Invitrogen GeneArt Platinum Cas9 Nuclease character design & illustration: ryuji nouguchi Invitrogen GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit

Invitrogen GeneArt Platinum Cas9 Nuclease character design & illustration: ryuji nouguchi Invitrogen GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit

이봐, 난 CRISPR 인데 나를 한번 단백질 형태로 세포에 넣어볼래? 교수님께서 게놈 편집이 어려운 ips 세포에서 결과를 내라고 하는데...iPSC 는 전기 충격으로 발생한 세포막의 transfection 효율이 낮아 실험이 잘 구멍을 통해 내가 세포안으로 될지 모르겠네... 들어가게 될거야! 난 DNA 형태나 mrna 보다 transfection 이 어려운 세포에서 더 빠르고 높은 효율을 보여줄수 있어! Transfection 이 어려운 세포에서는 Cas9 nuclease 를 단백질 형태로 이용하여 전달하는 것을 강추합니다! 02

왜 Cas9 Protein 을단백질형태로세포에전달하는게좋을까요? 게놈편집의효율은 Cas9 단백질과 in vitro 에서전사된 grna 를미리복합체로만들어세포에 electroporation 을이용하여전달하게되면상당히높아지게됩니다. 기존 mrna 혹은 plasmid DNA 를이용한 Cas9 nuclease 의세포전달방식과 Cas9 nuclease 를단백질형태로세포에도입한결과를비교한결과 DNA 를절단하는시간이감소하고세포에서빠르게작동하여잠재적인 off-target 효과도감소하게됩니다.Invitrogen GeneArt Platinum Cas9 Nuclease 는 Nuclear localization signal 을가지고있으며 99% 이상의순도를보여주며낮은 endotoxin 을함유하고있습니다. 이러한다양한특성으로인해대부분의세포에서 70% 이상의절단효율을보여주게됩니다 Guide RNA(gRNA) 는어떻게준비해야하나요? guide RNA (grna) 는 Cas9 nuclease 가원하는지역으로유도하는중요한역할을하게됩니다. grna 는 single-stranded RNA 의형태로세포에서작동하게됩니다. grna 를준비하기위해처음에는 double stranded DNA 가필요합니다. 이 DNA 앞쪽에는 T7 promoter 가있어 T7 RNA polymerase 가이프로모터를인지하여 grna 로전사하여 DNA 에서 RNA 를만들게됩니다. 이렇게생성된 grna 는 Cas9 nuclease 와복합체를구성하게되고이러한형태로세포에전달이되게됩니다. CRISPR Search & Design tool 은여러분이원하는유전자에대한 grna 의디자인을돕게되며이를통해 invitrogen GeneArt CRISPR T7 Strings DNA 를주문할수있으며바로 in vitro transcription 을진행할수있습니다 (6 페이지참고 ). DNA RNA in vitro transcription T7 promoter T7 RNA polymerase grna Target-specific crrna TracrRNA Target-specific cr RNA TarcrRNA grna coding cassette Target genome DNA sequence PAM GeneArt CRISPR T7 Strings DNA 의구조 grna 구조와 target DNA 와결합하는방법 grna 는어떻게디자인하게되나요? Genomic DNA 가잘릴부위에는 "PAM site" 가있어야만합니다. 이부분의 3' 말단에 NGG 의형태로구성되어있습니다. 이부위의앞쪽 20 bp 가 Target-specific crrna 로불리는부위이며이부분은 target gene 에따라변화되게됩니다. PAM 아래쪽부위의염기서열을 "TracrRNA" 라고불리며이부 분이 Cas9 가결합하는데필요한염기서열이며항상같은염기서열을사용하게됩니다. Transfection 에좋은방법은무엇일까요? Neon Transfection System grna를세포에전달하기위해서는 in vitro에서전사된 RNA와 Cas9 nuclease protein을 electroporation을통해전달하는방법을추천합니다. Invitrogen Neon Transfection System을이용하면다양한파라미터를조정하여최적의효율을구할수있습니다. 만일 lipofection 방법만을사용해 야한다면 Cas9 단백질과 grna 를 Invitrogen Lipofectamine CRISPRMAX 를이용하는방법을추천드립니다. 이새로운 Lipofectin 시약은 Cas9 단백질을세포에도입하기위해개발된시약입니다. 03

시퀀싱 확인하는데 시간을 버리지 시퀀싱을 통해 확인해야 할 샘플이 너무 말라고! 실험 결과 좀 빨리 내고! 안 많은데요. 혹시 절단된걸 확인할 수 있는 그러면 다른 데에서 먼저 논문 내잖아! 간단한 방법 없나요? ` 게놈 편집에 의해 편집이 된 DNA 부위를 PCR 을 이용하여 증폭하고 이를 변성하여 다시 double stranded DNA 로 만들게 됩니다. 이렇게 되면 mismatch 부위가 만들어지고 이를 인지하는 효소를 처리하면... mismatch 부위가 mistmatch 이렇게 절단된 DNA 들은 DNA detection enzyme 에 의해 전기영동으로 절단 여부를 확인하게 절단되게 됩니다 됩니다. 04

Mismatch Detection Enzyme 은무엇인가요? Mismatch Detection Enzyme 은 heteroduplex 의 mismatch 를인지하여절단하는효소입니다. 게놈편집에서 CRISPR/Ca9, TALEN 에의한 DNA 절단이후복구과정에서 insertion/deletion(indel) 이나타나게됩니다. 따라서세포샘플을용해한이후에 PCR 로목표부위의특이적인프라이머를이용하여증폭한이후에 denature 와 anneal 을반복하게되면 heteroduplex 의 mismatch 가발생하게됩니다. 이러한 mismatch 는 Mismatch Detection Enzyme 에의해절단하여전기영동을하게되면서로다른밴드패턴이나타나게되고이를밴드의크기의비율에따라분석할수있습니다. Invitrogen GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit 는 genomic DNA 추출과정없이바로쉽게 cleavage 를확인할수있는믿을수있는제품입니다. 시작 Genomic insertions or deletions (indels) Mismatches 1 indel (-) 2 indel (+) Genimic DNA 에 double strand break 가특이적인부위에일어난부분을 PCR 로증폭하게됩니다. 1 2 Denatured and re-annealed Detected and cleaved by Detection Enzyme Gel electrophoresis 분석을위한프라이머디자인은어떻게해야하나요? CRISPR/Cas9에의해절단된지역을기준으로증폭산물의사이즈가대략 400 bp에서 500 bp 정도가될수있게프라이머를디자인하게됩니다. 이경우절단이이루어진지역이정중앙에위치하지않게디자인하는것이중요합니다. 잘린부위양쪽의크기가서로다르다면전기영동으로서로다른밴드를쉽게확인할수있습니다. 만일비특이적산물이발생한다면프라이머의염기서열을다른부분과의상동성검사를실시하여확인해볼수있습니다. Tm>55 Primer length: 18-22 bp GC contents: 45% 60% PCR Amplicon: 400 bp 500 bp loci where the gene-specific double-strand breaks occur Fw primer Genome Rv primer Genomic detection assay 를이용하면어떠한장점이있나요? 목표한 genomic DNA의염기서열을시퀀싱을통해확인하는것은정확한돌연변이가일어났는지를확인하는데꼭필요한실험단계입니다. 그러나그이전에게놈편집실험을진행하는중에여러 grna를디자인하여이중가장좋은효율을보여주는 grna 염기서열을탐색하는과정과다양한조건을통해실험을최적화하는과정이필요합니다. 직접클로닝하여시퀀싱하는실험은매우손이많이가고시간도많이소요됩니다. 따라서게놈편집실험초반에는 Cleavage Detection Assay를이용하는것이여러모로매우효율적이라할수있습니다. Cleavage Detection Assay를반드시하시는것을추천드립니다. 05

저... 제가지금바로게놈편집실험을하고싶은데요... 어떤 grna 디자이너가좋은지좀추천해주세요. CRISPR Search & Design tool 을 추천드리고싶군요. 디자인을하기위해서는 Thermo Fisher Cloud 계정이필요합니다. 인간과마우스의연구에이용할수있는디자이너로 600,000개의 pre-designed grna를바로검색할수있게되어있습니다. 거기에 off-target에대한정보및위험한위치도함께표시됩니다. 또한다양한 grna 중에추천되는순서대로보여주기도한답니다. 그래서여러분의실험에 grna가적합한지보기가참쉽게되어있습니다. 이외에도 T7 혹은 U6 프로모터를선택할수있게되어있어서클릭한번으로손쉽게결정도가능합니다. 요즘에는실험하기참편리하네요. www.thermofisher.com/crisprdesign Mismatch detection enzyme 으로절단해서되는건봤는데 그다음에는무엇을해야하나요? 좋아, 그러면 Knock-in/Knock-out 세포에서목표로했던 유전자를클로닝해서시퀀싱해봐. 여러분의 grna가높은효율을보여준다는것을확인하였을때그때부터가장좋은실험조건으로 transfection 세포를이용하여실험을시작하세요. Transfection이끝난다음에는세포를희석하여하나의세포로분리하고목표로했던지역을 PCR로증폭하여클로닝한이후에시퀀싱을하게됩니다. 처음부터하나의세포를분리하는것은사실상불가능에가깝습니다. 따라서처음에는 96well에 10-20개정도의세포를배양하고 PCR을통해목표로한지역을증폭합니다. 증폭된산물은 TOPO vector에클로닝하여시퀀싱을하게됩니다. 클로닝이잘되었는지안되었는지는각각의유전자염기서열이동일한지동일하지않는지를통하여확인해볼수있습니다. PCR amplification Fw Sequencing Rv 06

Off-target 이란게뭔가요? 그리고안생기게할수있는방법이있나요? Off-target이란건내가원하지않은지역에게놈편집이발생하는거랍니다. 만일내가원래목표로하는염기서열과비슷한곳이있다면 grna가이를잘못인식하게되어 Cas9 nuclease가이부위를절단하는상황이발생할수있습니다. 지금까지알려진바에의하면 PAM 염기서열에서 8-12 base 정도인접한염기서열이다른부위와염기서열이달라야만이러한 off-target이일어나지않습니다. 우리의연구결과에따르면 Cas9 nuclease를단백질형태로이용하게되면이러한 off-target이많이줄어드는것을확인했습니다 off/on target ratio 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 DNA RNA Protain OT3-2 DNA RNA Protain OT3-18 Off-target Indel production VEGFA T3 의유전자에대한절단을 Cas9 plasmid DNA, mrna 그리고단백질을이용한이후에 Off-target 에의한돌연변이가나타나는지확인하였다. OT3-2 와 OT3-18 에대한 off-target 효과를시퀀싱을통해확인해보았다. 이런... 절단효율이낮게나오네요! 이제어떻게하죠? 먼저해볼것은다른 grna를디자인하여이용해보세요. Gene: CHKA mrna: NM_001277 Total No. Exons: 12 Targeted Exons: 2(1.2) 여러 grna를 Cas9 nuclease와이용해보고이중가장높은절단효율을보여주는 grna를이용하는것이가장좋은방법입니다. Knock-in 실험의경우 grna가사용되는부위가한정되어있으므로다른 grna를이용하여효율을높이는것은어려워보입니다. 이러한경우 transfection 효율을높일방법을찾아야합니다. 최적화된 electroporation의조건은세포의종류에따라달라집나다. 이번에우리가실험한논문 * 1 에서조건을확인해보는것도좋은방법입니다. 또한세포의가장최적화된 transfection 데이터베이스 * 2 를검색해보는것도좋습니다. 만약에지금실험하는세포가 non-dividing 세포인경우에는우리의숨겨놓은비장의무기인 CRISPR/Cas9 렌티바이러스를이용해보는것도좋습니다. 포기하시기엔아직이릅니다. Plasmid mrna Protein Cell Lines Lipid Electro Lipid Electro Lipid Electro HEK293FT 49 49 70 40 51 88 U2OS 15 50 21 24# 18 70 Mouse ESCs 30 45 45 20 25 70 Human ESCs (H9) 0 8 20 50 0 64 Human ipscs 0 20 66 32 5 87* N2A 66 75 66 80 66 82 Jurkat 0 63 0 42 0 94* K562 0 45 0 27 0 72 A549 15 44 23 29 20 66 Human Keratinocytes (NHEK) 0 30 0 50 0 35 Human Cord Blood Cells CD34+ n/a 0 n/a 0 n/a 24 Comparison of plasmid DNA, Cas9 mrna/grna and Cas9 RNP transfection and resulting editing efficiencies as measured by GCD assay in a variety of cell lines. Ref. *1: X.Liang et al/journal of Biotechnology vol.208, 20 Aug, 2015), *2: www.thermofisher.com/neon 07

과학원더랜드에오신것을환영합니다. 게놈편집에관심있으시다면 "Genome editing special site" 를방문하여실험에대해더많은내용을확인해보세요. 이페이지를통해여러도움이될만한많은자료와내용을확인해보실수있습니다. 실험원리부터실험방법, 그리고다양한실험에필요한내용을지금바로확인하세요. 강추 Start here! www.thermofisher.com/geneeditingcomics Step Product name Size Cat.No Cas9 Nuclease (Protein) + grna 강력추천 grna GeneArt CRISPR T7 Strings DNA >200 ng Design and Order at www.thermofisher.com/crisprdesign Genome editing tool Cas9 Nuclease (Protein) GeneArt Platinum Cas9 Nuclease 25 µg (1 µg/µl) 75 µg (3 µg/µl) B25640 B25641 MEGAshortscript T7 Kit 25 rxns AM1354M in vitro transcription MEGAclear Transcription Clean-Up Kit 20 preps AM1908 Quant-iT RNA Assay Kit 1 kit Q-33140 Transfection Electroporation Neon Transfection System 1 instrument MPK5000 Neon Transfection System 10 µl Kit 96 2 rxns MPK1096 Lipofection Invitrogen Lipofectamine CRISPRMAX Coming soon Genomic lentivirus DNA CRISPR/Cas9 Cleavage Detection Assay GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit 20 rxns A24372 Contact us at Custom.Services@lifetech.com. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. character design & illustration: ryuji nouguchi art direction & design: masami furuta, yuka uchida(opportune design)