대한진단검사의학회지 : 제 25 권제 5 호 2005 Korean J Lab Med 2005; 25: 임상미생물학 Nocardia asteroides type I 에의한폐렴 1 예 최원호 강정옥 배현주 1 최태열 한양대학교의과대학진단검사의학과, 감염내과 1

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대한진단검사의학회지 : 제 25 권제 5 호 2005 Korean J Lab Med 2005; 25: 324-8 임상미생물학 Nocardia asteroides type I 에의한폐렴 1 예 최원호 강정옥 배현주 1 최태열 한양대학교의과대학진단검사의학과, 감염내과 1 A Case of Nocardia asteroides type I Induced Pneumonia Won Ho Choe, M.D., Jung Oak Kang, M.D., Hyun Joo Pai, M.D. 1, and Tae Yeal Choi, M.D. Departments of Laboratory Medicine and Internal Medicine 1, Hanyang University College of Medicine, Seoul, Korea Nocardia species are opportunistic pathogens that are known to affect mostly the immunocompromised patients. Recently, we experienced a young systemic lupus erythromatosus female patient having infected with Nocardia species, which we were able to isolate from her lung abscess. The patient is twenty-nine years old female who was diagnosed as having systemic lupus erythromatosus two years ago and is currently engaged with ongoing treatment. During her admission, new symptoms of fever and dyspnea along with a lesion in the apical lobe of her left lung found by simple chest X-rays were observed. Under lung biopsy examination, there were seen neutrophilic exudates that were gram-positive, AFB-negative, and modified AFB-positive. By culturing the biopsy material, we found gram-positive, AFB-negative, and modified AFB-positive branching hyphaes that were morphologically matched for Nocardia species. We have analyzed the Nocardia DNA by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method and found the organism to be Nocardia asteroides type I. Treatment of patient was done using sulfamethoxazole/trimethoprim and ceftriazone, and her clinical conditions as well as her radiological findings improved. (Korean J Lab Med 2005; 25: 324-8) Key Words : Nocardia asteroides, PCR, Restriction endonuclease analysis, SLE, Pneumonia 서 Nocardiosis는 Nocardia 종에의해발병되는질환으로서주로면역이저하된환자에서폐렴이나피부낭창등의형태나혹은전반적인폐혈증의형태로나타난다 [1]. 이는빈도가낮은보기드문질환으로서, 주로호흡기를통해인체에유입된다. 우리나라에서는신장이식환자, 전신성홍반성루푸스환자및백혈병환자등에서균이검출되어보고된바있다 [2-4]. Nocardia 종은 actinomycetes에속하는 12종중하나로, N. asteroides가발견빈도가 접 수 : 2005년 3월 31일 접수번호 : KJLM1842 수정본접수 : 2005년 9월 2일 교신저자 : 최태열 우 133-792 서울시성동구행당동 17 한양대학병원진단검사의학과 전화 : 02-2290-8974, Fax: 02-2298-1735 E-mail: tychoi@hanyang.ac.kr 론 높으며그외에도 N. brasiliensis, N. caviae, N. farcinia 등도드물게보고된바있다 [2, 5, 6]. 전신성홍반성낭창환자의경우주요자가항체의출현등으로인한자체적인면역체계이상을동반하면서치료약재로쓰이는여러면역억제재의효과로전반적인면역상태가저하되어있어기회감염이생길가능성이높다 [7]. Nocardia 종을동정하는방법으로는 casein, tyrosine, xanthine 과 hypoxanthine 등의효소적가수분해를사용하였으나그유용성이높지않고결과들이일치하지않는등의단점이있어, HPLC 나, PCR 후에 restriction endonuclease 분석법이새로도입되어사용되고있다 [6, 8, 9]. Nocardiosis 증례보고는국내에서그간수차례보고되었으나주로균집락의모양, 염색성등을참조하여 genus level까지진단을하였고, 저자들은전신성홍반성낭창환자에서중증폐렴을일으킨 Nocardia를배양후, PCR과 restriction endonuclease 분석법으로종단계까지동정하였기에보고하 324

Nocardia asteroides type I 에의한폐렴 1 예 325 300 bp 200 bp 150 bp 100 bp 300 bp 200 bp 150 bp 100 bp 50 bp 75 bp A B Fig. 1. Gram stained smear showed long, branched, beaded Grampositive rods ( 1,000). 는바이다. 증 현병력 : 29세여자환자가전신성홍반성낭창및루푸스신증으로 cytoxan pulse의치료를받던중입원 18일경부터호흡곤란과고열이나타났으며흉부단순촬영상과흉부컴퓨터단층촬영에서왼쪽의폐심첨부에동공성병변이관찰되어폐생검을실시하였다. 검사소견 : 말초혈액검사에서백혈구수 17,100/ L, 혈색소 8.7 g/dl, 헤마토크릿 26.7%, 혈소판 227,000/ L이었다. PT는 9.8초 (136%), aptt는 52초 ( 정상 24초 ) 로증가되었고혈청전해질은 sodium 146 meq/l, potassium 3.5 meq/l, chloride 112 meq/l, 총 CO 2 24.4 meq/l로정상범위였으며 blood urea nitrogen은 24 mg/dl, creatinine은 0.6 mg/dl였다. 총단백질과 albumin은각각 4.6 g/dl와 2.5 g/dl로감소되었으며, 간기능검사에서 aspartate aminotransferase는 11 IU/L, alanine aminotransferase는 13 IU/L로정상이었다. Alkaline phosphatase도 96 IU/L로정상이었으나 -glutamyl transferase는 520 IU/L로높았다. 총 bilirubin은 0.2 mg/dl, direct bilirubin은 0.1 mg/dl 로정상이었다. 그외에 lactate dehydrogenase와 triglyceride가각각 776 IU/L, 323 IU/L로높았다. 미생물학적검사 : 폐에서실시한폐생검을통해얻은검체로그람염색을한결과그람양성의간균이가지모양 (branching) 을한것이관찰되어 AFB (Ziehl-Neelsen) 염색을하였으나 AFB 음성, modified AFB 염색에서부분양성의가지모양의간균을관찰할수있었다. 이검체를 sheep blood agar 배지와 chocolate 배지, 그리고 ogawa 배지에배양하였다. 배양 4일후에각각의배지에서하얀집락이관찰되었고, 집락에서실시한그람염색에서그람양성의간균이가지모양의균사를형성한것을관찰하였다 (Fig. 1). Ziehl-Neelsen 염색에서음성, modified AFB 검사에 례 Fig. 2. (A) RFLP of HSP gene block using MspI. Lane 1 shows Nocardia gene fragments formed using MspI. 2 bands of 265 bp and 180 bp are seen. (B) RFLP of HSP gene block using BsaHI. Lane 1 shows Nocardia gene fragments formed using BsaHI. 3 bands of 270 bp, 70 bp, and 65 bp are seen. 서양성소견을보여 Nocardia로추정하였다. 이균에대해항생제감수성검사를시행한결과 gentamicin, tobramycin, 광범위 cephalosporin, amikacin에모두감수성을, carbenicillin, ampicillin, ciprofloxacin, erythromycin에내성을보였고, kanamycin 에중등도감수성을보였다. 분자생물학적검사 : Nocardia를종단계까지밝히기위해 Steingrube 등 [6] 이발표한 PCR-RFLP법을이용하였다. 방법을간략히기술하면 primers NB-1 (5 -ACCAACGATGGTGTGT- CCAT-3 ), NB-2 (5 -CTTGTCGAACCGCATACCCT-3 ) (Bioneer, Changwon, Chungbuk, Korea) 를사용하여검체로부터추출된 Nocardia DNA의 65 kd heat shock protein (HSP) 유전자중 439 bp 부분을증폭하였다 [6]. PCR의반응액은 5 L template DNA, 0.2 Unit Taq DNA polymerase, 200 M dn- TP, 0.2 M 시발체두종류, 20 L 10 buffer (100 mm Tris- HCl, ph 9.0, 400 mm KCl, 15 mm MgCl 2 ), 2% DMSO 4 및증류수로총량이 50 L이되도록혼합하였다. DNA 증폭은 Gene Amp PCR system 9600 (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ, USA) 를이용하여 94 에변성, 60 에부착, 72 에연장을각각1분씩 35회를실행후72 에서 10분간마무리하였다. 증폭산물은 2% agarose gel에서 120 V로 90분전기영동후 ethidium bromide (0.5 g/ml) 로염색하여 439 bp의 DNA 절편을확인하였다. RFLP 분석법에는 10 L PCR산물에각각 0.5 L MspI과 BsaHI 제한효소들를따로첨가하고 2.5 L의 buffer와 12 L 증류수를첨가한후 30분동안 37 에보관하여 DNA 절편을분해한후전기영동을통해나타난결과를확인하였다. MspI를이용한결과 265 bp와 180 bp 크기의 DNA 밴드가보였고 (Fig 2A), BsaHI를이용한결과 270 bp, 70 bp, 65 bp 크기의 3개밴드가보였다 (Fig. 2B). 이결과는 Steingrube 등 [6] 이분석한결과와비교하여 Nocardia asteroides type I으로판

326 최원호 강정옥 배현주외 1 인 정하였다 [6]. 치료및경과 : 환자는 sulfamethoxazole/trimethoprim과 ceftriaxone으로치료시작 1주일후에는폐의방사선검사에서폐렴이호전되는것을관찰하였다. 환자는치료시작 2주후퇴원하여수개월간계속치료를받고있다. 고찰 Nocardia 균은 aerobic Actinomycetes group에포함된균들중한속이다. 이균들은 mycobacteria와같이 tuberculostearic acid를포함하고있지만그사슬의크기가작은것이특징이며이균의세포벽은 meso-diaminopimelic acid, arabinose, galactose 등이포함되어있다 [10]. 이균들은그람양성, 간균성, 가지모양의균으로균사들이자주분절되어구-간균성의모양을나타낸다. 최근이균들의분자적, 생물학적특성과표현형의분류에따라새로분류되는 Nocardia 종이많이발견되고있지만, 현재인체에감염될수있는 Nocardia 종은약 16개가밝혀져있다 [10, 11]. Nocardia는세계전역에서발견되며부생성균으로일반토양의정상균총으로대개존재한다. 이외에도부패되는식물성물질들이나, 먼지, 공기에도분포할수있다 [12]. 미국에서분리된주요원인균들로는 N. asteroides, N. farcinica, N. brasiliensis, N. travalensis 등이며이중 N. asteroides가가장많은것으로알려져있다 [9]. Nocardia 감염은사람과사람의전파나병원감염으로일어나기보다는대부분호흡기를통해감염되는것으로알려져있다. 미국에서는연간 500명에서 1,000명의감염이보고되고있고, 우리나라에는지난 5년간약 20여명의환자에서보고되었지만실제모든감염이보고되는것이아니므로그빈도는높을것이라추정된다 [2-4, 13, 14]. Nocardia는기회감염균으로서주로폐에관련된질환의형태로출현한다. 환자의대부분은면역체계에이상을가져오는기저질환들이있는경우가많으며, 기저질환이없는경우에는대부분외상에서기인한다 [10, 12]. 국내에서보고된 Nocardiosis의환자의경우에도대부분면역력저하를동반한신이식환자들과백혈병환자, 전신성홍반성루푸스환자등에서그예를찾아볼수있다 [2-4, 13]. 본증례에서도환자는전신성홍반성루푸스에대한치료를최근받은상태였고스테로이드사용등이이질환의선행조건이되었을것으로사료된다. Nocardia는폐질환의형태외에도국소적외상에의한농양, 폐에서부터시작된패혈증, 농흉, 뇌농양, 심근염, 활막염, 연부조직감염등의형태로도나타난다 [10, 12]. 장관막염이나, 각막궤양도보고되었으며궁극적으로는조직의괴사와농양의형성을일으키게되나육아종은보통생기지않는것이특징이다 [5, 10, 12]. 본증례에서도환자는폐렴의증상과소견을보였으며흉부단순촬영상에결핵이나진균감염의소견이보였고, 흉부컴퓨터단층촬영에서도폐의좌상엽부위에결절성병변이관찰되어이를세침흡입생검및미생물학적및분자생물학 적검사를통해 N. asteroides type I를발견할수있었다. 이질환은임상적증상과증후및방사선학적검사등으로확진하기는어렵다. 객담이나 BAL 검체의염색검사와배양검사가이질환의확진에중요하지만각검사마다예민도와특이도가다양하다 [5]. 실제 Saubolle 등 [5] 이검사한 Nocardiosis 환자들에서배양양성률은 95% 였으며그람염색도말검사의양성률은 64%, 그람양성중변형된 modified AFB stain의양성률은 51% 였다. 그람염색도말검사가임상검체에서 Nocardia를발견하는데민감도가좋은반면변형된 modified AFB stain은그람염색도말검사에서발견된균을확진하는데이용하는것이바람직하다 [5]. 본증례에서도균집락의그람염색에서가지모양을하는그람양성간균을발견하여 modified AFB stain의부분양성이관찰되여 Nocardia를의심할수있었다. Nocardia를종단위까지동정을하기위해서는기존에는 casein, tyrosine, xanthine과 hypoxanthine의가수분해방법을이용하였다 [6]. 그러나결과와표현형들이일치하지않는단점들이밝혀졌으며현재널리쓰이지는않는다. 현재는 Nocardia 균을종수준까지밝힐수있는방법들은 16sRNA 유전자증폭후 RFLP를이용한분석법과, 증폭된 HSP 유전자를 RFLP를이용한분석법, 그리고 16sRNA나 DNA sequencing을이용한분석법등이있다 [6, 15-17]. 연구자들은이들방법중 Steingrube 등 [6] 이개발한 HSP 유전자 RFLP 분석법으로 Nocardia를종단위로밝히려고시도하였다. 본연구에사용한 primers NB-1, NB-2는 Nocardia 속에공통으로존재하는 HSP유전자를증폭하게하는 oligonucleotide이다. 본예에서는 MspI을이용한결과 265 bp와 180 bp의 DNA 밴드가, BsaHI를이용한결과에서 270 bp, 70 bp, 65 bp 의 3개의 DNA 밴드가증폭되어 Steingrube 등 [6] 의분석결과에비교하여 Nocardia asteroides type I의패턴결과와일치하였다 (Fig. 2). Nocardiosis의주치료제는 sulfa계열이함유된항생제와함께 minocycline, amikacin, imipenem과 linezolid 등의약제를병합하는것이현재추세이다 [18]. Nocardia asteroides의경우 sulfa 제제외에다른항생제내성양상에의해 6개의종류의균으로나누어지며 penicillin에내성을보이나광범위 cephalosporin에감수성을보이는 type VI의빈도가높다 [5, 19]. 본환자의원인균은 Nocardia asteroides type I으로서 gentamicin, tobramycin, carbenicillin, 광범위 cephalosporin, kanamycin, amikacin에모두감수성을보이고 ampicillin, ciprofloxacin, erythromycin에저항성을보인다. 실제로본원에서항생제감수성검사를시행한결과 carbenicillin에저항성을보인것과 kanamycin에중간반응을보인것이외에나머지검사들이 N. asteroides type I의결과와일치하였다. 최근장기이식의증가및각종면역질환들의증가로면역억제제와스테로이드가많이쓰이고있고이런면역저하환자들의 Nocardia의검출건수가증가함에따라앞으로좀더빠르고확실한검사법을도입하는것이필요하다. 이증례를통해기존에실시하던

Nocardia asteroides type I 에의한폐렴 1 예 327 도말및배양검사에도 Nocardia가확진되지않으나의심될때추가적으로해볼수있는빠르고민감한새로운검사로서 PCR-RFLP 법이적합하다고사료된다. 또한최근추가된새로운 Nocardia 종들에대해서도검사를할수있다는점과우리나라에서발병하는 Nocardia의종들에대한보다더자세한역학적자료를제공할수있다는점도이검사의장점이라할수있다. 국내에서도면역저하환자에서 Nocardia에의한감염이자주발생되고있어 Nocardia 속을종수준까지신속정확하게진단할필요성이있다. 이에연구자는 Steingrube 등 [6] 의 PCR-RFLP 법을사용한결과 Nocardia asteroides type I을확인동정할수있었다. 요약 Nocardia는주로면역력이약화된환자에침범하여발병하는원인균으로서질환들은주로폐질환, 피부농양과같은국소적형태나패혈증과같은전신적형태로나타날수있다. 최근저자들은전신성홍반성루푸스환자에서발생한 Nocardia asteroides type I에의한폐렴을경험하였다. 본환자는 29세여자환자로서 2년전전신성홍반성루푸스진단을받고최근루푸스신염에대한화학요법을받은과거력이있던환자로서입원중호흡곤란및미열을동반한왼쪽폐상첨부의병변과백혈구의증가등검사결과상폐렴의소견을보였다. 그후실시한폐조직검사의배양에서형태학적으로 Nocardia 종과일치하는그람양성, AFB 음성, modified AFB 양성인가지모양의간균들을발견하였다. 저자들은이 Nocardia균을종단위까지동정하고자하여 Nocardia DNA를 PCR 과 restriction endonuclease 분석법으로검사한후원인균을 Nocardia asteroides type I으로확인하였다. 환자의치료에 sulfamethoxazole/trimethoprim과 ceftriaxone이사용되었고환자의임상소견과검사소견들은모두향상되었다. 참고문헌 1. Corti ME and Villafane-Fioti MF. Nocardiosis: a review. Int J Infect Dis. 2003; 7: 243-50. 2. Kim TH, Kim SC, Sohn JH, Sung HS, Kim MN, Han DJ. Nocardiosis following renal transplantation. Korean J Transpl 2001; 15: 208-16. ( 김태희, 김승철, 손준홍, 성흥섭, 김미나, 한덕종. 신이식후발생한 Nocardiosis. 대한이식학회지 2001; 15: 208-16.) 3. Cheong JY, Ko YW, Chong SY, Chong YS, Min YH, Hahn JS. A case of Nocardiosis in patient with chronic lymphocytic leukemia. Korean J Hema 1999; 34: 137-41. ( 정재연, 고윤웅, 정소영, 정윤섭, 민유홍, 한지숙. 만성림프구성백혈병환자에서발생한노카르디아증 (Nocardiosis) 1예. 대한혈액학회지1999; 34: 137-42.) 4. Lee JS, Lee YH, Choi SJ, Ji JD, Song GG. A Nocardial infection in a patient with systemic lupus erythematosus. Korean J Int Med 2002; 62: 100. ( 이종섭, 이영호, 최성재, 지종대, 송관규. 전신성홍반성낭창환자에서발생한 Nocardiosis 1예. 대한내과학회지 2002; 62: 100-3.) 5. Saubolle MA and Sussland D, Nocardiosis: review of clinical and laboratory experience. J Clin Microbiol 2003; 41: 4497-501. 6. Steingrube VA, Brown BA, Gibson JL, Wilson RW, Brown J, Blacklock Z, et al. DNA amplification and restriction endonuclease analysis for differentiation of 12 species and taxa of Nocardia, including recognition of four new taxa within the Nocardia asteroides complex. J Clin Microbiol 1995; 33: 3096-101. 7. Mok CC, Yuen KY, Lau CS. Nocardiosis in systemic lupus erythematosus. Semin Arthritis Rheum 1997; 26: 675-83. 8. Butler WR, Kilburn JO, Kubica GP. High-performance liquid chromatography analysis of mycolic acids as an aid in laboratory identification of Rhodococcus and Nocardia species. J Clin Microbiol 1987; 25: 2126-31. 9. Lungu O, Latta PD, Weitzman I, Silverstein S. Differentiation of Nocardia from rapidly growing Mycobacterium species by PCR-RFLP analysis. 1994: Diagn. Microbiol Infect Dis 1994; 18: 13-8. 10. Saubolle MA. Aerobic actinomycetes. In: McClachey KD, ed. Clinical Laboratory Medicine, 2nd ed. Philadelphia. Lippincott Williams & Wilkins 2002; 1201-20. 11. Kiska DL, Hicks K, Pettit DJ. Identification of medically relevant Nocardia species with an abbreviated battery of tests. J Clin Microbiol 2002; 40: 1346-51. 12. Brown JM and McNeil MM. Nocardia, Rhodococcus, Gordonia, Actinomadura, Streptomycetes, and other aerobic actinomycetes. In Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH ed, Manual of Clinical Microbiology, 8th ed. Washington DC. American Society Microbiology 2003; 502-31. 13. Chae EY, Kim YG, Park EJ, Park JH, Park JH, Yang CW, et al. A case of empyema thorax and intraabdominal abscess caused by Nocardiae Species. Korean J Nephro 1999; 18: 825-9. ( 채은영, 김용균, 박은정, 박정희, 박주현, 양철우등. 신이식환자에서흉강및복강을침범한 Nocardiosis 1예. 대한신장학회지 1999; 18: 825-9.) 14. Beaman BL, Burnside J, Edwards B, Causey W. Nocardial infections in the United States, 1972-1974. J Inf Dis 1976; 134: 286-9. 15. Laurent FJ, Provost F, Boiron P. Rapid identification of clinically relevant Nocardia species to genus level by 16S rrna gene PCR. J Clin Microbiol 1999; 37: 99-102. 16. Roth A, Andrees S, Kroppenstedt RM, Harmsen D, Mauch H. Phylogeny of the genus Nocardia based on reassessed 16S rrna gene sequences reveals underspeciation and division of strains classified as Nocardia asteroides into three established species and two unnamed taxons. J Clin Microbiol 2003; 41: 851-6.

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