Title : Structural Features and Hypoglycemic Activity of a polysaccharide(cs-f10) from the Cultured Mycelium of Cordyceps sinensis Researcher : Tadashi Kiho, Kato Ookubo, Shigeyuki Usui, Shigeo Ukai, and Kazuyuki Hirano Address : Dept of Pharmaceutics, Gifu Pharmaceutical University, 506-1 Mitahora-higashi, Gifu 502-8585, Japan Published in Biot. Pharm. Bull. 22(9) 966-970(1999). Vol.22, No. 9 key words : Cordyceps sinensis; polysaccharide ; hypoglycemic activity ; diabetes; glucokinase 요약 Cordyceps sinensis의배양균사체 ( Mycelium) 열수추출물로부터정제된다당체 (CS-F10) 의구성은 galactose, glucose 및 mannose으로몰비 (molar ratio) 는 43 : 33 : 24이며 ; 분자량은약 15000으로측정되었다. 화학적분광학적연구결과는 CS-F10 comb-type를갖추고있는것으로제시되었고, Cordyceps sinensis의측쇄말단및특징적인당 residue에 -D-glucopyranosyl residues, 즉 1,5-linked -D-galactofurannosyl residues를갖고있다. CS-F10은복강내투여 (50 mg/kg) 후, 정상및 STZ(streptozotocin)-유발당뇨그리고 Epinephrine-유발당뇨증 mice 혈당치를크게낮추며주었다. CS-F10을 STZ-유발당뇨 mice에투여는간의glucokinase 활성을증가시켰다. perfused rat간을사용해서 CS-F10의주입수행시, 간장의 glucose 생산량의상당한감소가있었다. CS-F10은역시복강내투여시 rat간으로부터 GLUT2(glucose transporter isoform 2) 단백함량을상당히감소시켰다. 이런효과들이아마도저혈당활성에기여하는것같다. 논문연구소개이논문은 Cordyceps sinensis의배양균사체 ( Mycelium) 열수추출물로부터정제된다당체 (CS-F10), 그구조특성및복강내투여후, 정상및STZ-유발당뇨 mice그리고 Epinephrine-유발당뇨증 mice 에서저혈당활성을다루고있다. 또한 CS-F10이STZ- 유발당뇨 mouse 간에서 glucokinase 활성에대한영향을설명하고있다. 재료및방법
다당체의정제 Cordyceps sinensis의배양균사체 ( Mycelium) 건조분말을 ethanol과 70%ethanol로연속적으로추출한다. Residues는열수용기에서 10시간동안열수로추출했다. Ethanol침전물에대해열수추출인 CS-HWEP를 DEAE-Totopearl 650M(phosphate buffer) 의컬럼에적용했다. 추출분획을물에대하여투석했으며, 비투석된분획을 lyophilized하여중성다당체 (CS-F10) 을만들었다. Gel 및 Affinity chromatography Gel chromatography는 0.1 N NaCl, Totopearl HW-55F(Tosoh) column상에서알맞다. 분자량은표준dextrans을사용하여구성한표준선으로부터측정하였다. concanavalin A (Con A)-Sepharose 4B(Pharmacia) 상에서affinity chromatography는 Tris-HCl buffer(ph 7.0) 에서 -methyl-d-glucoside을유출시켜서수행하였다. Quantitative Precipitation with Con A 샘플용액 (0.5 ml) 은 con A(1.5 mg, Sigma) 용액 (0.5ml) 으로 25 C에서 24시간동안, 50 mm Tris-HCl buffer(ph 7.0) 을사용하여배양하였다. 배양후, 각반응혼합물은원심분리하였고, 세척된침전물의용액은당함량을측정하기위하여 phenol-sulfuric acid로반응시켰다. 구성당분석샘플은 100 C에서 8시간동안 2 M trifluoroacetic acid(tfa) 로가수분해하였고그가수분해물은 alditol acetate 유도체로서 paper chromatography(ppc) 와 gas chromatography(gc) 로분석하였다. 메틸화분석다당체는 Hakenori방법으로 3회메틸화시켰다. 완전메틸화된다당체는100 C에서 8시간동안 90 % formic acid 및 100C에서 8시간 2 M TFA으로가수분해한다. 부분적으로메틸회된당의 aditol acetates는 DB225 fused-silica capillary column(0.25 cm X 30 m, film thickness 0.2 M ) 및 3% ECNSS-M column(0.3 cm X 2 m ) 이사용되는 GC 및 GC-MS로분석하였다. Smith Degradation 다당체는 25 mm sodium periodate(40ml) 로 8시간동안암실 4 C 에서산화시켰다. 연속해서 ethylene glycol 및 sodium borohydride로처리되었으며, 물에대하여투석하였다. 비투석분획으로부터얻은 polyalcohol은가수분해시켰고, 가수분해물 (Smith degradation product) 은 aditol acetates 유도체로서 GC로분석하였다. 13C-NMR Spectroscopy 스펙트롬은실온, dimethyl sulfoxide(dmso)-d6(50 mg/0.5ml) 에서 JEOL FT-NMR EX-400 spectrometer에서 recording하였다. 저혈당활성 male ddy mice(japan SLC) 를 5주령에서 normal mice로사용하였으며이stz-유발당뇨 mice를 insulin-의존당뇨증의모델로사용하였다. 샘플의식염수용액 ( 대조군 : 생리식염수 ) 을복강내투여후, 혈당치는 glucose oxidase method에근간한glucose B-test kit(wako Pure chemical) 을사용하여측정하였다. Epinephrine-유발당뇨증 mice의혈당치의영향을다음과같이시험하였다 : ddy mice에 CS-F10(50mg/Kg) 또는식염수복강내투여를하였으며 8시간후에 Epinephrine 용액 (0.8mg/kg) 또는식염수를복강내주사하였다. 혈당농도는상기의설명과같이 1시간뒤에측정하였다. Glucokinase 활성 STZ-유발당뇨 mice의간은 ice-cold 0.15 M KCl 및 1 mm EDTA용액으로관류시키고절개시켰다. 간균질물을원심분리하여얻은상등액을얻고, 그활성을 glucose-6-dehydrogenase을사용하여광학적으로분석하였다.
Glucose Output Test male wistar rats ( 약 200 g, Japan SLC) 를마취시켜간을 Mortimore방법에따라서관류시켰다. 문맥을빼내고간을 30 ml/min의일정한유속으로 25 mm sodium bicaronate, 1% bovine serum albumin, 2.5 mm CaCl2 및 0.28 mm glucose 함유한 oxigenated Krebs-Henseleit buffer(ph 7.4) 으로관류시켰다. 관류된 medium은 95% O2-5% CO2 혼합가스로연속해서가스처리하였다. 대정맥cava의제거후, 관류buffer을 37 C로유지되는순환water bath로유입되도록하였고, 관류 30 min후, 50 g/ml CS-F10을 medium에첨가하였다. 순환buffer내 glucose함량은 20~30 min, 30~50 min 것을각각 prevalue 및 value로정의하였다. glucose output의감소비율 (%) 은식 [(prevalue-value)/prevalue] X 100 으로부터게산하였다. Western Blot Analysis of liver Glut2 Western bloting은, Thorens et al과 Kato et al의제시대로수행하였다. Wistar rats( 약 200g) 에대해샘플복강내처리 (50 mg/kg) 을실시하였다. 간샘플은 6시간후에얻었다. 간은 1mM EDTA, 250 mm sucrose, 1mM Phenyl-methylsulfonyl fluoride 및 1000 units/ ml aprotinin을함유된 Tris-HCl buffer(ph 7.4) 으로균질화하였다. 그균질물을 4 C, 700 g 에서 10분간원심분리하였다. 그상등액은 4 C, 700 g 에서 10분간원심분리하여 pellet을만들었다. pellet은 250 mm sucrose, 100mM KCl 및 5 mm MgCl2을함유하는 50 mm Tris-HCl buffer(ph 7.4) 에현탁하였다. 준비된 membrane fraction(248 g/ 20l) 은 sodium dodecyl sulfate(sds)-polyacrylamide(9%) gel electrophoresis로분리하였고, 단백질은 nitrocellulose paper에전기영동하였다. Rabbit antipolyenonal antibody(chemicon International Inc.) 가 primary antibody로사용되었다. 측정은 chemiluminescence(bio-rad) 로수행하였고, dentitometry(tias-100 ACI Japan) 으로분석하였다. 통계분석모든데이터는 meanss.e. 으로나타내었다. 평균치간의유의성은 Student's t-test을사용하여평가하였다. 결과및토의 Cordyceps sinensis의배양균사체 ( Mycelium) 의열수추출물인 CS-HWEP를 anion-exchange chromatography로정제하여중성분획으로부터중성다당체 (CS-F10) 을얻었으며, CS-HWEP로부터수율은 40%, 배양균사체건조분말로부터의수율은 1.53 % 이었다. CS-F10은 gel chromatography에서대칭적탄수화물패턴을보였으며 Con A-Sepharose 4B의컬럼에완전히흡착되었다. CS-F10은 []D+32 (c=0.5, water) 의특성을가지며분자량은 gel chromatography에의한측정시약 15000이다. 가수분해물의 PPC 및 GC 수행시, galactose, glucose 및 mannose로구성되어있었으며, 몰비는 43 : 33 : 24이었다. CS-F10의분자량은균사체의알칼리추출물로부터정제된CS-F30( 약 45000) 보다작았다. 다당체는동일당으로구성되어있었지만, CS-F10의 galactose비율은 CS-F30(62 %) 보다낮았다. CS-F10은완전리메틸화되었다. 메틸회된제품은산으로가수분해되었으며, 당을부분적으로메틸화된 alditol acetate로전환시켰다. GC 및GC-MS의결과는 Table1에나타내었다.
Table 1 GC and GC0MS of alditol Acetate derivated from the Methylated Product of cd-f10 Methylated Sugar Ta) Primary mass fragments Molar ratio Mode of linkage (as alditol acetate) Column A Column B (m/z) 2,3,4,6-Me4-Glc 1.00 1.00 45,117,161,205 15 [Glcp]1 2,3,4,6-Me4-Gal 1.08 1.00 45,89,117,205 1 [Galf]1 3,4,6-Me3-Man 1.76 1.98 45,161,233 8 2[Manp]1 2,3,6-Me3-Gal 2.07 2.48 45,117,233 15 5[Galf]1 2,3,5-Me3-Gal 2.56 3.48 117,233 2 6[Galf]1 2,3-Me2-Gal 4.32 6.28 117,261 4 5,6[Galf]1 2-Me-Manl 4.63 7.41 117 6 5,6[Galf]1 a) Relative retention time with respect to that of 1,5-di-O-acetyl-tetra-o-methyl-D-glucitol, Column A: DB225(capillary column), Column B: 3%ECNSS-M. 모든포도당잔기는비환원말단잔기로서확인되었으며, 중요한 galactose잔기는 (15 및 / 또는 6)-연결 furanosyl 잔기로위치하였다. mannose 잔기가 (12)-연결및분지형 pyranosyl 잔기로서존재한다는결과가보이고있다. Periodate-산화다당체및산가수분해의일련의 borohydride 환원을거친후, CS-F10은 glycerol, threitol 및 mannose가되었다. threitol과 mannose의검출로메틸화분석에의하여제시된 (15 및 / 또는 6)-연결 galactofuranosyl 잔기및분지형 mannopyranosyl 잔기의존재가확인되었다. 비대칭배열은 CS-F10의 13C-NMR Spectrum을문헌데이터와비교하여특정되었다. 108.3, 105.4 및 104.9 ppm에서더낮은 field signals은 galactofuranosyl 잔기의 C-1에특정되었다. 98.0, 96.8 및 95.0 ppm에서의 resonance는 galactofuranosyl 잔기및분지형 mannopyranosyl 잔기에기인된다. 5 mm sulfuric acid로 100 C에서 2시간동안과 50 mm sulfuric acid로 100 C에서 2시간동안으로연속적처리후의산-내성다당체에서manose가구성당으로검출된것은 Cordyceps species의다당체에서관찰된것처럼 mannopyranosyl units의 core의존재를제시한다. Quatatitative precipitation 결과에서볼때 CS-F10은 CS-F30 보다 Con A에대한더높은affinity를보였다. CS-F30의구조가아직특성이발혀지지는않았지만, 이결과는 CS-F30과비교시 CS-F10에서 glucose 및 mannose의더높은비율과일치한다. 이결과는 CS-HWEP로부터얻은새로운 galactoglucomannan, CS-F10이 comb 타입의구조를갖고있다는것을제시하며, 주로비환원말단인-D-glucopyranosyl residues, (15 및 / 또는 6)-연결-D-galactopyranosyl residues, 그리고 (12)-연결및가지형 -D-mannonpyranosyl residues residues로이루워져있다. C. sinensis의조의약품조제
시, 매우분지형인 galactomannan(ct-4n) 를가지는 (15)-연결 -D-galactopyranosyl residues가분리되었지만, 말단 glucopyranosyl residues는없었으며말단의대부분은 galactopyranosyl residues로구성되어있다. 25-100 mg/kg dose에서복강내투여후, 정상및 STZ-유발 diabetic mice에서저혈당활성이 CS-F10에의하여나타나는것이관찰되었다. saline투여한것과비교하여상대적혈당치를평가하였다. Table 2에서보는것처럼, 뚜렷한 dose의존효과는이시험에서는관찰되지는않았지만, CS-F10은특징적인활성을보였으며, 투여후 6 시간째가가장강력하였다. 복강내투여후저혈당활성을보이는다른다당체에서도전자와같은효과을보였다. CS-F10 과 saline 복강내투여 ( 50 mg/kg) 후 6시간째저혈당증 ( hypogycemia) 이 epinephrine 주사로유발시켜서, 혈당농도부석은 1시간후애분석하였다. Cs-F10은역시중요하게 epinephrine-induced hyperglycemia을억제하였다. CS-F10을 glucose대사에중요한간효소인glucokinase에대하여효과시험하였다. CS-F10은 50 mg/kg dose에서 i.p. 투여후 6시간째에 STZ-유발 diabetic mouse에서 glucose 활성 (1464 to 1003, n=4) 을의미있게강화시켰다. Mouse 간에서 glucokinase의증가된활성이cs-f30과 Ganoderma Lucidum원천인 ganoderan과같은저혈당활성을갖는다당체의경우에역시보였다. 이결과는저혈당활성이 Cs-F10에의하여 hepatic glucose output을억제한다는결과일수있다는것을제시하고있다. Table 2. Effect of CS-F10 on Plasma Glucose Level in Normal Mice and STZ-Induced Diabetic Mice Following i.p. Admintration Group Dose Relative plasma glucose level(%)a) (n=5) (mg/kg,i.p.) 0 3 6 24(h)b) Normal mice Control 100 102.53.6 95.42.3 95.93.5 CS-F10 25 100 74.74.1** 60.14.5*** 96.03.6 CS-F10 50 100 72.65.7** 61.12.3*** 89.54.8 CS-F10 100 100 82.46.6* 62.44.3*** 80.72.0 Diabetic mice Control 100 99.45.5 90.45.8 108.46.0 CS-F10 25 100 66.44.7** 47.85.0*** 100.39.3 CS-F10 50 100 77.53.1* 57.77.4** 94.22.8** CS-F10 100 100 75.34.8* 33.64.3*** 89.74.7* a)plasma glucose level at 0 h(normal mice 170-21- mg/dl, diabetic mice 470-650 mg/dl) was adjusted to 100. Values represent the means.e. b)time after administration. Significantly differnet from the control, * p<0.05, ** p<0.005, *** p<0.001
glucose 대사의가속화는이런다당체의저혈당활성에대한하나의대사이다. CS-F10은간의 glucose input 및 output에영향을준다는상기의발견으로부터역시제시할수있기때문에, 간에서 glucose대사의첫단계는 Wistar rats( 작업의용이성으로 mice대신사용 ) 을사용하여시험을수행하여, GLUT2에의하여조절된다고보고하였다. 관류된 rat 간을사용하여 CS-F10 주입으로 hepatic glucose output에대한효과를시험하였다. Hepatic glucose output은 CS-F10(50 g/ml) 을 perfused medium에첨가함으로서의미있게감소하였다 ( Reduction of glucose(%) ; control : 14, CS-F10 ; 27). Western blotting을사용하여 6시간 fasted rats 및 fed rats의경우cs-f10 (50 mg/kg) 을 i.p. 투여후 hepatic GLUT2 protein 함량을조사하였다. fasted 및 fed 상태의양쪽하에서 GLUT2 단백질이 saline 투여에의허여생산된것보다의미있게감소한것이발견되었다. 간GLUT2 단백질은굶주림동안증가한다는 Torens의보고이후, CS-F10-처리fasten rats 에서 GLUT2의감소수준은 Fed rats경우보다더낮지는않았다.