대한진단검사의학회지 : 제 23 권제 4 호 2003 Korean J Lab Med 2003; 23: 258-62 임상미생물학 타액에서 Helicobacter pylori 검출을위한배양법과연쇄중합효소법의비교 백인기 한태희 인제대학교의과대학상계백병원진단검사의학과 The Comparsion of Polymerase Chain Reaction and Culture for Detection of Helicobacter pylori in Saliva In Ki Paik, M.D. and Tae Hee Han, M.D. Department of Laboratory Medicine, Inje University, Sanggye Paik Hospital, Seoul, Korea Background : The presence of Helicobacter pylori DNA from saliva has been demonstrated by polymerase chain reaction; however, the culture of H. pylori is quite difficult. Because isolation of H. pylori strains from saliva plays an important role in epidemiological and pathogenic studies, our study was aimed to establish the H. pylori culture method from saliva and the compared detection limit between cultures after HCl-urea treatment and PCR. Methods : A strain of H. pylori was cultured, diluted and mixed with saliva of an H. pylori-negative volunteer to make a final concentration of a 10 1-10 5 colony forming unit (CFU)/mL saliva. Each concentration of samples was treated with various concentrations of HCl-urea (ph 1.2) to suppress other bacteria. Paired samples (HCl-urea treated and untreated) were streaked on horse blood agar and cultured for 3-10 days at 37 in microaerophilic condition. The DNA templates were extracted from the same concentrations of HCl-urea treated bacterial suspensions in saliva and PCR was performed. Results : The detection limit of the culture after HCl-urea treatment was 10 3 CFU/mL of saliva and that of the PCR after HCl-urea treatment was 10 2 CFU/mL of saliva. Conclusions : A culture after HCl-urea treatment for H. pylori would be an effective method for isolation of H. pylori from saliva; however, this method is less sensitive than PCR as far as the detection limit is concerned. A combination of both methods would be an effective method for detecting H. pylori from saliva. (Korean J Lab Med 2003; 23: 258-62) Key Words : Helicobacter pylori, Culture, Saliva PCR, Hydrochloride-urea treatment 서 론 Helicobacter pylori 는위염, 위십지장궤양, 위암의원인균으로 접수 : 2003년 6월 14일접수번호 : KJCP1682 수정본접수 : 2003년 7월 15일교신저자 : 한태희우 135-707 서울시노원구상계7 동 761-1 싱계백병원진단검사의학과전화 : 02-950-1228, Fax : 02-950-1244 E-mail: kscosby@sanggyepaik.ac.kr * 본논문은 2001 년도인제대학교학술연구조성비보조에의한것임 (This work was supported by the 2001 Inje University research grant.). 알려져있다 [1-4]. 그러나 H. pylori의감염원및감염경로에대해서는아직도명확하지않다 [5-7]. H. pylori가구강에서분리된이후타액이감염경로중하나로제기되어왔으며 [5], 구강내 H. pylori 배양으로균주가확보되면감염원, 감염경로, 구강과위장관내H. pylori의상관관계, 감염의재발등의연구에유용하게사용될수있다. 하지만타액에서 H. pylori를배양하는것은용이하지않은데, 그이유는 H. pylori가구강내에소수존재하며빠르게성장하는상재균등이다수있기때문이다 [7, 8]. 그러므로구강에서 H. pylori는존재여부를확인하기위해주로중합효소연쇄반응이주로이용되어왔다 [9-15]. 258
타액에서 Helicobacter pylori 검출을위한배양법과연쇄중합효소법의비교 259 Song 등 [7] 은타액을염산 (HCl) 과요소로처리하여오염된균들의성장을억제시켜낮은농도의 H. pylori를배양하는데성공하였는데, 저자등은이번연구에서이방법을이용하여타액에서 H. pylori 배양법을확립하여, 향후타액에서 H. pylori 균주를확보하고감염원및감염경로연구에이용하고자하였다. 검사방법의민감도를확인하기위해중합효소연쇄반응을병행하여두방법을비교하였다. 대상및방법 1. 시약과배지제조 ph 1.2의다양한농도의 HCl-urea (0.12 M HCl-0.08 M urea, 0.06 M HCl-0.16 M urea, 0.12 M HCl-0.16 M urea, 0.06 M HCl-0.2 M urea, 0.12 M HCl-0.2 M urea, 0.06 M HCl-0.5 M urea, 0.12 M HCl-0.5 M urea, 0.24 M HCl-0.5 M urea, 0.06 M HCl-1 M urea, 0.12 M HCl-1 M urea, 0.24 M HCl-1 M urea) 를 0.02 L pore sized filter (Millipore, Bedford, USA) 를이용하여멸균처리하였다. Blood agar base (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 16 g 을증류수 364 ml에녹인후가압멸균하였다. 배지를 50 까지식힌후 horse blood (Komed, Seongnam, Korea) 28 ml과 Tayer-Martin supplement I, II (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) 각각 2 vial 씩 (4 ml) 넣고잘혼합한후평판에분주하였다. 배지에는 vancomycin 5.0 mg/l, trimethoprim 5.0 mg/l 및 colistin 7.5mg/L이포함되었다. 2. 균주환자에게서분리되었던 [16, 17] H. pylori 균주 1주를이용하였다. 냉동보관된균주를자가제조한 7% horse blood agar plate 에접종하여물에젖은거즈를바닥에깐 GasPack jar (Becton Dickinson, Cockeysville, MD, USA) 에넣고 CampyPak Plus (Becton Dickinson) 를사용하여미호기성상태를조성하였다. 37 항온기에넣어 3일간배양하였다. 3. H. pylori 포함된표준타액의제조계대배양한 H. pylori 균주를생리식염수에풀어 McFarland 1.0 (10 7 CFU/mL) 으로맞춘다. 이균액을 10배연속희석하여 10 6, 10 5, 10 4 CFU/mL의균액을만든다. Urea breath test와타액중합효소연쇄반응에서 H. pylori 음성인지원자의타액을실험당일 10 ml 이상채취하였다. 타액 1 ml에균액 10 L을넣어 H. pylori 최종농도 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, CFU/mL의타액을제조하였다. 이타액을대상으로배양법과중합효소연쇄반응을시행하였다. 4. 표준타액의배양 1 L 정량백금이를이용하여표준타액을직접 7% horse blood agar plate에접종하였고 Song 등 [7] 의방법에따라타액 1 ml 에다양한조합의 HCl-urea 1.5 ml을첨가하여 37 에서 10분혹은 15분간항온한후 5,000 g에서 10분간원침시켰다. 상층액을버리고생리식염수 1 ml을첨가하여침사를부유시켰다. 부유액은다시 9,000 g에서 3분간원침하였다. 1 L 백금이를이용하여침사를 horse blood agar plate에접종하였다. 접종한 plate를냉동균주의계대배양과동일한방법으로배양하였다. 집락들을육안관찰하여무색투명한작은물방울모양의특정적인집락이관찰되면그람염색을실시하여그람음성의만곡된간균인경우 oxidase, catalase 및 urease 검사에서양성임을확인하였고 H. pylori 중합효소연쇄반응도병행하였다. 배양의재현성을보기위해배양검사는3회반복하였다. 5. H. pylori 중합효소연쇄반응표준타액 1 ml 혹은 HCl-urea 처리된표준타액부유액 1 ml 에 5% Chelex-100 resin (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) 1 ml를첨가한후 99 에서 20분항온한후원침하여상층액을주형 DNA로사용하였다. 한등 [17] 이사용했던 nested PCR법을이용하였다. 일차로 EHC-U (5-CCC TCA CGC CAT CAG TCC CAA AAA-3 ) 와 EHC-L (5-AAG AAG TCA CGC CAT CAG TCC CAA AAA-3 ) 시발체를이용하여 417 bp의 DNA를증폭한후이일차산물 1 L를이용하여 ET- 5U (5-GGC AAA TCA TAA GTC CGC AGA A-3 ) 와 ET-5L (5-TGA GAC TTT CCT AGA AGC GGT GTT-3 ) 시발체로 230 bp의 DNA를증폭하였다. 반응액구성은 Accu- Power PCR PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea, 조성 ; 1U of Taq DNA polymerase, 250 M of dntps in 10 mm Tris- HCl, 40 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2 ) 에 samples 1 L, primer 15 pmol씩을넣어총 20 L로맞추었다. 증폭조건은 1차, 2차모두 denaturation 95 45초, annealing 59 45초, extension 72 30초로 Gene Amp PCR System 9600 (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ, USA) 을사용하여 30회증폭하였다. 증폭된 DNA 산물은 2% agarose gel에서 100 V, 30분동안전기영동후 ethidium bromide (0.5 g/ml) 로염색하여판독후사진촬영하였다. 결과 1. 표준타액의배양 HCl-urea를처리하지않은타액을접종한배지에서는여러다
260 백인기 한태희 Table 1. The detection limits of H. pylori from saliva after 10 min or 15 min HCl-urea treatment Concentrations culture 10 min HCI-urea teatment PCR 15 min HCI-urea teatment culture PCR 0.06N HCI-0.08M urea 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 0.06N HCI-0.16M urea 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 0.06N HCI-0.20M urea 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 0.06N HCI-0.50M urea 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 0.06N HCI-1.00M urea 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 0.12N HCI-0.08M urea 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 0.12N HCI-0.16M urea 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 0.12N HCI-0.20M urea 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 0.12N HCI-0.50M urea 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 0.12N HCI-1.00M urea 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 0.24N HCI-1.00M urea 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 10 3 CFU/mL 10 2 CFU/mL 1 2 3 4 5 6 7 8 1,000 bp 500 bp 200 bp 230 bp Fig. 1. 10 3 CFU of H. pylori /ml of saliva culture for 3 days on 7% horse blood agar plate, showing small transparent colonies (arrow) which are urease (+), calatase (+), oxidase (+) and H. pylori PCR (+). 양한균주가성장하여 H. pylori 집락을확인할수없었다. 하지만 HCl-urea로처리한경우 10 3 CFU/mL까지무색투명한특징적인집락이관찰되었다. 이집락은 urease, catalase, oxidase 모두양성이었고 H. pylori 중합효소반응양성이었다 (Fig. 1). 흰색의보다크기가큰집락이모든배양에서다수관찰되었는데 urease (+), oxidase (+), catalase (-) 인그람음성간균으로중합효소연쇄반응음성이었다. 10 2 CFU/mL 이하에서는이러한그람음성간균집락만관찰되었다. 어떤조합의 HCl-urea를사용했는지에따른배양결과의차이는없었으며 HCl-urea처리시간이 15분으로연장되면타집락이줄어들어배경이깨끗해지나검출민감도가개선되지않았다 (Table 1). 3회반복한결과모두동일한양상을보였다. 2. H. pylori 중합효소연쇄반응 타액 1 ml에 H. pylori 균주를직접첨가한경우 10 3 CFU/mL 까지, 타액 1 ml에 HCl-urea 처리후중합효소연쇄반응을실시 Fig. 2. Detection limits of H. pylori PCR in HCl-urea treated saliva. Lane 1, DNA ladder marker; lane 2, positive control; lane 3, negative control; lane 4, 10 5 CFU of H. pylori/ml; lane 5, 10 4 CFU of H. pylori/ml; lane 6, 10 3 CFU of H. pylori/ml; lane 7, 10 2 CFU of H. pylori/ml; lane 8, 10 1 CFU of H. pylori/ml. 한경우에는 10 2 CFU/mL까지 H. pylori DNA가검출되었다 (Fig. 2). 고 H. pylori 배양은 H. pylori 감염진단에가장특이도가높은검사법이나까다로운배양조건과배양속도가느린이세군의특성때문에배양이용이하지않으며또한분변, 타액등다른세균의오염이많은검체의경우세균분리가더욱어렵다 [18]. 하지만세균배양은항균제감수성검사, 병인연구, 역학등의연구에필수적이다 [18]. 구강에서 ( 타액과치석 ) H. pylori 배양은일반적으로양성률이낮으나연구자에따라차이가있는데 [18-20] 이는사용한배지, 배양조건, 인구집단등의다양한요소들이원인으로판단된다 [18]. H. pylori는다른 urease 양성세균에비해 urease의양이많고활성이커서요소를분해하여주변에암모니아층을형성하여낮은 ph에서도생존이가능하다. Song 등 [7] 은 H. pylori의이런특성을오염균을제거하는데사용하여표준 H. pylori 균주 10 2 CFU/ 찰
타액에서 Helicobacter pylori 검출을위한배양법과연쇄중합효소법의비교 261 ml 까지타액에서검출하였다. 본연구에서도타액에서 H. pylori 를성공적으로배양할수있어타액에서균주확보가가능하게되었으나검출민감도가 10 3 CFU/mL으로 Song 등의연구에비해검출의민감도가낮았다. HCl과 urea의농도, 처리시간, 처리온도모두 Song 등 [7] 이제시한최적조건을이용하였으나검출민감도에차이가있어이부분에대한보완적연구도시행하였다. 모든농도에서 urease (+), oxidase (+), H. pylori 중합효소연쇄반응음성인그람음성간균집락이다수관찰되었는데특히 10 2 CFU/ ml 이하에서는이집락이상대적으로많이관찰되었다. 이집락은 Vitek GNI card에서 Agrobacterium radiobacter로동정되었다. 이균주는 HCl-urea법으로제거되지않는것으로판단되며이균의오염을감소시키기위해배지에포함된항균제의조성에변화를주는방법을향후연구에서시도해봐야할것으로판단하였다. 본연구에서 H. pylori 위장감염환자들의타액을 HCl-urea 처리후배양해보지않아정확한결과를예측할수는없으나 H. pylori 위장감염이있는환자의치석 mg 당균수가 1-213이라는연구보고가있어 [8] 타액에서도유사한결과가나타난다고가정하면저자들의배양법의 H. pylori 검출의민감도는 10 3 CFU/mL 으로앞으로검출민감도가최소한 10 2 CFU/mL 이하까지개선되어야할것으로판단되었다. 오염검체배양의민감도향상을위해검체의전처치, 배양배지, 선택배지에서적절한항균제조합, 배양조건등에대한연구가앞으로이루어져야할것이다. 이번연구에서배양후 H. pylori 집락의존재여부만을확인하였고집락수를확인하지않았다. 추후연구에서집락수확인도같이이루어져야할것이다. 저자들은타액이나치석등에서 H. pylori 존재여부를확인할때배양법과중합효소연쇄반응법을병행해야할것으로판단하였고중합효소연쇄반응법에서도검출률향상을위한전처치방법에대한연구가지속되어야할것으로사료되었다. 요약배경 : 타액에서 Helicobacter pylori 존재여부확인에는주로중합효소연쇄반응이이용되었다. 하지만역학혹은병인론연구에균주의분리가중요하나, 그동안타액에서 H. pylori 배양이용이하지않았다. 저자들은타액에서 H. pylori 배양법을확립하고배양법의민감도를중합효소연쇄반응과비교하고자하였다. 재료및방법 : 임상검체에서분리되었던 H. pylori 균주 1주를계대배양하여 H. pylori 음성타액에혼합하여 10 1-10 5 CFU/mL 의균액을만든다. 균액을다양한 HCl-urea (ph 1.2) 로처리한후 horse blood agar plate에접종하고 HCl-urea 처리전의균액도접종하였다. 검체는 37, 미호기성상태에서 3-10일간배양하였고각농도의검체에서 DNA를추출하여중합효소연쇄반응을시행하였다. 결과 : HCl-urea 처리후검체에서 10 3 CFU/mL 까지배양되 었고, 중합효소연쇄반응에서는 10 2 CFU/mL 까지 H. pylori가검출되었다. 결론 : HCl-urea 처리가타액에서 H. pylori 배양에유용한방법으로타액에서균주확보가가능해졌다. 하지만중합효소연쇄반응에비해민감도가낮아타액에서 H. pylori 검출에는두방법을병행해야할것으로판단된다. 감사의글본연구에많은도움을준곽은영병리사에게감사드립니다. 참고문헌 1. Graham DY. Campylobacter pylori and peptic ulcer disease. Gastroenterology 1989; 96: 615-25. 2. Tayler DN and Blaser MJ. The epidemiology of Helicobacter pylori infection. Epidemiol Rev 1991; 13: 42-59. 3. Forman D, Newell DG, Fullerton F, Yarnell JW, Stacey AR, Wald N, et al. Association between infection with Helicobacter pylori and risk of gastric cancer: evidence from a prospective investigation. BMJ 1991; 302: 1302-5. 4. Goodwin CS, Mendall MM, Northfield TC. Helicobacter pylori infection. Lancet 1997; 349: 265-9. 5. David RC. Transmission and Epidemiology of Helicobacter pylori infection. Ame J Med 1996; 100: 12-18. 6. Goosen C, Theron J, Ntsala M, Maree FF, Olckers A, Botha SJ, et al. Evaluation of a novel heminested PCR assay based on the phosphoglucosamine mutase gene for detection of Helicobacter pylori in saliva and dental plaque. J Clin Microbiol 2002 ; 40: 205-9 7. Song Q, Zirnstein GW, Swaminathan B, Gold BD. Pretreatment with urea-hydrochloric acid enhances the isolation of Helicobacter pylori from contaminated specimens. J Clin MIcrobiol 2001; 39: 1967-8 8. Song Q, Haller B, Ulrich D, Wichelhaus A, Adler G, Bode G. Quantitation of Helicobacter pylori in dental plaque samples by competitive polymerase chain reaction. J Clin Pathol 2000; 53: 218-22. 9. Song Q, Lange T, Spahr A, Adler G, Bode G. Characteristic distribution pattern of Helicobacter pylori in dental plaque and saliva detected with nested PCR. J Med Microbiol 2000; 49: 349-53. 10. Mapstone NP, Lynch DA, Lewis FA, Axon AT, Tompkins DS, Dixon MF, et al. Identification of Helicobacter pylori DNA in the mouths and stomachs of patients with gastritis using PCR. J Clin Pathol 1993; 46(6): 540-3. 11. Li C, Musich PR, Ha T, Ferguson DA Jr, Patel NR, Chi DS, Thomas E. High prevalence of Helicobacter pylori in saliva demonstrated by
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