JMLS [Journal of Marine Life Science] June 2019; 4(1): 29-37 [ 보문 ] Tiamulin 이 Streptococcus parauberis HFTC0083 에감염된강도다리 (Platichthys stellatus) 에미치는영향 주민수 1 김보성 2 김도형 2 서정수 3 권문경 3 지보영 3 박찬일 1* 1 경상대학교해양과학대학해양생명과학과 2 부경대학교수산생명의학과 3 국립수산과학원수산방역과 Effects of Tiamulin on Starry Flounder, Platichthys stellatus Infected with Streptococcus parauberis HFTC0083 Min-Soo Joo 1, Boseong Kim 2, Do-Hyung Kim 2, Jung-Soo Seo 3, Mun-Gyeong Kwon 3, Bo-Young Jee 3, Chan-Il Park 1* 1 Institute of Marine Industry, Department of Marine Biology and Aquaculture, College of Marine Science, Gyeongsang National University, Gyengsangnam-do 53064, Korea 2 Department of Aquatic Life Medicine, Pukyong National University, Busan 48513, Korea 3 Aquatic Life Disease Control Division, National Institute of Fisheries Science, Busan 46083, Korea Corresponding Author Chan-Il Park Institute of Marine Industry, Department of Marine Biology and Aquaculture, College of Marine Science, Gyeongsang National University, Gyengsangnam-do 53064, Korea E-mail : vinus96@hanmail.net Received : May 21, 2019 Revised : May 23, 2019 Accepted : June 11, 2019 수산양식산업에서발생하는다제내성균에의한질병을통제하기위해기존에사용하던수산용의약품대신어류에사용이금지된동물용의약품사용이증가하고있다. 그중, 티아물린은그람양성균에효과적인항균성을나타내기때문에일부양식어가에서불법적으로사용되고있다. 불법적사용을막기위해서는티아물린의수산동물에대한연구를통해수의사나수산질병관리사의처방전에따라수산생물의치료행위가수반되어야한다. 연쇄구균에감염된강도다리에대해티아물린을 5, 10, 15 mg kg -1 의농도로근육주사하였으나치료효과가나타나지않았고 15, 30 mg kg -1 의농도로경구투여하였으나마찬가지로치료효과가미비하였다. 안전성확인을위해 30, 60 mg kg -1 의농도로근육주사와경구투여한경우항생제의독성에의한폐사가발생하였고따라서연쇄구균에감염된강도다리에티아물린으로항생제처리를하는것은부적절하다고할수있다. In order to control disease caused by multi-drug resistant bacteria in the aquaculture, the use of veterinary antibiotics, which are prohibited to fish, is increasing, instead of the existing fisheries antibiotics. Among them, tiamulin is illegally used in some cultured fish because it exhibits effective antibacterial activity against Gram-positive bacteria. To prevent unauthorized use, treatment of fish should be accompanied by a prescription from veterinarians or fisheries disease managers through research on fish of tiamulin. Tiamulin was injected intramuscularly at 5, 10 and 15 mg kg -1 for the streptococcusinfected starry flounder, but did not show any therapeutic effect. Oral administration at a concentration of 15 and 30 mg kg -1 was similarly ineffective. The concentrations of 30 and 60 mg kg -1 resulted in death due to toxicity of antibiotics. Therefore, it is inappropriate to treat antibiotics with streptococcus-infected starry flounder. Keywords: Tiamulin( 티아물린 ), Starry flounder( 강도다리 ), Streptococcus parauberis( 연쇄구균 ), Efficacy( 유효성 ), Safety( 안전성 )
30 주민수 김보성 김도형 서정수 권문경 지보영 박찬일 서론 전세계적으로양식산업이급성장함에따라양식생물의질병발생도증가하게되었고양식현장에서수산용의약품의사용빈도또한증가하고있다. 수산용의약품의오 남용으로인해내성균이출현하게되고 (Smith et al., 1994) 양식생물의안전성과수산식품의공중위생학적안전성에심각한문제를일으키기도한다 (Katz and Brady, 2000). 기존의수산용의약품에내성을가지는균주를억제하기위해서는새로운의약품을사용하여야한다. 현재포유류나가금류에사용하고있는동물용의약품들중에서어류에질병을일으키는세균에도좋은치료효과를나타내는항생제들은수의사로부터처방받고구매하여어류에도사용할수있다. 하지만이동물용의약품들은어종별, 항생제별로적절한용량과용법이정해져있지않고, 수산질병관리사를통한처방과구매가불법인상황이다. 그럼에도불구하고, 일부양식어가에서불법적으로동물용의약품을사용하는사례가발생하고있다. Pleuromutilin은담자균류인 Pleurotus mutilus에서처음발견되었고 (Kavanagh et al., 1951), pleuromutilin 으로부터반합성된 tiamulin 은세균 ribosome 의 50S subunit 을타겟으로하여 peptidyl transferase center에서세포벽합성을억제하여정균활성을나타낸다고알려져있다 (Bøsling et al., 2003). Tiamulin 은 Mycoplasma gallisepticum, M. synoviae, M. meleagridis 그리고 M. iowae와같은 Mycoplasma 균주들에강한항균활성을나타내며그람양성균에도좋은항균성을나타내지만그람음성균에는비교적약한활성을나타낸다 (Werner et al., 1978; Messier et al., 1990). Tiamulin 은돼지와가금류의이질, 폐렴, mycoplasma 감염에대한치료제로써축산농가에서주로사용되고있으며, 돼지의장관전염병으로써대장의염증과혈액성하리가특징인돈적리에효과적이다. Streptococcus parauberis 는우리나라강도다리양식현장에서여름철고수온기에많은피해를입히는원인균주로써 (Woo and Park, 2013) S. parauberis 에감염된어류는외부증상으로출혈과농양을동반한안구돌출, 체색흑화등이나타나고내부증상으로는비장과간의비대, 복부와복벽의점상출혈등이나타난다고알려져있다 (Doménech et al., 1996). 이번연구에서는우리나라의강도다리양식현장에서발생하는주요한질병인연쇄구균병에대한치료제로써 tiamulin 의유효성과안전성에관한연구를수행하였다. 연쇄구균에감염된강도다리에다양한농도별, 방법별로항생제를투여하여나타나는치료효과를확인하였으며, 고농도로 tiamulin 을투여하여강도다리의내부조직에항생제가어떤영향을미치는지확인하여수산용항생제로써의적용가능성을검토해보았다. 재료및방법 1. 실험어 강도다리는경상북도포항소재의한양식장으로부터구입하였으며 S. parauberis 에감염된이력이없는것을사용하였다. 농도별근육주사실험에사용된강도다리는평균체장 12.3 ± 0.8 cm, 평균체중 38.2 ± 2.3 g이었으며농도별경구투여실험과근육주사와경구투여후안전성검사에사용된강도다리는평균체장 10.5 ± 0.7 cm, 평균체중 29.6 ± 1.3 g이었다. 실험에사용하기전일주일간 250 l의유수식수조에순치하였다. 수조의유수량은수조당 1.44 l/min 이었고지속적인유수를통하여수질을유지하였다. 2. 항생제근육주사용 tiamulin 은엘캄코바이오사의바이오- 티아물린 10% 주 ( 본제 1 ml 중 tiamulin hydrogen fumarate 100 mg 함유 ) 를사용하였으며경구투여용 tiamulin 은 ( 주 ) 우진B&G 의데나가드39( 본제 1 kg 중 tiamulin hydrogen fumarate 39 g 함유 ) 를사용하였다. 3. 균주 2015년에경상북도영덕의한양식장에서연쇄구균에감염된강도다리로부터분리된 S. parauberis HFTC0083 균주를사용하여인위감염실험을진행하였다. 사용균주는 1% NaCl이첨가된 Brain Heart Infusion Agar (BHIA; Difco., USA) 증균배지를사용하여 27 에서 24시간배양하였고배양된균주는인위감염에사용하였다. 균주는실험에사용될때까지 -80 에보관하였다. 인위감염후폐사하는개체의신장과비장으로부터균을재분리하여동정하기위해특이적인 primer (Mata et al., 2004) 를이용한 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로동정하였으며 PCR 조건은 94 에서 2분간 initial denaturation 하고, 후에 92 에서 1분, 55 에서 1분, 72 에 1분 30초를 1회로하여총 25회반응시켰으며, 마지막으로 72 에서 5분간 final extension 하였다 (Table 1). 4. 근육주사의농도별유효성조사강도다리에대한 tiamulin 의근육주사농도별유효성을확인하기위하여 Joo et al. (2019) 의연구에서기술한방법을참고하여실험을진행하였다. 실험수온은 24~25 를유지하였으며, PBS에현탁시킨 S. parauberis HFTC0083 균주를어체당 3 10 3 CFU 의농도로 100 μl를피하주사하여인위감염을실시하였다. 인위감염을실시한지 24시간후에주사용 tiamulin 을어체중 (kg) 당각각 5, 10, 15 mg이되도록 PBS에희석하여 100 μl를등근육에주사하였
15 June 2019; 4(1): 29-37 Tiamulin 이연쇄구균에감염된강도다리 (Platichthys stellatus) 에미치는영향 31 Table 1. Specific primers for S. parauberis detection Primer Sequences (5' 3') Target gene Product size (bp) Spa2152 Spa2870 TTTCGTCTGAGGCAATGTTG GCTTCATATATCGCTATACT 23s rrna 718 다. 음성대조구는세균접종대신 PBS를동량피하주사하고 24시간후에항생제대신 PBS를동량근육주사하였다. 양성대조구는인위감염을실시하였고 24시간후에항생제대신 PBS를동량근육주사하였다. 대조구는각각 12마리, 실험구는각각 24마리의강도다리를사용하였다. 인위감염후 2주간폐사율을관찰하였으며 15일째에각실험수조의생존한개체들을마취시킨후해부하고신장을 0.1 g (ml) 적출한뒤 PBS와함께마쇄하여단계희석하고 BHIA 배지에도말하여감염률을확인하였다. 5. 경구투여의농도별유효성조사 강도다리에대한 tiamulin 의경구투여농도별유효성을확인하기위하여 Joo et al. (2019) 의연구에서기술한방법을참고하여실험을진행하였다. 실험수온과인위감염조건은근육주사농도별유효성확인실험과같은조건으로진행되었다. 앞선실험에서결정된최적농도와 2배농도로설정하여실험을진행하였다. 인위감염을실시한지 24시간후에경구투여용 tiamulin 을어체중 (kg) 당각각 15, 30 mg이되도록 PBS에희석하였고 100 μl를 zonde 를사용하여 5일간 1일 1회경구투여하였다. 각실험구당 20마리의강도다리를사용하였다. 인위감염후 2주간폐사율을관찰하였으며 15일째에생존한개체들의감염률을확인하였다. 6. 근육주사와경구투여후강도다리의안전성분석 Tiamulin 이어체에미치는영향을확인하기위하여 Joo et al. (2019) 의연구에서기술한방법을참고하여병리조직학적분석을진행하였다. PBS를 100 μl 근육주사또는경구투여한대조구, 근육주사용 tiamulin 을 PBS에희석하여 15, 30, 60 mg kg -1 의농도로 100 μl 근육주사한세가지실험구와경구투여용 tiamulin 을 PBS 에희석하여 15, 60 mg kg -1 의농도로 100 μl 경구투여한두가지실험구로나누었고각실험구당 20마리의실험어를사용하였다. 근육주사는 1회실시하였으며 24시간동안나타나는폐사율을확인하였다. 경구투여는 5일간 1일 1회투여하였으며경구투여한지 0( 대조구 ), 1, 2, 4, 7, 14, 21일후에각수조에서 3마리씩무작위로선택하여마취하고해부하여간, 신장, 근육조직을적출하였다. 적출한조직을 10% 중성포르말린용액에전고정하였고세절한후동일한고정액에후고정하였으며 70% 에서 100% 에탄올로순 차적인탈수, xylene 으로투명화, paraplast 로치환과정을통하여각장기를 4 μm 두께로절편제작하여 H&E 염색을실시하였다. 그후에염색된장기절편들은광학현미경상에서 400배율로관찰하였다. 관찰하여나타나는병적증상은정도에따라정상, 경도, 중등도, 심도로구분하였다. 결과 1. 근육주사의농도별유효성 최초폐사는 15 mg kg -1 실험구에서발생하였고 day post challenge (DPC) 1에서 8.3% 의폐사율을보였다. 양성대조구와 5 mg kg -1 실험구의최종누적폐사율은 92% 로나타났고 10 mg kg -1 실
32 주민수 김보성 김도형 서정수 권문경 지보영 박찬일 Table 2. The cumulative mortality and infection rate in survival fish of efficacy studies of injection method in S. parauberis HFTC0083 infected starry flounder by tiamulin dosing concentration Group Con (-) Con (+) 5 mg kg -1 10 mg kg -1 15 mg kg -1 Cumulative mortality (%) 0 92 92 100 96 Infection rate (%) in survival fish 0 (0/10) 0 (0/2) 0 (0/2) - 0 (0/1) Table 3. The cumulative mortality and infection rate in survival fish of efficacy studies of oral administration method in S. parauberis HFTC0083 infected starry flounder by tiamulin dosing concentration Group Con (-) Con (+) 15 mg kg -1 30 mg kg -1 Cumulative mortality (%) 0 95 95 100 Infection rate (%) in survival fish 0 (0/10) 100 (1/1) 0 (0/1) - 험구의폐사율은 100%, 15 mg kg -1 실험구의폐사율은 96% 로확인되었다. 음성대조구에서는 15일간폐사가나타나지않았다 (Fig. 1). 실험종료후생존한개체들의감염률확인결과, 감염된개체는없었다 (Table 2). 2. 경구투여의농도별유효성 최초폐사는양성대조구와 30 mg kg -1 실험구에서발생하였다. 양성대조구와 15 mg kg -1 실험구의최종누적폐사율은 95% 로나타났고 30 mg kg -1 실험구의경우 100% 의폐사율이확인되었다. 음성대조구에서는 15일간폐사가나타나지않았다 (Fig. 2). 실험종료후생존한개체들의감염률확인결과, 양성대조구에서는 100% 로나타났고음성대조구와 15 mg kg -1 실험구는 0% 로확인되었다 (Table 3).
15 June 2019; 4(1): 29-37 Tiamulin 이연쇄구균에감염된강도다리 (Platichthys stellatus) 에미치는영향 33 3. 근육주사와경구투여후강도다리의안전성근육주사 24시간후 30 mg kg -1 실험구의폐사율은 25% 로나타났고 60 mg kg -1 실험구의폐사율은 60% 로나타났다 (data not shown). 경구투여한실험구에서는 60 mg kg -1 실험구에서 3일차에 1마리, 4일차에 2마리의폐사가발생하였다. 조직검사결과모든실험구에서지방간이관찰되었고 (Fig. 3-9) 신장에서는모든실험구에서전반적으로경도의조혈활성이나타났고 (Fig. 3-9) 15 mg kg -1 실험구에서는 1일차 (Fig. 4-q), 2일차 (Fig. 5-k) 에서중등도의조혈활성이관찰되었다. 60 mg kg -1 실험구에서는 1일차 (Fig. 4-t, w) 와 4일차 (Fig. 6-w, z), 7일차 (Fig. 7-t, w, z), 14일차 (Fig. 8-t), 21일차 (Fig. 9-z) 에서중등도의조혈활성이나타났다. 또한신장에서전반적으로경도의세뇨관위축이나타났으며 15 mg kg -1 실험구에서는 1일차 (Fig. 4-n, q) 와 14일차 (Fig. 8-k), 21일차 (Fig. 9-t) 에서중등도 의세뇨관위축이나타났고 60 mg kg -1 실험구에서는 1일차 (Fig. 4-w) 와 2일차 (Fig. 5-t), 7일차 (Fig. 6-t, z) 에서중등도의세뇨관위축이확인되었다. 그리고신장에서전반적으로중등도의 reticuloendothelial system (RES) 활성이확인되었다. 근육에서는모든실험구에서특별한증상이발견되지않았으며유의적인차이가관찰되지않았다. 고찰 이번연구에서는 S. parauberis 에의한연쇄구균병에걸린강도다리에대한 tiamulin 주사제의유효농도를확인해보기위해 5 mg kg -1, 10 mg kg -1, 15 mg kg -1 의농도로설정하여시험하였다. 농도설정은돈적리가발병한돼지에대한 tiamulin 주사치료에관한연구 (Burch et al., 1983) 에서설정한실험농도 10 mg kg -1,
34 주민수 김보성 김도형 서정수 권문경 지보영 박찬일 15 mg kg -1 과제조사의제품사용기준인 10 mg kg -1 을참고하였다. In vitro 에서 S. parauberis HFTC0083 에대한 tiamulin hydrogen fumarate 의최소억제농도 (Minimal inhibitory concentration, MIC) 확인결과 1 μg ml -1 로강한감수성을나타냈지만 (data not shown) in vivo에서근육주사와경구투여실험결과에서는치료효과가나타나지않았다. 시험관내에서측정한 MIC로는생체내의반응을정확하게예측할수없으며투여한항생제의대부분이체내에서혈청단백질과결합된상태로존재하여일부분만이조직내로확산되는경우에는치료효과를기대하기어려운경우가있다 (Lee and Shin, 2008). Tiamulin 의강도다리에대한안전성을확인하기위해주사제로강도다리의등근육에 15, 30, 60 mg kg -1 의농도로주사하였고 30, 60 mg kg -1 실험구에서는주사후 10분이내에주사부위의피부가검게변색되는것을관찰할수있었으며 (Supplementary Fig. 1) 주사후 3시간이내에각각 25%, 60% 의폐사가나타난것을확인할수있었다. 또한경구투여용항생제를 5일간 15, 60 mg kg -1 의농도로투여하였을때 60 mg kg -1 의실험구에서총 3마리의폐사가발생하였고, 병원체감염여부를확인해본결과감염되지않은것으로확인되었기때문에고농도의항생제투여로인한폐사로생각된다. 그리고병리조직학적검사결과전체실험구에서지방간이관찰되었고, 신장의경우모든실험구에서전반적으로약한조혈활성과세뇨관위축이나타났으며중등도의 RES 활성이확인되었다. 돼지의경우 tiamulin 주사제 (Denagard 10% injection, Premier Shukuroglou, Athens, Greece) 를과다투여하면타액분비, 구토방향감각상실, 간장경련등을일으킬수있다고명시되어있다. 이외에도 European Medicines Agency (1999) 의연구에따르면, 간중량증가나지방축적이발생하거나, 신근장애, 저칼슘혈증, 심실빈맥성부정맥등의증상에대한지표인 QT interval 의
15 June 2019; 4(1): 29-37 Tiamulin 이연쇄구균에감염된강도다리 (Platichthys stellatus) 에미치는영향 35 각된다. 결론적으로, tiamulin 은연쇄구균에감염된강도다리에대한치료효과가미비하며일정수준이상의농도에서숙주에대한강한독성반응을일으켜숙주를폐사로이르게하는부작용이심각하였다. 따라서연쇄구균에감염된강도다리에는적합한항생제라고볼수없다고생각된다. 사사 이논문은 2019 년해양수산부재원으로해양수산과학기술진흥 원의지원을받아수행된연구임 ( 스마트수산양식연구센터 ). 참고문헌 연장 (Nachimuthu et al., 2012) 과심한저칼륨혈증, 동성맥, heart block 을야기할수있는 double peaked T-waves 의증가 (Lionte et al., 2012) 등의증상이발생할수있다. 조혈활성은평소에는휴지기였다가혈중내에세균이나약물이침투하게되었을때활성이나타난다. 특히항생제의부작용으로인해빈혈, 혈소판감소, 백혈구감소등이발생할수있으며항생제투여를중단하게되면회복을하기위해조혈활성이나타날수있다 (Josefsdottir et al., 2017). 세포질이넓어지고대식세포의활성화가이루어지는현상을 RES 활성이라고하며조직에서거즈모양으로나타난다. RES 활성이나타나는조직에는대식세포등과같은포식세포들이항진하고있고조직에서흰색으로나타난다. 또한혈중내에세균감염이나항생제같은약물에의해활성화될수있다고알려져있다. 세뇨관이공포화된것은세뇨관에직접적인독성이영향을미쳤기때문이며이또한항생제에의해손상을입은것으로생 Bøsling J, Poulsen SM, Vester B, Long KS. 2003. Resistance to the peptydal transferase inhibitor tiamulin caused by mutation of ribosomal protein L3. Antimicrob. Agents Chemother 47: 2892-2896. Burch DGS. 1983. Tiamulin injection for the treatment of swine dysentery. Vet Record 113: 236-237. Doménech A, Fernández-Garayzábal JF, Pascual C, Garcia JA, Cutuli MT, Moreno MA, Collins MD, Dominguez L. 1996. Streptococcosis in cultured turbot, Scophthalmus maximus (L.), associated with Streptococcus parauberis. J Fish Dis 19: 33-38. European agency for the evaluation of medicinal products, veterinary medicines and information technology unit; committee for veterinary medicinal products: tiamulin, summary report (1). European Medicines Agency (EMA). P.3, EMEA/MRL/578/ 99-FINAL. Joo MS, Kim BS, Kim DH, Seo JS, Kwon MG, Jee BY, Park CI. 2019. The efficacy and safety of enrofloxacin antibiotics to Streptococcus parauberis PH0710 infected starry flounder (Platichthys stellatus). J Fish Mar Sci Educ 31: 459-473. Josefsdottir KS, Baldridge MT, Kadmon CS, King KY. 2017. Antibiotics impair murine hematopoiesis by depleting the intestinal microbiota. Blood 129: 729-739. Katz SE, Brady MS. 2000. Antibiotic residues in food and their significance. Food Biotechnol 14: 147-171. Kavanagh F, Hervey A, Robbins WJ. 1951. Antibiotic substances from basidiomycetes: VIII. Pleurotus multilus (Fr.) SACC. and Pleurotus passeckerianus pilat. Proc Natl Acad Sci USA 37: 570-574. Lee DG, Shin HH. 2008. Parmacokinetics and pharmacodynamics of antibiotics: General concepts and recent advances. Infect Chemother 40: 140-147.
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