대한내과학회지 : 제 78 권제 3 호 2010 원저 09-007 갑상선유두암에서 p16 INK4A 촉진자과메틸화와 p16 INK4A, cyclin D1 및 Rb 발현 계명대학교의과대학 1 내과학교실, 2 병리학교실 김윤정 1 김혜순 1 하유진 1 이호영 1 박근규 1 김미경 1 권선영 2 p16 INK4A promoter hypermethylation and expression of p16 INK4A, cyclin D1, and Rb in papillary thyroid carcinoma Yoon-Jung Kim, M.D. 1, Hye-Soon Kim, M.D. 1, Yu-Jin Ha, M.D. 1, Ho-Young Lee, M.D. 1, Keun-Gyu Park, M.D. 1, Mi-Kyung Kim, M.D. 1, and Sun-Young Kwon, M.D. 2 Departments of 1 Internal Medicine and 2 Pathology, Keimyung University School of Medicine, Daegu, Korea Background/Aims: Dysregulation of the cell cycle is believed to be important in human neoplasia. p16 INK4a, a regulator of the retinoblastoma protein, is inactivated by several mechanisms, including hypermethylation of the promoter. The aim of this study was to assess the relationship between p16 INK4a methylation status and the expression of p16 INK4a, cyclin D1, and retinoblastoma protein in papillary thyroid cancer. Methods: Thirty-five surgically resected papillary thyroid cancer cases treated at Keimyung University Dongsan Medical Center from Jan 2003 to Dec 2005 were included in the study. We examined promoter hypermethylation of p16 INK4a and immunohistochemically analyzed p16 INK4a, cyclin D1, and retinoblastoma protein expression. Results: Aberrant hypermethylation of 5 CpG islands of the p16 INK4a gene promoter was observed in 17 (48.6%) out of 35 cases, and the p16 INK4a protein was lost in 18 (51.4%) cases. With the exception of one case, p16 INK4a promoter hypermethylation correlated with the loss of p16 INK4a protein expression (p<0.0001). Overexpression of cyclin D1 was found in 27 (77.1%) cases and retinoblastoma immunostaining was detected in 10 (28.6%) cases. There was an inverse relationship between p16 INK4a and prb immunostaining (p<0.018, r=-0.398), and a strong direct correlation between cyclin D1 and prb immunostaining (p<0.0001, r=0.710). Cyclin D1 expression was significantly associated with the pathologic T stage of cancer (p=0.04). Conclusions: These data suggest that promoter hypermethylation is a major mechanism underlying the inactivation of p16 INK4a and alterations in the p16 INK4a /cyclin D1/retinoblastoma pathway, which are thought to be very important in papillary thyroid cancer. (Korean J Med 78:333-340, 2010) Key Words: Cyclin D1; Methylation; p16 INK4a ; Retinoblastoma; Thyroid Neoplasm Received: 2009. 1. 7 Accepted: 2009. 10. 26 Correspondence to Hye-Soon Kim, M.D., Department of Internal Medicine, Keimyung University School of Medicine, 194 Dongsan-dong, Jung-gu, Daegu 700-712, Korea E-mail: hsk12@kmu.ac.kr - 333 -
- The Korean Journal of Medicine: Vol. 78, No. 3, 2010 - 서론갑상선암은조직학적으로크게갑상선상피세포에서기원하는유두암, 여포암그리고미분화암과갑상선부여세포에서기원하여칼시토닌을분비하는갑상선수질암으로분류할수있다 1). 이중갑상선유두암은전체갑상선암의약 80% 이상을차지하며 10년생존율이 90% 이상으로보고되고있다 2). 세포주기에관여하는단백질의하나인 p16 INK4a 는 cyclin-dependent kinase (CDK) 를억제하는물질로 CDK4 및 CDK6와결합하여 cylind-cdk4 복합체의형성을저해하며, 결과적으로 Retinoblastoma (Rb) 유전자의인산화를억제하여세포주기의 G1기진행을차단하는종양억제인자이다 3). p16 INK4a 유전자의비활성은방광, 유방및전립선암등을비롯한암발생에관여하는것으로보고되고있으며, 이러한종양억제인자의비활성화기전으로는동종접합체결손, 유전자변이및촉진자의과메틸화등이있다 4,5). 최근 p16 INK4a 유전자비활성의원인으로동종접합체결손이나유전자변이등이없이 p16 INK4a 유전자촉진자부위의과메틸화로인한유전자의비활성화가폐암, 신경교종, 유방, 전립선암및신장암등의발생과연관이있다는연구들이보고되었다 6-8). Cyclin D1은 CDK4 및 CDK6와결합하여세포주기의 G1기진행을촉진하여종양의발생에관여한다. 종양억제인자 Rb 는저인산화형태에서세포주기의 G1 정지기의조절인자로작용하는데, p16 INK4a /cyclin D1/Rb 경로의이상은인간의종양발생에있어서세포주기조절기전에손상을가져와암발생에중요한인자로작용하는것으로알려져있다 9). 최근갑상선암발생이급격히증가하고있으나아직까지국내에서는갑상선암발생에있어서세포주기조절에관여하는경로의하나인 p16 INK4a /cyclin D1/Rb 이상에대한연구가이루어지지않았으므로갑상선유두암조직에서 p16 INK4a 촉진자의과메틸화여부와 p16 INK4a, cyclin D1 및 Rb의발현과의관계에대해알아보고암의임상양상과상관관계가있는지알아보고자하였다. 대상및방법 1. 대상환자환자는 2003년 1월부터 2005년 12월까지계명대학교동산의료원에서갑상선절제술후전형적인갑상선유두암으로진단된 35예를대상으로하였다. 환자들의임상정보는 의무기록조사를이용해수집하였고, 수술조직슬라이드를확인하였다. 암의병기는 American Joint Committee on Cancer (AJCC) 의 2002년권고안을따라분류하였다 10). 2. DNA 추출수술조직 1 cm 3 을파쇄기로균질화하고 75% 알코올 2 ml를첨가하여섞은후상온에서 10분간원심분리하여상층액을제거하고남은침전물을건조시켰다. TE9 용액 (10 mmol/l Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA, ph 8.9) 4.5 ml를첨가하여진탕및부유후 0.5 ml sodium dodecyl sulfate (SDS) 와 proteinase K 혼합액을넣고 60 에서 48~60시간반응시킨후다시 0.1 ml SDS 와 proteinase K 혼합액을첨가하여 60 에서 24~48시간반응시켰다. 10분간끓는물에담근후상온에서서서히식히고 phenol/chloroform/isoamyl alcohol 5 ml 를넣고혼합한후원심분리하고, 상부수액층을옮겨 10 mmol/l ammonium acetate 2 ml와무수알코올 20 ml를첨가하여섞은후 4 에서하룻밤동안반응시켰다. 10,000 g에서 60분간원심분리하여 DNA를침전시킨후 70% 알코올로세척하여건조시켜 500 μl LOTE (3 mmol/l Tris, 0.2 mmol/l EDTA, ph 7.5) 에녹여 4 에서보관하였다. 3. p16 INK4a 촉진자의메틸화분석 (methylation analysis) p16 INK4a 촉진자의메틸화는 Herman 등 11) 이발표한메틸화분석법을이용하여분석하였다. 메틸화된 cytosine은 bisulfied modification에따라 thymidine으로변환되나메틸화되지않은 cytosine은 uracil로변환되므로이를 PCR로증폭하여 cytosine의메틸화여부를확인하였다. 추출한 DNA를 sodium bisulfite, hydroquinone 그리고 sodium hydroxide와반응시킨후탈아미노반응으로메틸화하지않은 cytosine을 uracil로변환시켜 Wizard DNA purification kit (Promega, Madison, Wisconsin, USA) 를이용하여 DNA를분리하고, sodium hydroxide로탈술폰화반응을유도한후에탄올침천시켜 PCR 증폭을하였다. 메틸화된 DNA 증폭을위한 sense primer로 5 TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC3, antisense primer 는 5 GACCCCGAACCGCGACCGTAA3 를사용하였고, 메틸화되지않은 DNA 증폭에는 5 TTATTAGAGGGTGGG GTGGATTGT3 와 5 CAACCCCAACCACAACCATAA3 가각각사용되었다. PCR 완충액에 dntp 250 mmol/l, primer 10 pmol/l, DNA 50 ng, MgCl 2 1.25 mmol/l 그리고 Taq polymerase 0.5 U를 95 에서 5분반응시킨후 95 에서 30초, 65-334 -
- Yoon-Jung Kim, et al. p16 INK4A, cyclin D1, and Rb in papillary thyroid carcinoma - Table 1. Clinical data and pathological features No Sex Age Size (cm) pt * ET Multi LN MSP p16 cyclind1 prb 1 F 12 2.5 T2 N N N 1 0 1 0 2 F 53 2.0 T1 N ** Y Y 1 0 1 0 3 F 60 1.5 T3 Y Y N 1 0 1 0 4 F 50 1.6 T1 N Y Y 0 1 0 1 5 F 35 4.6 T3 Y N Y 0 1 1 0 6 F 33 2.2 T2 N N N 0 1 1 0 7 F 52 3.0 T2 N N N 0 1 0 1 8 F 19 2.5 T2 N N N 1 0 1 0 9 M 53 4.5 T3 N N N 1 0 1 0 10 F 34 0.8 T1 N N N 1 0 1 0 11 F 37 1.6 T1 N N N 0 1 0 0 12 F 51 1.1 T1 N N N 1 0 1 0 13 F 49 2.5 T2 N Y N 0 1 1 1 14 F 41 1.7 T3 Y Y N 0 0 1 0 15 F 63 2.5 T2 N Y N 0 1 1 0 16 F 49 1.1 T3 Y Y N 1 1 1 0 17 F 63 1.1 T3 Y Y N 0 1 1 0 18 F 69 1.9 T3 Y Y Y 1 0 1 1 19 M 54 2.6 T2 N N N 0 1 0 1 20 F 33 2.5 T2 N Y Y 1 0 1 0 21 F 53 2.0 T1 N N N 1 0 1 0 22 F 56 1.8 T1 N Y Y 0 1 0 1 23 F 45 1.5 T1 N Y N 0 1 0 1 24 F 51 4.8 T3 N N Y 0 1 1 0 25 F 63 2.2 T2 N Y N 1 0 1 0 26 F 72 1.8 T1 N Y N 0 1 0 1 27 F 30 1.4 T1 N N Y 1 0 1 0 28 F 42 1.5 T1 N N N 1 0 1 0 29 F 31 1.2 T1 N N Y 0 1 0 1 30 F 53 1.5 T1 N N N 1 0 1 0 31 F 57 2.0 T3 Y N Y 0 1 1 0 32 F 62 1.1 T1 N N N 0 0 1 1 33 F 33 2.9 T2 N N N 1 0 1 0 34 M 66 3.0 T3 Y N Y 1 0 1 0 35 F 43 2.2 T2 N N N 0 1 1 0 pt, pathologic tumor stage; ET, extrathyroidal extension; Multi, multicentricity; LN, lymph node metastasis; MSP, methylation; Y, yes; ** N, no; 1, expression; 0, nonexpression. 에서 30초, 72 에서 30초반응을 36회반복한후 72 에서 5분반응시켜 1% agarose gel에전기영동하였다. 4. 면역조직화학염색면역조직화학염색을위해갑상선절제술후파라핀으로 처리하여보관중인조직을사용하였다. 10% 포르말린용액에고정후파라핀포매된조직을 4 µm 두께의절편으로깎은후슬라이드에붙여 60 오븐에서 1시간동안가열하고 histoclear 와크실렌을 3:1로혼합된탈랍제 (dewaxing agent) 에 60 에서 3회, 실온에서 1회처리하여탈파라핀화하였다. - 335 -
- 대한내과학회지 : 제 78 권제 3 호통권제 595 호 2010 - Figure 1. Representative data for methylation-specific PCR for CpG islands of the p16 INK4a gene promoter in papillary thyroid cancer. The presence of a visible PCR product in lane U indicates an unmethylated gene; the presence of a product in lane M indicates a methylated gene. A B C Figure 2. Typical images of p16 INK4a, cyclin D1 and prb expression in papillary cancer by immunohistochemistry ( 100). (A) positive p16 INK4a immunostaining, (B) positive cyclin D1 immunostaining, and (C) positive prb immunostaining. 실온에서무수알코올 4회처리하여함수시키고내재성과산화효소활성을없애기위하여 0.3% H 2O 2-methanol을 40 에서 2분동안가한후완충액으로세척하였다. p16 INK4a, cyclind1 및 prb 발현을보기위해 CINtec TM p16 INK4a Histology Kit (Dako, USA), NCL-CyclinD1-GM (Novocastra Laboratories, UK) 및 anti-prb monoclonal antibody (BDbiosciences, USA) 를각각 1:40, 1:25 및 1:6,000으로희석하여사용하였다. 5. 통계분석임상양상사이의상관관계는 Pearson Chi-Square test로분석하였다. 대상군간의다양한변수비교에는 independent-samples t-test와 Pearson Chi-Square test를이용하였으며기대도수가 5 미만인경우에는 Fisher s exact test를사용하였다. 변수들의상관관계는 Pearson 상관분석으로평가하였다 (correlation coefficient, r). 통계처리는 SPSS 14.0 (SPSS Inc., Chicago, IL,USA) 을사용하였으며통계적유의수준은 p value 0.05 미만으로정하였다. 결과 1. 임상및병리학소견세계보건기구의조직학적분류에따라여포성변종, 원주 세포변종, 고형변종및유두상미소암등의아형을제외한전형적인갑상선유두암으로진단된환자 35명이연구에포함되었다 12). 평균연령은 47.6세였고, 이중남자가 3명, 여자가 32명이었다. AJCC 에따른암의병기및임상양상을표 1에정리하였다. 2. p16 INK4a 촉진자의메틸화분석 p16 INK4a 의발현이억제되는기전의하나인촉진자부위의과메틸화를분석한결과 p16 INK4a 유전자촉진자 5 CpG의과메틸화는 35명중 17명 (48.6%) 에서관찰되었다 ( 그림 1). 갑상선유두암에서 p16 INK4a 촉진자의과메틸화는한예를제외하고조직의 p16 INK4a 단백질소실과일치하였다 (p<0.0001). 3. p16 INK4a, cyclined1 및 prb 면역조직화학염색갑상선유두암조직에서 p16 INK4a, cyclin D1 및 prb 발현여부를면역조직화학염색을이용하여알아보았다. 갑상선유두암에서 p16 INK4a 단백질은 35명중 18명 (51.4%) 에서소실되었다 ( 그림 2A). 세포주기에서 cyclin D1은 CDK4 및 CDK6와결합하여 G1 S 기의과정을촉진하여종양의발생을유발시키게되는데, 이연구에서갑상선유두암환자 35 명중 27명 (77.1%) 에서 cyclin D1이과발현되었다 ( 그림 2B). E2F와복합체를형성함으로써세포주기 G1에서 S phase로 - 336 -
- 김윤정외 6 인. 갑상선유두암과 p16 INK4A, cyclin D1 및 Rb - Table 2. Relationship between p16 INK4a expression and clinicopathological parameters in papillary thyroid cancer + (n=17) p16 INK4a - (n=18) Tumor size 0.78 2.0 cm 9 11 >2.0 cm, 4 cm 6 6 >4 cm 2 1 LN metastasis 0.63 Absent 11 13 Present 6 5 Multiplicity 0.41 Absent 9 12 Present 8 6 pt stage 0.84 1 6 8 2 6 5 3 5 5 Extrathyroidal ext. * 0.93 Absent 13 14 * Extrathyroidal ext., extrathyroidal extension. p Table 3. Relationship between cyclin D1 expression and clinicopathological parameters in papillary thyroid cancer + (n=27) Cyclin D1 - (n=8) Tumor size 0.42 2.0 cm 14 6 >2.0 cm, 4 cm 10 2 >4 cm 3 0 LN metastasis 0.67 Absent 19 5 Present 8 3 Multiplicity 0.51 Absent 17 4 Present 10 4 pt stage 0.04 1 8 6 2 9 2 3 10 0 Extrathyroidal ext. * 0.09 Absent 19 8 Present 8 0 * Extrathyroidal ext., extrathyroidal extension. p 의진행을억제하는유전자인 Rb는 cyclin D1에의해인산화가되면 E2F에서분리되어세포주기조절기능을상실하게되는데 prb 면역조직화학염색이 35명중 10명 (28.6%) 에서관찰되었다 ( 그림 2C). prb와 p16 INK4a 발현은역비례관계였고 (p<0.018, r=-0.398), prb와 cyclind1 의발현은양의상관관계를보였다 (p<0.0001, r=0.710). 4. p16 INK4a, cyclined1 및 prb 발현여부에따른갑상선유두암의특성마지막으로 p16 INK4a, cyclined1 및 prb의면역조직화학염색결과와임상- 병리조직학적인자들과의상관관계에대하여조사하였다. 갑상선유두암조직에서 p16 INK4a 발현여부에따른갑상선유두암의특성을살펴본결과, p16 INK4a 단백질이소실된군과소실되지않은군에서암종의크기, 림프절전이, 다발성유무, 조직학적병기, 갑상선외조직침윤차이는통계적유의성이없었다 ( 표 2). 갑상선유두암조직에서 cyclin D1이발현된군과발현되지않은군사이에암종의크기, 림프절전이, 다발성유무그리고갑상선외조직침윤은차이가없었으나, 조직학적병기는 cyclin D1 발현군에서 유의하게높았다 (p=0.04, 표 3). 갑상선유두암조직에서 prb 발현여부에따른차이는관찰되지않았다 ( 표 4). 고찰갑상선유두암은내분비계에발생하는악성종양중가장흔한암으로, Rearranged in transformation/papillary thyroid carcinomas (RET/PTC) 유전자재배열이서구지역성인 2.6~ 34% 에서 ras 변이는 10~20% 로보고되고있고, BRAF 변이는 29~83% 로가장흔히관찰되는유전자변이로생각되고있다 13,14). 국내에는갑상선유두암에서 BRAF 변이에따른암발생및예후인자와관련된보고가있었으며 15), 정등 16) 은갑상선유두암에서 p53, p21과 bcl-2 종양단백질의발현과의관계에대한조사를통해 p21 염색양성군에서종양의다발성이나갑상선외조직침범이통계적으로의미있게증가함을보고하였다. 암의발생및진행에있어서종양억제유전자의비활성화가중요한역할을하는것으로알려져있는데, 최근종양 - 337 -
- The Korean Journal of Medicine: Vol. 78, No. 3, 2010 - Table 4. Relationship between prb expression and clinicopathological parameters in papillary thyroid cancer + (n=10) prb - (n=25) Tumor size 0.43 2.0 cm 7 13 >2.0 cm, 4 cm 3 9 >4 cm 0 3 LN metastasis 0.49 Absent 6 18 Present 4 7 Multiplicity 0.13 Absent 4 17 Present 6 8 pt stage 0.21 1 6 8 2 3 8 3 1 9 Extrathyroidal ext. * 0.25 Absent 9 18 Present 1 7 * Extrathyroidal ext., extrathyroidal extension. 억제유전자인 p16 INK4a 촉진자부위의과메틸화가암발생에기여한다는연구들이보고되고있다 6-8). p16 INK4a 은염색체 9p21에존재하며 156개의아미노산으로구성된핵단백질로, CDK4/6에특이적으로결합하여 CDK4/6/cyclinD의결합을억제하고결과적으로 Rb의인산화를막음으로써 Rb와 E2F 의결합을지속시켜세포주기의진행을억제하는역할을한다 17). p16 INK4a 의변이및유전자소실은여러상피세포암, 췌장암및흑색종등에서발견되며, 갑상선종양에서도여포암과유두암의 2/3 및 1/2에서 p16 INK4a 유전자결손이관찰된반면정상조직에서는 p16 INK4a 유전자결손이없음을보고하였다 18). Ram 등 19) 은 44명의갑상선유두암조직에서 p16 INK4a 단백질발현과 mrna 변이및촉진자부위의과메틸화를분석하였으며, p16 INK4a 유전자변이가갑상선유두암의병리기전에중요한작용을할것이라제시하였다. 정상및갑상선종양조직을비교한연구에서는 p16 INK4a 촉진자의과메틸화가 p16 INK4a 단백질의소실과연관이있었으며, 종양의병기와환자의나이및성별에따른과메틸화차이는관찰되지않았다고보고하였다 8). 또한, 갑상선유두암 39예에 p 서 p16 INK4a, p14 ARF, RB1, p27 KIP1 및 O 6 -MGMT 등의유전자들을분석한연구에서는 p14 ARF 유전자의변이가갑상선유두암의만성염증화에관여하는반면 p16 INK4a 유전자의과메틸화가종양의성장에관여함을발표하였다 20). 이는특정종양억제유전자의과메틸화가종양의생성, 분화및진행초기에중요한소견임을나타내는결과라하겠다. 본연구에서는면역화학염색결과 p16 INK4a 단백질의발현이 35명중 18명 (51.4%) 에서소실되어갑상선유두암에서 p16 INK4a 단백질의소실이종양의발생및진행에관여하는인자의하나라예측할수있었으며, p16 INK4a 단백질이소실된조직 18예중 17 예에서촉진자의 5 CpG 부위과메틸화가관찰되어 p16 INK4a 발현을억제하는주요원인이촉진자과메틸화임을알수있었다. 갑상선유두암조직에서 Cycine D1의면역조직화학염색을실시한결과 35명중 27명 (77.1%) 에서발현이증가하였고, 암의조직학적병기와통계적으로유의한상관관계를보였고, 갑상선외침윤은증가하는경향이관찰되었다. 염색체 11q13에위치하는 cyclin D1은세포주기에서 CDK4/6와복합체를형성하여 Rb 유전자를인산화시킴으로써세포주기 G1 phase로의이동을가속화시켜종양유전자의과발현을통해다양한암을유발하는것으로알려져있다 21). 135명의폐암조직에서 cyclin D1의발현이 24.5% 에서관찰되었으며종양의분화도및림프절전이와연관성을보이고낮은생존율을나타내는연구가보고된바있으며 22), Carlos A 등 23) 은 35 명의갑상선유두암환자를대상으로 cyclin D1의과발현및이와관련된병기및예후인자들을조사한결과 cyclin D1의과발현은종양의재발및사망에밀접한관계가있음을보고하였다. 종양억제유전자 Rb는염색체 13q14에존재하며 110~114 KD로이루어진핵단백질로모든세포에서발현되며비인산화형태에서종양억제유전자로작용한다. 비인산화형태의 Rb는 E2F와복합체를형성함으로써세포주기 G1에서 S phase로의이동을억제하게되는데, cyclin D1의과발현은 Rb를인산화시킴으로써 E2F와의복합체형성을억제한다 9). Anwar 등 24) 은갑상선유두암에서 Rb 활성의감소를관찰하였고, Rb의활성여부가양성및악성갑상성질환의구별에도움이된다고발표하였다. 본연구에서도 prb의발현이갑상선유두암환자 35명의조직중 10명 (28.6%) 에서관찰되었으며 cyclin D1의발현과유의한상관관계를보였다. 이는 cyclin D1의과발현으로인한 Rb의인산화가세포주기조절에이상을초래하게되는데, 갑상선유두암조직에서 p16 INK4a - 338 -
- Yoon-Jung Kim, et al. p16 INK4A, cyclin D1, and Rb in papillary thyroid carcinoma - 의과메틸화로 p16 INK4a /cyclin D1/Rb 경로의이상이발생함을알수있었다. 결론적으로, p16 INK4a 촉진자부위의과메틸화로인한 p16 INK4a 감소가세포주기조절기전에손상을가져와암발생의중요한인자중하나로작용할것으로예측되며, 특히 cycine D1의과발현은암의조직학적병기와유의한상관관계를보였고, 갑상선외침윤이증가하는경향이관찰되어갑상선유두암예후와관련한예측인자및치료목표로서의가능성을제시하여주었다고생각된다. 앞으로더많은갑상선유두암조직에서 p16 INK4a, cyclin D1 및 Rb를비롯한세포주기의이상을알아보고치료경과및예후와의연관성을관찰하는것이갑상선유두암의발생기전을이해하고치료및예후를판정함에있어서도움을줄것으로사료된다. 요약목적 : 종양억제인자 Rb는세포주기의 G1 정지기의조절인자로작용하며 p16 INK4a /cyclin D1/Rb 경로의이상은인간의종양에중요한인자로작용하는것으로알려져있다. p16 INK4a 는촉진자의과메틸화를포함한여러가지기전으로비활성화된다. 이연구는갑상선유두암에서 p 16INK4a 촉진자의과메틸화여부와 p16 INK4a, cyclin D1 및 Rb의발현양상에대해알아보고자하였다. 방법 : 2003년 1월부터 2005년 12월까지계명대학교동산의료원에서갑상선절제술후전형적인갑상선유두암으로진단된 35예를대상으로하였다. p16 INK4a 촉진자의과메틸화여부를관찰하고, 조직에서 p16 INK4a, cyclin D1 및 Rb의단백질발현을면역조직화학염색을이용하여분석하였다. 결과 : p16 INK4a 유전자촉진자의 5 CpG 부위과메틸화는 35명중 17명 (48.6%) 에서관찰되었으며, p16 INK4a 단백질은 35명중 18명 (51.4%) 에서소실되었다. 한예를제외하고는, p16 INK4a 촉진자의과메틸화는 p16 INK4a 단백질소실과일치하였다 (p<0.0001). cyclin D1의과발현은 35명중 27명 (77.1%) 에서관찰되었고, prb 면역염색은 35명중 10명 (28.6%) 에서관찰되었다. prb와 p16 INK4a 면역염색은역비례관계였으며 (p<0.018, r=-0.398), prb와 cyclind1 면역염색은양의상관관계를보여주었다 (p<0.0001, r=0.710). 또한 cyclind1 의발현은종양의 T 병기와연관성이있었고 (p=0.04), 갑상선외침윤이증가하는경향이관찰되었다. 결론 : 촉진자의과메틸화에의한 p16 INK4a 비활성화및이와연관된 cyclin D1 과발현및 Rb 인산화가갑상선유두암 병인의주요한기전의하나일가능성을제시하고있다. 중심단어 : Cyclin D1; 메틸화 ; p16 INK4a ; Retinoblastoma; 갑상선신생물 REFERENCES 1) Hundahl SA, Fleming ID, Fremgen AM, Menck HR. A National Cancer Data Base report on 53,856 cases of thyroid carcinoma treated in the U.S., 1985-1995. Cancer 83:2638-2648, 1998 2) Gilliland FD, Hunt WC, Morris DM, Key CR. Prognostic factors for thyroid carcinoma: a population-based study of 15,698 cases from the Surveillance, Epidemiology and End Results (SEER) program 1973-1991. Cancer 79:564-573, 1997 3) Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature 366:704-707, 1993 4) Cairns P, Polascik TJ, Eby Y, Tokino K, Califano J, Merlo A, Mao L, Herath J, Jenkins R, Westra W, Rutter JL, Buckler A, Gabrielson E, Tockman M, Cho KR, Hedrick L, Bova GS, Isaacs W, Koch W, Schwab D, Sidransky D. Frequency of homozygous deletion at p16/cdkn2 in primary human tumours. Nat Genet 11:210-212, 1995 5) Herman JG, Merlo A, Mao L, Lapidus RG, Issa JP, Davidson NE, Sidransky D, Baylin SB. Inactivation of the CDKN2/p16/MTS1 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers. Cancer Res 55:4525-4530, 1995 6) Calabro V, Strazzullo M, La Mantia G, Fedele M, Paulin C, Fusco A, Lania L. Status and expression of the p16ink4 gene in human thyroid tumors and thyroid-tumor cell lines. Int J Cancer 67:29-34, 1996 7) Kim DH, Cho M, Kim DH, Joo KR, Park NH, Yang US. Methylation of the p16 tumor suppressor gene in Korean patients with colon cancer and adenoma. Korean J Med 64:396-404, 2003 8) Boltze C, Zack S, Quednow C, Bettge S, Roessner A, Schneider-Stock R. Hypermethylation of the CDKN2/p16INK4A promotor in thyroid carcinogenesis. Pathol Res Pract 199:399-404, 2003 9) Hartwell LH, Kastan MB. Cell cycle control and cancer. Science 266:1821-1828, 1994 10) Green FL. AJCC cancer staging manual. 6th ed. p. 77-79, New York, Springer-Verlag Press, 2002 11) Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A 93:9821-9826, 1996 12) Eszlinger M, Krohn K, Hauptmann S, Dralle H, Giordano TJ, Paschke R. Perspectives for improved and more accurate classification of thyroid epithelial tumors. J Clin Endocrinol Metab 93:3286-3294, 2008 13) Patel KN, Singh B. Genetic considerations in thyroid cancer. - 339 -
- 대한내과학회지 : 제 78 권제 3 호통권제 595 호 2010 - Cancer Control 13:111-118, 2006 14) Puxeddu E, Moretti S, Elisei R, Romei C, Pascucci R, Martinelli M, Marino C, Avenia N, Rossi ED, Fadda G, Cavaliere A, Ribacchi R, Falorni A, Pontecorvi A, Pacini F, Pinchera A, Santeusanio F. BRAF(V599E) mutation is the leading genetic event in adult sporadic papillary thyroid carcinomas. J Clin Endocrinol Metab 89:2414-2420, 2004 15) Rha SY, Lee JC, Kwon KH, Lee HJ, Kim KS, Jo YS, Ku BJ, Shong M, Kim YK, Ro HK. The relationship between the BRAF mutations in thyroid papillary carcinomas and the prognostic factors. J Korean Soc Endocrinol 20:224-229, 2005 16) Jung TS, Kim KS, Oh YL, Jung JH, Lee EY, Jung HS, Min YK, Lee MS, Lee MK, Kim KW, Chung JH. p53, p21 and bcl-2 protein expressions and the clinical significance in papillary thyroid carcinoma. J Korean Soc Endocrinol 22:98-104, 2007 17) Ortega S, Malumbres M, Barbacid M. Cyclin D-dependent kinases, INK4 inhibitors and cancer. Biochim Biophys Acta 1602:73-87, 2002 18) Jones CJ, Shaw JJ, Wyllie FS, Gaillard N, Schlumberger M, Wynford-Thomas D. High frequency deletion of the tumour suppressor gene P16INK4a (MTS1) in human thyroid cancer cell lines. Mol Cell Endocrinol 116:115-119, 1996 19) Lam AK, Lo CY, Leung P, Lang BH, Chan WF, Luk JM. Clinicopathological roles of alterations of tumor suppressor gene p16 in papillary thyroid carcinoma. Ann Surg Oncol 14:1772-1779, 2007 20) Ishida E, Nakamura M, Shimada K, Higuchi T, Takatsu K, Yane K, Konishi N. DNA hypermethylation status of multiple genes in papillary thyroid carcinomas. Pathobiology 74:344-352, 2007 21) Alao JP. The regulation of cyclin D1 degradation: roles in cancer development and the potential for therapeutic invention. Mol Cancer 6:24, 2007 22) Caputi M, Groeger AM, Esposito V, Dean C, De Luca A, Pacilio C, Muller MR, Giordano GG, Baldi F, Wolner E, Giordano A. Prognostic role of cyclin D1 in lung cancer: relationship to proliferating cell nuclear antigen. Am J Respir Cell Mol Biol 20:746-750, 1999 23) Muro-Cacho CA, Holt T, Klotch D, Mora L, Livingston S, Futran N. Cyclin D1 expression as a prognostic parameter in papillary carcinoma of the thyroid. Otolaryngol Head Neck Surg 120:200-207, 1999 24) Anwar F, Emond MJ, Schmidt RA, Hwang HC, Bronner MP. Retinoblastoma expression in thyroid neoplasms. Mod Pathol 13:562-569, 2000-340 -