류코노스톡발현시스템개발연구동향 충북대학교식품생명공학과한남수교수 1. 류코노스톡및이의발현벡터류코노스톡속은락트산, 아세트산, 알코올, 이산화탄소, 아세토인등의방향족화합물및네개의탄소함유화합물을생성하는이종발효유산균이다. 이는광범위하게채소 ( 김치, 사우어크라우트, 피클 ) 와유발효에사용되며구연산대사및디아세틸배양유제품의주된맛화합물인휘발성화합물을생산한다. 일반적으로독소를생성하지않으며호기성및혐기성조건에서성장하고 GRAS로서안전성이인정되기때문에식품생명공학산업에서좋은 host로간주된다. 지금까지유산균의다양한벡터는락토바실러스와락토코커스종의자체벡터의복제원점을사용함으로써구축되었다. 그러나효율적인유전적도구및기술의부족으로대사공학을이용한분자생물학, 유전학적기초연구, 그리고산업적이용을위한균주개량이충분히이루어지지않고있다 ( 표 1). 따라서류코노스톡의식품및생물공학적이용을위한항시발현, 유도발현, 식품용벡터시스템을구축하고자한국의채소발효식품인김치에서분리한 Leu. citreum CBNU75와 Leu. citreum CB2567 (KACC 91348P) 에서작은크기의플라스미드인 pcb18와 pcb42를선별하였으며염기서열과유전자구조를조사하였다.
표 1. 대표적인유산균에서의백터관련연구동향 Lactococcus Lactobacillus Streptococcus Bifidobacterium Leuconostoc Plasmid ++++++++ ++++++++ +++++ +++ ++ Shuttle vector +++++ +++++ +++ ++ + Heterologous protein extression +++++ +++++ +++ + + Food-grade vector +++++ +++++ + - - Intergative food grade vector Complete genome sequencing +++++ +++++ + - - 14 strains 143 strains 492 starins 42 starin 10 starins 플라스미드 pcb18은 G+C 함량은 39.2%, 1,821개의염기로이루어져있고, 하나의 replicase (342 amino acids, 41 kda) 를갖고있으며, Leu. citreum IH3유래의 pih01 벡터의 replicase 단백질과 96% 상동성을보였다 (Eom et al., 2010). 본벡터의복제기작을알아보기위해, single-stranded DNA 중간체생성여부를 southern blot으로분석한결과 rolling circle replication 기작에의해복제되는것으로판단된다. 플라스미드 pcb42는 G+C 함량은 34.58%, 4,231개의염기로이루어져있고, 6개의 ORF를함유하고있으며이는 1개의 transposase, 1개의 DNA-binding 유전자, 2개의 putative replication 유전자, 2개의 unknown 유전자를포함하고있다. 이는 theta-type replication 기작에의해복제되는것으로보인다 (Eom et al., 2012). 2. Leuconostoc-E. coli 셔틀벡터 pleucm, pleucm42 Leucostoc에서외래유전자를발현시키기위해, 분리한두가지유산균벡터를기반으로 Leuconostoc-E.coli 셔틀벡터를구축하였다. pcb18와 puc19에서파생된 pek104 벡터를 ligation하여 pleucm를제조하였다 ( 그림 2). pcb18과다르게 pcb42 벡터는크기가커서 Leuconostoc-E. coli 셔틀벡터를구축하기전에, replicon minimization를진행하였다. 이는위해 6개의 ORF를단계별로최소화하면서복제여부를분석하면서크기를최소화하였고 ( 그림 1)(Eom et al., 2012), 최소화한벡터 pcbm32는 pek104벡터와 ligation하여 Leuconostoc-E. coli 셔틀벡터인 pleucm42 ( 그림 3) 을구축하였다.
그림 1. pcb42 벡터의 replication 부분최소화모식도 그림 2. pleucm 벡터구축모식도 그림 3. pleucm42 벡터구축모식도 구축된 pleucm의벡터안정성과다양한 host에서의 transformation 효율을분석한결과, 100세대이후, 80% 정도의균주에벡터를함유하고있어안정적으로복제됨을알수있었다. 또한, 다양한유산균에서의 transformation 효율을분석하였고, Leu. citreum, Leu. mesenteroides, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum. Lb. reuteri, Streptococcus thermophilus, Weissella confusa, Oenococcus oeni와같은다양한유산균에서 transformation이가능하였다 (Eom et al., 2010).
표 2. pleucm 벡터가다양한유산균에서의 transformation 효율 pleucm벡터에서의외래유전자의발현여부를확인하고자, α-amylase와 β -galactosidase 유전자를각각 Lb. amylovorus와 Lb. plantarum의염색체 DNA에서분리하여 pleucm 셔틀벡터에클로닝하여재조합체인 pleucmamy와 pleucmgal을구축하였다. 그림 4,5와같이, 두가지외래유전자가성공적으로 Leuconostoc에서발현되었다 (Eom 2007; Eom et al., 2009). supernatant from Leuconostoc harboring pleucmamy kda SDS-PAGE Active staning 225 150 100 75 Control supernatant 그림 4. pleucm 과 pleucmamy 벡터를함유한 Leuconostoc 균주에서의 amylase 활성측정 그림 5. pleucmgal 벡터를함유한 Leuconostoc 균주에서의 β-galactosidase 활성측정 pleucm42벡터는 100세대배양이후 60% 정도의벡터안정성을보였다. 또한다양한유산균에서의 transformation 효율을비교분석하였을때, Leu. citreum, Leu. mesenteroides, Lc. lactis, Lb. plantarum, Lb. reuteri, St. thermophilus, W. confusa, O. oeni 등여러속및종에서복제가능했다 ( 표 3). 이는 pleucm와 pleucm42가유산균을위한일반적인유전자형질전환도구로써사용될수있는광범위한숙주범위를가지는벡터임을보여준다 (Eom et al., 2012).
표 3. pleucm42 벡터가다양한유산균에서의 transformation 효율 pleucm42벡터는 Leuconostoc에서의 L-lactic acid 대량생산과 dextransucrase knock-out 연구에적용하였다. D-Lactic acid는발효식품의발효과정에서생성되며과량섭취시유아나대사질환을가진환자에게서산중독을야기시킬수있다. Leuconostoc속은 MRS에서배양시켰을때 D-lactic acid를주산물로생성하면서소량의 L-lactic acid를생성한다. 따라서 L-lactic acid를대량생산하는 Leuconostoc균주를얻기위해, Lb. plantarum 유래의 ldhl 유전자와 Leu. mesenteroides pyruvate kinase promoter를 pleucm42에삽입하여재조합체인 plc42pkl를제조하였다. 표 4 와같이, L-lactate dehydrogenase활성과 L-lactic acid 함량은현저히증가하였고, D-/L-lactic acid 함량비례는감소하였다. 또한, 구축된균주를 sauerkraut 발효과정에스타터로사용했을때, 같은효과를보였다 ( 그림 6)(Jin et al., 2016). 표 4. 야생균주와각종형질전환 Leu. mesenteroides의 D-/L-lactic acid 생성량비교
그림 6. Sauerkraut 발효중에 야생균주 ( ) 와 plc42pkl 이형질전환된 Leu. mesenteroides ( ) 를스타터로사용하였을때 L-lactic acid (A) 와 D-lactic acid (B) 생성량비교 Leuconosotc을물김치와같은발효식품의스타터로이용할때, 점질물 (dextran) 생성이또한문제가되고있다. 따라서 dextran을생성하지않는 mutant를스타터로이용하기위해 Leu. citreum CB2567균주 chromosome에있는 dextransucrase를 homologous recombination기술을이용하여 knock-out시켰다. Dextransucrase유전자가불활성화된균주와야생균주의생육속도, 주요대사산물생성량등은큰차이를보이지않았고 dextran을생성하지않았다 (Jin et al., 201). 표 4에서는두가지 Leuconostoc-E. coli shuttle 벡터의특성을요약하였다. 표 4. pleucm 와 pleucm42 의특성 Characteristics pleucm pleucm42 Size 5.8 kb 8.3 kb Replication type Rolling circle replication Theta-type replication Copy number Low High Plasmid stability High High Host-range Leu. citreum, Leu. mesenteroides, Lc. lactis, Lb. plantarum, Lb. reuteri, St. thermophilus, W. confusa, O. oeni 3. Leuconostoc 항시발현벡터재조합 Leuconostoc을단백질, 효소와같은다양한물질들을효율적으로생산할수있는세포공장으로이용하기위해항시발현벡터를구축하였다. 먼저, Leu. mesenteroides ATCC 8293이주탄소원으로사용하는 glucose와 sucrose배지에서의항시발현유전자를 transcriptome 데이터를이용하여분석하였고, 그중에서상위 6개의항시발현유전자의 promoter를 β-galactosidase 유전자에 fusion하여활성이가장높은
promoter(p710) 를선발하였다. 또한, Leuconostoc에서의항시발현벡터인 pcb4170을구축하였다 (Cho 2015). 하지만, 항시발현벡터인 pcb4170의 copy number가여전히낮은수준을보이기때문에기존의벡터의 replicase 유전자의랜덤돌연변이를유발하여 sfgfp (super folding GFP) 를 reporter 유전자로하여높은 copy number를보이는 mutant를 FACS 기반고속선발하였다 ( 그림 7). pcb4170의 replicase 유전자의 4690번째 sequence가 C에서 T로변이된벡터를 pcb4270으로명명하였다. pcb4270의 copy number는기존벡터의것에비해 30배정도높았다 ( 그림 8). 고밀도복제벡터인 pcb4270은세가지단백질 (sfgfp, glutathione-s-transferase, α-amylase) 발현으로효율을증명하였다 (Son et al., 2016). 본발현벡터는 Leuconostoc에서높은수준의유전자발현을위한유용한도구가될것으로기대된다. 그림 7. FACE 기반으로한 high-copy 벡터구축 그림 8. Leu. citreum CB2567 에서의 pcb4170 과 pcb4270 재조합체의 copy number 비교 4. Leuconostoc 유도발현시스템유산균에서동형-이형유전자를발현하기위한발현벡터에는복제될유전자의전사를조절하기위해서적절한프로모터가존재한다. 만일발현벡터의프로모터 strength 가강하고유전자발현이매우높으면, 생성된단백질은세포질 (cytoplasm) 안에축적되고생물학적활성이없는 inclusion bodies를생성하게된다. 또한몇몇의단백질의경우고농도로생성이되면오히려세포에독성을나타낸다. 그로인해발현수준을적절히조절할수있는유도프로모터가필요하다. Leuconostoc균주가 sucrose배지에서의 transcriptome과 secretome 데이터분석으로 sucrose PTS (Leum_0288) 와
levansucrase(leum_1409, Leum 1411) 유전자가 sucrose에의해조절되는것을알수있었다. 세가지유전자의 promoter 서열을 β-galactosidase유전자에 fusion하여유도발현벡터를구축하였고 Leu. citreum CBNU2567에도입하여발현시켜각각 glucose 와 sucrose가첨가된 MRS배지에서의효소활성을측정하였다. 그결과, 두가지유도발현벡터 (pek32p1409gal과 pek32p1411gal) 가 sucrose 배지에서 β-galactosidase가유도발현됨을보였다 (Cho 2015). 5. Leuconostoc food-grade 발현벡터프로바이오틱박테리아는담즙산에대한내성뿐만아니라항생제내성이필요하다. Leu. citreum은다양한발효식품에서우점종이지만프로바이오틱으로간주되기에는산내성과담즙산내성이너무부족하다. 따라서담즙산가수분해효소유전자 (bsh) 를 selection marker로사용하여담즙산내성을가진 Leu. citreum 균주를제조하고자 Lb. plantarum유래의 bile salt hydrolase유전자를 pcb4170에클로닝하여 food-grade 발현벡터인 pcb4170bsh를구축하였다 ( 그림 9). 이를 Leu. citreum CB2567에형질전환하였을때, 0.3% 의 glycodeoxycholic and sodium salt(gdca) 에서내성을보였다 ( 그림 10)(Cho et al., 2015). 그림 9. pcb4170bsh 재조합체구축모식도 그림 10. 다양한담즙염농도에서의야생타 입 Leu. citreum CB2567 과 pcb4170bsh 가 형질전환된유산균의생육비교 6. 기대효과류코노스톡속은한국의전통음식인김치에서우점종으로잘자라는유산균으로식물성환경에적응한균이다. 유가공식품이고칼로리와고지방으로인해점차시장이정체되는반면, 식물과곡물을이용한발효식품의시장이장차확대될것으로전망된다. 이와함께류코노스톡속유산균은주된종균으로이용될것이며, 다양한미생물특성과기능성을보이 8
는균주의개발이필요할것이다. 또한, 장내미생물이인체건강에미치는영향을고려할 때장차 metabolic engineering of gastrointestinal microbiome( 장내균총대사공학 ) 기술 개발에도이용될것으로기대된다. 참고문헌 1. Hyun-Ju Eom. Heterologous Gene Expression in Leuconostoc spp. via Leuconostoc-E. coli Vector Development and Transposon-mediated Gene Integration. 2007. 2. Qing Jin. Metabolic Engineering of Leuconostoc spp. for Biotechnological Application: Overexpression of L-Lactate Dehydrogenase Gene and Knock-out of Dextransucrase Gene. 2009. 3. Qing Jin, Jee Yun Jung, Yu Jin Kim, Hyun-Ju Eom, So-Young Kim, Tae-Jip Kim, Nam Soo Han. Production of l-lactate in Leuconostoc citreum via heterologous expression of l-lactate dehydrogenase gene. Journal of Biotechnology. 2009, 144:160-164. 4. Hyun-Ju Eom, Jin-Seok Moon, Eun-Young Seo, Nam Soo Han. Heterologous expression and secretion of Lactobacillus amylovorus α-amylase in Leuconostoc citreum. Biotechnology Letter. 2009, 31:1783-1788. 5. Hyun-Ju Eom, Seung Kee Cho, Myeong Soo Park, Geun Eog Ji, and Nam Soo Han. Characterization of Leuconostoc citreum Plasmid pcb18 and Development of Broad Host Range Shuttle Vector for Lactic Acid Bacteria. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2010, 15:946-952. 6. Hyun-Ju Eom, Jin-Seok Moon, Seung Kee Cho, Jeong Hwan Kim, and Nam Soo Han. Construction of theta-type shuttle vector for Leuconostoc and other lactic acid bacteria using pcb42 isolated from kimchi. Plasmid. 2012, 67:35-43. 7. Seung Kee Cho. Development of Food-grade Vector for Constitutive and Inducible Gene Expression in Leuconostoc citreum. 2015. 8. Seung Kee Cho, Soo Jin Lee, So-Yeon Shin, Jin Seok Moon, Ling Li, Wooha Joo, Dae-Kyung Kang, and Nam Soo Han. Development of Bile Salt-Resistant Leuconostoc citreum by Expression of Bile Salt Hydrolase Gene. Journal of Microbiology and Biotechnology. 2015, 25:2100-2105. 9
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