamil.net Received May 23, 12; Revised September 26, 12; Accepted October 8, 12; Published November 3, 12 종물리, 화학및환경적요인등에의하여생성되며 hydroxyl radical (OH ), nitricixide radical (NO ), superoxide anion radical ( -), peroxyl radical (H ) 과같은자유라디칼들과라디칼의형태가아닌과산화수소 (H 2 ), hypochlorous acid (HOCl), single oxyen ( 1 ) 과오존 (O 3 ) 등이있다 ( 최원식등, 2). 이러한활성산소는사람의피부에항산화방어막으로구축되어있지만계속적인자외선노출로생성된과잉의활성산소는피부의효소적그리고비효소적항산화막을파괴시켜세포의성분들에대한손상을야기하여피부의지질과산화, 단백질산화, 탄력섬유인콜라겐과엘라스틴의사슬절단및비정상적인교차결합, 히아루론산사슬의절단, 멜라닌생성반응촉진, DNA 산화와같은피부구성성분들의손상이일어나주름및기미 주근깨등의피부노화가가속화된다 ( 안봉전등, 4). 또한활성산소종이정상적으로소거되지않았을때잔존하는자유라디칼에의해산화적스트레스를받게됨으로써다른질병의원인이되기도한다 ( 민경진등, 8; 최원식등, 2; Halliwell, 1996). www.kosac.or.kr 757
천연물을이용한기능성화장품소재개발을위한연구로는황백열수추출물 ( 배인숙등, 12), 소리쟁이추출물의항균효과 ( 박주아과최미옥, 11), 울금 ( 박은영등 1) 과민들레분획물 ( 강정란과유선미, 9) 등의미백효과, 연잎추출물의여드름피부개선효과 ( 이선숙등, 12), 벚나무잎과어린가지추출물의항산화활성효과 ( 김숙하등, 1) 등이알려져있다. 따라서본연구에서는예부터민간요법, 녹즙등으로널리이용되어왔고, 폐암, 간암, 식도암, 종양, 통증제거, 지사, 토혈, 혈뇨, 자궁출혈등에치료약물로서널리사용되고있는 ( 신민교, 1997) 선학초 (Agrimonia pilosa) 전초를에탄올로추출하여생리활성기능에대하여검토하여화장품산업및식품산업등의미용기능성소재로의적용가능성을검색하고자한다. 1. 재료및시료의추출본실험에서사용한선학초는시중 ( 전남생약조합, 화순 ) 을통해서구입하였다. 추출방법으로 heating mentle에서시료중량의약 1배의 ethanol로 3회반복환류추출하였다. 추출액은 filter paper (Whatman No. 2, Advantec) 를이용하여여과한후 rotary evaporator (EYELA, Japan) 로감압농축하여에탄올을완전히제거한후동결건조하여 - 에보관하여사용하였다. 2. 총폴리페놀함량측정총폴리페놀함량은 Folin-Denis법에따라측정하였다. 추출물.1 g에 methanol 1 ml을가하여 7 에서 3분동안추출한후 1 mg / ml로희석하여사용하였다 (Gutfinger, 1981). 검액 5 μl에증류수 65 μl를넣은후 Folin-Denis reagent를 5 μl가하여 3분동안실온에서반응시킨다. 반응시킨후 1% Na 2 Co 3 포화용액을 μl을첨가하고, 최종볼륨을 1 ml로맞추기위해증류수 15 μl을넣어잘혼합시켰다. 37 water bath에서 1시간반응시킨후 725 nm에서흡광도를측정하였다. 표준곡선은 tannic acid (Sigma Co., USA) 를이용하였다. 4. 전자공여능측정항산화활성검색은 DPPH법을이용하여시료의 radical 소거효과를측정하는 Blois의방법을변형하여측정하였다 (Blois, 1958). 1,1-diphenyl-2,5-picrylhydrazyl (DPPH) 용액 μm과농도별추출물을각각 μl씩취하여혼합한후 3 분간암상태에서방치한후잔존 radica 농도를 microplate reader (Molecular Devies, USA) 를이용하여 517 nm에서측정하였다. IC 5 은 DPPH 농도가 1/2로감소하는데필요한시료의양 ( μg ) 으로나타내었다. 항산화물질로잘알려진 Butylated Hydroxy Toluene (BHT), Ascorbic acid 와비교하였다. 5. 세포배양본실험에사용된세포주는인간유래 Skin keratinocyte인 HaCaT 세포주와마우스의 RAW 264.7 대식세포를 Dulbecco`s Modified Eagle`s medium (DMEM) 배지에 1% Fetal Bovine Serum (FBS) 와항생제 (Antibiotic antimycotic) 를첨가하여생육배지로사용하였고, 37, 5% C 의습윤화된 incubator 에서적응시켜배양하였다. 세포는 2 3일마다 culture dish의 % 정도까지자랐을때계대배양하였다. 6. 세포생존율측정선학초에탄올추출물이 HaCaT 세포주와 RAW 264.7 대식세포에미치는생존율측정은 Mosmann의방법 (1883) 에의하여실시하였다. 96well plate 에 logarithmic phase 에도달한세포를 3 1 4 cell/well의농도가되도록조절하여분주후 24 시간배양하여부착화및안정화를시행하였다. 24시간의배양이끝난후추출물농도 5, 1,, 5,, μg / ml되게배양액에희석하여세포주에처리한후 48시간동안배양하였다. 배양완료후각 well에 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltertrazoliumbromide (MTT) 용액 (5 mg / ml in PBS) 1 μl씩을가해주고, 다시 37, 5% C 의습윤배양기에서 4 시간동안반응하여 MTT가환원되도록하였다. 각 well에생성된 formazan 결정을 DMSO 15 μl로잘녹여서 microplate reader (Molecular Devices, USA) 를이용하여 5 nm에서흡광도를측정하였다. 3. 총플라보노이드함량측정총플라보노이드함량은 Davis 등의방법에따라, 추출물.1 g에 methanol 1 ml을가하여 7 에서 3분동안추출한후 1 mg / ml로희석하여사용하였다 (Swaim et al, 1959). 검액 μl에 1 ml의 diethylene glycol을첨가하고다시 1N NaOH μl을넣어잘혼합시켜 37 water bath에서 1시간반응시킨후 4 nm에서흡광도를측정하였다. 표준곡선은 naringin (Sigma) 를이용하였다. 7. H 2 에의한세포손상보호효과측정 H 2 에의한 HaCaT 세포손상보호효과를관찰하기위하 여 O Toole 등의방법을응용하여실험하였다. 96 well plate 에 HaCaT 세포를 well 당 3 1 4 cell/ well 로분주하고, 24 시간 을배양하여부착및안정화를시행하였다. 24 시간의배양이 끝난후, 선학초에탄올추출물을, 5, 1,, 5 μg / ml의농 도를 2 시간전처리하여배양액을씻어낸후, 5 μm 의 H 2 를함유한배양액을투여하여 24 시간동안반응시킨다음 MTT 758 www.kosac.or.kr
선학초에탄올추출물의미용기능성소재 assay 로생존율을측정하였다. 8. 항염증활성측정 RAW 264.7 세포로부터생성된 NO 의양은 Griess 시약을 이용하여세포배양액중에존재하는 N- 의형태로서측정 하였다. RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를이용하여 1 1 5 cell/well 로조절한후 24 well plate 에접종하고 37, 5% C 의항온기에서배양하였다. 세포에선학초에탄올추출물, 5, 1,, 5 μg / ml의농도를전처리하고 1 시간후 1 μg / ml 의 LPS 를처리하여 18 시간배양하였다. 세포배양상등액과동 량의 Griess 시약을혼합하여 96 well plates 에서 1 분동안반 응시킨후 5 nm에서흡광도를측정하였다. Nitrite 의농도는 sodium nitrite (NaN ) 를 standard 로비교하였다. 9. 통계분석 본연구의모든실험결과는 3 회이상반복으로평균값으로 나타내었다. 대조군과실험군사이의통계학적유의성검정은 one-way ANOVA 검정을적용하였으며 p<.5 수준에서유의 성검정을실시하였다. 1. 수율및총폴리페놀및플라보노이드함량 선학초는장미과에속하는다년생숙근초로서용아, 용아초, 황아초, 지선초, 짚신나물등으로부르기도한다 ( 김대성등, 1). 선학초에탄올추출물의수율은건시료 g 을 3 회 반복하여추출한후감압농축하여동결건조된무게를측정한 결과 8 g 을얻어수율 15% 의효율을보였다. 페놀성화합물은식물계에널리분포되어있는 2 차대사산물 의하나로서다양한구조와분자량을가지며, 이들은 phenolic hydroxyl 기를가지고있기때문에단백질등의거대분자들과 결합하는성질을가지며, 항산화, 항미생물활성효과등의생 리활성기능도가진다 ( 문지숙등, 4). 선학초추출물의폴 리페놀과플라보노이드의함량을측정한결과각각 15.1± 1.5, 32.8±2.7 mg /g 로나타났다 (Table 1). 이결과는황초롱 등 (11) 이보고한미나리에탄올추출물의 37.5, 26.5 mg /g Table 1. Amount of Total phenolics and flavonoid of Agrimonia pilosa ethanol extract. Yields (%) phytochemical (mg/g plant extract) 1) Total phenolics Total flavonoids 15 15.1 1.5 32.8 2.7 1) The values represent the mean SD DPPH scavenging activity (%) 보다높게나타났다. 식물체가지니고있는페놀화합물의함 량을조사함으로서식물유래천연추출물의항산화활성을탐색 하는일자적인자료가될수있을것으로사료된다 ( 부희옥등, 9). 2. 전자공여능 항산화능은자유라디칼에전자를공여하여산화를억제하는 능력을평가한다. 항산화능측정방법으로는 DPPH 를이용하 는방법, β-carotene linoleate 를이용하는방법등다양한방 법이있다 ( 장상훈등, 8). 본연구에서는선학초에탄올추 출물의전자공여능을측정하게위하여 DPPH radical 에대한 소거활성을측정하였다. Figure 1 에서보는바와같이선학초 에탄올추출물은 12.5, 25, 5,,, μg / ml에서각 각 13.±.32, 25.87±.7, 45.12±.22, 74.9±.44, 88.15±.8, 9.13±.95% 로나타나농도에비례하여전자 공여능이증가하였고, 대조구인 Vit C 보다는낮게나타났으나 BHT 보다는높게나타났다. 이는오세인과이미숙 (8) 이보 고한뜰보리수에탄올추출물의 5 μg / ml에서 36.91% 보다 높게나타났다. 전자공여능은라디칼에수소를공여함으로써 지질과산화저해뿐만아니라, 체내에서발생하는활성산소종 을효과적으로제거할수있으며, 따라서선학초에탄올추출물 은천연항산화제로서사용이가능한것으로생각된다. 3. 세포생존율 Agrimonies pilosa Vit C BHT 12.5 25 5 Concentration ( / ) Figure 1. Effect of Agrimonia pilosa ethanol extract on DPPH. radical scavenging activity. Extracts were incubated with DPPH solution on at 37 for 3 min. Activities were determined by measurement of absorbance at 517 nm. Vit C: ascorbic acid group, BHT: Butylated Hydroxy Toluene group. The values represent the mean±sd for triplicate experiments. 선학초에탄올추출물이인간유래 Skin keratinocyte 인 HaCaT 세포주에미치는영향을알아보기위하여 μg www.kosac.or.kr 759
1 1 Cell viability (%) DPPH scavenging activity (%) 5 1 5 Concentration ( / ) Agrimonia pilosa H 2-5 1 5 Figure 2. Effect of ethanol extract from Agrimonia pilosa on the cell viability of HaCaT cells. HaCaT cells were treated with various concentrations (~ μg/ml) of Agrimonia pilosa ethanol extract for 24 hr. Cell viability was measured by MTT assay. The values represent the mean±sd for triplicate experiments. Figure 4. Protective effect of Agrimonia pilosa ethanol extracts against oxidative stress induced by H 2 in human HaCaT cells. Protective effect of Agrimonia pilosa extracts against oxidative stress induced by H 2 were measured using MTT method. Cells were incubated with Agrimonia pilosa extracts for 2 hr followed by treatment with 5 μm H 2 for 24 hr. / ml까지다양한농도로처리하여세포생존율을확인한결과 98.5±1.56, 97.1±2.73, 94.17±2.67, 9.15±1., 84.79±2.79, 78.42±.5% 의생존율이나타나농도가높을수록살아있는세포가상대적으로적은것으로나타나 5 μg / ml이하의농도에서는세포독성이관찰되지않았다 (Figure 2). 선학초에탄올추출물이마우스 RAW 264.7 대식세포에미치는영향을알아보기위하여 μg / ml까지다양한농도로처리하여세포생존율을확인한결과 97.45±1.3, 95.7± 1.7, 93.69±.36, 91.58±1.14, 87.8±.93, 67.8±1.1 생존율이나타나농도가높을수록살아있는세포가상대적으로적은것으로나타나 5 μg / ml이하의농도에서는세포독성이관찰되지않았다 (Figure 3). 따라서선학초에탄올추출물 5 5 μg / ml농도에서 H 2 에의한 HaCaT 세포주의보호효과및항염증활성측정시세포사멸에큰영향을주지않는것으로분석되었다. 4. H 2 에의한세포손상보호효과과산화물음이온 (superoxide anion), 과산화수소 (H 2 ), 수산기라디칼 (hydroxyl radical, OH) 등과같은반응성산소종 (ROS, reactive oxygen species) 은산화성스트레스를유발하는유해산소종의하나로서이들은세포내 DNA를공격하여여러종류의염기를손상시킴으로써돌연변이를유발시키는것으로알려져있다 ( 신성해등, 6; 유호진과우은란, 4). 임상에서는가장흔히사용되고있는국소소독제의하나이며 ( 박향준과이정현, 1999) 미용의헤어시술에서는퍼머넌트웨이브의 2제나, 염색 2제에사용되고있다. 과산화수소와같은활성산소종은단순히호흡과정에서생성되는부산물로여겨져왔 으나최근에이르러활성산소종은외부자극에의하여세포막에존재하는수용체를통하여일시적으로생성되며, 세포내활성산소의증가는세포의사멸과관계가있다 ( 박용훈등, 9). 따라서과산화수소에의해유도된 HaCaT 세포독성에대한선학초에탄올추출물의보호효과는독성을나타내지않은농도범위 (5~5 μg / ml ) 의시료를처리하여측정하였다. 각농도별로 2시간전처리한세포에 5 μm H 2 를함유한배양액을투여하여 24시간동안반응시킨다음 MTT assay로생존을측정하여생존율의차이를평가하였다. 그결과, 대조군의세포생존율을 % 로보았을때전처리하지않는실험군은 39.5% 세포생존율을나타낸반면, 선학초에탄올추출물은 5, 1,, 5 μg / ml전처리에서는각각 63.25±.62, 53.38±.43, 42.75±.84,.2±.8% 의생존율이나타나농도의존적으로보호효과가증대되었다 (Figure 4). 5. 항염증효과활성산소중하나이며, 최근염증유발에중요한역할을하는것으로알려진 nitric oxide (NO) 생성에대한선학초에탄올추출물의효과를알아보았다. 생선된 NO 양을 Giriess 시약을이용하여세포배양액중에존재하는 N -의형태로측정하였다 ( 이혜자등, 6). 선학초에탄올추출물 5. 1,, 5 μ g/ ml의처리농도에서 NO의생성억제효과를측정하였다. LPS (1 μg/ ml ) 처리후 NO의생성량은세포만배양하였을때세포배양에비하여약 14배이상증가되었다. 에탄올추출물은각각 9.32±.71, 7.41±.62, 5.41±.43, 3.9±.21 μm/ ml로측정되어농도의존적이고유의적으로 NO 생성이억제되는것으로나타났다. 이와같이선학초에탄올추출물은농도범위내에 7 www.kosac.or.kr
선학초에탄올추출물의미용기능성소재 1 1 Cell viability (%) DPPH scavenging activity (%) 5 1 5 Concentration ( / ) Agrimonia pilosa H 2-5 1 5 Figure 3. Effect of ethanol extract from Agrimonia pilosa on the cell viability of RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were treated with various concentrations (~ μg/ml) of Agrimonia pilosa ethanol extract for 24 hr. Cell viability was measured by MTT assay. The values represent the mean±sd for triplicate experiments. 서모두유의적으로 NO 생성을감소시키는것으로나타났다. 본연구에서는선학초에탄올추출물의생리활성기능을검 증하여미용식품및화장품산업등의미용기능성소재로의적 용시제품의안정성과기능성을가지는천연소재로서의역 할을검토하였다. 선학초추출물의폴리페놀과플라보노이드 의함량을측정한결과각각 15.1±1.5, 32.8±2.7 mg / ml로 나타났다. 항산화능은자유라디칼에전자를공여하여산화를 억제하는능력을평가하였다. 선학초에탄올추출물은 12.5, 25, 5,,, μg / ml에서각각 13.±.32, 25.87 ±.7, 45.12±.22, 74.9±.44, 88.15±.8, 9.13±.95% 로나타나농도에비례하여전자공여능이증가하였다. 세포독성이실험에서는 5 μg / ml이하의농도에서관찰되지 않았다. 따라서선학초에탄올추출물 5 5 μg / ml농도에서 과산화수소에의한 HaCaT 세포주의보호효과및항염증활성 측정시세포사멸에큰영향을주지않는것으로분석되었다. 그결과, 대조군의세포생존율을 % 로보았을때전처리하 지않는실험군은 39.5% 세포생존율을나타낸반면, 선학초에 탄올추출물은 5, 1,, 5 μg / ml전처리에서는각각.2±.8, 42.75±.84, 53.38±.43, 63.25±.62% 의생존율이 나타나농도의존적으로보호효과가증대되었다. LPS (1 μg/ ml ) 처리후 NO 의생성량은세포만배양하였을때세포배양에 비하여약 14 배이상증가되었다. 에탄올추출물은각각 9.32 ±.71, 7.41±.62, 5.41±.43, 3.9±.21 μm/ ml로측정 Figure 5. Effects of Agrimonia pilosa ethanol extract of on NO production in LPS-stimulated of RAW264.7 cell. Cells were treated with different concentrations of ethanol extract of Agrimonia pilosa for 1hr, and stimulated with or without LPS (1 μg/ml) for 24 hr. The nitric concentration in medium were determined by Griess assay. The value represents mean±sd of three different experiments. 되어농도의존적이고유의적으로 NO 생성이억제되는것으로 나타났다. 이와같이선학초에탄올추출물은농도범위내에서 모두유의적으로 NO 생성을감소시키는것으로나타났다. 이 상의결과를보면선학초에탄올추출물의생리활성의가능성 이확인되어추후보완연구가이루어진다면미용기능성소재로 가능할것이라사료된다. 강정란, 유선미. 민들레분획물이미백활성에미치는효과에대 한연구. 대한피부미용학회지, 7: 199-6, 9. 김대성, 김영목, 우원홍, 문연자. 선학초추출물의멜라닌합성 억제및항산화효과. 동의생리병리학회지, 24: 236-241, 1. 김숙하, 한효선, 김성건, 황완균. 벚나무잎과어린가지추출 물의항산화활성효과연구. 대한피부미용학회지, 8: 13-22, 1. 김태혁, 김정미, 백종미, 김태우, 김대중, 박정해, 최면. 짚신나 물물추출물의항산화활성및미백효과에관한연구. 한국 약용작물학회지, 19: 177-184, 11. 문지숙, 김선재, 박윤미, 황인식, 김의형, 박정욱, 박인배, 김 상욱, 강성국, 박양균, 정순택. 약용식물추출물에대한항 미생물활성검색과폴리페놀함량. 한국식품저장유통학회 지, 11: 7-213, 4. 민경진, 송진욱, 차춘근. 선학초추출물의항산화및항암활성. www.kosac.or.kr 761
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