2113

대한진단검사의학회지제 28 권제 3 호 2008 Korean J Lab Med 2008;28:239-43 DOI 10.3343/kjlm.2008.28.3.239 원저 진단유전학 In-House PCR법을이용한 HLA-B27 형별검사의유용성검토 ; PCR 검사키트와 In-House PCR의일치율비교 조선영 이광길 박수연 이희주 경희의료원진단검사의학과 Utility of In-House PCR for HLA-B27 Typing: Comparison of Concordance Rate between PCR Kit and In-House PCR Sun Young Cho, M.D., Kwang Gil Lee, M.T., Su Yon Park, M.D., and Hee Joo Lee, M.D. Department of Laboratory Medicine, Kyung-Hee Medical Center, School of Medicine, Kyoung-Hee University, Seoul, Korea Background : Commercial kits of PCR method are widely used in HLA-B27 typing; however, their cost is relatively high. In this study, we evaluated the utility of an in-house PCR method by comparing it with that of a commercial kit. Methods : HLA-B27 typing was done in 188 patients by using two PCR methods, Absolute TM HLA- B27 PCR kit (Biosewoom, Korea) and an in-house PCR method. The primers used in the in-house method were prepared by Bioneer (Korea). Both PCR tests were done by Gene Amp PCR System 9600 (Perkin-Elmer Centus Corp., USA). Results : The commercial kit and in-house PCR showed 100% concordance rate with each other in HLA-B27 typing. Of 188 patients tested 72 (38.3%) were positive and 116 (61.7%) were negative by the both tests. Of 62 patients with ankylosing spondylitis, 50 were positive (80.7%). Conclusions : The in-house PCR is a reliable and cost-effective method and can replace or supplement commercial kits for HLA-B27 typing. (Korean J Lab Med 2008;28:239-43) Key Words : HLA-B27, In-house PCR, DNA typing 서 사람백혈구항원 (HLA) 은주조직적합복합체 (MHC) 유전자의산물로서인체의면역계에서자기와비자기를구별하고세포간의사소통을하는데필수적인물질로알려져있다 [1]. HLA는 접 수 : 2008년 1월 30일 접수번호 : KJLM2113 수정본접수 : 2008년 4월 16일 게재승인일 : 2008년 4월 17일 교신저자 : 이희주 우 130-701 서울시동대문구회기동 1 경희대학교의과대학진단검사의학과 전화 : 02-958-8672, Fax: 02-958-8609 E-mail: leehejo@khmc.or.kr 론 이식분야에서그역할이가장잘규명되어있지만일부 HLA는특정질환과의높은연관성을가지고있음이알려져있다 [2]. 대표적으로 HLA-B27은강직성척추염에서높은연관성을보이며그외에도포도막염, 건선, 아밀로이드증, 대동맥염, 혈액암등과연관되어있다 [2]. 강직성척추염은척추와천장골관절을침범하는전신성염증성질환이며일부에서는심장과장, 피부의침범을보이기도한다 [1]. 일반적으로남성에서우위를보이나남녀에게서공히나타날수있는질환이며늦은 10대나빠른 20대에척추관절병증 (spondyloarthropathy) 이시작된다. 또한 HLA-B27이양성인사람이일등친 (first degree relative) 중에강직성척추염환자가있다면그환자에서강직성척추염 239

240 조선영 이광길 박수연외 1 인 이발병할위험도가세배정도증가한다 [1]. 고식적 HLA-B27 typing은전통적인도움체의존세포독성 (complement-dependent cytotoxicity) 법을이용하여세포표면에존재하는 HLA 항원을검사하는방법에기초하였다. 최근에는유세포분석을이용한 HLA-B27 항원검출법도이용되고있다. 이러한세포표면의항원을이용한 HLA-B27 형별검사법은분석을위해살아있는세포가요구된다는단점을가지며 HLA-B27에대한항체는 B7이나 B40과같은항원에교차반응성을가지므로위양성이유발될수도있다 [1]. HLA-B27 항원을암호화하는유전자를분석하는방법은이러한위양성을줄일수있으며 PCR with specific oligonucleotide probe (PCR-SSO) 와 PCR with sequence-specific primer (PCR- SSP) 등의방법이있다 [3]. HLA-B27 검사는오래전부터혈청학적방법을이용하여검사되어왔으나제품공급이중단되면서 PCR법에기반한제품들로대부분대치되었다. 경희의료원에서는 HLA-B27 형별검사에상품화된 Absolute TM HLA-B27 키트 ( 바이오세움, 서울, 대한민국 ) 을사용하여왔다. 그러나 PCR법은혈청학적방법에비해매우비싸다는문제점이있어 in-house PCR을개발하여비용을절감하고자하였으며또한상품화된키트와 in-house PCR법의비교를통해 in-house PCR에대한유용성을검토하고자하였다. 재료및방법 1) DNA의추출환자의 EDTA 혈액 100 μl 와증류수 1,000 μl 를상온에서소용돌이혼합기 (vortex mixer) 로잘혼합한후 13,000 rpm으로 1분간원침하여상층액을제거한후다시위의과정을두번더반복하였다. DNA 추출용액 50 μl 를첨가하고소용돌이혼합기로잘혼합하여 56 C 에서 15 분간방치한후다시잘혼합하였다. 100 C 로 8분간가열한후 13,000 rpm에서 2분간원심분리하여상층액을 PCR 검사에이용하였다. 2) 유전자증폭 PCR 혼합체와 PCR 중합효소를 3:1의비율로혼합한후이혼합액 15.5 μl 와검체에서추출된상층액 4.5 μl 를 PCR 시험관에분주하고 94 C 에서 5분초기변성과정을거친후, 세 cycle 즉94 C 에서 30 초, 65 C 에서 30 초, 72 C 에서 30 초의조건으로 30회반복시행한후 72 C 에서 5분간연장처리하였다. 3) 결과의판정증폭된 DNA 산물 6 μl 를 1.5% agarose gel을이용하여 120 volt에서 30 분간전기영동한후 ethidium bromide로염색하여 UV 투과조명기에서 HLA-B27 및 internal control ( 베타글로빈, 268 bp) 밴드를확인하였다. Internal control 밴드를관찰할수있는결과에서 HLA-B27 결과를확인할수있을때 HLA-B27 양성으로판정하고 internal control 밴드만확인가능하였을때는음성으로판정하였다. 경희의료원에서 2004년 6월부터 8월까지 HLA B27 검사가의뢰된환자 70 명과 2006년 7월부터 2007년 4월까지 HLA B27 검사가의뢰된환자 117명의환자의총 188개의 EDTA 혈액검체에대해 2가지방법으로 DNA 형별검사를시행하였다. HLA- B27 DNA 형별검사는 PCR법을이용한상품화된 Absolute TM HLA-B27 PCR 키트 ( 바이오세움 ) 을이용한방법과 Bunce 등과 Zino 등이기술한시발체를제작하여 PCR을시행하였다 [4, 5]. 매검사시양성과음성대조군을포함하여시행하였다. 1. 키트를이용한 HLA-B27 형별검사검사에사용된 DNA 추출용시약과 PCR 혼합체, Taq 중합효소는모두검사키트내에포함된것을사용하였다. 전반적인검사과정 (DNA 추출, 유전자증폭, 전기영동, 결과확인 ) 은모두검사키트제공시동봉된검사지침서에따라수행하였다. 2. In-house PCR을이용한 HLA-B27 형별검사 1) DNA의추출 DNA의추출은키트를이용한 HLA-B27 형별검사에서와동일한방법을사용하였고분리한 DNA 추출물은두방법에동시에사용되었다. 2) 시발체 (HLA B27 280) Bunce 등 [4] 과 Zino 등 [5] 이기술한시발체들을바이오니아사 ( 대전, 대한민국 ) 에합성의뢰하여사용하였다 (Table 1). Internal control로는암억제유전자로알려진 p53 유전자에특이적인시발체를제작하여사용하였다. 3) 유전자증폭 Gene Amp PCR System 9600 (Perkin-Elmer Centus Corp., Norwalk, CT, USA) 을이용하여 PCR을시행하였다. 각

In-House PCR for HLA-B27 241 각의 dntp ( 코아바이오시스템, 서울, 대한민국, 각각 200 μm) 와 internal control용시발체 (0.2 μm), HLA-B27에대한시발체 (1 μm) 로혼합물을만들고여기에 1) 에서추출된상층액 ( 약 2.0 μl) 과중합효소 ( 이노메디텍, 오산, 대한민국, 약 0.5 U) 를첨가하여최종적으로 20 μl 가되게하였다. 이를 PCR용시험관에분주하고키트를이용한 HLA-B27 형별검사에서와동일하게 PCR을시행하였다. 4) 결과의판정키트를이용한 HLA-B27 형별검사에서와동일하게시행하였다. 1. 대상환자군 결 환자 188명의평균나이는 37.0세이며남녀비율은 2.1:1이었다. 이중강직성척추염으로이미진단받은환자가 60명으로가장많았고홍체모양체염이 28명, 척추관협착증이 11명으로 Table 1. Patient characteristics and HLA-B27 typing results Diseases 과 HLA- B27 N. of positive patients cases N (%) Mean age yr Sex ratio M/F Ankylosing spondylitis 62 50 (80.7) 35.9 48/14 Iridocyclitis 28 6 (21.4) 38.9 17/11 Rheumatism 16 5 (31.3) 32.1 11/5 Arthrosis 16 1 (6.3) 32.9 12/4 Spinal stenosis 11 2 (18.2) 36.2 6/5 Joint pain/myalgia 11 2 (18.2) 27.6 11/0 Optic neuritis 7 0 (0) 55.9 0/7 Other articular diseases* 8 4 (50.0) 34.8 5/3 Other diseases 29 2 (6.7) 42.3 17/12 Total 188 72 (38.3) 37.0 127/61 *, HLA-B27 positive in synovitis, osteochondrosis and pyogenic arthritis;, HLA-B27 positive in diabetes and cerebral infarct. Abbreviations: F, female; M, male; N, number. 뒤를이었다 (Table 2). 질환별양성률을살펴보면강직성척추염에서가장높아 80.7% 를차지하였고류마티즘이 31.3%, 홍채섬모염이 21.4% 를나타내었다. 188개의환자검체중양성을보인 72명중에서강직성척추염이차지하는비율은 68.1% 였다. 2. PCR 결과 양성을보인 72예에서는키트와 in-house PCR ( 시발체 B27 280) 의두방법에서모두양성을나타냈으며 (38.3%) 음성을보인 116예에서는두방법에서모두음성을보여 100% 의일치율을나타내었다 (Table 3). 2004년에수집된 70개의환자검체에대하여는 in-house PCR을시행한각각에대한결과를살펴보았다. 70개의환자검체중 20 예에서는키트와 in-house PCR 에서모두양성을나타냈으며 52예에서는모두음성을보여세결과간에 100% 의일치율을보였다. 또한 in-house PCR의경우, 상품화된키트에비해 90% 정도의재료비절감효과가있었다 (Fig. 1). 고 PCR법은환자의유전자에 HLA-B27의존재유무를확인하는데있어서정확하고간편한방법이다 [2]. Lucotte와 Burckel 은유세포분석법을뛰어넘는 PCR법의몇가지장점에대해언급한바있다. 첫째, 하루에수백건에달하는검사를수행할수있는용량을가지며둘째, 수시간내에결과를낼수있으며셋 Table 3. Comparison of the test results in 188 patients by PCR kit and in-house PCR 찰 In-house PCR Positive Negative Total Commercial Kit Positive 72 0 72 (Biosewoom) _negative 0 116 116 Total 72 116 188 Concordance rate=100%. Table 2. Characteristics of primers used in the in-house PCR Primer name Primer sequence Locus Primer length (bp) Product length (bp) B27 280 Sense 5 -GCTACGTGGACGACACGCT-3 B*2701-2709 19 149/150 Antisense 5 -CTCGGTCAGTCTGTGCCTT-3 19 5 -TCTCGGTAAGTCTGTGCCTT-3 20 Internal control Sense 5 -TAGGACCTGATTTCCTTACTGCCTC-3 P53 exon 8 25 236 Antisense 5 -AACTGCACCCTTGGTCTCCTCCACC-3 25 Abbreviation: bp, base pair.

242 조선영 이광길 박수연외 1 인 a b c d P 1 2 3 4 N A P 1 2 3 4 N Fig. 1. Results of HLA-B27 typing. (A) Absolute TM HLA-B27 PCR kit (Biosewoom), (B) In-house PCR with B27 280 primer. Lanes 1-4, patient 1-4; P, positive control; N, negative control; a, internal control (beta-globin); c, internal control (P53 exon 8); b and d, HLA B27 band. B 째, DNA 형태로검체를보존할수있고넷째, 유세포분석법에비해한검사당저렴한가격을가지며다섯째, 항체가갖는교차반응성에의한위양성을피할수있다는점이다 [6]. 또한유세포분석시경계치 (cut-off) 부근의결과등판정이어려울때에도도움이될수있다 [7]. 그러나 PCR 법은고유의단점인검체간오염에의한위양성의가능성을염두에두고검사시검체간오염을줄이기위해주의를기울여야한다 [8]. 이러한 PCR법은키트로보급되어많은검사실에서사용되고있고특히대형검사실에서 HLA-B27 형별검사에폭넓게쓰이고있는방법이다. 그러나검사비용이비싸소규모의검사실에서는적용하기어려울수있다. 저자들은이번연구를통해키트를이용한 PCR법과 in-house PCR의일치율의검토를통해 in-house PCR의유용성을확인해보고자하였다. 상품화된키트와 in-house PCR은모든검체에서동일한결과를나타내었고 in-house PCR은편의성은조금떨어지나재료비면에서상품화된키트에비해약 1:10 정도로저렴하므로저자들이개발한 in-house PCR은정확할뿐만아니라비용-효율적이라판단된다. 그러므로 in-house PCR로서상품화된키트를대체하거나상호보완적으로사용이가능하다고사료되었다. HLA-B27 검사는일반인에게는 8% 정도만양성으로나타나나강직성척추염환자에서는 90% 정도에서양성을나타낸다고알려져있다 [1, 2]. 본연구에서는강직성척추염에서양성률 80.7% 를나타내었고 ( 남자 ; 83.3%, 여자 ; 71.4%), 일반질환군에서는 6.7% 를나타내었다. 이등 [9] 은한국인 412명의강직성척추염환자를대상으로한연구에서 93% 의환자가미세림프구독성검사를통한 HLA-B27 형별검사에서양성을나타냈다고 보고하였다. PCR법만으로진행된본연구에서는이보다낮은양성률을보여위음성의존재가능성도배제할수없었으나미세림프구독성검사법과 PCR법의양성률이약간다르게보고된보고들을고려해볼때강직성척추염환자를대상으로한검사방법간의비교도필요할것이라생각되었다 [3, 10]. Inaoui 등 [11] 은 53 명의미분화성만성단일관절염 (undifferentiated chronic monoarthritis) 외래환자들을대상으로한후향적연구에서 8명의 HLA-B27 양성환자중 5명이후에척추관절증으로진행하여그빈도가 HLA-B27 음성인미분화성만성단일관절염환자들보다통계적으로유의하게높았다고보고하였다. 본연구에서 HLA-B27 형별검사가의뢰된환자중강직성척추염외의관절계질환자는총 62 명이었으며이중 14 명 (22.6%) 이 HLA-B27 양성으로확인되었다. 이환자들에있어서기존의질환치료후에도지속적인추적을통해척추관절증의발병을감시하고이러한추적조사를통한강직성척추염에대한 HLA-B27의예측능에대한연구도필요할것으로사료되었다. 요약배경 : PCR 키트를통한 HLA-B27 검사는최근많이사용되고있는방법이나그비용을무시할수없다. 본연구에서는상품화된키트와 in-house PCR법의비교검토를통해 in-house PCR에대한유용성을검토하고자하였다. 방법 : 총 188명의환자에서두가지 PCR법을이용하여 HLA-B27 형별검사를시행하였다. 하나는상품화된 Abso-

In-House PCR for HLA-B27 243 lute TM HLA-B27 PCR 키트 ( 바이오세움, 대한민국 ) 을이용한방법이며, 다른하나는시발체 ( 바이오니아, 대한민국 ) 를제작하여시행한 in-house PCR법이었다. 두방법모두 Gene Amp PCR System 9600 (Perkin-Elmer Centus Corp., USA) 을통해증폭이이루어졌다. 결과 : HLA-B27 형별검사에있어서키트와 in-house PCR 의두방법은 100% 의일치율을나타내었다. 양성을보인 72예에서는키트와 in-house PCR의두방법에서모두양성을나타냈으며 (38.3%) 음성을보인 116예에서는두방법에서모두음성을보였다. 62명의강직성척추염환자에서의양성률은 80.7% 로나타났다. 결론 : In-house PCR의검사결과는높은신뢰도를보여주었고비용면도상품화된키트에비해저렴하므로 in-house PCR로서상품화된키트를대체하거나상호보완적으로사용이가능하다고사료되었다. 참고문헌 1. Seipp MT, Erali M, Wies RL, Wittwer C. HLA-B27 typing: evaluation of an allele-specific PCR melting assay and two flow cytometric antigen assay. Cytometry B Clin Cytom 2005;63:10-5. 2. Downing J, Coates E, Street J, Hammond L, Rees TJ, Pepperall J, et al. A high-resolution polymerase chain reaction-sequence-specific primer HLA-B*27 typing set and its application in routine HLA- B27 testing. Genet Test 2006;10:98-103. 3. Nathalang O, Tantimavanich S, Nillakupt K, Arnutti P, Jaruchaimontree C. HLA-B27 testing in Thai patients using the PCR-SSP technique. Tissue Antigens 2006;67:233-6. 4. Bunce M, O Neill CM, Barnardo MC, Krausa P, Browning MJ, Morris PJ, et al. Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens 1995;46:355-67. 5. Zino E, Di Terlizzi S, Carugo C, Baggi L, Galli A, Bonini C, et al. Rapid detection of all HLA-B*27 alleles (B*2701-B*2725) by groupspecific polymerase chain reaction. Tissue Antigens 2004;63:88-92. 6. Lucotte G and Burckel A. DNA typing of HLA-B27 by polymerase chain reaction. Mol Cell Probes 1997;11:313-5. 7. Bonnaud G, Aupetit C, Preux PM, Cogne M, Drouet M. Optimisation of HLA-B27 testing by association of flow cytometry and DNA typing. Clin Rheumatol 1999;18:23-7. 8. Lee KW and Kim JY. HLA-B27 typing using PCR-SSP. Korean J Clin Pathol 1996;16:744-50. ( 이경화및김진영. PCR-SSP법을이용한 HLA- B27 검사. 대한임상병리학회지 1996;16:744-50.) 9. Lee JH, Jun JB, Jung S, Bae SC, Yoo DH, Kim TW, et al. Higher prevalence of peripheral arthritis among ankylosing spondylitis patients. J Korean Med Sci 2002;17:669-73. 10. Bae JS, Kim YR, Choi HI, Cho YJ. Comparison of HLA-B27 typing methods- PCR-SSP, microlymphocytotoxicity, and flow cytometry-. Korean J Clin Pathol 2000;20:198-203. ( 배준수, 김영리, 최현일, 조윤정. HLA-B27 검사법의비교- PCR-SSP법, 미량독성림프구법, 유세포분석법비교. 대한임상병리학회지 2000;20:198-203.) 11. Inaoui R, Bertin P, Preux PM, Treves R. Outcome of patients with undifferentiated chronic monoarthritis: retrospective study of 46 cases. Joint Bone Spine 2004;71:209-13.