생약학회지 Kor. J. Pharmacogn. 43(4) : 323 327 (2012) 마우스모델에서의생약복합제의여드름치료효능 이기만 1,2 이금선 1,2 심홍 1,2 오세군 3 박일호 1 임동술 1 강태진 1,2 * 1 삼육대학교약학과, 2 삼육대학교만성병연구소, 3 ( 주 ) 로다멘코스메딕스 Anti-Acne Effects of Herbal Complex in Acne Vulgaris Mouse Model Ki Man Lee 1,2, Geum Seon Lee 1,2, Hong Shim 1,2, Se Koon Oh 3, Il Ho Park 1, Dongsool Yim 1 and Tae Jin Kang 1,2 * 1 College of Pharmacy, Sahmyook University, Seoul 139-742, Korea 2 Institute of Chronic Disease, Sahmyook University, Seoul 139-742, Korea 3 Lordamen Cosmedics Co., Seoul 137-070, Korea Abstract Acne, also known as Acne vulgaris, is a common disorder of human skin involving the sebaceous gland and Propionibacterium acnes (P. acnes). The purpose of this study was to demonstrate whether anti-acne herbal complex (AAHC), a functional extract from herbal complex can be used for acne treatment as a natural product. We first demonstrated anti-acne activity of AAHC in mouse acne model. Acne was induced by injecting P. acnes on the backside 2 10 7 CFUs in ICR mice and then the mice were treated with AAHC by dermal application once daily. ACFREE (clindamicin phosphate) was used as a positive control. Treatment with AAHC decreased the P. acnes-induced skin swelling and inflammation. AAHC treatment significantly decreased serum DHT concentration in acne-induced mice. Especially, treatment of 20% AACH 20 in mice was more effected than 40%. We next evaluated the antimicrobial property of AAHC against P. acnes, Staphylcococcus aureus (S. aureus). and Escherichia coli (E. coli). Incubation of P. acnes, S. aureus, and E. coli with AAHC showed minimal inhibitory concentration (MIC) values against the bacterial growth lower. Alamar blue method was also carried for the antibacterial activity. It was effectively MIC level at 6.25% of P. acnes. AAHC effectively inhibited the growth of S. aureus and E. coli at 0.097% on MIC level, respectively. Our results showed the potential of using AAHC as an alternative treatment for antibiotic therapy of acne and the application of AAHC as a herbal medicine for acne treatment. Key words Acne vulgaris, Propionibacterium acnes, AAHC, DHT, MIC 피부표면의형태변화는여러가지피부노화, 혹은피부질환들과관련되어있으며, 1,2) 인구의 80~90% 가경험하는흔한피부질환인여드름은일부에선심한염증반응으로흉터를남기게된다. 3,4) 여드름의원인은다양한인자가관련되어있으며여러인자의상호작용으로인하여임상증상이나타나지만정확한원인은아직밝혀지지않았다. 잘알려진여드름의병인은면포형성과남성호르몬에의해유발된피지분비증가, 박테리아의증가, 염증유발및피부장벽의기능이상등이있다. 5) 면포는모피지선내의각질세포축적에의해발생되는데이원인은비정상적으로증가된모낭표피의각질형성세포의과증식현상과각질세포의탈락이제대로일어나지못해생기는각질세포의유착때문이다. 5) * 교신저자 (E-mail):kangtj@syu.ac.kr (Tel): +82-2-3399-1608 또한남성호르몬의분비증가에따른피지의과도한생성으로발생하는염증질환으로원인균으로알려진여드름균인 Propionibacterium acnes (P. acnes) 는지방분해효소 (lipase) 를분비하여피지를유리지방산으로지질분해하고모낭벽을자극하여모낭및그주위에여드름을형성하는것으로알려져있다. 3,6) 우리몸은스트레스를받게되면스트레스를극복할수있는호르몬인코티솔 (cortisol) 을분비하는데 2,7) 이로인해피지분비가더많아지고여드름을악화시키는기전으로스트레스가피지선과형성을유발하는부신안드로겐과 glucocorticoid 를증가시키는것으로보고되었다. 8) 여드름병변에서염증에주요한역할을하는 substance P 를함유한신경섬유가피지선주위에더많았으며또한분해효소인 neutral endopeptidase 가증가되어있는것이관찰된연구가 5,9) 있고배양된피지선에도 substance 323
324 Kor. J. Pharmacogn. P 가피지선내에 neutral endopeptidase 의발생을유발시키는것이관찰되었는데이것은여드름이신경학적이나정신적요소와관련있음을나타내주는것이다. 5) 남성호르몬인안드로겐의작용에있어서특히모유두부 (follicular in fundibulum) 와피지선내의 type I 5 알파 - 환원효소 (5α-reductase) 가증가하여디하이드로테스토스테론 (dihydrotestosterone, DHT) 의생성이증가하게되고이는수용체의민감성증가와함께피지생성의증가에중요한역할을한다고알려져있다. 2) 여드름의병인에중요한역할을하게되는박테리아의증식역시중요한역할을하게되는데특히여드름균의경우정상성인의피부상재균임에도불구하고병인의중요한역할을담당한다. 5) 그리고피지내지질성분이변화하게되어유발된여드름피부는콜레스테롤과콜레스테롤황산염간의불균형을초래하여모낭내각질세포사이의결합을증진시킴으로모낭정체과각화증이초래되며, 아실세라마이드의리놀산의감소역시모낭의수분함량증가와여드름균증식을촉진시켜염증을악화시킨다. 10) 여드름균의작용을억제하기위해화학적합성항생제가여드름치료제로처방이되고있으나내성과같은다양한부작용으로문제가되고있다. 항생제의부작용을줄이려는측면에서천연물이주요한대체제제로주목받고있고, 더불어해양천연물에대한연구도 11,12) 발표된바있으며여러한약재나패치 13) 등을이용한치료방법의개발등다각도의연구들이진행되고있는실정이지만아직도정확한병인이밝혀지지않았으며획기적인치료제도없는실정이다. 이에본연구에서는민간에서피부질환의예방과치료에사용되어온생약복합제를가지고연구를진행하였는바그중항균작용을가진오배자와천련자, 항염과항미생물효능을지닌것으로보고된창이자및피부종기등에사용되어왔다는초장초를혼합한조성물인 AAHC (anti-acne herbal complex) 를이용하여여드름질환동물모델에서여드름의치료효능과여드름균, 황색포도상구균에대한항균효과에대해평가함으로써여드름관련제품으로의개발가능성을확인하고자하였다. 재료및방법 시약및시료 ACFREE 외용액 ( 용액 100 ml 중클린다마이신포스페이 (7(S)-choloro-7-dexylincomycin-2-phosphate) 1.188 g ( 클린다아마이신으로서 1.0 g) 은 ( 주 ) 신신제약 (Ansan, Korea) 에서시판중인것을구입하여사용하였으며, ( 주 ) 로다멘코스메딕스 (Seoul, Korea) 에서제작된 AAHC 를공급받아시료로사용하였다. 그외의시약은시중에서구입할수있는최상급을사용하였다. 실험동물 실험동물로사용한 ICR 마우스 (4 주령, 18-20 g) 는 ( 주 ) 한림실험동물 (Whasung, Korea) 에서공급받아삼육 Table I. List of herbal medicine used for experiment 생약명 초장초 ( 酢漿草 ) Oxalidis Herba 오배자 ( 五倍子 ) Galla Rhois 창이자 ( 蒼耳子 ) Xanthii Fructus 천련자 ( 川練子 ) Meliae Fructus 대학교의명신경과학연구소동물실에서 1 주일동안안정화시킨후사용하였다. 온도 (23±2 o C), 습도 (55±10%) 및명암주기 (12 시간 ) 는자동으로조절되도록하였으며물과사료는자유롭게섭취하도록하였다. 실험물질 AAHC 의제조 본실험에서사용한약제는경동시장에서구입하였고 ( 주 ) 로다멘코스메딕스에서제조한것을공급받아사용하였다. 초장초잎 10 g, 오배자 10 g, 천련자열매 5g, 창이자잎 5g 의건조분말을혼합, 에탄올과정제수의혼합극성용매로추출한후그추출액을수욕상에서감압농축하여실험물질을얻었다 (Table I). 이추출물들을 ( 주 ) 로다멘코스메딕스가지정한비율로혼합한후연고기제 ( 프로필렌글리콜, 세라마이드및피롤리돈카르본산나트륨혼합물 ) 를첨가하여여드름치료용조성물을제조하였다. 균주 항균실험에사용한균주는혐기성균주인여드름유발균주 (P. acnes) 로삼육대학교예방약학연구실에서분양받아사용하였다. 균의생육배지로써 Reinforced-clostridial Broth (Difco, USA) 를사용하였으며 37 o C, 72 시간동안배양하였다. 대장균 (Escherichia coli KACC 25922) 과황색포도상구균 (Staphylococcus aureus KACC 10768) 은국립농업유전자센터에서분양받아사용하였다. ampoule 상태로분양된균주를각각멸균수에현탁한후 LB agar (BioShop) 배지에접종하고 37 o C 에서 24 시간배양하여 single colony 를확인하였다. 이후 single colony 를 LB broth (BioShop) 에서증식하여실험에사용하였다. 균보존은 20% glycerol (Sigma Co.) 을이용하여 -70 o C 에서동결보존하였으며시험하루전증식시켜사용하였다. 마우스의여드름유발 안정화기간이지난후마우스등의귀하단부에서부터꼬리상단부까지전체를제모하고 24 시간방치한후 4 등분하여각부위에소독된주사기를이용하여 2 10 7 CFUs 의여드름균을주입하여여드름을유도하였다. 14) 일주일동안상태를관찰한후같은양의균을재주입하여여드름을유발시켰다 (Fig. 1A). 시험약물의처치및항여드름효능 여드름이유발된마우스를선별하였으며여드름비유발군, 대조군, 시험물질도포군과양성대조군으로분류한후오전 10 시 -11 시사이에대조군에는 control base 를, 처치군에는 AAHC 10, 20, 40% 를함유한연고 20 mg 을 1 일 1 회, 1 주일또는 2 주일동안등부위에붓을이용하여도포하였으며, 양성대조군의동물
Vol. 43, No. 4, 2012 325 에는 ACFREE 외용액을도포하였다. 시험물질을도포후 1, 3, 7, 14 일이되는시점에육안으로여드름증상의정도를측정하였다. 혈중 DHT 측정 시험물질처치후 2 주되는시점에서 thiopental sodium (50 mg/kg) 을복강주사하여마우스를마취시킨후심장혈액을채취하였고, 3,500 rpm, 7 분, 4 o C 에서원심분리하여혈장을얻은후 DHT ( 디하이드로테스토스테론, dihydrotestosterone) ELISA kit (Alpha Diagnostic intl. San Antonio, TX. USA) 를사용하여 DHT 함량을측정하였다. 항균활성실험 항균효능을측정하기위해 paper disc diffusion 방법을사용하였다. 배양된세균을 LB agar 배지에 1 10 6 CFU/ml 로되도록희석하여각각 100 µl 씩 spreading 하였다. Paper disc (Advantec, 8 mm) 에 AAHC 를각각 50 µl 씩흡수시키고실온에서 1 시간확산시킨후세균이도말된배지상에고정시켜 37 o C 에서배양하였다. 24 시간후 paper disc 주위의 inhibition zone 생성여부로항균활성을확인하였다. 또다른항균활성을알아보기위한최소성장억제농도 (minimum inhibitory concentration, MIC) 측정은 alamar blue (Invitrogen, USA) 지시약을이용하여실시하였 다. 간단히설명하자면, 96 well plate 에 LB broth 배지를각각 100 µl 씩넣은후 AAHC 를각각첫번째 well 에 100 µl 씩첨가하였다. 이후 100 씩단계희석하여농도별로희석된모든 well 에증식된세균 (5 10 5 CFUs/ml) 을 100 µl 씩넣어최종 volume 을 200 µl 로고정하였다. 이를 37 o C 에서 24 시간배양한후 alamar blue 시약을 20 µl 씩넣어 1 시간다시배양하고발색여부로 MIC 를확인하였다. 균주는여드름균, 대장균및황색포도상구균을사용하였다. 통계처리 모든실험결과는 ANOVA (one way analysis of variance) 를이용하여통계처리하였고, Post-hoc test 로 Newman-Keuls Test 를사용하여 p<0.05 수준이하에서유의성검정을실시하였다. 결과및고찰 마우스에서의항여드름효능시험 여드름증상들을종합하여관찰한결과 AAHC 를 3 일간도포한경우 AAHC 의 10%, 20% 와 40% 의투여군에서유의성있게감소하였으며 7 일간도포한실험군에서는저용량을제외한모든농도의 AAHC 의처리가유의성있는감소효과를나타내었다. 14 일간도포한실험에서도저용량을제외한모든농도의 AAHC 의모든용량군에서 ACFREE 외용액에비해더좋은효과를보여주었다 (Fig. 1B). 이상의결과는 AAHC 도포가여드름성피부염의증상을완화시킬수있음을시사한다. DHT 생성억제효능 5 알파 - 환원효소활성증가에의한 DHT 의증가가피지생성과여드름유발에중요한역할을한다고알려져있었기때문에여드름이유발된마우스에 AAHC 처치후혈중 DHT 의수치를측정하였다. 그결과 20% 농도를처리한마우스에서혈중 DHT 의농도가유의하게감소하는경향을보여주었다. 그러나사용한농도 Fig. 1. Anti acne effect of AAHC in ICR mice (n=7). A. Induction of acne. P. acnes (2 10 7 CFU) were intradermally injected into backside of mice. Significantly swelling was observed in 72 hours after infection. B. The surface area of clinical sign was measured after dermal application of AAHC at dose 10%, 20%, and 40%. ACFREE solution was used as a positive control. Non-treated mice were used as a control. (1) control (gel base), (2) AAHC 10%, (3) AAHC 20%, (4) AAHC 40%, (5) ACFREE Fig. 2. The effect of AAHC on dihydrotestosterone (DHT) in mice serum (n=3). The acne-induced mice were treated with AAHC for 14 days and then cardiac blood was collected and used for DHT measurement. Each bar represents the mean± SEM of level of DHT. *p<0.05 **p<0.01 versus Control.
326 Kor. J. Pharmacogn. 중 20% 의 AAHC 가 40% 의농도보다 DHT 생성억제효능을보여주어 20% 농도가최적의항여드름효과를보여주는것으로생각된다 (Fig. 2). 따라서 AAHC 의항여드름효능은여드름균에대한항균작용과 DHT 분비억제를통한피지생성의감소효과에기인한것으로추측된다. 항균활성시험 여드름을유발시키는여러가지병인중하나인피부장벽기능의저하가염증에취약해진피부를통해여드름균뿐만아니라다른종류의박테리아의침투를용이하게하는것도병인의다양한인자중하나이다. 인체에서장내상재균으로존재하거나기생감염하여질병을유발시킬수있는그람음성균의종류중하나인대장균 (E. coli) 과그람양성균의일종인황색포도상구균 (S. aureus) 을사용하여여드름균 (P. acnes) 과함께항균활성실험을진행하였다. 그결과 paper disc 법을이용하여측정한생약혼합추출물의항균활성은여드름균, 대장균, 및황색포도상구균모두에서확인되어 Inhibition zone 의크기는여드름균에대하여 20 mm, 대장균, 황색포도상구균에대하여각각 16 mm 와 22 mm 로황색포도상구균에대하여더강한항균활성을보여주었다 (Table II). Alama blue 방법을이용한여드름균에대한 AAHC 의 MIC 는 6.25~12.5% 에서나타났고 (Fig. 3A), 대장균에대한 MIC 는 0.097~0.195% (Fig. 3B), 황색포도상구균에대한 MIC 또한 0.097~0.195% (Fig. 3C) 를보여주었다. 이상의결과는 AAHC 처치가여드름균뿐아니라여드름유발과관련된다른균들에대한항균작용도있음을시사한다. 여드름은사춘기에가장흔한피부질환중의하나로자연히좋아지는것으로알려져있지만, 일부에서는나이가들어도지속되는경우도있고, 사춘기여드름과달리염증성병변이많아서흉터로이어지는것을볼수있다. 특히젊은성인연령에서도유병율이증가되면서외모적스트레스의주요원인이되고있다. 2,17) 심한여드름은남자에게서많이나타나며면포, 농포, 낭종, 결절과가끔반흔을형성하는임상적소견을보이고피지분비가많은얼굴, 목, 가슴부위에많이나타나는양상을보인다. 5) 피질내의지질의조성, 남성호르몬, 국소적싸이토카인등이중요한인자로작용하는것으로보이나명확한기전은알려지지않았다. 여드름에서나타나는과각화현상은모낭표피세포의과증식을유도하고이들이유착됨으로더심화될것이다. 18) 특별히사춘기가되면남녀모두남성호르몬의분비가왕성하게되고이남성호르몬 ( 테스토스테론, testosterone) 은피부내의 5 알파 - 환원효소에의해 DHT 로바뀌게되어이것이피지선세포의 DNA 와결합하여그결과피지세포의분열이증가하고지질생합성효소의활성화가증가되어피지분비량이많아지게된다. 여드름환자는피지분비량이정상인보다많고이는피지병변의심한정도와밀접한관련이있는데정상인의피부에서보다 5 알파 - 환원효소의활성도가 Table II. Inhibition zone and minimum inhibitory concentration of AAHC against P. acnes, E. coli, and S. aureus Bacterial strain Inhibition zone (mm) MIC (%) P. acnes 20 12.5-6.25 E. coli 16 0.195-0.097 S. aureus 22 0.195-0.097 Fig. 3. The minimum inhibitory concentration (MIC) of AAHC against (A) P. acnes, (B) S. aureus, and (C) E. coli. 증가되어있음이밝혀지면서성호르몬, 특히국소적인 DHT 의불균형이여드름의중요원인이된다는것이밝혀지게되었다. 19) 본실험에서는이러한증상들과연관된여드름균에의해나타나는피부변형정도를실험동물을통하여분석해보고 (Fig. 1), 피지생성과연관된 DHT 생성억제효과 (Fig 2) 를측정함으로써천연물복합제제인 AAHC 의항여드름효과를평가한결과여드름병인과연관된효과를억제할가능성이있는결과를나타내었다. 항균시험 (Fig. 3, 4) 결과여드름균과여드름발생후이차감염과관계된대장균또는황색포도상구균에대한항균효능또한확인되었다. 여드름의정확한병인은완전히밝혀진것은아니지만현재에도다각도의연구들이수행되어지고있고특별히천연물질을통한연구가지속되어지며또한많은실험적연구를통하여실용가능한물질들이개발되어서여드름의예방및치료에기초가마련되리라기대해본다. 이러한문제를해결하기위해과다피지조절, 각질형성조절을통한모공폐쇄방지, 항균기능을가지고있으며피부에안전하면서도천연소재에의한면역조절기능을통한여드름의염증, 화농
Vol. 43, No. 4, 2012 327 을치료해야하는보다근본적인대안이필요하게되었다. 비록 AAHC 가 DHT 생성을억제하는결과를보여주었지만어떤기전에의해또는사용된생약의어떤성분에기인한것인지규명하는것이중요하다. 따라서이후의연구에서는생약혼합물의항여드름효능을보이는주요성분을분석하고그생리활성을규명하는연구를진행하고자한다. 결 여드름성피부염의 ICR 마우스모델에서여드름발현정도는 AAHC 실험물질도포군전용량에서대조군에비해감소하였으며그감소효능은아크프리외용액의효능보다우수하였다. 또한 AAHC 처치시혈중 DHT 의생성을억제하는효과를나타내었으며이는피지생성억제작용과관련이있음을시사한다. paper disc diffusion 방법과 alamar blue 방법을이용한항균효능에서도여드름균뿐아니라여드름발생후이차감염과관련있는황색포도상구균에대한항미생물효과를확인하였다. 피부질환의예방과치료에사용되어온생약의복합제를가지고연구를진행하였는바부작용없이안전하면서여드름증상을완화시키는효과를가진것으로판단되며여드름성피부염의새로운치료제로서의가능성을확인하였다. 시험물질 AAHC 처치가여드름성피부염의증상을완화시키는효능이있지만그효능이어떤단일성분또는어떤성분들의복합작용에기인하는지는확인되지않았다. 그러므로향후연구를통하여실험물질 AAHC 의처치로인한여드름성피부염치료효과가어떤성분에기인하며어떤작용기전을통하여발현되는지밝혀야할것이다. 사 본연구는 2010 년삼육대학교교내연구비에의해수행되었으므로이에감사를드립니다. 론 사 인용문헌 1. Choi, H. C. and Oh, C. H. (1997) Evaluation of Skin Furrows in the Ageing Process using an Image Analysis System. Kor. J. Dermatol. 35: 292-302. 2. Klingman, A. M. (1974) An overview of acne. J. Invest. Dermatol. 62: 268-287. 3. Norris, J. F. and Cunliffe, W. J. (1988) A histological and immunological stiudy of early acne lesions. Br. J. Dermatol. 118: 651-659. 4. Jeremy, A. H. T., Holland, D. B., Roberts, S. G., Thomson, K. F. and Cunliffe, W. J. (2003) Inflammatory events are involved in acne lesion initiation. J. Invest. Dermatol. 121: 20-27. 5. Farrar, M. D. and Ingham, E. (2004) Acne: Inflammation. Clin. Dermatol. 22: 380-384. 6. Ki, H. G., Yun, S. J., Lee, J. B., Kim, S. J., Lee, S. C. and Won, Y. H. (2005) Microorganisms isolated from acne and their antibiotic susceptibility. Kor. J. Dermatol. 43: 871-875. 7. Tollenaar, M. S., Elzinga, B. M., Spinhoven P. and Everaerd, W. A. (2008) The effects of cortisol increase on long-term memory retrieval during and after acute physchosocial stress. Acta Psychol. 127: 542-552. 8. Cunliffe, W. J., Holland, D. B., Clark, S. M. and Stables, G. I. (2000) Comedogenesis: some new aetiological, clinical and therapeutic strategies. Br. J. Dermatol. 142: 1084-1091. 9. Toyoda, M., Nakamura, M., Makino, T., Kagoura, M. and Morohashi, M. (2002) Sebaceous glands in acne patients express high levels of neutral endopeptidase. Exp. Dermatol. 11: 241-247. 10. Drake, D. R., Brogden, K. A., Dawson, D.V. and Wertz, P. W. (2008) Thematic review series: skin lipids. Antimicrobial lipids at the skin surface. J. Lipid Res. 49: 4-11. 11. Kim, S. C., Park, S. J. and Park, C. I. (2010) Antimicrobial activities of ethanolic extracts of marine resources against Propionibacterium acnes. Kor. J. Herbol. 25: 65-70. 12. Eady, E. A. (1998) Bacterial resistance in acne. Dermatology 196: 59-66. 13. Lee, T. W., Kim, J. C. and Hwang, S. J. (2003) Hydrogel patches containing triclosan for acne treatment. Eur. J. Pharm. Biopharm. 56: 407-412. 14. Nakatsuji, T., Kao, M. C., Fang, J. Y., Zouboulis, C. C., Zhang, L., Gallo, R. L. and Huang, C. M. (2009) Antimicrobial property of lauric acid against Propionibacterium acnes: its therapeutic potential for inflammatory acne vulgaris. J. Invest. Dermatol. 129: 2480-2488. 15. Ku, D. D., Zaleski, J. K., Liu, S. and Brock T. A. (1993) Vascular endothelial growth factor induces EDRF-dependent relaxation in coronary arteries. Am. J. Physiol. 265: H586-592. 16. Bate, J. M., Akerlund, J., Mittge, E. and Guillemin, K. (2007) Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota. Cell Host Microbe. 2: 371-382. 17. Jeong, E. G., Park, H. J., Lee, J. Y. and Cho, B. K. (2004) The study of post-adolescent acne in nurses. Kor. J. Dermatol. 42: 1255-1262. 18. Knaggs, H. E., Hughes, B. R., Morris, C., Wood, E. J., Holland, D. B. and Cunliffe, W. J. (1994) Immunohistochemical study of desmosomes in acne vulgaris. Br. J. Dermatol. 130: 731-737. 19. Thboutot, D., Harris, G., Iles, V., Cimis, G., Gilliland, K. and Hagari, S. (1995) Activity of the type 1 5-α reductase exhibits regional differences in isolated sebaceous glands and whole skin. J. Invest. Dermatol. 105: 209-214. (2012. 9. 17 접수 ; 2012. 11. 1 심사 ; 2012. 11. 2 게재확정 )