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J. Fd Hyg. Safety Vol. 23, No. 4, pp. 314~318 (2008) Journal of Food Hygiene and Safety Available online at http://www.foodhygiene.or.kr 고래회충검출을위한육안검사법과중합효소연쇄반응 제한효소절편길이다형성의비교 강주희 이민화 이강범 최창순 * 중앙대학교생활과학대학식품영양학과 Comparison of Macroscopic Inspection and Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism (PCRRFLP) for the Detection of Anisakis simplex complex JuHee Kang, Min Hwa Lee, KangBum Lee, Changsun Choi* Department of Food and Nutrition, College of Human Ecology, ChungAng University (Received November 20, 2008/Revised November 29, 2008/Accepted December 2, 2008) ABSTRACT This research aimed to compare the detection methods of Anisakis simplex in Sea fish by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) and macroscopic inspection. We examined 18 Trichiurus lepturus, 11 Scomber japonicus, and 65 Todarodes pacificus collected from the retail markets in the areas of Uljin, Kyuonggi province and Seoul. As the result of examinations, we found that detection rate of Anisakis simplex by macroscopic observation was 89% in Trichiurus lepturus, 90.9% in Scomber japonicus, 32.3% in Todarodes pacificus. The detection rate of Anisakis simplex by PCRRFLP was 77.7% in Trichiurus lepturus, 81.8% in Scomber japonicus, 26.1% in Todarodes pacificus. We could conclude that PCRRFLP method of Anisakis simplex was more specific rather than macroscopic observation. Key Words: Anisakis simplex complex, Polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCR RFLP), Trichiurus lepturus, Scomber japonicus, Todarodes pacificus 서론 고래회충 (Anisakis simplex) 은고래회충과 (Family Anisakidae) 에속하는선충류의일종으로고래회충유충증 (Anisakiasis) 를일으키는병원체로알려져있다. 고래회충의유충은유백색을띄며, 1 2mm 안팎의둘레와 10 20 mm정도의크기이다. 고래회충의충란은 0.05mm 0.05mm의크기로육안확인이어려울정도로작고, 종에따라서그크기가다양하다. 1) 고래회충은복잡한생활사를가지고있다. 해수로유출된유충은크릴새우와같은작은갑각류에감염을일으키고, 감염된갑각류생물들은상위포식자인해산어류및포유류에포식되게된다. 이러한먹이사슬구조에서고래 *Correspondence to: Changsun Choi, D.V.M., Ph.D. Department of Food and Nutrition, College of Human Ecology, ChungAng University, 721, Naeri, Daedukmyun, Ansungsi, Kyounggido, Republic of Korea Tel: 82316704589, Fax: 82316768741 Email: cchoi@cau.ac.kr 회충은다양한종류의해산어류 ( 고등어, 아지, 갈치, 도미, 대구, 오징어, 청어등 ) 를중간숙주로이용하며소화관이나근육에서 3기유충형태로감염하게된다. 이후고래, 돌고래, 바다사자등과같은해양포유류와같은종숙주에감염되는경우고래회충은성충으로발달하고유충및충란을배출하게된다. 사람은고래회충에감염된갑각류, 해산어류, 포유류를부적절하게조리하여섭취하거나, 생으로섭취하는경우고래회충유충증을일으키게되는것이다. 1) 고래회충유충증은고래회충에감염된해산어류를충분히조리하여섭취하지못한경우또는생식한경우섭취후 3 6시간이내구토, 설사, 복부팽만, 두드러기, 발열등의증상을동반한급성위장염을일으키는것이특징이다. 고래회충증의감염초기에는흰실같이보이는고래회충이위벽을뚫고복강으로이동하면서복통을유발시키고십이지장, 공장및충수돌기로이동하여장아니사키스증을일으킨다 1). 고래회충유충증은 1960년네덜란드과학자인 Van Thiel 2) 314

Comparison of Macroinspection and PCRRFLP for Anisakis spp 315 에의하여최초로보고된이후미국, 캐나다, 포르투갈, 이탈리아, 일본, 한국, 중국등에서발생보고가있었다. 고 34) 래회충유충증은어류를생식하는문화를가진아시아권국가에서다발하는것으로보고되었는데, 특히회 (sashimi), 초밥 (sushi) 등과같이해산어류를생식하는문화가발달한일본의경우 500여건이상의고래회충유충증이사람에게발생한것으로보고되기도하였다. 그러나아시아국가뿐만아니라북미, 유럽권국가를포함한전세계국가에서고래회충유충증이지속적으로보고되고있어식품안전성분야의중요한문제로대두되고있다 24). 국내에서는 1971년고래회충유충에의한편도선염발생보고이후현재까지 240여건의감염사례가보고되었다. 국내에서발생한고래회충유충증은고래회충과의유 45) 충인 Anisakis spp., Terranova spp., Contracaecum spp., Raphidascaris spp. 등에의하여발생하였다고보고된바있다. 특히고래회충에의한감염사례가다수보고된바있으며, 시판어류에서도고래회충과물개회충 (Pseudoterranova decipiens) 등이검출보고도있었다. 1, 67) 기존에사용되는고래회충검사법에는숙련된검사자에의한육안검사법이광범위하게활용되어왔다. 육안검사법은식품또는환자로부터분리및확인된유충을크기및형태적특징을바탕으로확인하는검사법으로써국내에서보고된고래회충유충증의대부분이이검사법에의하여확인보고되었다. 그러나고래회충유충증을일으킬수있는다양한선충류가보고됨에따라서검사자의숙련도에과도하게의존하는육안검사법의문제점과제한점이대두되었다. 최근에는이러한단점을극복하기위하여분자유전학적검사법을활용한고래회충검사법개발이활발히진행되고있는실정이다. 따라서본연구에서는국내어시장에서판매되고있는해산어류에감염되어있는고래회충유충을육안검사법과중합효소연쇄반응제한효소절편길이다형성 (Polymerase Chain ReactionRestriction Fragment Length Polymorphism, PCRRFLP) 검사법으로검출하고, 고래회충검출에대한특이도를비교연구하고자하였다. 재료및방법 고래회충육안검사법고래회충유충의감염여부를조사하기위하여총 94 마리의해산어류를 2007년 9월부터 10월까지수집하여검사에사용하였다. 어종별로는갈치 18마리, 고등어 11마리, 오징어 65마리였으며, 서울, 경기도, 울진등의어시장또는소매시장에서구매하여육안검사에사용하였다. 폭 0.5~1mm 15~20mm 길이를가지는유충을육안으로확인하여채취하였으며고래회충의유충과특징이동일한개체를분자생물학적검사에사용하였다 (Table 1). Anisakis 유충의 DNA 추출육안검사법에의하여확인된고래회충의유충을새로운 eppendorf tube에옮겨담고, 500 ul PhosphateBuffered Saline(PBS) 를첨가하여세척후제거한다음 500 ul 0.1N NaOH를첨가하고 steal floating rack에결합하여 10분간끓는물에가열후냉각하였다. Phenol(Bioneer, Daejeon, Korea) 500 ul를첨가한후 vortex시키고 5분후, microcentrifuge (VS15000N, Vision, Kyounggi, Korea) 에넣고 14,000 rpm에서 30분간원심분리하였다. 상층액을새로운 eppendorf tube로옮기고 Phenol:Chloroform(1:1) 을동량첨가하고 5 10초간 vortex 했다. 5분후 microcentrifuge (VS15000N, Vision, Kyounggi, Korea) 에넣고 7500 rpm 으로 10분간원심분리했다. 상층액을분리하여새로운 tube 로옮겼다. 전체 volume의 1/10 용량으로 3 M sodium acetate(duksan, Kyungki, Korea) 를첨가하고전체 volume 의 2 2.5배용량으로 100% ethanol(duksan, Kyungki, Korea) 을첨가한다음 20도냉동조건에서하룻밤침전하였다. 4도로냉각된원심분리기에서 14,000 rpm 30분간원심분리하여 DNA를침전시켰다. 이후상층액을조심스럽게제거하고, 70% ethanol 500 ul를첨가하여 14,000 rpm 30분간 DNA washing을수행하였다. 원심이끝난후상층액을조심스럽게버리고 10 15분간 air dry를실시하였다. 30 50 ul 멸균수또는 TE buffer를첨가하여 DNA를부유하였다. Table 1. Sampling sites and fish species for the detection of Anisakis simplex complex No. of samples Fish market (Uljin) Retail market (Anyang) Fish market (Ansung) Retail market (Seoul) Trichiurus lepturus 16/18 a Scomber japonicus Todarodes pacificus 21/65 0/30 6/10 15/25 (32.3%) (0.0%) Total no. of samples 47/94 0/30 24/30 7/25 (50.0%) (0.0%) (80.0%) a No. of positive samples / No. of total samples

316 JuHee Kang, Min Hwa Lee, KangBum Lee, Changsun Choi 중합효소연쇄반응 (Polymerase chain reaction, PCR) 고래회충을확인하기위한중합효소연쇄반응검사법에대한선행연구가일부이루어진바있다. 본연구에서는 ITS1, 5.8S ribosomal DNA, ITS2 등을포함한전체 internal transcribed spacer (ITS) 를증폭할수있는프라이머를사용하였다. 고래회충에특이적인 DNA를증폭하 89) 기위한프라이머와 PCR mixture 조성은다음과같다. D.W. 13 µl와 10 PCR buffer 2 µl dntp 2 µl(bioneer, Daejeon, Korea) 를넣고 Primer A (5'GTC GAA TTC GTA GGT GAA CCT GCG GAA GGA TCA TT3') 와 Primer B (5'GCC GGA TCC GAA TCC TGG TTA GTT TCT TTT CCT CCG CT3') 그리고 Taq Polymerase 14) (bioneer) 1 µl와고래회충유충으로부터추출한 DNA template를 2 µl를혼합하여준비하였다. PCR 반응조건은 denaturation 94 5분, amplification 94 o C 30초, 55 o C 30 초, 72 C 30초씩 35회반응시킨후 extension 72 C 10분 o o 으로 DNA를증폭하였다. 제한효소절편길이다형성 (Restriction fragment length polymorphism, RFLP) 중합효소연쇄반응에서얻어진 DNA fragment를제한효소절편길이다형성분석에사용하였다. DNA product 8 ul와 10X reaction buffer 1 ul, HinfI 또는 HhaI(10U; Bioneer, Daejeon, Korea) 1 ul를혼합하고 37 C조건에서 2시간동안 o 반응시켰다. 반응이끝난산물은 0.1% Ethidium bromide 를첨가한 1% agarose gel(qbiogene, CA, U.S.A) 로 100V 에서 60분간전기영동을실시하였고 UV 영상분석기를통해분절의크기를확인하였다. 결과및고찰 Anisakis 유충의육안검사시중에서판매되고있는갈치, 고등어, 오징어에대한고래회충감염정도를육안검사법으로조사하였는데, 총 94마리의개체중에 47마리 (50.0%) 의개체에서고래회충으로추정되는유충이관찰되었다 (Table 1). 대부분의고래회충유충은어체의소화기장기에부착된형태로발견되었고일부는소화기장기의내부에서관찰되었으며, 근육에이행한경우는관찰할수없었다. 오징어 65마리를대상으로육안검사를수행한결과총 21마리에서고래회충으로추정되는유충이발견되어 32.3% 의감염률을보였다. 이중에서어시장에서가져온개체에서는 Anisakis 유충이발견되지않았으며경기도안양시장과서울반포시장에서획득한샘플은 60% 의감염률을보였다. 우등 10) 은선행연구에서다양한종류의해산어류를대상으로아니사키스유충의감염실태를조사하였는데, 11개의오징어검체를대상으로육안검사를실시하 여총 6개체 (54.5%) 가감염되어있다고보고하였으며, 조사대상어류중에서가장낮은감염률을보였다고하였다. 본연구에서도오징어를대상으로한아니사키스유충검출빈도가갈치, 고등어에비하여상대적으로낮았는데, 우등의선행연구결과와유사한경향을가지고있음을확인할수있었다. 고등어검체에대한육안검사법을수행한결과총 11개체중에서 10개체에서 Anisakis 유충이발견되어 90.9% 의감염률을보였다. 우등의연구조사에의하면고등어 20 10) 개의샘플중 20개가감염되어 100% 의감염률을보였으며이는본실험과마찬가지로상당히높은감염률을보이고있음을확인할수있었다. 육안검사에사용한 18개의갈치검체의경우총 16개체에서아니사키스유충이검출되어 88.9% 의감염률을보였다. 갈치검체는대형마트와경기도안양시장에서수집되었는데육안검사법에의한고래회충유충의검출율은각각 88.9% 로동일하게조사되었다. 우 10) 등이수행한선행연구에서도갈치의감염률은 100% 라고보고함으로써, 본연구결과와유사한양상을확인할수있었다. 고래회충에대한육안검사법에서고등어또는갈치의감염률이오징어보다더높음을확인할수있었다. 특히오징어의경우어시장에서직접구매한가검물에서는고래회충의감염을확인할수없었으나대형마트와같은소매시장에서판매되는경우고래회충유충의발견빈도가상대적으로높은양상을관찰할수있었다. 이는유통경로에의한감염이라고는볼수없으나, 유통단계가길어짐에따라서고래회충유충이소화기내강또는근육장기로의이동이증가하여검출빈도가높아지는것으로추정하였다. 따라서소매시장에서구입한고등어, 갈치등을섭취할경우고래회충의감염또는검출빈도가높으므로, 해산어류의섭취시내장을제거하고충분한가열조리를하는것이고래회충유충증예방을위하여필요할것으로보인다. 고래회충유충의 PCRRFLP 육안검사법에서고래회충유충으로확인된개체를대상으로 DNA를추출하고아니사키스종에특이적으로반응하는프라이머를사용하여중합효소연쇄반응을수행하였다. 중합효소연쇄반응결과에서고래회충의유전자중 ITS1, 5.8S rdna subunit, ITS2 region을포함하는 Internal transcribed spacer에서약 1,000bp 길이의특이적인 DNA 분절을확인하였다. 육안검사에서고래회충으로추정되는유충 47개체중에서 40개체가 PCR 양성반응을보임으로써추정된개체대비 85% 가고래회충으로확인되었으며, 총검체수대비 43% 의해산어류에서고래회충유충이검출되었다 (Table 2). 중합효소연쇄반응에서양성반응을보인 40개의 PCR

Comparison of Macroinspection and PCRRFLP for Anisakis spp 317 product를제한효소 HinfI과반응시킨제한효소절편길이다형성분석에서는 370, 300, 250 bp 크기를가지는 3개의분절이확인되었으며, HhaI과반응시킨결과에서는 550, 430 bp의 2개분절이확인되었다. HinfI과 HhaI을이용한제한효소절편길이다형성분석결과에따르면본연구에서검출된고래회충의유충은 Anisakis simplex complex 중에서 Anisakis pegreffii인것으로확인할수있었다 89). 일본과이탈리아에서는 A. pegreffii에의한감염환자가발생한것으로보고된바있으나, 국내에서는아직보고된바가없다 1112). 그러나국내에서판매되는어류에 A. pegreffii 의존재가확인됨으로써식품위생학적측면및공중보건학적측면에서도관심을기울일필요가있을것으로사료된다. 어종별로살펴보면갈치는육안관측에서는 88.9% 의감염률을보였으나중합효소연쇄반응에서는 77.7% 의양성율을보였다. 고등어의경우육안관측에서는 90.9% 에서아니사키스유충이검출되었으나, 중합효소연쇄반응에서는 81.8% 에서만고래회충의유충으로확인되었다. 오징어의경우육안검사법과중합효소연쇄반응검사법에서각각 32.3%, 26.1% 가고래회충감염을보이는것으로확인되어두검사법간의검출율이상이한것으로확인되었다. 본연구에서수행된고래회충육안검사법과중합효소연쇄반응검사법을비교하였을때육안검사법에의한검출률이보다높게나타났다. 그러나고래회충의경우 Anisakis pegreffii, Anisakis simplex sensu stricto, Anisakis simplex C를포함하여 Anisakis simplex complex라고통칭하며, 그밖에 Anisakis typica, Anisakis ziphidarum, Anisakis physeteris, Anisakis schupakovi 등형태적특성이매우유사한종들이다수존재하기때문에육안검사를전적으로신뢰하기는어려운점이있었다 1,4,7). 또한 Anisakis spp. 는 10 29 mm의길이와 0.44 0.54 mm의폭의선충이며, 길이 25 50 mm, 폭 0.3 1.2 mm의 Pseudoterranova spp. 는형태학적특성이매우유사한것으로알려져있다 13). Anisakis spp. 와 Pseudeterranova spp. 는식도 (esophagus) 위 (ventriculus)장관(intestine) 의배열상태에따라서구분되나, 검사자의숙련도및검사조건에따라검출율및감별율이저하될수있는문제점이있었다. 따라서 Anisakis 유충의특이적 DNA를증폭하여검사하는 PCR 검사결과 Table 2. Comparison of detection of Anisakis spp. by macroscopic inspection and polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) Species Macroscopic obsevation PCRRFLP Trichiurus lepturus 16/18 14/18 (89.0%) (77.7%) Scomber japonicus 9/11 (81.8%) Todarodes pacificus 21/65 (32.3%) 17/65 (26.1%) 가신뢰도측면에서는더높다고할수있다. 고래회충에대한육안검사법과중합효소연쇄반응검사법의검출률차이는다음과같은이유로설명될수있을것이다. Im 등은의하면고래회충 (Anisakis simplex) 뿐만아니라고래회충과 (Family Anisakidae) 에속하는 Anisakis type II., Contracaecum type A, Pseudoterranova decipiens ( 물개회충 ) 등이국내에서발생하는고래회충유충증의원인체이며, 광어, 우럭, 도미, 우럭, 고등어등과같은해산어류에서검출되는유충의종류도다양하다고보고한바있다 1). Szostakowska등도발트해연안에서포획된어류를대상으로한 PCR 검사에서 A. simplex, Hysterothylacium auctum, Contracaecum osculatum, C. rudolphi 등과같이고래회충과유사한선충의존재를보고하였다. 14) Szostakowska 등의연구에서사용된 Nemspec18SF와 NC2 primer는 Anisakid 속에속하는선충의 18S ribosomal DNA를일반적으로증폭하므로특이성이떨어지는제한점이있었다. 그러나본연구에서사용된중합효소연쇄반응은고래회충과에속하는다른유충들과는반응하지않기때문에음성반응을보인것으로추정할수있었다. 따라서중합효소연쇄반응에서고래회충유충이아닌것으로판명된개체의경우어류에서자주검출되는 Pseudoterranove decipiens, Anisakis physeteris ( 향유고래회충 ) 등과같은종의기생충으로추정되며이에대한추가적인연구조사가필요하다고생각된다. 감사의말씀 (Acknowledgement) 본연구는 2007학년도중앙대학교학술연구비지원에의하여수행되었으며, 이에감사의말씀을드립니다. 요약및정리 본연구에서는일상생활에서쉽게접할수있는해산어류 3종 ( 갈치, 고등어, 오징어 ) 에서발견되는고래회충의유충을육안검사법으로조사하고, 중합효소연쇄반응제한효소절편길이다형성검사법과의검출률을비교조사하였다. 오징어의경우 32.3% 의감염률을보였으며, 갈치와고등어는각각 88.9% 와 90.9% 로높은감염률을보였다. 중합효소연쇄반응을이용한고래회충의유전자검출에서는 분리된유충의 85% 가고래회충으로확인되었으며, 총검사대상어류를기준으로 43% 가고래회충에감염된것으로판명되었다. 또한 HinfI과 HhaI을이용한중합효소연쇄반응 제한효소절편길이다형성분석결과에따르면고래회충중에서 Anisakis pegreffii 인것으로확인할수있었다. 결과적으로해산어류또는고래회충유충증의검출시육안검사법과더불어분자생물학적검출법을활용하면그특이도와민감도를높일수있는것으로조사되었다.

318 JuHee Kang, Min Hwa Lee, KangBum Lee, Changsun Choi 참고문헌 1. Im, K. I., Shin, H. J., Kim, B. H., Moon, S. I.: Gastric anisakiasis cases in chejudo, Korea. Korean J. Parasitol. 33, 179186 (1995). 2. Van Thiel, P. H., Kuipers, F. C., Raskam, R. T.: A nematode parasitic to herring, causing acute abdominal syndroms in man. Trophic Geographic Medicine, 2, 97113, (1960). 3. Yokogawa, M., Yoshimura, H.: Clinicopathologic studies on larval anisakiasis in Japan. Am. J. Trop. Med. Hyg. 16, 723 728 (1967). 4. Kim, C. H., Chung, B. S., Moon, Y. I., Chun, S. H. : A case report on human infection with Anisakis sp. in Korea. Korean J. Parasitol., 9, 39 (1971). 5. Cho, S. Y., Chi, J. G., Kim, I. S.: A case human anisakiasis in Korea. Seoul J Med. 21, 203208 (1980). 6. Lee, A. H., Kim, S. K., Choi, K. Y.: A case of human infection with the larva of Terranova type A. Korean J. Parasitol. 19, 463467 (1985). 7. Sohn, W. M., Seoul, S. Y.: A human case of gastric anisakiasis by Pseudoterranova decipiens larva. Korean J. Parasitol. 32, 5356 (1994). 8. D'Amelio, S., Mathiopoulos, K.D., Brandonisio, O., Lucarelli, G., Doronzo, F., Paggi, L. Diagnosis of a case of gastric anisakidosis by PCRbased restriction fragment length polymorphism analysis. Parassitologia, 41, 591593 (1999). 9. Zhu, X., Gasser, R. B., Podolska, M, Chilton, N. B. Characterisation of anisakid nematodes with zoonotic potential by nuclear ribosomal DNA sequences. Int. J. Parasitol. 28. 19111921 (1998). 10. Woo, H. C., Kim, J. A.: The Infection Status and Identification of Anisakid Larvae in Marine Fish Caught from the sea Near Cheju Island, Kor. J. Vet. Publ. Hlth 24, 690696 (2000). 11. Umehara, A., Kawakami, Y., Araki, J., Uchida, A. Molecular identification of the etiological agent of the human anisakiasis in Japan. Parasitology Int. 56, 211215 (2007). 12. Umehara, A., Kwakami, Y., Matsui, T., Araki, J., Uchida, A. Molecular identification of Anisakis simplex sensu stricto and Anisakis pegreffii (nematoda: Anisakidae) from fish and cetacean in Japanese waters. Parasitology Int. 55, 267271 (2006). 13. Sakanari, J. A., McKerrow, J. H. Anisakiasis. Clin. Microbiol. Rev. 2, 278284 (1989) 14. Szostakowska, B., Myjak, P., Kur, J. Identification of aniskid nematodes from the Southern Baltic Sea using PCRbased methods. Mol. Cell. Probes. 16, 111118 (2002).