KISEP Original Article 대한간질학회지 2005;9(2):119-128 생쥐 Pilocarpine 모델에서중첩경련으로유발한해마신경세포사멸과이끼섬유발아에대한 MMP-9 의역할 * 주민경 1,2 조양제 1 조경주 1 이두재 1 김현우 1 김현정 1 김경환 1 허경 1 이병인 1 연세대학교의과대학신경과학교실, 뇌연구소, 1 한림대학교의과대학신경과학교실 2 The Role of MMP-9 on the Hippocampal Neuronal Cell Death and Mossy Fiber Sprouting due to Pilocarpine-Induced Status Epilepticus in Mice Min Kyung Chu, M.D. 1,2, Yang-Je Cho, M.D. 1, Kyoung-Joo Cho 1, Doo Jae Lee, Ph.D. 1, Hyun-Woo Kim 1, Hyun-Jung Kim 1, Gyung Whan Kim, M.D., Ph.D. 1, Kyoung Heo, M.D. 1 and Byung In Lee, M.D. 1 Department of Neurology and Brain Research Institute, 1 Yonsei University College of Medicine, Seoul, Department of Neurology, 2 Hallym Univeristy College of Medicine, Anyang, Korea Purpose:Matrix metalloproteinases (MMPs) have been known to participate in various pathologic situations by modulating extracellular matrix. Although MMP-9 upregulation has been reported in some experimental seizure models, the exact role of MMP-9 in hippocampal cell death during epileptogenesis and subsequent mossy fiber sprouting (MFS) is not clear. Here, we investigated the role of MMP-9 on hippocampal cell death and MFS after pilocarpineinduced status epilepticus (SE) in mice, using highly specific hydroxamic MMP-9 inhibitor. Methods:SE was induced by intraperitoneal pilocarpine administration in adult male C57BL/6 mice. MMP-9 specific inhibitor was administered intracerebroventrically 3 h after pilocarpine-induced SE. Expression and activation of MMP-9 were assessed by zymography and Western blot analysis. TdT-mediated UTP-biotin nick end labeling (TUNEL) and caspase-3 activity assay were also performed. MFS was investigated using Timm staining. Results:Increased expression and activation of MMP-9 after pilocarpine-induced SE were observed in zymography and Western blot analysis. MMP-9 specific inhibitor decreased MMP-9 activity in in situ zymography and hippocampal cell death in cresyl violet staining. DNA fragmentation and caspase-3 activity were also attenuated by MMP-9 specific inhibitor. Four months after pilocarpineinduced SE, MFS was evident in vehicle-treated mice; in contrast, MFS was barely observed in MMP-9 specific inhibitor-treated mice. Conclusions:This study suggests MMP-9 is associated with hippocampal cell death and MFS after pilocarpine-induced SE. Furthermore, the findings that MMP-9 specific inhibitor ameliorates cell death and MFS offers the possibility of MMP-9 specific hydroxamic inhibitor as novel therapeutic strategy to reduce hippocampal damage and epileptogenesis. (J Korean Epilep Soc 2005;9(2):119-128) KEY WORDS:Seizures Gelatinase B Apoptosis Mossy fiber, hippocampal Anthranilic hydroxamic acid. 서 론 간질은가장흔한만성후천성뇌질환의하나로약 40% 의환자는약물에잘반응하지않는난치성간질이다. 1 간질발생은외상, 뇌경색, 열성경련, 저산소증, 간질중첩증 (status epilepticus;se), 중추신경계감염등초기유발뇌손상 (initial precipitating insult) 에의한뇌신경 Received 15 November 2005 Accepted 18 December 2005 Corresponding author: Byung In Lee, M.D., Department of Neurology, Yonsei University College of Medicine, 134 Sinchon-dong, Seodaemun-gu, Seoul 120-752, Korea E-Mail: bilee@yumc.yonsei.ac.kr 본연구는보건복지부보건의료기술연구개발사업단독기초연구지원연구개발과제 (02-PJ1-PG3-21301-0019) 의연구비의지원으로이루어졌음. 대한간질학회지 2005;9(2):119-128 119
생쥐중첩경련후간질병소생성과정에대한 MMP-9 의역할 세포사멸이선행하는것으로알려져있으며, 이후수년에서십여년에이르는잠복기, 즉간질병소생성 (epileptogenesis) 과정을거쳐자발발작 (spontaneous seizure) 이일어나고만성간질, 더나아가난치성간질로진행한다. 1 이끼섬유발아 (mossy fiber sprouting;mfs) 와같은뇌신경회로의재구성은여러실험적간질모델이나사람측두엽간질에서발견되며, 간질병소생성기에일어나는일련의뇌신경세포의복잡한변화, 즉뇌신경세포사멸, 신경전달물질과정의이상, 이상신경세포생성 (neurogenesis), 교세포증식및항상성 (homeostasis) 변화등과같은간질병소생성과정에있어매우중요한기전의하나로인식되고있다. 1 이러한간질병소생성과정을차단하는것은간질발생뿐아니라난치성간질로의진행을막아주는역할을할것으로기대되나, 현재사용중인약제중에서그러한효능을가진약제는아직없는실정이다. Matrix metalloproteinase(mmp) 는세포외기질 (extracellular matrix, ECM) 을분해하는단백분해효소로정상상태에서는발생 (embryogenesis), 변태 (metamorphosis), 조직흡수및개형 (tissue resorption and remodeling), 상처재생과같은과정에중요한역할을하는것으로알려져있다. 2 하지만, 악성종양전이나만성염증질환, 폐섬유화증, 동맥경화증과같은병적인상태에서도 MMP 가비정상적으로발현이증가되며, 중요한병태생리적역할을하는것으로보고되고있다. 2 MMP 중 MMP-2와 MMP-9은뇌의기저막을구성하는주요세포기질인 type IV collagen이나 laminin을주로파괴하기때문에여러중추신경계질환의발생기전에중요한역할을할것으로생각된다. 2 여러신경학적질환들에서도 MMP가비정상적으로증가되는것으로보고되어있는데, 생쥐 3 나백서, 4 영장류 5 를이용한실험적인뇌경색이나, 뇌경색환자들에서 6,7 MMP-2와 MMP-9의발현이증가할뿐아니라, 근위축성축삭경화증, 8 알츠하이머병, 9 다발성경화증 6 및헌팅턴병모델 10 에서도증가함이보고되었다. 간질과 MMP의연관관계에대한연구는아직많지않은데, 실험적으로백서또는백서기관형적해마배양 (organotypic hippocampal culture) 에서 kainic acid(ka) 또는 bicuculline을투여하여경련을유발했을때 MMP-9 의활성도가증가된다고보고되고있으며, 11-13 MMP-9 활성화가조직손상에선행하고, 비선택적 MMP 억제제를투여했을때기관형적해마배양에서신경세포사멸이감소한다는결과 13 는 MMP-9 이간질병소생성과정에서초기뇌손상과연관있음을시사하고, 손상된백서내후각 피질 (entorhinal cortex) 에서 MMP-9을차단했을때 plasticity가억제된다는연구 14 와편도내 KA 주입으로간질발작을유도한생쥐에서 MMP 활성인자를 knock out 시켰을때 MFS가억제된다는보고 15 는 MMP-9이또한 MFS 생성에중요한역할을할것이라는가정을가능하게한다. 따라서본연구에서는측두엽간질의한모델인생쥐 pilocarpine 유발중첩경련모델 16,17 에서 MMP-9의발현및활성도증가여부를재확인하고, 간질발생과정인해마신경세포사멸과 MFS 생성에관련된 MMP-9의역할을규명하고자하였다. 특히이번연구에서는과거비선택적 MMP 억제제가이를이용한여러임상시험에서부작용과낮은효능으로실패하였음 18 을감안하여 MMP- 9에특이적인 anthranilic hydroxamic inhibitor 19 를사용하였다. 대상과방법 Pilocarpine 유발간질모델모든동물들은연세대학교의과대학동물실험윤리위원회의지침에따라실험에사용되었다. 생후 2개월된, 체중 20~25 g의웅성 C57BL/6 생쥐를사용하였으며, 한우리 (cage) 당 5마리로사육되었고, 실내온도는 22± 0.5 로유지되었으며, 12시간간격으로낮과밤의주기를두었다. 물과먹이는자유롭게접근하도록하였다. Pilocarpine 투여에의한말초콜린성부작용을억제하기위해 methyl scopolamine(sigma, St. Louis, MO, U.S.A) 을 1 mg/kg 으로마우스복강내에투여한후, 30분이지나 pilocarpine(sigma)(dissolved in 0.9% saline, 330 mg/ kg) 또는 0.9% saline 을대조군으로복강내투여하여발작을유발하였다. 16,17 일부생쥐에서는선택적 MMP-9 억제제인 anthranilic hydroxamic inhibitor(c 27 H 33 N 3 O 5 S, Calbiochem, Darmstadt, Germany) 19 를 pilocarpine 투여 3시간후에뇌실내주입하였다. 실험동물들을 2% isoflurane 과질소와산소혼합기체 (70%/30%) 로마취시킨후, stereotaxic frame 에고정시키고우측측뇌실위치 (0.2 mm posterior, 1.0 mm lateral, and 3.1 mm deep to the bregma) 에 Hamilton syringe를이용하여 MMP-9 억제제 (5 mg/ml in DMSO, 2 μl, at a rate of 0.2 μl/min) 를 10분에걸쳐투여했으며, 이후 MMP-9 억제제의역류를막기위하여 syringe 를 10분간더그자리에위치시켰다. 대조군으로 DMSO 를동일한방법으로투여하였다. Pilocarpine을투여한생쥐는 plexiglass 120 대한간질학회지 2005;9(2):119-128
주민경 조양제 조경주등 chamber에서발작행동을 pilocarpine 투여후 6시간까지관찰하였으며, 간질의강도평가는 Racine scale 을따랐다. 20 Pilocarpine을투여한모든생쥐에서간질발작이나타났으며, Racine grade 4 이상의지속적간질발작을보이는중첩경련생쥐만을이번실험에포함시켰다. MMP 분리우레탄 (Sigma) 을복강내주사하여마취한상태에서 10 U/ml의 heparin이섞인 0.9% saline를심장을통해관류시키고즉시뇌를적출한후, 양측해마를 cold plate 에서신속히분리하여 -80 에보관하였다. Western blot analysis 와 zymography 를위한 MMP 분리는이전에보고된방법 3,10,11 들을일부변형하여사용하였다. 해마조직을 400 μl 의 working buffer(50 mm Tris-HCl, 150 mm NaCl, 5 mm CaCl 2, 0.02% NaN 3, 0.05% BRIJ-35, and 1% Triton X-100, ph 7.6) 에서균질화한후 4 에서 20분간 9,000 rpm 으로원심분리하였다. 상층액을취하여 50 μl 의 gelatin Sepharose 4B(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 와 200 μl working buffer 혼합액에서 4 에서 60분간반응시켰다. 이후 2차례 7,000 rpm 으로 5분간원심분리한후, pellet 을 70 μl elution buffer(10% DMSO plus working buffer) 에서 30분간반응시킨후상층액을취하여실험에사용하였다. Gelatin zymography MMP-2와 MMP-9의활성과발현을관찰하기위한 gelatin zymography 는이전에보고된방법에따라시행하였다. 3,5,10 앞에서기술된대로분리된 MMP를똑같은양을취하여 sample buffer(80 mm Tris-HCl, 4% SDS, 10% glycerol, and 0.01% bromphenol blue, ph 6.8) 와섞은후, 0.5% gelatin이함유된 8% SDS-polyacrylamide 겔을사용하여전기영동하였다. 전기영동후 150 ml의 2.5% Triton X-100 용액으로 15분씩 3차례세척하였으며, 세척이끝난겔은 250 ml 의 incubation buffer (50 mmol/l Tris-HCl, 10 mm CaCl 2, 0.02% NaN 3, and 1 μm ZnCl2, ph 7.5) 에넣고 37 에서 72시간동안반응시켰다. 이후, 겔을아세트산, 메탄올및증류수가 1:3:6 의비율로구성된 0.1% amido black 용액에 1시간동안염색하였으며염색이끝난후에는 amido black 을제외한같은용액을수차례바꾸어주면서탈색하였다. Human recombinant MMP-2와 MMP-9(Chemicon, Temecula, CA, USA) 을 standard control 로사용하였다. Western blot analysis MMP-9의 Western blot analysis을위한생쥐대뇌샘플은 MMP 분리법에서기술된대로준비하였다. 동일양의샘플을 8% SDS-polyacrylamide겔에서전기영동한후, polyvinylidene fluoride(pvdf) 막 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) 에옮기고 0.1% Tween 20을포함한 TBS(50 mm Tris/HCl, 140 mm NaCl, ph 7.3) 로 2차례세척한후, 5% skim milk로실온에서 1시간동안 blocking 하였다. PVDF 막을상온에서 mouse anti-mmp-9 monoclonal 항체 (1:1000, Chemicon) 와 1시간동안반응시킨다음, 2차항체로 HRP-conjugated sheep anti-mouse IgG(1:5000, Amersham Biosciences) 를 1시간동안반응시킨후, ECL plus chemiluminescent kit(amersham Biosciences) 로발색하여관찰하였다. In situ zymography MMP 활성도를생쥐해마내에서국재화 (localization) 하고, 이에대한선택적 MMP-9 억제제의효과를분석하기위해 in situ zymography를시행하였으며, 이전보고의방법에따랐다. 13,21 생쥐대뇌를적출한후, powdered dry ice 를이용해즉시냉동시켰으며, cryostat 을사용해 20 μm 두께의관상절편을만들어슬라이드에올렸다. Fluorescein isothiocyanate(fitc) 가결합된 DQ gelatin(enzchek Gelatinase/Collagenase assay kit, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 을포함한 reaction buffer(50mm Tris-HCl, 150 mm NaCl, 5 mm CaCl 2, 0.2 mm sodium azide, ph 7.6) 를슬라이드에적정량가한후, 37 의암실에서 12시간동안반응시켰다. 활성화된 MMP가 DQ gelatin을분해하면, 억제되었던 (quenched) FITC 가형광을내게되므로, FITC 의형광강도는 MMP의활성과비례한다. 반응시킨절편은 4% paraformaldehyde로고정한후, Vectashield(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 로봉입하고형광현미경 (BX51, Olympus, Tokyo, Japan) 을이용해관찰하였다. 조직학적검사를위한대뇌절편준비복강내우레탄주사로마취한생쥐를 peristaltic pump 로 10 U/ml의 heparin이섞인 0.9% saline과 3.7% formaldehyde 를순차적으로 transcardiac perfusion한후, 대뇌를적출하고 12시간동안 3.7% formaldehyde로고정하였다. 24시간동안 30% sucrose 용액에담근후 powd- 대한간질학회지 2005;9(2):119-128 121
생쥐중첩경련후간질병소생성과정에대한 MMP-9 의역할 ered dry ice와 optimum cutting temperature(oct; Tissue-Tek, Sakura Finetek Inc, Torrance, CA, USA) 용액을이용하여냉동시켰으며 -80 에서보관하였다. 이후 cryostat 을사용해 20 μm coronal section을하여사용하였다. 조직학적검사를위해서 cresyl violet 염색을시행하였고통계적계수를위해반정량적 (semiquantitative) 방법을사용하였는데, 17 각각의생쥐에서우측과좌측모두에서 3개의각기다른 section 을선택한후정상적핵과핵소체모양을갖춘세포를계수하였다. 정상 control 군의평균값을 100% 로한후, 각각의실험조건표본에서계수한세포수를비교하여 percentage 로나타내었다. DNA 분절현상검출을위한형광염색조직절편은앞에서기술된대로준비되었으며, DNA 분절현상검출법은이전에기술된방법에따랐다. 10,22,23 각각의절편은 50 μl 의 terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated uridine 5 -triphosphate-biotin nick end labeling(tunel) 반응혼합액 (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany) 을가한후, 37 의암실에서 1시간동안반응시켰다. 세척후다시핵대조염색을위해 0.5 g/ml의 propidium iodide(pi;sigma) 을가하여 37 의암실에서 20분간반응시켰다. Vectashield 로봉입한후, confocal laser scanning microscope(carl Zeiss, Thornwood, NY, USA) 으로관찰하였다. 만들어슬라이드에올리고 30% gum arabic(sigma) 과 1.68% hydroquinone(sigma), 그리고 citrate solution (2.35% sodium citrate, 2.55% citric acid monohydrate) (Sigma) 이들어있는 200 ml용액에 silver nitrate(17%, 1.5 ml) 를첨가한후, 26 암실에서 1시간동안반응시켰다. 탈수후 cresyl violet 대조염색을시행하여관찰하였으며, Tauck과 Nadler의기준 26 에따라평가하였다. 해마 dentate gyrus(dg) 의 inner molecular layer와 granular cell layer 에서관찰하였으며, Timm 염색이관찰되지않거나 granular cell layer에서미약하게관찰되는경우를 score 0, granular cell layer 에서만부분적으로흩어져 (patched) 관찰될때 score 1, 연속적이지않거나또는연속적이더라도염색강도가 score 1과 score 3의중간수준일때는 score 2, 마지막으로짙고, 연속적인띠모양으로 inner molecular layer에관찰되는경우를 score 2로정의하였다. 통계처리데이터들은 mean±sd 로표현하였다. 여러집단간의통계학적비교는 ANOVA(with Fischer s post-hoc test) 를사용하였고, 두집단간의차이는 t-test 를통해실시되었으며 (StatView;SAS Institute Inc., Cary, NC, USA), p<0.05를유의한것으로판정하였다. 결과 Caspase-3 활성도측정 Caspase-3 활성도측정법은이전에기술된방법을따랐으며,24 조직샘플은 MMP 분리법에서와같이해마를적출한후, 세포질분획만을따로분리하여사용하였다. 동일양 (20 μg) 의단백질을시판되는 caspase-3 활성도측정키트 (Calbiochem) 를이용해 ELISA 를시행하였다. Timm s staining for detection of MFS MFS를관찰하기위한 Timm s 염색은이전에보고된방법을약간변형하여사용하였다. 16,17,25 우레탄마취를시행한생쥐에서먼저 heparinized saline으로 transcardiac perfusion 한후, distilled water에 0.6% sodium sulfide와 0.6% sodium phosphate가섞인용액으로다시 perfusion 하였고, 마지막으로 3.7% formaldehyde 용액을 perfusion 하였다. 12시간동안 3.7% formaldehyde 로후고정을하였고 20% sucrose 용액에 24시간동안담궈두었다. Cryostat 으로 30 μm 두께관상절편을 Pilocarpine 유발중첩경련후, 해마에서 MMP-9 의발현증가및활성화 MMP-2와 MMP-9의발현및활성화정도를알아보기위해 pilocarpine 유발중첩경련후 1일, 3일, 7일그리고 14일후에생쥐해마를적출한후, gelatin zymography 를시행하여관찰하였다 (Figure 1A). 정상대조군에서비활성화 (latent) 상태인 pro MMP-2와 pro MMP-9 은각각분자량 ~94 kda 과 ~70 kda 위치에서관찰되었다 [Optical density(od):pro MMP-2, 2.057 ±0.47;pro MMP-9, 1.5±0.35]. Pilocarpine 유발중첩경련후 1일째에 pro MMP-9의활성도는정상대조군에비해의미있게증가하였으며 3일째에가장높았다. 7일째에는 pro MMP-9의활성도가감소되었고 14일째에는정상대조군의수준으로감소하였다 (OD:1일, 7.23 ±1.02 * ;3일, 10.67±1.27 * ;7일, 3.42±0.92;14일, 1.56±0.54;ANOVA, *p<0.001). 분자량 ~88kDa의활성화 MMP-9(active MMP-9) 은정상대조군에서는 122 대한간질학회지 2005;9(2):119-128
주민경 조양제 조경주등 pro MMP-9 active MMP-9 pro MMP-2 14 Relative optical density A 12 10 8 6 4 2 0 pro MMP-9 active MMP-9 B β-actin Std Ctr 1 d 3 d 7 d 14 d * * pro MMP-9 active MMP-9 Ctr 1 d 3 d 7 d 14 d Ctr 1 d 3 d 7 d 14 d 해마내 MMP 활성도국재화및이에대한선택적 MMP- 9 억제제투여의효과해마내소구역 (subfield) 에따른 MMP 활성도를국재화하고, 선택적 MMP-9 억제제투여에의한 MMP 활성억제효과를알아보기위해 pilocarpine 유발중첩경련후 3 일째에 in situ zymography 를시행하였다 (Figure 2A). 활성화된여러 MMP 들에의해 gelatin 이분해되면, 억제되었던 FITC 가녹색형광을방출하므로, 녹색형광의강도는 MMP 활성도와비례하게된다. 정상대조군에서는 CA1 과 CA3, 그리고 DG 에서미약한녹색형광이발광됨을관찰할수있었다 (Figure 2A, upper row). 이에비해서 pilocarpine 유발중첩경련후 vehicle 을투여한군에서는강한녹색형광이 CA1 과 CA3, 그리고 DG 모두에서관찰되었으며 (Figure 2A, middle row), 선택적 MMP-9 억제제를투여한군에서는 vehicle 투여군에비해녹색형광의정도가 CA1 과 CA3, 그리고 DG 모두에서감소하였다 (Figure 2A, lower row). Figure 1. Upregulation of MMP-9 protein and its enzymatic activation after pilocarpine-induced seizure. A:Gelatin zymography of mice hippocampal tissue obtained at various time points after pilocarpine treatment. Std, standard control; Ctr, normal control. B:MMP-9 Western blot analysis of mice hippocampal protein extracts at different time points after pilocarpine treatment. Samples in A and B were from 5 independent studies. 관찰되지않았으나, pilocarpine 유발중첩경련 1 일후에 관찰되기시작하였으며, 3 일째에가장뚜렷하였고, 7 일째 에는감소하여 14 일째에는관찰되지않았다 (OD:1 일, 1.13±0.10;3 일, 2.21±0.33;7 일, 0.64±0.06). 이에 반해서, pro MMP-2 의발현은 pilocarpine 유발중첩경 련이후에도정상대조군에비해의미있는변화가관찰 되지않았고 (OD:1 일, 2.36±0.42;3 일, 3.02±0.63; 7 일, 2.11±0.19;14 일, 1.04±0.10)(Figure 1A), active MMP-2 도관찰되지않았다. MMP-9 의발현양을알아보기위한 Western blot analysis 에서 MMP-9 면역반응은정상대조군에서미약하 게관찰되었다 (Figure 1B). MMP-9 면역반응은 pilocarpine 유발중첩경련후 1 일째에정상대조군에비해의 미있게증가함이관찰되었으며, 3 일째에가장증가하는 것으로나타났다. 7 일째와 14 일째에는 MMP-9 발현증 가가감소하여, 정상대조군과비슷한정도의면역반응 을나타내었다 (OD:control, 1.71±0.24;1 일, 6.83± 0.93 * ;3 일, 9.22±1.22 * ;7 일, 2.66±0.17;14 일, 2.29 ±0.20;ANOVA, *p<0.001)(figure 1B). 중첩경련으로인한해마세포사멸및이에대한선택적 MMP-9 억제제투여의효과 Pilocarpine 유발중첩경련후일어나는해마세포사멸및조직손상을알아보기위해, 중첩경련후 3 일째에대뇌를적출하고 cresyl violet 염색을시행하였다 (Figure 2B). 정상대조군에서는 CA1, CA3, 그리고 DG 모두에서특별한이상소견이관찰되지않았다 (Figure 2B, upper row). 이에반해 pilocarpine 유발중첩경련후 vehicle 을투여한군에서는조직학적손상이일어났는데, CA3 에는다수의 pyramidal 세포가소실되었고 CA1 은 pyramidal 세포소실과함께농축핵 (pyknotic nuclei) 이많이관찰되었으며, DG 는비교적세포소실이적었으나일부세포에서핵질농축 (chromatin condensation) 이관찰되었다 (Figure 2B, middle row). 하지만 pilocarpine 유발중첩경련후선택적 MMP-9 억제제를투여한군에 서는 vehicle 투여군에비해해마세포소실이현저히감소하는것을관찰할수있었으며 (Figure 2B, lower row), 반정량적계수를통해이를확인할수있었다 (percentage of survived cells against control:mmp-9 inhibitor-ca1, 86.72±11.06;vehicle-CA1, 18.91 ±2.24 * ;MMP-9 inhibitor-ca3, 62.48±9.13;vehicle-CA3, 6.19±1.03 * ;MMP-9 inhibitor-dg, 90.56 ±14.03;vehicle-DG, 54. 25±7.63 * ;unpaired t- test, *p<0.001). 대한간질학회지 2005;9(2):119-128 123
생쥐중첩경련후간질병소생성과정에대한 MMP-9 의역할 A B Figure 2. Reduction of MMP activity and mice hippocampal degeneration after pilocarpine-induced seizure by treatment of selective MMP-9 inhibitor. A:Comparison of net proteolytic activity in hippocampal subfields by in situ zymography among normal control, vehicle-, and selective MMP-9 inhibitor-treated groups at 3 days after pilocarpine treatment. MMP- 9I, MMP-9 inhibitor;bar=100 μm in left panel and 50 μm in the other panels. B:Comparison of cresyl violet staining in hippocampal subfields among normal control, vehicle-, and selective MMP- 9 inhibitor-treated group at 3 days after pilocarpine treatment. Bar= 100 μm in left panel and 50 μm in the other panels. 선택적 MMP-9 억제제투여로인한 DNA 분절현상및 caspase-3 활성감소 Pilocarpine 유발중첩경련으로인한생쥐해마세포의 DNA 분절현상여부를알아보기위해, 중첩경련후 3일째에 TUNEL 염색을시행하였다 (Figure 3A). TUNEL 반응에양성인세포들은 confocal microscope상에서녹색형광을띄게되고, 핵대조염색으로시행한 PI는붉은색형광을띄게되며, 이둘을결합한 (merged) 영상에서 TUNEL 과 PI 모두에양성인세포는노란형광을나타내게된다. 정상대조군에서는 CA1 과 CA3 모두 PI 양성세포가많이관찰되나, TUNEL 양성세포는관찰되지않았다 (Figure 3A, left panel). 이와대조적으로 pilocarpine 유발중첩경련후 vehicle 을투여한군에서는정상대 조군에비해 CA1 과 CA3 모두에서많은수의 TUNEL 양성세포가관찰되었으며이와더불어 PI 양성세포가많 이소실되었다 (Figure 3A, middle panel). 하지만선택 적 MMP-9 억제제를투여한생쥐군에서는 vehicle 투 여군에비해 CA1 과 CA3 모두 TUNEL 양성을보이는 세포가의미있게감소함을관찰할수있었다 (TUNELpositive cells/mm 2 :control, 0;vehicle-CA1, 1132 ±103.24;MMP-9 inhibitor-ca1, 124.40±32.89 * ; vehicle-ca3, 1084.32±96.53;MMP-9 inhibitor- CA3, 96.40±23.16 * ;unpaired t-test, *p<0.001)(figure 3A, right panel and B). Pilocarpine 유발중첩경련후 1 일째와 3 일째에 caspase-3 활성도를측정하였는데, 선택적 MMP-9 억제제 를투여한군에서 vehicle 을투여한생쥐군에비해의 미있게 caspase-3 활성도가감소함을알수있었다 124 대한간질학회지 2005;9(2):119-128
주민경 조양제 조경주등 (OD:control, 85.90±10.45;1 day-vehicle, 945.37 * ; ±102.47;1 day-mmp-9 inhibitor, 589.23±101.29 * ; 3 days-vehicle, 1509.14±158.39;3 days-mmp-9 inhibitor, 747.62±99.36 * ;unpaired t-test, *p<0.001) (Figure 3C). 선택적 MMP-9 억제제투여후 MFS 생성의변화 간질병소생성과정에서중요기전의하나로생각되는 MFS 생성에미치는 MMP-9 의영향을알아보기위해 Timm s staining 을시행하였다 (Figure 4). Zinc 를함유 하는이끼섬유는 Timm s staining 상에서암갈색을나 타내며, DG granular cell 과 CA pyramidal cell layer 는 A Figure 3. Reduction of DNA fragmentation and caspase-3 activity after pilocarpine-induced seizure by treatment of selective MMP-9 inhibitor. A:Comparison of TUNEL staining in hippocampal subfield CA1 and CA3 among normal control, vehicle-, and selective MMP- 9 inhibitor-treated group at 3 days after pilocarpine treatment;nuclear PI counterstaining (red), TUNEL staining (green); MMP-9I, MMP-9 inhibitor;bar=50 μm. B:Semi-quantitative analysis of TUNEL-positive cells in mice hippocampal subfields between vehicle- and selective MMP-9 inhibitor-treated groups. C: Comparison of the relative funct- ional activity of caspase-3 between vehicle- and selective MMP-9 inhibitor-treated group after pilocarpine treatment. TUNEL-positive cells/mm 2 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 TUNEL-positive cells Vehicle MMP-9I * * Control CA 1 CA 3 B Relative functional unit Caspase-3 activity 1800 Vehicle MMP-9I 1600 1400 1200 1000 * 800 * 600 400 200 0 Control 1 day 3 days C Figure 4. Reduction of mossy fiber sprouting by selective MMP-9 inhibitor, visualized by Timm staining in coronal sections of the mice hippocampus at 16 weeks after pilocarpine-induced seizure. Note the strong silver deposits at the inner molecular layer (black arrow heads) and granular cell layer of the vehicle-treated mice. MMP- 9I, MMP-9 inhibitor;mml, middle molecular layer;iml, inner molecular layer;gl, granular cell layer; Bar=100 μm in upper panel and 50 μm in lower panel. 대한간질학회지 2005;9(2):119-128 125
생쥐중첩경련후간질병소생성과정에대한 MMP-9 의역할 cresyl violet 대조염색을시행하여보라색을띄게된다. Pilocarpine 유발중첩경련후 16주째에정상대조군에서는 granular cell layer나 inner molecular layer 모두에서 MFS가관찰되지않았다 (Figure 4, left panel). Pilocarpine 유발중첩경련후 vehicle을투여한군에서는 granular cell layer와 inner molecular layer 전층에걸쳐이끼섬유가짙게염색됨을관찰할수있었다 (Figure 4, middle panel). 이에반해서선택적 MMP-9 억제제를투여한군에서는 MFS이약하게관찰되어 vehicle을투여한군에비해감소함을알수있었다 (Figure 4, right panel). Tauck과 Nadler의기준에따른 score를비교하였을때, vehicle을투여한군에비해선택적 MMP-9 억제제를투여한군에서의미있게 score 가감소하였다 (Score:vehicle, 3.0;MMP-9 inhibitor, 1.2±0.45 * ; unpaired t-test, *p<0.05). 고찰 본연구를통해저자들은측두엽간질모델로널리쓰이는생쥐 pilocarpine 간질모델 16,17 에서중첩경련이후해마에서증가된 MMP-9이해마세포사멸및 MFS과연관되며, MMP-9 선택적억제제를사용하여해마세포사멸및 MFS를감소시킴을최초로확인하였다. 결과를요약하면, 첫째, MMP-9의발현및활성은 pilocarpine 유발 SE 1일후부터증가하여 3일후에최대에이르렀으나 MMP-2의발현및활성은별다른변화를보여주지못했다 (Figure 1). 둘째, SE 이후, MMP 활성은해마전영역에걸쳐증가했으며, 이는선택적억제제를통해감소됨을확인하였다 (Figure 2A). 셋째, MMP-9을선택적으로억제함으로써 SE 후발생하는해마세포사멸을감소시켰고 (Figure 2B), DNA 분절현상과 caspase-3 활성도감소하였다 (Figure 3). 마지막으로, 선택적 MMP- 9 억제제를사용하여간질병소생성의주요기전인 MFS 생성을억제함을보여주었다 (Figure 4). 이번연구에서중첩경련후 1일째와 3일째에생쥐해마에서 MMP-9의발현과활성모두증가하고이후감소되나, MMP-2의발현과활성은변화되지않았다 (Figure 1). 이러한결과는 KA를이용한이전연구들 11-13 과도비교적유사한데, Zhang 등의연구에따르면, 백서에 KA를복강내로투여하여유발한간질모델에서는해마내 MMP-9의활성이간질유발 12시간후에 8배증가하여최고도에달하고 24시간까지증가하나 MMP-2의발현은 3일째에만 2배증가한다고보고하였으며, 같은연 구에서 GABA A 길항제인 bicuculline을투여하였을때는 MMP-2 활성의증가는관찰되지않고 MMP-9 의활성만이관찰된다고하였다. 11 또다른연구에서는백서해마의 MMP-9 발현이 KA 간질유발 6시간후에먼저증가하고이후 24시간까지 MMP-9 활성이증가하였으나, MMP-2 의변화는관찰되지않았다고보고하였으며, 12 Jourquin 등은 in situ zymography를이용하여백서해마 MMP 활성이 KA 간질유발 8시간후부터증가한다고보고하여 13 이번연구결과와부합된다. 특히 Szklarczyk 등은 reverse transcription(rt)-pcr과 in situ hybridization 기술을사용하여, 정상백서에서 MMP-2 mrna는 MMP-9 mrna에비해대뇌전반에걸쳐발현하고해마내에서는그발현양이적으며, 주로 astrocyte 및일부 DG granule cell 에주로발현한다고보고하여, 12 간질발작이후해마에서 MMP-2와 MMP-9의발현및역할의차이를시사하고있다. 또한정상생쥐에서 CA 와 DG 등해마전영역에서약하게관찰된 MMP 활성이중첩경련에의해증가되었다 (Figure 2A). 이러한결과는백서 KA 모델에서 CA1, CA3 및 DG 모두에서 MMP 활성이증가하였다는이전보고 13 와도일치하고, 역시백서 KA 모델에서초기에전 CA subfield와 DG에서 MMP 활성이증가한다는보고 12 와도부합한다. 또한비교적세포사멸에저항적이고 MFS 과같은가소성에중요한역할을하는 DG에서 MMP-9 활성이증가한점은이부위에서 MMP-9이 MFS, 즉이상회로생성에중요한역할을할것이라는점을제시하고, 이러한가정은 MMP-9이 ECM 을분해하여악성세포전이나상처치유과정과같은조직개조 (remodeling) 과정에중요한효소인점 2 과백서 KA 모델에서후기에주로 DG에서 MMP-9 발현과활성이증가한다는보고 12 에의해간접적으로뒷받침된다. In situ zymography는 MMP 활성도를시공간적 (temporospatial) 으로측정할수있는방법이나, 전반적인 MMP 활성도만을나타내고특정 MMP의활성을잴수없는단점이있다. 하지만우리실험에서선택적 MMP-9 억제제를썼을때, in situ zymography 상에서 MMP활성도가뚜렷이감소하는점 (Figure 2A) 은아마도중첩경련후해마내에서증가된 MMP 활성도가주로 MMP-9에의한것임을시사한다. 선택적 MMP-9 억제제를사용하여중첩경련에의한해마세포사멸을감소시키고, DNA 분절현상과 caspase-3 활성또한감소시키는것 (Figure 2B, 3) 은중첩경련후간질병소생성과정에서 MMP-9 이생쥐해마세포사멸에관여하며, 그일부기전으로세포고사 (apoptosis) 과정이 126 대한간질학회지 2005;9(2):119-128
주민경 조양제 조경주등 관여됨을제시한다. Pilocarpine 유발간질과같은실험적간질모델에서해마세포사멸은비교적잘알려진사실이며, 1,16,17 이러한간질모델의해마세포사멸에세포고사가중요한역할을하는것으로보고되고있다. 27-29 MMP-9은여러뇌질환모델에서신경세포사멸에관여하는데, 3,5,6,8-10 MMP 억제제를사용하거나, 10,12,13,30,31 MMP-9 knock-out 생쥐를이용한실험에서신경세포사멸이감소하고, 31 해마배양조직에 MMP-9 을가했을때, 세포사멸이증가한다는보고 13 는활성화된 MMP-9 이신경세포사멸을유도하는것을시사한다. MMP-9이세포사멸에관여하는기전은아직확실하지않지만뇌혈관기저막을손상시켜뇌부종, 염증및뇌혈관장애를일으킨다는보고 3-5,10 들이있으며, 최근연구들에따르면 MMP- 9의단백분해에의해 integrin 32 이나 laminin 30 과같은 ECM-cell 상호작용이소실됨으로써 caspase 의존성세포고사를유도하는것으로보고되고있다. 32 이번실험에서는 pilocarpine 유발중첩경련후, MFS 가생성되는것을확인하였고, 선택적 MMP-9 억제제를사용하였을때, 이러한 MFS 생성이감소하는것을관찰할수있었다 (Figure 4). MFS는사람측두엽간질뿐아니라, 여러실험적간질모델에서나타나며, 일부논란이있지만자발간질발작을설명하는간질병소생성의중요한기전으로받아들여지고있다. 1 이러한현상은 MMP- 9 억제제를사용하였을때, 손상된편측백서내후각피질 (entorhinal cortex) 에서반대측내후각피질로의 sprouting 이억제된다는보고 14 와유사하며, 편도내 KA 주입으로간질발작을유도한생쥐에서 MMP 활성인자인 tissue plasminogen activator를 knock out시키면 MFS가억제된다는보고 15 와도유사하여저자들의결과를간접적으로뒷받침하고있다. 결론적으로, 저자들은생쥐 pilocarpine 모델에서중첩경련에의해해마내 MMP-9 발현및활성이증가하며, 이러한 MMP-9의발현및활성증가는생쥐해마세포의손상과 MFS 생성에밀접한관련이있음을밝혔다. 또한 MMP-9 선택적인억제제를사용했을때간질발작후간질병소생성기간초기에해마세포의사멸을감소시키고, 또한후기변화인 MFS를성공적으로억제함을밝혔다. 따라서간질치료에있어선택적 MMP-9 억제제의사용은과거임상시험에서나타난비선택적 MMP 억제제의부작용을감소시킬것으로기대되며, 향후간질발작에의한뇌신경세포손상예방및간질발생의억제치료에있어유망한치료전략으로서의가능성을제시하고있다. REFERENCES 1. Pitkanen A, Sutula TP. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. Lancet Neurol 2002;1:173-81. 2. Werb Z. ECM and cell surface proteolysis: regulating cellular ecology. Cell 1997;91:439-42. 3. Gasche Y, Fujimura M, Morita-Fujimura Y, et al. Early appearance of activated matrix metalloproteinase-9 after focal cerebral ischemia in mice: a possible role in blood-brain barrier dysfunction. J Cereb Blood Flow Metab 1999;19:1020-8. 4. Rosenberg GA, Navratil M, Barone F, Feuerstein G. Proteolytic cascade enzymes increase in focal cerebral ischemia in rat. J Cereb Blood Flow Metab 1996;16:360-6. 5. Heo JH, Lucero J, Abumiya T, Koziol JA, Copeland BR, del Zoppo GJ. Matrix metalloproteinases increase very early during experimental focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 1999; 19:624-33. 6. Anthony DC, Ferguson B, Matyzak MK, Miller KM, Esiri MM, Perry VH. Differential matrix metalloproteinase expression in cases of multiple sclerosis and stroke. Neuropathol Appl Neurobiol 1997; 23:406-15. 7. Montaner J, Alvarez-Sabin J, Molina C, et al. Matrix metalloproteinase expression after human cardioembolic stroke: temporal profile and relation to neurological impairment. Stroke 2001;32: 1759-66. 8. Lim GP, Backstrom JR, Cullen MJ, Miller CA, Atkinson RD, Tokes ZA. Matrix metalloproteinases in the neocortex and spinal cord of amyotrophic lateral sclerosis patients. J Neurochem 1996;67:251-9. 9. Deb S, Gottschall PE. Increased production of matrix metalloproteinases in enriched astrocyte and mixed hippocampal cultures treated with beta-amyloid peptides. J Neurochem 1996;66:1641-7. 10. Kim GW, Gasche Y, Grzeschik S, Copin JC, Maier CM, Chan PH. Neurodegeneration in striatum induced by the mitochondrial toxin 3-nitropropionic acid: role of matrix metalloproteinase-9 in early blood-brain barrier disruption? J Neurosci 2003;23:8733-42. 11. Zhang JW, Deb S, Gottschall PE. Regional and differential expression of gelatinases in rat brain after systemic kainic acid or bicuculline administration. Eur J Neurosci 1998;10:3358-68. 12. Szklarczyk A, Lapinska J, Rylski M, McKay RD, Kaczmarek L. Matrix metalloproteinase-9 undergoes expression and activation during dendritic remodeling in adult hippocampus. J Neurosci 2002;22: 920-30. 13. Jourquin J, Tremblay E, Decanis N, et al. Neuronal activity-dependent increase of net matrix metalloproteinase activity is associated with MMP-9 neurotoxicity after kainate. Eur J Neurosci 2003;18: 1507-17. 14. Reeves TM, Prins ML, Zhu J, Povlishock JT, Phillips LL. Matrix metalloproteinase inhibition alters functional and structural correlates of deafferentation-induced sprouting in the dentate gyrus. J Neurosci 2003;23:10182-9. 15. Wu YP, Siao CJ, Lu W, et al. The tissue plasminogen activator (tpa)/plasmin extracellular proteolytic system regulates seizureinduced hippocampal mossy fiber outgrowth through a proteoglycan substrate. J Cell Biol 2000;148:1295-304. 16. Shibley H, Smith BN. Pilocarpine-induced status epilepticus results in mossy fiber sprouting and spontaneous seizures in C57BL/6 and CD-1 mice. Epilepsy Res 2002;49:109-20. 17. Cavalheiro EA, Santos NF, Priel MR. The pilocarpine model of epilepsy in mice. Epilepsia 1996;37:1015-9. 18. Coussens LM, Fingleton B, Matrisian LM. Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations. Science 2002;295: 2387-92. 대한간질학회지 2005;9(2):119-128 127
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