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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(3): 109-113 (2015) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2015.30.3.109 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 연구논문 프로바이오틱스의동결보호및장관안정성개선을위한첨가제효과분석 정은지 1, 문대원 1, 오준석 1, 문진석 2, 김광엽 2, 최혜선 3, 한남수 2 * Analysis of Ingredient Mixtures for Cryoprotection and Gastrointestinal Stability of Probiotics Eun Ji Jeong 1, Dae Won Moon 1, Joon Suk Oh 1, Jin Seok Moon 2, Kwang Yup Kim 2, Hye Sun Choi 3, and Nam Soo Han 2 * Received: 21 March 2015 / Revised: 12 May 2015 / Accepted: 26 May 2015 2015 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: Current drying and encapsulation methods for probiotics manufacturing are complicate and cost-burdened processes. The aim of this study was to develop a simple ingredient mixture to make probiotic granules via one-step process, providing not only a cryoprotective effect during freezing and drying but also high survival ratio in gastrointestinal tract. As cryoprotectans, commercially available ingredients including skim milk, monosaccharide (trehalose or glycerin), maltodextrins (with low or high degree of equivalents) were used. Their cryoprotective effect during lyophilization and survival ratios in artificial gastric juice and bile salt were measured against 3 strains of lactic acid bacteria (LAB) (Lactobacillus plantarum, Lb. brevis, and Lactococcus lactis). As results, 3 mixtures with different compositions showed a cryprotective effect on LAB tested and the best compostion was dependant upon LAB; skim milk 10%, trehalose 15%, glycerin 0.5%, and 1 주식회사토비코 1 TOBICO Inc., # 4104 Beonyounggwan, Chungnam TechnoPark, 136 Jiksan-ro, Jiksan-eup, Seobuk-gu, Cheonan 331-858, Korea 2 충북대학교식품생명공학과 2 Department of Food Science and Biotechnology, Chungbuk National University, Cheongju 361-763, Korea Tel:+82-43-261-2567, Fax: +82-43-271-4412 e-mail: namsoo@cbnu.ac.kr 3 농촌진흥청국립농업과학원 3 Department of Agrofood Resources, NAAS, RDA, Wanju 565-850, Korea NaCl 1% was for Lb. plantarum and Lc. lactis, and maltodextrin 10% instead of skim milk was for Lb. brevis. In addition, those mixtures showed similar survival effect on LAB tested. These results demonstrate that skim milk or maltodextrins with trehalose, glycerin, and NACl can be effectively used for onestep lyophilization of LAB as an alternative method of encapsulation. Keywords: Probiotics, Lactic acid bacteria, Acid tolerance, Bile resistance, Cryoprotectant agents, freeze drying 1. INTRODUCTION 현재식품의약품안전처가분석한 2013 년건강기능식품생산실적 에따르면국내프로바이오틱스는 2012 년대비생산액이 55% 증가하였고, 이는유산균과장내면역, 장내미생물의중요성에대한소비자의인식이높아진데따른다 [1]. 프로바이오틱스란 체내에들어가서건강에좋은효과를주는살아있는균 으로정의되며, 유익한유산균증식, 유해균억제또는배변활동원활에도움을준다. 유산균을비롯한세균들이프로바이오틱스로인정받기위해서는위산과담즙산에서살아남아소장까지도달한후, 장에서증식하고정착하여장관내에서유용한효과를나타내어야한다 [2]. 그러므로프로바이오틱스로서유산균이갖추어야할중요한특성이가공과정과섭취후장내에서생존력이높아야한다는점이다 [3]. 균체를저장하는방법인동결건조는미생물을

110 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(3): 109-113 (2015) 효과적으로장기보존할수있는방법으로오염방지, 저장, 수송, 경제성등장점이있는반면동결건조과정에서균체가손상을받아생존율이크게감소할수있다 [4-6]. 따라서동결건조시세포손상을보호하기위하여동결보호제 (cryoprotectant agents) 를흔히사용하는데, 이는미생물의종류에따라그리고보호제의성분에따라서로다른영향을미칠수도있다 [7]. 그러므로동결건조과정중에서의생존과동결건조후장기간보존을위해서는그미생물의종류및특성에맞는적절한동결보호제의사용이필요하다. 유산균이살아있는상태로대장에도달하기위해서는염산이존재하는위와담즙이분비되는소장을통과하여야하며, 이때대부분의미생물은사멸하거나원래갖고있던활성이저하된다 [8,9]. 따라서, 프로바이오틱스의장내정착률을향상시키기위하여위산과담즙의세포손상을감소시키기위한조치가균체생산과정에서추가로필요하다 [9]. 이를위해대부분의프로바이오틱스제품은유산균을동결건조한분말형태로코팅하거나식물성캡슐에담는형태가많다. 프로바이오틱스건조균주를코팅또는캡슐화하기위한최근연구에따르면, 대부분동결건조와코팅으로구분되는 2단계이상의다단공정을제안하고있다 [10-13]. 하지만, 이러한다단공정은높은생존율을제공하는반면, 실제생산현장에적용될때에공정이복잡하고다량의첨가제들이소요되는문제점이있다. 또한, 이러한다단공정에서프로바이오틱스의높은생존율을유지하기위해서는매우엄격한공정관리기술이함께확립되어야한다. 한편, 사료용과같은프로바이오틱스상품의경우에는비용과효율을함께고려하여, 최소한의첨가물을이용하여최소단계로생산하는공정의개발이필요하다. 이를위해첨가물의조성을결정할때, 유산균의동결보호효과와장내환경생존효과를모두조사하는것이필요하다. 따라서, 본연구에서는서로다른프로바이오틱스유산균을대상으로동결건조시위장과소장환경에서높은생존율을보이는동결보호첨가제의조성을찾고자하였다. 이를위해, 전통발효식품에서선발된 3종유산균 (Lactobacillus plantarum JSA22, Lactobacillus brevis JSB22, Lactococcus lactis I13) 에대하여, 냉동및건조시단백질변성방지효과및흡습성이낮은trehalose를기반으로기존산업체에서주로사용하는다당류및단백질성분들로동결건조과정과인체내의소화환경에서의유산균의활성실험을수행하였다. 성된보관액에혼합하여 -80 C 초저온냉동고에서보관하였으며, 멸균된 MRS 배지 (Difco, USA) 에접종하여 37 C 배양기에서 24 시간배양하였고 3 회이상계대배양을거친균주를실험에사용하였다. 2.2. 동결보호제첨가및동결건조동결보호제의재료는모두식품원료인 skim milk (Seoulmilk, Korea), maltodextrin (dextrose equivalent, DE 14~19, Daesang, Korea), low DE maltodextrin (DE 10~12, Daesang, Korea), trehalose (Samyang genex, Korea), glycerin (LG H&H, Korea), NaCl (Young Jin Green Foods, Korea) 을사용하였다. 3회이상계대배양을거친균주를MRS medium에접종하여 37 C 배양기에서 24시간배양한후, 배양액을원심분리기 (DHC-250A, Hanil, Korea) 로분리하여균체를회수하였다. 회수된균체는다양한조성의동결보호제를각균주에 1:1로혼합한뒤샘플링하여생균수를측정하였다. -80 C 초저온냉동고 (DF8517, Ilshinlab., Korea) 에서 12시간동결후, 동결건조기 (FD8508, Ilshinlab., Korea) 로실온 (25~29 C) 에서응축기온도 -80 C, 압력 5 mmtorr 이하의조건에서 72시간건조하고생균수를측정하였다. 동결보호제조성은 Table 1과같다. 동결건조된균체는분쇄하여분말화시킨다음 4 C 냉장보관하여실험에사용하였다. 2.3. 인공위액저항성체내소화관조건과유사한환경에서측정하기위하여인공위액내성실험을실시하였다. Kobayashi 등 [8,14] 의방법을변형하여 1N HCl 로 ph 2.1 으로조정한 Lactobacilli MRS broth (Difco, USA) 에 pepsin (Sigma, USA) 을 1,000 unit/ml 가되도록첨가하여인공위액을조제하였다. 인공위액 9 ml 에각각의동결건조된균주를 1 g 씩넣고 0 시간과 2 시간경과후, 샘플링하여멸균생리식염수로단계별로희석하고 Lactobacilli MRS Agar medium (Difco, USA) 에도말하였다. 2. MATERIALS AND METHOD 2.1. 사용균주및생장배지본연구에서사용된균주는국립농업과학원발효이용과에서분양받은 Lactobacillus plantarum JSA22 (KACC91973P), Lactobacillus brevis JSB22 (KACC91760P) 그리고 Lactococcus lactis I13 균주를사용하였다. 상기균주들은보존을위하여균배양액을 10% skim milk 와 10% glycerin (w/v) 로조 Fig. 1. Survival rate of freeze dried lactic acid bacteria. : Mixture 1 (Control), : Mixture 2 (skim milk), : Mixture 3 ( 저 DE Maltodextrin), : Mixture 4 (maltodextrin), JSA22: Lactobacillus plantarum, JSB22: Lactobacillus brevis, I13: Lactococcus lactis; 1) Within same figure, different letters indicate significant differences (p<0.05) at Duncan s multiple range test.

프로바이오틱스의동결보호및장관안정성개선을위한첨가제효과분석 111 그리고 37 C 배양기에서 24 시간배양한다음집락의수를측정하였다. 대조군은 Lactobacilli MRS broth (Difco, Detroit, MI, USA) 에서배양하여실험구와동일하게실험하였다. 2.4. 인공담즙액저항성모든인공담즙액은 Lactobacilli MRS broth (Difco, Detroit, MI, USA) 에 0.45 µm filter 로여과한 oxgall (Difco, USA) 용액을 0.3% 첨가하여제조하였다 [15,16]. 인공담즙액 9 ml 에각각의동결건조된균주를 1g 씩넣고, 0 시간과 2 시간경과후, 샘플링하여멸균생리식염수로단계희석하고 Lactobacilli MRS Agar medium (Difco, USA) 에도말하여 37 C 배양기에서 24 시간배양한다음집락의수를측정하였다. 대조군은 Lactobacilli MRS broth (Difco, Detroit, MI, USA) 에서배양하여실험구와동일하게실험하였다. 2.5. 통계분석통계분석은 SPSS (Statistical Package for the Social Science, Ver 12.0, SPSS Inc., Chicago, USA) program 을이용하여각측정군의평균과표준편차를산출하였으며분산분석을실시한후 Duncan 의다중검정을실시하였다. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 동결건조보호효과동결건조는유산균을가장효과적으로보존할수있는방법이지만, 동결건조시동해 ( 凍凍 ) 로인한세포손상이일어나게된다. 이를경감할목적으로, 식품산업에서흔히사용하는단백질, 다당, 올리고당, 단당성분들로동결보호제를제조하고이들을각각처리하여동결건조하였다 (Table 1). 동결건조후생존율을비교한결과, 각각의대조구와실험구간유의적차이가나타났다 (p<0.05). 세가지유산균모두보호제를첨가한경우에서첨가하지않은대조구에비해높은생존율을보였다. 특히, Lb. plantarum JSA22 는동결보호제를첨가하지않은 1 번조성보다, skim milk 10%, trehalose 15%, glycerin 0.5%, NaCl 1% 로구성된 2 번조성에서유의한증가가크게나타났다. 또한, Lb. brevis JSB22 는동결보호제를첨가한 2, 4 번조성에서높은생존율나타냈으며, 특히 maltodextrin 을첨가한 4 번조성은가장큰유의적차이를보였다. 반면, Lc. lactis I13 은 skim milk 를주로포함하는 2 번조성에서가장효과가높은생존율을보였다. 특히, 본균주는자체생존율이다른균주에비해동해에높은저항력이있는것으 로판단되며, 이는생장과함께생성되는대사물질중다당류등이원심분리시균체와함께침적되어균체를포집및포괄하는작용을한것으로판단된다 [17]. 본실험에서동결보호제의첨가유무와종류에따라그영향을살펴본결과, 동결건조전과후생존율은균주에따라그리고동결보호제조성에따라차이가있었다. Lb. plantarum JSA22 와 Lc. lactis I13 은 skim milk 포함동결보호제가높은유의적차이를보였고, Lb. brevis JSB22 의경우에는 maltodextrin 포함동결보호제조성에서높은생존율을보였다. 특히, Lb. brevis JSB22 경우동결건조시심각한세포손상이수반되므로반드시동결보호제의첨가가필요하다고판단된다. 3.2. 인공위액저항성유산균 3 종을인공위액에서 2 시간처리한결과를 Fig. 2 에나타내었다. Lb. plantarum JSA22 의경우동결보호제를처리한 2, 3, 4 번조성이동결보호제를넣지않은 1 번조성보다비교적높은균수 (10 9 ~10 10 CFU/mL) 를나타내었다 (Fig. 2- A). 특히동결보호제를처리하지않은 1 번조성과비교하였을때 2, 4 번조성은유의적차이가있었다. Lb. brevis JSB22 도동결보호제를첨가하지않은 1 번조성에대해동결보호제를첨가한 2, 4 번조성이유의적차이를보였다 (Fig. 2-B). Lc. lactis I13 역시동결보호제를첨가한모든조성에서유의적차이를보였으며, 특히 2, 4 번조성에서유의적효과가보다높았다. 결론적으로, 3 균주모두동결보호제를처리하지않았을때보다동결보호제를처리시인공위액에대한내성을보였다. 특히 Lb. plantarum JSA22, Lc. lactis I13 의경우 10% skim milk, 15% trehalose, 0.5% glycerin, 1% NaCl 조성의동결보호제가생균수 10 9 ~10 10 CFU/mL 을유지하여가장높은생존율을보였다. 3.3. 인공담즙액저항성동결보호제조성별동결건조균체에 0.3% oxgall 을함유한인공담즙액에각각 2 시간처리한결과, 4 가지조성모두생균수 10 10 CFU/mL 이상으로유의한차이를나타내어인공담즙에대한저항성을보였다 (Fig. 3). Lb. plantarum JSA22 의경우 2, 3, 4 번조성이동결보호제를첨가하지않은 1 번조성보다유의적효과를보였다. Lb. brevis JSB22 는동결보호제를넣지않은 1 번조성에비해 2, 3, 4 번조성은모두유의적차이를보였고, Lc. lactis I13 의경우도 3, 4 번조성이 1 번조성과는다른유의적차이가나타나높은생존율을보였다. 요약하면, 본실험에사용한 3 개균주모두공통적으로인공 Table 1. Composition of cryoprotectant mixtures Mixture number 1 2 3 4 Skim milk 10% Low DE maltodextrin 10% Maltodextrin 10% Composition Control Trehalose 15% Trehalose 15% Trehalose 15% Glycerin 0.5% Glycerin 0.5% Glycerin 0.5% NaCl 1% NaCl 1% NaCl 1%

112 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(3): 109-113 (2015) Fig. 2. Survival rate of lactic acid bacteria in artificial gastric acid. : 0 hr, : 2 hr, : survival rate; A: Lactobacillus plantarum JSA22, B: Lactobacillus brevis JSB22, C: Lactococcus lactis I13; 1) Within same figure, different letters indicate significant differences (p<0.05) at Duncan s multiple range test. Fig. 3. Survival rate of lactic acid bacteria in artificial bile juice. : 0 hr, : 2 hr : survival rate; A: Lactobacillus plantarum JSA22, B: Lactobacillus brevis JSB22, C: Lactococcus lactis I13; 1) Within same figure, different letters indicate significant differences (p<0.05) at Duncan s multiple range test. 담즙산에대해일정수준의저항성을갖고있었으며, 첨가한동결보호제에의해그저항성이더향상되었다. 4. CONCLUSION 본연구에서는 3 가지유산균균주를프로바이오틱스분말상품으로제조하기위해몇가지첨가물조성에대해동결보호및장관내안정성향상효과를조사하였다. 종래연구된마이크로캡슐화코팅 [10] 은알지네이트나검류등을첨가하는추가공정이필요하여, 소규모생산라인에적용하기에는시간소요와비용상승의부담이있었다. 또한기존동결보호제연구들은동해방지효과를주로조사하였으나, 본연구에서는동결보호효과와함께각각의유산균의위산과담즙산에 대한내성향상효과도함께분석하였다. 본실험을위해동결보호제를첨가하지않은균주와각기다른동결보호제조성 3 가지를제조하여각각의균주에처리하여동결건조한후, SPSS Program 을이용하여통계처리한결과, 동결건조전과후생존율은 Lb. plantarum JSA22 과 Lc. lactis I13 경우 skim milk 10%, trehalose 15%, glycerin 0.5%, NaCl 1% 조성동결보호제에서유의적차이를보였다. 또한, Lb. brevis JSB22 는동결보호제의첨가가큰영향력을나타냈으며, maltodextrin 10%, trehalose 15%, glycerin 0.5%, NaCl 1% 조성에서가장큰유의적차이를보였다. 결과적으로 3 균주모두동결보호제를첨가하지않았을때보다동결보호제를첨가했을때, 동결건조후에생존율이높았다. 또한인공위액저항성을알아보기위해동결건조후의유산균을인공위액에서 2 시간배양하였다. 그결과 3 균주모두동결보호제

프로바이오틱스의동결보호및장관안정성개선을위한첨가제효과분석 113 를첨가한조성이동결보호제를첨가하지않은조성에비해높은유의적효과를보였다. 특히, Lc. lactis I13 의경우 maltodextrin 을 10% 첨가한동결보호제와 10% skim milk 를첨가한동결보호제에서유의한효과를보였으며, 나머지 2 균주는 10% skim milk 를첨가한동결보호제가효과가있었다. 인공담즙액에대한저항성의경우도동결보호제를첨가하지않은조성보다동결보호제를첨가한조성이유의적차이를보이며, 생존율과 10 10 CFU/mL 이상의높은균수를나타내었다. 이와같이동결보호제를첨가하였을때동결및위액과담즙액에대한보호효과가향상되었으며, 그효과는유산균에따라최적동결보호제조성이각각달랐다. 본실험에서사용한동결보호제조성을각종프로바이오틱스생산에적용한다면, 유산균이위장과소장에서생존하여보다많은균체가대장으로이동할수있을것으로기대된다. 또한, 본연구는기존연구되었던복잡한다단계코팅기술보다간편하면서동시에높은유산균생존효과를제공하여다양한프로바이오틱스제품제조에적용가능할것으로판단된다. Acknowledgements 본연구는농촌진흥청농업과학기술개발공동연구사업으로국립농업과학원농업기술연구개발사업과제 (PJ907153030 52013) 의지원에의한연구결과이며, 이에감사드립니다. REFERENCES 1. The Korea Food and Drug Administration, Available from: http:// www.mfds.go.kr/index.do?mid=675&seq=24741&cmd=v. (2014). 2. The Korea Food and Drug Administration, Available from: http:// www.foodnara.go.kr/hfoodi. (2014). 3. FULLER, Ray (ed.). (2012) Probiotics: the scientific basis. pp. 111-144. Springer Science & Business Media, London. 4. Heckley, R. J. (1978) Preservation of microorganisms. Adv. Appl. Microbiol. 24: 15-28. 5. Morich, T. (1973) Lactic acid bacteria in animal industry. Japanese J. Zootech. Sci. 44: 535-553. 6. Deman, J. C., M. Rogosa, and M. E. Shape (1960) A medium for the cultivation of lactobacilli. J. Appl. Bacteriol. 23: 130. 7. Heckley, R. J. (1961) Preservation of bacteria by lyophilization. Adv. Appl. Microbiol. 3: 1-28. 8. Yun, H. J., Y. J. Lee, S. H. Yeo, H. Y. Park, H. D. Park, S. Y. Baek (2013) Isolation and characterization of exopolysaccharide producing lactic acid bacteria from Korean soy sauce and soybean paste. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 41: 190-197. 9. Hood, S. K. and E. A. Zittola (1998) Effect of low ph on the ability of Lactobacillus acidophilus to survive and adhere to human intestinal cells. J. Food Sci. 53: 1514-1516. 10. Kwak, H. S. and A. Feucht (2013) Microencapsulation of lactic acid bacteria. Korean J. Food Sci. An. 33: 229-238. 11. Burgain, J., C. Gaiani, M. Linder, and J. Scher (2011) Encapsulation of probiotic living cells: From laboratory scale to industrial applications. J. Food Eng. 104: 467-483. 12. Heidebach, T., P. Forst, and U. Kulozik (2010) Influence of caseinbased microencapsulation on freeze-drying and storage of probiotic cells. J. Food Eng. 98: 309-316. 13. Cook, M. T., G. Tzortzis, D. Charalampopoulos, and V. V. Khutoryanskiy (2014) Microencapsulation of a synbiotic into PLGA/ alginate multiparticulate gels. Int. J. Pharm. 466: 400-408. 14. Kobayashi, Y., K. Tohyamat, and T. Terashima (1974) Biological characteristics of Lactobacillus Tolerance of the multiple antibiotic resistance strain, L. casei PSR3002, to artificial digestive fluids. Nihon Saikingaku Zasshi 29: 691-697. 15. Shin, M. S., J. J. Lee, S. H. Na, H. S. Bae, C. S. Huh, and Y. J. Baek (1998) Characteristics of Bifidobacterium spp. Isolated from korean faces for probiotics. Korean J. Dairy Sci. 20: 273-282. 16. Paik, H. D., M. Y. Jung, W. S. Kim, and K. T. Kim (2002) Characterization of bacillus polyfermenticus SCD for oral bacteriotherapy of gastrointestinal disorders. Korean J. Food Sci. Technol. 34: 73-78. 17. Cell biotech Co., Ltd. (2011) Lactic acid bacteria having multi-coting layers and preparing method thereof. Korea Patent, 10-2011- 0093074.