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The Annual Report of Busan Metropolitan 자생식물추출물의 city Institute MTT assay of 를이용한항바이러스활성연구보건환경연구원보9 Health & Environment 21(1) 9~15(2011) 자생식물추출물의 MTT assay 를이용한항바이러스활성연구 박은희 민상기 박연경 박소현 김남호 황수정 진성현 역학조사과 미생물과 Study for Antiviral Activity of Methanol Extracts in Indigenous Plants by MTT assay Eun-Hee Park, Sang-Kee Min, Yon-Koung Park, So-Hyun Park, Nam-Ho Kim, Su-Jeong Hwang and Sung-Hyun Jin Epidemiology Division Microbiology Division Abstracts The methanol extracts from seven indigenous plants in Busan were tested for antiviral activities against echovirus serotype 30 (ECV 30) and influenza virus type A by MTT (3-(4,5-dimethy-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) assay in vero and MDCK cells, respectively. Cytotoxicity in vero and MDCK cells was shown under 50% cytotoxic dose by extracts concentration of Zea mays (corn silk) and Equisefum arvense at 1,000 ug/ml. The inhibition rates of Zea mays (corn silk) and Equisefum arvense at 10,000 ug/ml on ECV 30 were 89.5% and 17.7%, respectively. The inhibition rates of Zea mays (corn silk) at 5,000 ug/ml on Influenza virus A/H1N1 2009 and Influenza virus A/H3N2 were 93.4% and 93.9%. The inhibition rates of Equisefum arvense at 2,500 ug/ml on Influenza virus A/H1N1 2009 and Influenza virus A/H3N2 were 37.7% and 44.0%. From this study, Zea mays (corn silk) could be used as the candidate materials for antivirus drug with in vitro further research. Key words : cytotoxicity, indigenous plant, inhibition rate, methanol extract, MTT assay 1) 서론식물은화학물질합성공장이라불릴만큼광범위한물질 을생산하고, 특히생명체자기방어기작등과관련한 2차대사산물은천연항바이러스활성연구대상으로무궁한잠재력이있어, 국내 외적으로자국의민속약용식물을중심으로새로운항바이러스물질탐색을위한연구가활발하게진행되고있다 1~5). 현재까지알려진식물유래항바이러스효능보유물질은 flavonoids, terpenoids, lignans, sulphides, polyphenolics, coumarins, saponins, alkaloids, polyines, thiophenes, proteins, peptides 및향신료, 허브차의정유성분 (essential oil) 등다양한 phytochemicals 가지속적으로보고되고있으며 6), 바이러스는숙주세포의 대사과정에의존하여증식하는절대세포내기생체이므로천연물을이용한항바이러스물질의개발은인체부작용을줄일수있는효과를기대할수있다. 인플루엔자바이러스는바이러스자체의잦은항원성변이때문에영구백신개발이어렵고, 개발된항바이러스제도증상약화및바이러스의전파기간단축등에는효과가있으나. 부작용및내성획득등의문제점을안고있다. M2 protein 억제제로개발된 amantadine, rimantadine은내성바이러스출현율증가로사용제한을권고받으며, neuramindase 억제제인 oseltamivir, zanamivir에대하여도내성주발생이보고되었다 7). 또한현재항바이러스치료제로사용중인 acyclovir (anti-herpes simplex virus), zidovudine (anti-humam immunodeficiency Corresponding author. E-mail : peh731@korea.kr Tel : +82-51-757-6936, Fax : +82-51-753-1424

10 박은희 민상기 박연경 박소현 김남호 황수정 진성현 virus), ribavirin (anti-respiratory syncytial virus) 등에대한내성도보고되고있다 8). 또한수족구병, 무균성수막염등의원인바이러스인엔테로바이러스는예방백신이없고효과적인치료제가개발되지않아대증요법으로치료하고있으며, 미국등선진국에서사용되는 pleconaril 도부작용의우려가높아생명을위협하는임상증상에한정하여사용하고있다 9). 이렇듯새로운항바이러스제개발의필요성은지속적으로요구되고있다. 항바이러스효능을탐색하는 in vitro 검색계 (screening system) 로는감수성세포를이용한세포병변효과 (cytopathic effect, CPE) 억제시험, 바이러스만성감염세포시험, 다핵거대세포형성저해법, influenza virus, mumps virus 와같이혈구응집능이있는바이러스의경우혈구응집억제 (HI) 시험법, serum pharmacological assay 10), RIA를이용한항원량검출법, 새로운분자마커를이용한 southern blotting, PCR, 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay 11) 등이있다. 본연구는 2009년부산지역야산및생활주변에자생하는야생잡초류, 수목류및민간약초류 125종 134건의열수추출액을세포부착및세포병변효과 (CPE) 시험으로세포독성및항바이러스활성을검색한결과에코및인플루엔자바이러스에대해항바이러스활성이확인된옥수수수염등 7종의자생식물을대상으로메탄올로추출하여각추출물에대하여 MTT assay를실시하여세포독성및항바이러스활성결과에대한재현성과이들시험에대한정량화및수치화하여과학적인데이터를보완하여항바이러스제신물질개발을위한기초자료로제시하고자하였다. 재료및방법실험재료본실험에사용된식물은 2009년부산지역야산및생활주변에흔히자생하는야생잡초류, 수목류및민간약초류등의열수추출액 134건을대상으로에코바이러스와인플루엔자바이러스에대해세포부착과세포병변시험으로세포독성및항바이러스활성이확인된 7종의식물중쇠뜨기 ( 지상부 ), 아카시아 ( 꽃 ), 철쭉 ( 꽃 ), 소루쟁이 ( 지상부 ), 쪽 ( 지상부 ) 및무궁화 ( 충영 ) 6종은금련산주변에서채집하였으며, 옥수수수염은시장에서건조된것을구입하여사용하였다. 시료의조제생체로채집된식물은물로세척한후세절하여건조기에서 3일이상건조하여각각의시료 30g 당메탄올 (Merck, HPLC용 ) 300 ml를넣고실온에서 8시간교반추출하였다. 추출액은 36 에서감압농축하고, 농축잔여물은최종동결건조하였다. 시료용액의조제는동결건조된시료를 20,000 ug/ml가되도록멸균증류수에녹여무균적으로 pore size 0.22um 멸균필터를통과시켜조제하였으며, 조제된시료는실험에사용할때까지 4 에서냉장보관하였다. 바이러스배양각추출물의항바이러스활성을측정하기위해사용된바이러스는우리나라에서매년유행율이높은 echovirus serotype 30 (ECV 30) 과 2009년세계적대유행주인 Influenza A/Califonia/7/2009 (H1N1) 와 Influenza A/Brisbane/10/2007 (H3N2) 을사용하였다. ECV 30은고려대학교병원성바이러스은행 (http://www.kbpv.co.kr) 으로부터, 인플루엔자바이러스는질병관리본부로부터분양받았으며, African green monkey kidney (vero) 세포와 Madin-Darby canine kidney (MDCK) 세포는질병관리본부로부터분양받아사용하였다. Vero 세포는 5% fetal bovine serum (FBS) 과 penicillin / streptomycin 을첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 을이용하여유지계대하였으며, 접종용배지는 2% FBS(+) DMEM을사용하였고, MDCK 세포의유지배양용배지는 10% FBS (GIBCO BRL, USA) 와 penicillin / streptomycine / nystatine 을각각 1% 포함하는 minimum essential medium (MEM, GIBCO BRL, USA) 을사용하였으며, 접종용배지는 vitamin solution, D-glucose, trypsin을함유한 serum-free MEM을사용하였다. 세포독성시험추출물에대한세포독성은 MTT assay로시험하였으며, 기존에상품화되어있는 MTT cell viability assay kit (Biotium, Inc. USA) 를사용하였다. 96 well plate에 well당세포 (MDCK: 3.6 10 4 cells, vero: 4.3 10 4 cells) 를접종하여 5% CO 2, 37 에서 24시간배양하여세포단층을얻은후, phosphate buffered saline (PBS) 으로 1회세척하고, 배양액 100 ul와세포접종용배지로

자생식물추출물의 MTT assay 를이용한항바이러스활성연구 11 희석한추출물 1,000 ug/ml를 100 ul/well씩접종하여 5% CO 2, 37 배양기에서 48시간배양하였다. 세포병변도를확인한후배양액 100 ul씩을제거한후, MTT 용액 10 ul씩을각 well에가하여 5% CO 2, 37 배양기에서 4시간동안정치하였다. MTT 용액을완전히제거하여배양 plate를건조한후 200 ul dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich, USA) 로세포내에형성된 formazan 결정체를용해하여 ELISA plate reader (BioTec Ex800, USA) 로 570 nm에서흡광도를측정하였다. 세포독성비율은정상세포와식물추출물을처리한군의비율로식 (1) 에따라계산하였다. 식 (1) 세포독성능 (%) = A - B 100 A 각식물추출믈의바이러스증식억제능은다음식 (2) 에따라구하였다. 식 (2) 바이러스증식억제능 (%) = D - C 100 B - C 결과및고찰 바이러스증식억제능분석에코바이러스와인플루엔자바이러스에대한각추출물의바이러스증식억제능은 vero 세포와 MDCK 세포를세포독성시험때와같은조건으로배양한후, 기존의배양액을제거하고각추출물을농도 (100, 250, 500, 1,000, 5,000, 10,000 ug/ml) 별로 100 ul/well 씩접종하였다. 에코및인플루엔자바이러스는 75 cm 2 tissue culture flask (Corning, USA) 에서배양하여 CPE가일어나부착된세포들이떨어지면 freezing-thawing을 2번반복한후, 1,500 g에서 5분간원심분리하였다. Cell debris는제거하고바이러스를함유하고있는상등액을 cryogenic vial (Nalgene, USA) 에소분후 -80 에보관사용하였다. 접종용바이러스의감염역가는 Reed-Muench method 12) 를이용하여 50% tissue culture infective dose (TCID 50) 를산정하여, 에코바이러스는 TCID 50 (3.6 10 7 /ml) 를인플루엔자바이러스는 100 TCID 50 (A/H1N1 2009 : 3.1 10 4 /ml, A/H3N2: 4.3 10 4 /ml) 100 ul/well 씩을접종하여 5% CO 2, 3 7 배양기에서 48시간배양하였으며, 세포독성시험과동일한 MTT assay로각바이러스에대한증식억제능분석을실시하였다. 각처리군은바이러스를처리하지않은정상세포군의흡광도 (A), 식물추출물만처리한군의흡광도 (B), 바이러스만을처리한군의흡광도 (C), 바이러스와식물추출물을같이처리한군의흡광도 (D) 를기준으로, 각각식물추출물의세포독성비율과식물추출의바이러스증식억제비율 13) 을계산하였다. 각식물추출물의세포독성비는다음식 (1) 에따랐으며, 세포독성시험 2009년부산지역야산및생활주변에자생하는야생식물 125종 134건의열수추출액에대한세포부착및세포병변효과시험으로바이러스억제능이확인된옥수수수염 [Zea mays (corn silk)], 쇠뜨기 (Equisefum arvense, 지상부 ), 아카시아 (Robinia pseudoacacia, 꽃 ), 철쭉 (Rhododendron schlippenbachii, 꽃 ), 소루쟁이 (Rumex crispus, 지상부 ), 쪽 (Persicaria tinctoria, 지상부 ) 및무궁화 (Hibiscus syriacus, 충영 ) 7종의메탄올추출물에대하여 MTT assay로 1,000 ug/ml 농도에서세포독성을확인하였다. Vero 세포에대해서는옥수수수염 48.6%, 쇠뜨기 19.6% 였으며, 무궁화충영, 쪽, 철쭉, 아카시아및소루쟁이추출물의세포독성은각각 59.4%, 75.9%, 84.5%, 95.4% 및 96.1% 였다 ( 표 1). MDCK 세포에대해서는옥수수수염 14.3%, 쇠뜨기 5.8% 및무궁화 ( 충영 ) 49.9% 로나타났으며, 쪽, 철쭉, 아카시아및소루쟁이추출물은 86.3%, 94.8%, 94.9% 및 70.7% 의세포독성을나타내었다 ( 표 1). 바이러스억제능분석에는 1,000 ug/ml 농도에서 vero 및 MDCK 세포에대해 50% cytotoxic dose (CD 50) 미만으로확인된옥수수수염및쇠뜨기추출물에대해농도별로세포독성및바이러스증식억제능을분석하였다. 열수추출액을사용하여세포독성을나타내지않는최대희석배수 (MNTD) 농도에서세포부착성으로확인한세포독성시험에대한 2009년의연구결과 (Table 1) 와비교해볼때다소차이가있었다. 이는사용한추출액의농도가정량화되지못하고, 부착된세포량의유무판별이실험자의육안에의존하는주관적판정에기인하는것으로, 세포배양후현미경적검경에의한세포부착정도로는세포독성정도판정이어렵다고사료된다.

12 박은희 민상기 박연경 박소현 김남호 황수정 진성현 Table 1. Cytotoxicity results by methanol and aqueous extracts of indigenous plants against vero and MDCK cells Botanical name MTT assay a) (%) Cell attachment test b) Vero cell MDCK cell Vero cell MDCK cell Equisefum arvense (aerial part) 19.6 5.8 +1 +4 Hibiscus syriacus (plant gall) 59.4 49.9 +1 +1 Persicaria tinctoria (aerial part) 75.9 86.3 +1 +4 Rhododendron schlippenbachii (flower) 84.5 94.8 +1 +2 Robinia pseudoacacia (flower) 95.4 94.9 +1 +1 Rumex crispus (aerial part) 96.1 70.7 +4 +1 Zea mays (corn silk) 48.6 14.3 +1 +1 a) MTT assay; Cytotoxicity(%) of methanol extracts concentration at 1,000 ug/ml) b) Cell attachment test; Cytotoxicity score of 2-fold dilution factor for aqueous extracts showing (-) cytotoxicity at the maximum non-toxic dose (MNTD) Table 2. Cytotoxicity and Inhibition rates of methanol extracts on ECV 30 in vero cells by MTT assay Extracts Zea mays (corn silk) Equisefum arvense conc. (ug/ml) Cytotoxicity(%) Inhibition rate(%) Cytotoxicity Inhibition rate(%) 100 15.6 2.9 9.1 2.2 500 44.9 33.8 11.6 2.3 1,000 48.6 42.1 19.6-2,500 46.8 63.2 21.5-5,000 49.7 63.9 34.7 2.2 10,000 48.9 89.5 51.4 17.9 - : non inhibitory effect 따라서다수의시료를대상으로세포독성유무를판별하기에는 MTT assay가시간과경비가적게들고실험방법이비교적간편하며, 살아있는세포내에형성된 fomazan의흡광도측정으로세포독성유무의객관적판정이가능하므로대량의항바이러스활성물질검색에는 MTT assay가적합하다고사료된다. ug/ml에서는 89.5% 로가장높은바이러스증식억제능을나타내었으며, 쇠뜨기추출물은 100~5,000 ug/ml에서거의항바이러스활성이나타나지않았고, 10,000 ug/ml 에서 17.9% 의바이러스증식억제능이확인되어 ( 표 2), 에코바이러스증식억제능은옥수수수염추출물이쇠뜨기추출물보다우수하였다. Echo virus 30에대한억제능분석 Vero 세포에대해각추출물의농도별 (100, 500, 1,000, 5,000, 10,000 ug/ml) 세포독성은옥수수수염추출물은 100 ug/ml에서 15.6% 와 500, 1,000, 5,000 및 10,000 ug/ml에서 44.9%, 48.6%, 46.8%, 49.7% 및 48.9% 를나타내었으며, 쇠뜨기추출물은시험한각농도에서 9.1%, 11.6%, 19.6%, 21.5%, 34.7% 및 51.4% 의세포독성을나타내어추출물농도의증가에따라세포독성도높았으며, 100~5,000 ug/ml에서는쇠뜨기추출물이옥수수수염추출물보다 vero 세포에대한독성이낮았다 ( 표 2). 바이러스증식억제능은옥수수수염추출물은 2,500 ug/ml 와 5.000 ug/ml에서 63% 의억제능을, 10,000 Influenza virus type A에대한억제능분석 MDCK 세포에대해각추출물의농도별 (250, 500, 1,000, 5,000, 10,000 ug/ml) 세포독성은옥수수수염추출물은 250~500 ug/ml에서 7% 미만의세포독성이확인되었으며, 1,000~10,000 ug/ml에서도 13% ~ 32.8% 의세포독성이확인되어 vero 세포보다는세포독성정도가낮았고, 쇠뜨기추출물은 250~5,000 ug/ml 에서는 8.2%~14.6% 의세포독성을, 10,000 ug/ml에서는 30% 의세포독성을나타내어 MDCK세포에대한세포독성정도는옥수수수염추출물과비슷하였다 ( 표 3). 바이러스증식억제능은옥수수수염추출물의경우인플루엔자 A/H1N1 2009에는 1,000 ug/ml 이하에서는

자생식물추출물의 MTT assay 를이용한항바이러스활성연구 13 Table 3. Cytotoxicity and Inhibition rates of methanol extracts of Zea mays (corn silk) and Equisefum arvense on Influenza virus type A in MDCK cells by MTT assay Extracts conc. (ug/ml) Cytotoxicity(%) Zea mays (corn silk) Equisefum arvense Zea mays (corn silk) Influenza virus A/H1N1 2009 Inhibition rate(%) Equisefum arvense Zea mays (corn silk) Influenza virus A/H3N2 Equisefum arvense 250 4.7 8.2-11.3-16.6 500 6.9 7.7-25.3-40.3 1,000 14.3 5.8 2.0 37.3 22.7 32.7 2,500 17.1 11.8 29.2 37.7 82.3 44.0 5,000 21.0 14.6 93.4 19.3 93.9-10,000 32.8 30.0 - - - - - : non inhibitory effect 바이러스억제능이거의확인되지않았으며, 5,000 ug/ml에서 93.4% 의바이러스억제능이확인되었다. 인플루엔자 A/H3N2에대해서는 250~500 ug/ml에서는바이러스억제능이확인되지않았으나, 2,500 ug/ml과 5,000 ug/ml에서각각 82.3% 와 93.9% 의바이러스증식억제능이확인되어 A/H1N1 2009보다다소낮은농도에서바이러스억제능이확인되었다 ( 표 3). 쇠뜨기추출물은 2,500 ug/ml에서인플루엔자 A/H1N1 2009는 37.7% 와인플루엔자 A/H3N2는 44.0% 로최고의억제능이확인되어, 인플루엔자바이러스증식억제능도옥수수수염추출물이쇠뜨기추출물보다우수하였다 ( 표 3). 식물추출물의인플루엔자바이러스에대한항바이러스효과에관한이전연구보고와비교해볼때 Park 등 14) 은모과와생강의열수추출물농도 390 ug/ml 와 195 mg/ml에서인플루엔자바이러스 A형에대하여강하게항바이러스효과가있다고보고하였고, Mariam 등 8) 은에티오피아약용식물 Euclea schimperi (Ebenaceae, 감나무과 ) 추출물이 6.22 ug/ml에서 influenza virus type A에대해억제능이있다고보고하여, 본연구의옥수수수염추출물이 5,000 ug/ml에서높은항바이러스효과가나타난것과달리낮은추출물농도에서항인플루엔자바이러스효과가확인되었다. Rym 등 15) 은잔나비걸상버섯수용성물질이 104 ug/ml 에서 vesicular stomatitis virus (VSV) 에대한항바이러스효과가가장높았다고보고하였고, Kwon 등 13) 은전통약용식물중초피나무, 구지뽕나무, 누리장나무의열수추출물 1,000 ug/ml에서돼지위장염바이러스 (TGEV) 에 90% 이상의바이러스억제효과를, 초피나무, 조각자나무, 마황의열수추출물은돼지유행성설사바이러스 (PEDV) 에대하여 50% 이상의항바이러스효과를나타낸다고보고하였다. 또한 herpes simplex virus (HSV) 에대한항바이러스효과를탐색한결과, Lee 등 16) 은 flavonoid 화합물중 naringenin 이 7.6 ug/ml에서항 HSV-1, hesperetin 이 22.2 ug/ml에서항 HSV-2에대한항바이러스효과가있다고보고하였고, Lee 등 17) 은알로에 (Aloe arborescens) 추출물이 HSV-1, measles virus, hantaan virus, VSV에대하여항바이러스효과가있다고보고하여, 성병및피부병변을유발하는 HSV-1, 2에대한항바이러스효과보유식물검색연구는많이보고되고있다. 이전의많은항바이러스효능검색연구보고에도불구하고항바이러스치료제로서상품화에성공한예는많지않다. 이는 in vitro에서세포배양을이용한항바이러스효능검색시험이숙주세포의다양성과세포배양환경요인이실험실마다다르고, in vivo 임상실험에서세포내절대기생체인바이러스의유전적변이, 표적숙주세포와의안전성평가등의요인으로인하여결과에차이가있기때문이라사료된다. 이는 in vitro의세포배양에서항바이러스효과를나타내는유효성분이추출물의농도, 추출방법등에따라 in vivo에서는활성이나타타지않을수있다는보고 18) 에서찾아볼수있다. 엔테로바이러스는분변에의해오염된강, 양식장등물환경에서오랫동안감염력입자로존재하며 19), 분변- 구강경로를통하여사람에게전파 20) 되어, 무증상감염에서감기, 수족구병등다양한증상을나타내지만치료제가없어대증요법으로치료하고있는실정이다. 이에본연구에서옥수수수염메탄올추출물이 10,000 ug/ml에

14 박은희 민상기 박연경 박소현 김남호 황수정 진성현 서 vero 세포에대해세포독성은 48.9% 이었지만, 항 ECV30 바이러스에대한효과가 89.5% 로비교적높게나타나항엔테로바이러스치료제개발을위한후보물질로서의연구가치가있다고사료된다. 또한 Snook 등 21) 은옥수수수염에 maysin이라는항생물질이 corn earthworm의생육을억제한다고보고하였고, 본연구에서도옥수수수염의메탄올추출물이인플루엔자바이러스 A형에대한항바이러스효과를나타내어, 향후옥수수수염메탄올추출물의에코및인플루엔자바이러스증식억제능을나타내는유효성분물질정제및항바이러스활성성분의바이러스에대한작용기작규명과이들물질의다른바이러스에대한활성시험등이수행되어야할것으로사료된다. 요약부산지역의자생식물 7종의메탄올추출물로부터 MTT assay로 vero 및 MDCK 세포를사용하여에코바이러스와인플루엔자바이러스에대한세포독성및항바이러스효능을검색하였다. 7종의자생식물메탄올추출물 1,000 ug/ml 농도에서옥수수수염및쇠뜨기추출물이 50% cytotoxic dose 미만의세포독성을나타내었다. 항바이러스효과는에코바이러스에대해서각각의추출물농도 10,000 ug/ml에서옥수수수염은 89.5%, 쇠뜨기는 17.9% 의바이러스증식억제능이확인되었다. 인플루엔자바이러스에대해서는옥수수수염추출물이 5,000 ug/ml에서인플루엔자 A/H1N1(2009) 에 93.4%, 인플루엔자 A/H3N2에 93.9% 바이러스억제능을나타내었으며, 쇠뜨기추출물은 2,500 ug/ml에서인플루엔자 A/H1N1(2009) 에 37.7%, 인플루엔자 A/H3N2에 44.0% 의바이러스억제능을나타내었다. 참고문헌 1. Yoon, J. C., J. J. Cho, S. M. Yoo, and Y. M. Ha., Antiviral activity of ascorbic acid against herpes simplex virus. J. Korean Soc. Microbiol. 35, pp.1~8(2000). 2. Kim, H. K., E. J. Kang, B. J. Kang, K. J. Park, and B. S. Ko., Isolation of anti-herpes simplex virus type 1 component from Thujae orintalis semen. Kor. J. Pharmacogn. 29, pp.277~282 (1998). 3. McCutcheon, A. R., T. E. Roberts, E. Gibbons, S. M. Ellis, L. A. Babiuk, R. E. W. Hancock, and G. H. N. Towers., Antiviral screening of British Columbian medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology 49, pp.101~110(1995). 4. Goncalves, J. L. S., R. C. Lopes, D. B. Oliveira, S. S. Costa, M. M. F. S. Miranda, M.T. V. Romanos, N. S. O. Santos, and M. D. Wigg., In vitro anti-rotavirus activity of some medicinal plants used in Brazil against diarrhea. Journal of Ethnopharmacology 99, pp.403~407(2005). 5. Paredes. A., M. Hasegawa, F. Prieto, J. Mendez, M. Rodriguez, and M. R. ortega., Biological activity of Guatteria cardoniana fractions. Journal of Ethnopharmacology 78, pp.129~132 (2001). 6. Biological research information center. http://bric.postech.ac.kr/webzine. 7. Kim, K. A., J. Y. Lee, W. K. Kim, Y. Kim, Y. K. Park, and C. Kang., Amantadine and zanamivir resistance of Influenza A/H3N2 viruses isolated in Korea, 2002/03~2003/04. Journal of Bacteriology and Virology. 38, pp.127~137(2008). 8. Mariam, T. G., R. Neubert, P. C. Schmidt, P. Wutzler, and M. Schmidtke., Antiviral activities of some Ethiopian medicinal plants used for the treatment of dermatological disorders. Journal of Ethnopharmacology 104, pp.182~187(2006). 9. 질병관리본부. 감염병실험실진단질환별시험법Ⅱ. pp. pp.650-651(2005). 10. Kurokawa, M., H. Ohyama, T. Hozumi, T. Namba, M. Nakano, and K. Shiraki., Assay for antiviral activity of herbal extracts using their absorbed sera. Chem. pharm. Bull. 44, pp.1270~1272(1996). 11. Lee, J. S., J. G. Nam, H. R. Lee, Y. J. Lee and Y. O. Shin, Evaluation of anti- human immunodeficiency virus compounds by MYY [3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl

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