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주간건강과질병 제 8 권제 4 호 B 형간염바이러스잠재감염헌혈자및헌혈혈액특성분석 Analysis of Characteristics of Blood Donors with Occult Hepatitis B Virus Infection Abstract Background: Since June 0, HBV Nucleic Acid Amplification test (NAT) has been implemented in Korea. Occult Hepatitis B Virus infection (OBI) donors who were reported as HBsAg negative and HBV NAT positive were confirmed. Methods: Characteristics of HBV NAT reactive donors from June 0 to June 03 were analyzed through the Blood Information Management System of the Korean Red Cross Blood Services. Anti-HBc, anti-hbc IgM, anti-hbs, anti-hbe and HBeAg assays were performed for OBI donors. The same assays were performed for HBsAg positive/nat positive donor as control. HBV DNA quantitation and analysis of HBV S gene variants were also conducted. Results: A total of 374 OBI cases were identified. The ratio between males and the elderly was high. Among 346 adapted specimens of OBI donors, 65 donors (8.8%) had a HBV DNA titer of more than 0 IU/mL and most of them were anti-hbc negative (90.7%). About 7 specimens out of 346 samples were isolated with HBV genotype C; HBV S gene variants were identified in 5 donors. Conclusion: With the implementation of HBV NAT, the blood safety level was improved. The management of hepatitis B infection could be further enhanced if additional clinical research will be conducted on OBI donors. 질병관리본부장기이식관리센터혈액안전감시과 조현정, 최영실, 김준년 * * 교신저자 (drlord@korea.kr, 043-79-7660) 들어가는말 B형간염바이러스잠재감염 (Occult Hepatitis B virus Infection, OBI) 은환자의혈액, 간조직등에서 B형간염바이러스 (Hepatitis B Virus, HBV) 의 DNA는검출되나표면항원 (HBV surface antigen, HBsAg) 이지속적으로검출되지않는경우를말한다. 이러한현상은과거감염에서의회복상태이거나만성간염인경우로 HBsAg가검출한계이하로존재하는경우, HBsAg을발현시키는 S 유전자의돌연변이로인하여 HBsAg이검출되지않는경우등으로설명된다. 다만, HBV 감염초기의혈청전환기이전에도이와같은경우를보일수있으므로, 일부에서는이들과구분하기위하여 real-obi 또는 true-obi라고정의한다 [-]. 하지만혈액에서의 HBsAg검사와 DNA검사 결과만으로는초기감염과 real OBI 유형을구분하기는어렵다. OBI 의경우향후만성간질환과간세포암으로발전할수있으며, 수혈및장기이식등으로면역억제상태의환자에게전파되면간질환을유발시킬수있다 [3]. 국내에서는 009 년에 HBsAg 음성인일반성인집단에서 OBI 빈도가약 0.7% 로보고된바있다 [4]. 우리나라는 HBV 감염에대한발병율이높은국가로이에대한헌혈혈액의안전성을확보하기위해 973년부터모든헌혈혈액에대하여면역혈청학적검사방법인 HBsAg검사를선별검사로도입하였고, 007년부터화학발광면역검사 (Chemilumicescent immunoassay, ChLIA) 를이용하고있다. 0 년 6월부터는국내헌혈자선별검사에 HBV 핵산증폭검사 (Nucleic acid amplification test, NAT) 를전면도입하여헌혈혈액의안전성을강화하였다. NAT 도입이후, 일부헌혈자에서혈청학적검사 (HBsAg 998 www.cdc.go.kr

Vol. 8 No. 4 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC ChLIA) 에서음성이나 HBV NAT 에서양성인경우가확인되었다. 이들의헌혈혈액은 HBV NAT 양성결과에따라폐기되고, 해당헌혈자는향후에도헌혈이금지된다. 또한헌혈자가과거헌혈기록이있을경우역추적조사도진행한다. 본연구에서는 HBsAg 검사결과음성이면서 HBV NAT 검사결과양성인 OBI 헌혈자가확인됨에따라 OBI 헌혈자관리방안을구축하고자, OBI 헌혈자특성및헌혈혈액에대한혈청학적, 유전학적특성을분석하였다. 몸말연구대상 0년 6월 일부터 03년 6월 일까지헌혈한총,57,53 명의헌혈자중 HBV NAT 검사양성으로나타난헌혈자는,53명 (0.059%) 이었으며, 이들중 HBsAg 음성, HBV NAT 양성결과를보인 OBI 헌혈자는 374명으로전체헌혈자중에서는 0.045%, NAT 양성자중에서는 4.556% 가 OBI 에해당하였다 (Table ). Table. HBV NAT test results in blood donors (0. 6. - 03. 6. ) No. of blood donors HBV NAT* HBsAg ChLIA Non-reactive(%),570,990(99.94) - HBsAg reactive,45(75.8) (%),53(0.059) HBsAg HOD 4(0.63) HBsAg non-reactive(obi) 374(4.556) Total,57,53(00) * HBV NAT, Procleix TIGRIS System(Grifols, USA) and Procleix Ultrio plus assay (Grifols, USA) HBsAg, Abbott prism HBsAg(Abott, USA), reactive; S/Co ratio is more than.00(cut off: 0.80) HOD, High optical density, S/Co ratio is more than 0.80 and less than.00, means gray zone, regarded as HBsAg reactive Figure. HBV NAT reactive rate according to blood center www.cdc.go.kr 999

주간건강과질병 제 8 권제 4 호 헌혈자특성분석지역별로전체헌혈자에서 OBI 헌혈자분포를확인한결과, 제주지역 (0.05%) 이가장높게나타났다. 다만, 제주지역은 HBV-NAT 양성률도타지역에비해높게나타났다 (Figure ). 성별로전체헌혈자에서 OBI 헌혈자분포를확인한결과, 전체 374명중남성이 96명 (79.%), 여성이 78명 (0.9%) 로각성별별헌혈자수와비교한결과남성은 0.063%, 여성은 0.003% 로나타났다 (Table ). 0대 0.007%, 0대 0.00%, 30대 0.009%, 40대 0.044%, 50대 0.3%, 60대이상 0.308% 로나타났다. HBV NAT 양성자는 0대에서양성비율이높은것에반해, OBI 헌혈자는 40대이상부터비율이증가하였고, 특히 60대이상에서높은비율로나타났다 (Table 3). OBI 헌혈자 374 명에대한 ALT (Alanine transferase) 조사결과, 대부분헌혈혈액선별검사적합기준인 65 IU/L 이내였고, 65 IU/L을넘은경우는 건 (0.535%) 이었다 (Table 4). 연령별로전체헌혈자에서 OBI 헌혈자분포를확인한결과, Table. Distribution of gender in OBI donors Gender No. of blood donors No. of HBV NAT reactive donors OBI donors Ratio of OBI by blood donors(%) Male,86,688(70.6%) 967(63.5%) 96(79.%) 0.063 Female 755,85(9.4%) 556(36.5%) 78(0.9%) 0.003 Total,57,53(00%),53(00%) 374(00%) 0.045 Table 3. Distribution of age in HBV NAT reactive donors Age No. of blood donors No. of HBV NAT reactive donors OBI donors Ratio of OBI by blood donors(%) 6-9 973,54(37.8%) 746(64.9%) 7(9.3%) 0.007 0-9,055,409(4.0%) 30(.3%) 03(7.5%) 0.00 30-39 36,33(.3%) 08(9.4%) 8(7.5%) 0.009 40-49 6,6(6.3%) 3(9.8%) 7(9.0%) 0.044 50-59 57,5(.%) 47(4.%) 76(0.3%) 0.3 60-7,800(0.3%) 5(0.4%) 4(6.4%) 0.308 Total,57,53(00%),53(00%) 374(00%) 0.045 Table 4. Distribution of ALT in OBI blood donors ALT (U/L) No of donors(%) <65 37(99.465) 65 (0.535)* Total 374(00) * donors showed ALT level of 7 and 77 individually. 000 www.cdc.go.kr

Vol. 8 No. 4 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC 혈청학적검사및 DNA 정량검사혈청학적검사및 DNA 정량검사는 OBI 헌혈자 374 명중, 검체를확보할수없었던 8건을제외한 346건과실험대조군으로동일기간동안 HBsAg 과 HBV NAT 가모두양성인혈액 50건에대해시행하였다. HBV 혈청학적검사로서 HBV 중심항체 (HBV core antibody, anti-hbc) 검사, HBV 표면항체 (HBV surface antibody, anti-hbs) 검사, HBV envelope 항원 (HBV envelope antigen, HBeAg) 검사, HBV envelope 항체 (HBV envelope antibody, anti-hbe) 검사를실시하였고, 모두 Architect(Abbott, USA) 시약및장비를이용하였다. HBV DNA 정량검사는 Cobas Ampliprep/TaqMan system (Roche, Swiss) 을이용하였다. 모든검사는제조사의지침에따라검사를실시하고결과를해석하였다. 혈청학적검사결과, 346명중 78명 (5.4%) 이 anti-hbc 양성을보였으며, 이중 4명 (.%) 은 anti-hbc IgM에서도양성 결과를보였다. Anti-HBc IgM 양성을보인 4명은모두 anti-hbs 가음성이었으며, 이중 명은 anti-hbe 가양성이었다. Anti-HBc는양성결과를보였으나, anti-hbc IgM은검출되지않은헌혈자 74 명중 7명은 anti-hbe 양성결과를보였고이중 6명은 anti-hbs 양성결과를보였다. Anti-HBc 는양성결과를보였으나, anti-hbc IgM 은검출되지않은헌혈자 74 명중나머지 47 명은 anti-hbe 음성이었으며, 이중 5명은 anti-hbs 양성, 96명은 anti-hbs 음성을보였다. 반면, anti-hbc 음성결과를보인 68명은 anti-hbc IgM, anti-hbe 모두음성결과를보였으며, 83명은 anti-hbs 양성, 85명은 anti-hbs 음성이었다 (Table 5). OBI헌혈자의 HBV DNA 농도를확인한결과, 검출한계이하로검출이안되는경우가 5건 (43.6%) 이고음성으로판정되는 0 IU/ml 미만이 30건 (37.6%), 양성으로판정되는 Table 5. Serological pattern and distribution of HBV DNA titers for OBI donors Anti-HBc Anti-HBc IgM Anti-HBe Anti-HBs * 78 (5.4%) 68 (48.6%) * 0U/L Not detected 4 (.%) 74 (97.8%) All nonreactive Total 346 7 (5.5%) 47 (84.5%) All nonreactive All nonreactive HBV DNA(IU/ml) 0 <0 ND All nonreactive 0 0 6 (.%) (77.8%) 5 (34.7%) 96 (65.3%) 83 (49.4%) 85 (50.6%) 0 (9.5%) (.0%) (.%) 30 (36.%) 9 (34.%) 65 (8.8%) 3 5 (3.8%) 0 (39.%) 36 (37.5%) 30 (36.%) 35 (4.%) 30 (37.6%) 0 (00.0%) 3 4 (66.7%) 30 (58.8%) 58 (60.4%) 3 (7.8%) (4.7%) 5 (43.6%) www.cdc.go.kr 00

주간건강과질병 제 8 권제 4 호 0 IU/ml 이상이 65건 (8.8%) 로나타났다. 0 IU/ml 이상인헌혈자의혈청학적검사결과에서 anti-hbc 음성이 59 건 (90.7%) 으로대부분나타났다. anti-hbs 검사에서는양성이 3건 (47.7%), 음성이 34건 (5.3%) 로비슷하게나타났다 (Table 5). 일반적인 HBV 진단기준을참고할경우 [5, 6], anti-hbc IgM이양성으로나타난 4명중 anti-hbe 양성으로나타난 명의경우만성감염이나회복기로, anti-hbe가음성으로나타난 명의경우는윈도우기감염으로추정할수있다. 그리고 anti-hbc, anti-hbe와 anti-hbs가모두양성으로나타난 6명, anti-hbc와 anti-hbs가양성으로나타난 5명, anti-hbs만양성으로나타난 83명의경우는회복기상태임을추정해볼수있었다. anti-hbc와 anti-hbe가양성으로나타난 명, anti-hbc만 양성으로나타난 96명은과거감염으로인한만성감염이나회복기로추정해볼수있다. 모든혈청학적표지자가음성으로나타난 85명의경우는초기감염또는위양성일가능성이있으나명확하게분류하기어렵다 (Table 6). HBsAg 양성헌혈자 50명의경우, 대부분이 anti-hbc 양성 (4 건, 84%) 로나타났고, 이중 7건 (64.3%) 은 anti-hbe 양성으로나타났다. OBI헌혈자와는달리높은감염성을뜻하는 HBeAg이 0건 (40%) 이확인되었다. 대부분 HBV DNA 농도가 0 IU/mL 이상을보였으나, 8명에서는 0 IU/mL 미만의결과를보였고, 명은본검사에서검출되지않았다. 0 IU/mL 미만의값을보이거나, 미검출의경우모두 anti-hbe 양성결과인것이특징적이었다 (Table 7). Table 6. OBI donors interpretation by serological pattern Anti-HBc Anti-HBcIgM Anti-HBe Anti-HBs HBeAg No Interpretation + + + - - (0.6%) Chronic or Recovery + + - - - (0.6%) Window period + - + + - 6 (.7%) Recovery + - + - - (6.%) Chronic or Recovery + - - + - 5 (4.7%) Recovery + - - - - 96 (7.7%) Chronic or Recovery - - - + - 83 (.%) Recovery - - - - - 85 (.7%) Acute or? Total 374 (00%) - 00 www.cdc.go.kr

Vol. 8 No. 4 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC S 유전자변이분석유전자분석은 MagNa Pure LC DNA Isolation Kit (Roche, Swiss) 를이용하여 DNA 를추출하고 nested PCR 을통해 S region 을증폭한후 (primer set st; nt.8-989. nd; nt.56-796) 염기서열분석을의뢰하였다. 346건의 OBI 헌혈혈액중 7 건으로부터 HBV DNA 가추출되었으며, 이들의유전자형은모두 C형이고, 56건은 wild-type 이었으며, 변이가확인된것은 5건이었다. 7건의 subtype은 adw가 3건 (4.3%) 이며나머지는모두 adr이었고, 건은 adr과 ayr의이중감염으로확인되었다. S유전자변이가확인된 5건은 adr이 3건, adw 가 건으로확인되었다 (Table 8). 맺는말 본연구결과 HBV NAT의도입을통해혈청학적검사로는확인되지않는 374 건의 HBV NAT 양성헌혈혈액을추가확인할수있었고, 이는우리나라혈액사업의안전성을향상시키는데크게기여했다고볼수있다. 특히, 헌혈혈액 HBV 선별검사에사용되고있는 Procleix Ultrio plus assay 검사양성반응을보인 OBI헌혈자 (HBs Ag 음성 HBV NAT 양성을보이는헌혈자 ) 에대한 Cobas Ampliprep/TaqMan system 을사용한 HBV DNA 정량검사에서상당수 (8.%) 가 HBV DNA 음성 (<0 IU/ml) 을보여, 이는선별검사에사용되는 HBV NAT 의민감도가우수함을시사한다. Table 7. Serological pattern and distribuation of HBV DNA titers for HBsAg positive donors Anti-HBc No. Anti-HBe HBeAg HBV DNA 0 <0 ND* Anti-HBe 7 (64.3%) 8 (66.7%) 8 (9.6%) (3.7%) 4 (84.0%) HBeAg 4 (33.3%) 4 0 0 in anti-hbe and HBeAg (.4%) IV IV IV 8 (6.0%) HBeAg 6 (75.0%) in anti-hbe and HBeAg (5.0%) 6 0 0 0 0 Total 49 ( IV) 40 (8.6%) 8 (6.3%) (.%) * Not detected Invalid result www.cdc.go.kr 003

주간건강과질병 제 8 권제 4 호 Table 8. Results of HBV related markers in 5 samples with HBV S gene mutation HBV related markers No. Subtype Mutation HBV DNA (IU/mL) HBsAg Anti-HBe HBeAg Anti-HBc IgM Anti-HBc Anti-HBs ALT (U/L) adr M03I (Met03Ile) P7S (Pro7Ser) M33T (Met33Thr) - (<0) - - - - + - 6 5 adr Q0K (Gln0Lys) T3S (Thr3Ser) I/T6N (Ile/Thr6Asn) + (3.3) - - - - - - 8 adr wt (wild-type) T8K (Thr8Lys) M33I (Met33Ile) + () - - - - - + adr T3P (Thr3Pro) + (450) - - - - - + 35 4 adr 33 adr S4T (Ser4Thr) T40S (Thr40Ser) Q0K (Gln0Lys) T3S (Thr3Ser) I/T6N (Ile/Thr6Asn) G45A (Gly45Ala) Q0K (Gln0Lys) T3S (Thr3Ser) T5N (Thr5Asn) I/T6N (Ile/Thr6Asn) G45A (Gly45Ala) + (5.5) - - - - - + 5 - (<0) - - - - + + 6 37 adr S43L (Ser43Leu) - (<0) - - - - - + 45 adr 48 adr 5 adr 55 adr 56 adw G45A (Gly45Ala) C39Y (Cys39Tyr) G45A (Gly45Ala) I/T6S (Ile/Thr6Ser) M33T (Met33Thr) wt (wild-type) P4L (Pro4Leu) T8K (Thr8Lys) P7T (Pro7Thr) Q0K (Gln0Lys) L0F (Leu0Asn) PL (ProLeu) T3P (Thr3Pro) S4A (Ser4Ala) T6I (Thr6Ile) S7C (Ser7Cys) T8K (Thr8Lys) T40I (Thr40Ile) D44E (Asp44Glu) + (03) - - - - - - 6 + (376) - - - - - + 0 + (69.) - - - - - + 3 + (34.3) - - - - - + + (73.5) - - - - + - 8 57 adr M33I (Met33Ile) + (.4) - - - - + - 59 adr P7A (Pro7Ala) + (,40.0) - - - - - + 8 7 adw Q0R (Gln0Arg) M03I (Met03Ile) G45R (Gly45Arg) + (37.8) - - - - + + 33 004 www.cdc.go.kr

Vol. 8 No. 4 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC 대부분의 OBI 환자는증상이없고혈청학적검사로는진단이안되기때문에임상에서는확인하기어렵다. 그러므로헌혈과정에서확인된 OBI 헌혈자는 OBI 환자의특징을연구할수있는기회로제공될수있다. 본연구에서는 5건의 S 유전자변이를확인하였으나, 이들의 subtype 은 HBsAg이검출한계이상으로존재할시검출이가능한 subtype 으로 S 유전자변이에의한 HBsAg 음성이아닌것으로추측된다. HBsAg 양성 /HBV NAT 양성헌혈자의경우 anti-hbc 양성율이 84%, DNA농도 0 IU/ml 이상이 8.6% 였고, OBI 헌혈자에서는 anti-hbc 양성율이 5.4%, DNA농도 0 IU/ml 이상이 8.8% 이었다. 이는 OBI 헌혈자도 HBsAg 양성 /HBV NAT 양성헌혈자처럼임상적으로 B형간염증상이나타날가능성이있음을뜻한다. DS, Colombo M, Craxi A, Donato F, Ferrari C, Gaeta GB, Gerlich WH, Levrero M, Locarnini S, Michalak T, Mondelli MU, Pawlotsky JM, Pollicino T, Prati D, Puoti M, Samuel D, Shouval D, Smedile A, Squadrito G, Trepo C, Villa E, Will H, Zanetti AR, Zoulim F. 008. Statements from the Taormina expert meeting on occult hepatitis B virus infection. J Hepatol. 49:65-7. 3. Cheung CK, Lo CM, Man K, Lau GK 00. Occult hepatitis B virus infection of donor and recipient origin after liver transplantation despite nucleoside analogue prophylaxis. Liver Transpl. 6:34-3. 4. Song EY, Yun YM, Park MH, Seo DH. 009. Prevalence of occult hepatitis B virus infection in a general adult population in Korea. Intervirology. 5:57-6. 5. 대한진단검사의학회. 진단검사의학. 제4판. E*PUBLIC. 009;699 6. CDC, http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/pinkbook/hepb Laboratory Dignosis 특히, OBI 헌혈자중 anti-hbc 음성인집단 (68 건 ) 중, DNA 농도가 0 IU/ml 이상인헌혈자는 59건 (90.7%) 으로초기감염으로해석될수있으며, 향후 HBsAg 양성으로나타날가능성이있다. OBI 헌혈자중 anti-hbc 양성이고 anti-hbc IgM 음성인집단 (74건) 은대부분이 DNA농도가 0 IU/ml 미만이거나검출한계이하 (69건, 97.%) 로만성간염으로해석될수있다. 그러나이들은진단기준에따른예측에불과하다. 또한, 진단기준과정확히부합되지않는군은그유형을명확하게해석하여분류하기어렵다. 따라서혈청학적, 유전학적특성으로분류한 OBI군에대해혈청학적특성변화, DNA 농도등을장기적으로추후관찰한다면이들특성에따른임상적인경과를확인할수있을것이다. 이러한결과를토대로헌혈자를관리를한다면단순히헌혈자관리에서더나아가국내 B형간염관리에도기여할수있을것이다. 참고문헌. Said ZN. 0. An overview of occult hepatitis B virus infection. World J Gastroenterol. 7:97-38.. Raimondo G, Allain JP, Brunetto MR, Buendia MA, Chen www.cdc.go.kr 005