Journal of Bacteriology and Virology 2013. Vol. 43, No. 2 p.120 130 http://dx.doi.org/10.4167/jbv.2013.43.2.120 Original Article The Synergistic Effects of Antimicrobial Peptides on the Growth Inhibition of Salmonella Typhimurium through Imd Pathway in Drosophila Intestine Yun-Ji Lim, Yea-Hyeon Jo, Hwa-Jung Kim and Jeong-Kyu Park * Department of Microbiology, Cancer Research Institute, College of Medicine, Chungnam National University, Daejeon, Korea Some Bacillus species present in fermented foods are regarded as probiotics because of their ability to modulate the prevention of some intestinal infections and the modulation of the inflammatory immune response. We isolated bacteriocin-like substances producing Bacillus subtilis and B. lentus from Cheonggukjang, a traditional Korean fermented soybean paste having an inhibitory effect against Salmonella Typhimurium using a well diffusion inhibition assay and a broth co-culturing method. B. subtilis or B. letus was fed to Drosophila melanogaster alone as well as in combination with Salmonella Typhimurium and survival was monitored daily. The survival rates by oral feeding B. subtilis, B. lentus and Salmonella Typhimurium separately resulted in 85, 90 and 75%, respectively. In contrast, survival rates of co-feeding of B. lentus with Salmonella Typhimurium were increased from 75 to 90% during 7 days post-feeding as compared to Salmonella Typhimurium alone. However, B. subtilis in co-feeding with Salmonella Typhimurium significantly reduced D. melanogaster survival rate (85 to 70%). We found that the immune response to B. lentus and Salmonella Typhimurium is characterized synergistic activation of antimicrobial peptide gene expression by Imd pathway. In conclusion, the in vitro and natural-route infection of the D. melanogaster digestive system can result in the use of the probiotic B. lentus for effective treatment of Salmonella Typhimurium infection. We therefore propose the strain B. lentus as a suitable candidate probiotics for use in the prevention and treatment of the intestinal infections caused by Salmonella Typhimurium. Key Words: Antimicrobial peptide, B. lentus, Salmonella Typhimurium, Drosophila melanogaster 서론살모넬라증 (salmonellosis) 은오염된음식물과음료수섭취로감염된다. 우리나라에서는장염형이 90% 이상이며대표적인원인균은 Salmonella enterica serotype Typhimurium (Salmonella Typhimurium) 과 Salmonella enterica serotype Enteritidis (Salmonella Enteritidis) 이다. 우리나라 에서분리되는대부분의 Salmonella Enteritidis는다제내성균이없지만 Salmonella Typhimurium은 50% 이상이 ampicillin, chloramphenicol, sulfonamide, tetracycline 등의항생제에다제내성을보인다 (1). 원인으로 Salmonella Typhimurium에오염된고기, 우유제품등을통하여사람이감염되는데최근가축사료에항생물질을사용하는것이원인의일부로추정되고있다. 그러므로다제내성 Salmonella Typhimurium에대한대체치료법개발이요구 Received: March 19, 2013/ Revised: May 21, 2013/ Accepted: May 23, 2013 * Corresponding author: Jeong-Kyu Park, M.D. & Ph.D. Department of Microbiology, College of Medicine, Chungnam National University, Daejeon 301-747, Korea. Phone: +82-42-580-8244, Fax: +82-42-585-3686, e-mail: jekpark@cnu.ac.kr ** This research was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education, Science and Technology (NRF-2010-0013298). CC This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/license/by-nc/3.0/). 120
AMPs on the Growth Inhibition of Salmonella Typhimurium in Drosophila 121 되고있다. 프로바이오틱스 (probiotics) 는기존항생물질을대체할수있는기대가되는대체치료법이다. 프로바이오틱스는적절한균수를복용하였을때숙주의건강에유익을주는살아있는미생물로정의되고있다. 프로바이오틱스는 Lactobacilli와 Bifidobacteria를포함한유산균 (lactic acid bacteria, LAB) 과 Bacillus species, yeasts가이용되며, 항미생물펩티드 (antimicrobial peptide, AMP) 를생산하여다른균의성장을억제하는기능이있다 (2, 3). 이들이전통적으로유럽에서는요구르트 (yoghurt), 치즈 (cheeses) 와같은발효유제품에서우리나라에서는김치, 된장및청국장과같은발효식품으로부터섭취되어왔다 (4). 우리나라김치에서는 Lactobacillus species, Leuconostoc species, Weissella species 등이분리되며, 그이외에 B. licheniformis, B. pumilus 등이분리배양되었다 (5, 6) 고한다. 된장에서는 Leuconostoc mesenteroide, Tetragenococcus halophilus, Enterococcus faecium, B. subtilis, B. licheniformis 등의발효균과 Mucor plumbeus, Aspergillus oryzae, Deberyomyces hansenii 등의진균이분리되었으며 (7), 청국장에서는 B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. polyfermenticus, B. thuringiensis 등이분리배양되었다 (8) 고한다. 외국에서 B. subtillis는바닐라, 커피, 코코아등의향을증진시키기위하여발효식품의생산에사용되어왔다 (9). 또한 B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. pumilus 및 B. subtilis 등은포도, 배등의식물조직에서도흔히분리되며식물의보호나성장증진에매우중요한것으로알려져있다 (10). 아포를형성하는 Bacillus species는열, 건조, 살균제에도견딜수있어토양, 진흙, 바위, 채소, 식품등과같은다양한환경에서발견된다. 또한식품의조리과정과소화과정에영향을받지않기때문에동물의소화기계에집락을형성할수있는장점을가지고있어프로바이오틱스로서유용성이제기되어왔다 (11). B. subtilis는마우스에장염을일으키는 Citrobacter rodentium에의한장염발생을막을수있었으며 (12), B. licheniformis를프로바이오틱스로서사용했을때닭의장내점막면역의균형을유지하며장융모구조의회복에도움을주는것으로알려졌다 (13). 칠면조를대상으로수행한연구에서 B. subtilis 와 B. licheniformis는 Salmonella Typhimurium의장관균집락형성을유의하게감소시켰다 (14) 고한다. 최근 B. licheniformis와 B. subtilis는프로바이오틱스로서안전하다 (15, 16) 고보고되었다. 따라서 B. subtilis와 B. licheniformis 는사람이나동물에모두이용할수있는매우유용한프로바이오틱스균주라고할수있다 (9). 프로바이틱스는균주 (strain) 마다특별한특성이있다. 균주마다숙주세포와직접반응하는표면발현분자, 분비단백질및대사산물들의특별한능력이다르기때문이다. 장내균무리의 1% 를구성하는 B. clausii는 CD4 + T 세포의증식을자극하고병원균의성장을억제하는박테리오신 (bacteriocin) 을생산한다. 박테리오신은항균펩티드로서동종또는동족균주를살균또는정균하는특성이있다. 그람양성박테리오신은종류가많고다양하지만다른그람양성균만을사멸하여항균범위가비교적좁다. 또한진핵세포에서생산되는항미생물펩티드와많은점에서유사하다. 전통적으로박테리오신생산은프로바이오틱스균주의선정에중요한요소로생각되어왔다 (17). In vitro에서세균과세균간의상호관계, 세균과숙주세포와의상호관계를연구할수있다. 그러나 in vivo에서는장내정상균무리와의관계, 숙주의면역반응, 순응도의문제, 윤리문제및고비용등으로프로바이오틱스와병원균과의상호관계를연구하는데장애가되고있다. 그러므로 in vivo에서세균과세균간의관계뿐만아니라숙주의면역반응을연구하기위한적합한연구모델이요구된다. 이러한연구모델로서초파리 (Drosophila melanogaster) 의이용이제시되었다 (18). 초파리는세균에의한장관상피세포손상을보호하는 chitinous matrix와같은물리적기구와장관의세균증식을일정하게유지하는데기여하는장관상피세포에서생산되는 ROS와 AMP와같은화학적기구를가지고있다. 세균감염에반응하여생산되는 AMP는 Toll과 immune deficiency (Imd) 신호경로를경유하여생산된다. Imd 경로는그람음성세균과 Bacillus species 감염에대한반응을조절하며, Diptericin과같은 AMP 유전자의발현을조절한다. Toll 경로는그람양성세균과진균감염에대한반응을조절하며, Drosomycin과같은유전자발현을유도한다. AttacinA, CecropinA 및 Defensin의유도는 Imd 또는 Toll 경로와또는두경로모두와관계가있다. 두경로모두의돌연변이주는미생물감염에대한감수성이증가한다. 이와같은두경로의상승작용은숙주의선천면역반응범위를확대시킬수있다. 또한두개의서로다른병원균인식신호의협동작용도숙주의선천면역반응범위를확대시킬수있다 (19).
122 YJ Lim, et al. 본연구자들은청국장에서유래된그람양성 B. subtilis 와 B. lentus가구멍확산억제시험 (well diffusion inhibition assay) 에서그람음성 Salmonella Typhimurium을사멸시키는현상을관찰할수있었다. 이어서액체배지를이용한동시배양법 (coculturing) 으로 Salmonella Typhimurium 의성장억제를확인하였으며, 초파리경구감염을이용한초파리의생존율, Salmonella Typhimurium의성장억제율및 AMP 발현유도등을실시하여 Bacillus species가 Salmonella Typhimurium에대한선천면역반응과의상승작용으로 Imd 경로의 AMP 생산을증가시켜 Salmonella Typhimurium의성장을억제시키는결과를얻을수있었다. 재료및방법 Bacillus species의분리배양및동정청국장 5 g을각각 20 ml의멸균된생리식염수에넣어균질화하고 3,000 rpm에서 5분동안원심분리하였다. 상층액을 13,000 rpm에서 5분간원심분리하고그침사를생리식염수 1 ml로부유하였다. Luria-Bertani (LB) 평판배지에선상도말한후 37 에서 24시간배양하였다. 집락을그람염색, 아포염색그리고무산소배양등으로산소아포형성그람양성막대균을확인하였다. 일차동정은 API 50 CHB (BioMerieux, Marcy I'Etiole, France) 로제조회사의사용법에따라실시하였다. 확인동정은 16S rrna 유전자염기서열분석으로하였다 (20). Bacillus species를배양하여 Genomic DNA Prep Kit (SolGent, Daejeon, Korea) 를사용하여 DNA를추출하였다. 추출된 DNA를주형으로사용하여 16S rrna 유전자의 PCR 증폭 (Biometra, Gottingen, Germany) 을시행하였다. 사용된 primer pair는순방향은 27F로역방향은 1492R을사용하였다. PCR 조건은 95 에서 2분간예열후에 95 (1분 ), 45 (1분 ), 72 (1.5분 ) 의순으로 30 cycle을시행하였으며 72 에서 10분간정치하였다. Agarose gel 전기영동으로 PCR 산물을확인하고 Agarose gel extraction kit (SolGent, Daejeon, Korea) 를사용하여 PCR 산물을정제하였다. 정제된 PCR 산물을 pgem-t Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA) 에넣어 E. coli DH5α competent cells을형질전환하였다. 재조합프라스미드를정제하여순방향 primer T7과역방향 primer SP6 를이용하여 ABI PRISM Dye Terminator Sequencing Kit와 ABI PRISM 377 Sequencer (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA) 를사용하여프라스미드의유전자서열을 Macrogen Corporation (Seoul, Korea) 에서수행하였다. 염기서열데이터의상동성검색은 BLAST (http://www.ddbj.nig.ac.jp/) 에접속하여수행하였다. 구멍확산억제시험 (Agar well diffusion inhibition assay) 배양된표적균주 (Salmonella Typhimurium) 를 10-4 으로희석하여 100 μl를 4 ml soft agar에넣고혼합하여 LB 평판배지에도말하여굳혔다. Pasteur pipette 손잡이부분으로구멍을뚫었다. LB 액체배지에서 72시간배양된시험균주 (Bacillus species) 를각구멍에 40 μl씩넣고배양기에일정시간정치한후배양하였다. 배양 24시간후에표적균주성장억제지역의직경을측정하였다. 동시배양에의한 Salmonella Typhimurium의성장억제 Lavermicocca P 등 (21) 의방법을약간수정하여동시배양에의한병원균의성장억제를조사하였다. 각 Bacillus species를 LB 액체배지에서 72시간배양하여 LB 액체배지로 1 10 8 CFU/ml를준비하였다. Salmonella Typhimurium도 LB 액체배지에 24시간배양하여동일한방법으로준비하였다. 준비된 Bacillus species 균액 400 μl 에 Salmonella Typhimurium 균액 20 μl를혼합하여 37 에서배양하였다. 1, 3, 5 및 7일간격으로 20 μl를각각취하여생리식염수로 10배씩순차적으로희석하여희석액을만들었다. 각희석액 20 μl를 MacConkey 우무평판배지위에떨어뜨리고 37 에서 18시간배양한후집락수를측정하였다. Bacillus는 MacConkey 우무평판배지위에서집락을형성을하지못하는것을이용하여 Salmonella Typhimurium의집락수를측정하였다. 초파리경구감염에서 Bacillus species가초파리생존율에미치는영향성인암컷초파리를분리하여 3시간을굶겨준비하였다. LB 우무평판배지에배양한 Bacillus species와 Salmonella Typhimurium을각각 OD600 = 0.2 (5% sucrose in LB broth) 로맞춰서준비하였다. 3 M paper 2.5 3.5 cm 2 에 500 μl 씩적셔서배양시험관벽에붙여넣었다. 성인암컷초파리 20마리씩을이시험관에옮겨 24시간빨아먹게하였다. 그리고초파리를새로운 corn meal agar가든시험관에옮겼다. 3일마다새로운배지의시험관에옮기면서
AMPs on the Growth Inhibition of Salmonella Typhimurium in Drosophila 123 9일동안매일생존율을조사하였다. 초파리경구감염에서 Bacillus species가 Salmonella Typhimurium 의성장억제에미치는영향위에서와같이 Bacillus species를경구감염시킨 24시간후에 Salmonella Typhimurium을같은방법으로경구감염시켰다. 새로운 corn meal agar가든시험관에옮기고 3일마다새로운배지의시험관에옮기면서 1, 2, 3, 5 및 7일동안초파리몸통을취하여생리식염수를넣어분쇄하였다. 이를 MacConkey 우무평판배지위에배양하여 Salmonella Typhimurium의균수를측정하였다. 초파리경구감염에서 Bacillus species가 AMP 발현에미치는영향초파리장관으로부터 total RNA의분리초파리경구감염후 6, 24 및 48시간후에각각장관을분리하여 total RNA를 easy-bluetm Total RNA Extraction Kit (Intron, Seongnam, Korea) 를이용하여얻었다. 초파리마리당 1 ml의 easy-blue 용액으로완전히용해한후, 200 μl의 chloroform 용액을가하여혼합하였다. 4, 13,000 rpm에서 10분간원심분리하였다. 400 μl의상층액을분리하여새로운 1.5 ml eppendorf tube로옮기고 400 μl의 isopropanol을가하여상온에서 10분간방치하였다. 다시 4, 13,000 rpm에서 5분간원심분리후, 상층액을제거하고얻은 RNA pellet을 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 가포함된 500 μl의 75% ethanol 로세척하였다. 4, 10,000 rpm에서 5분간원심분리한후, 상층액을제거하고얻은 RNA pellet을건조시켜 40 μl의 RNase free water로용해하였다. Primer DNA 준비초파리에서분리된 total RNA의중합연쇄반응에사용된 oligonucleotide primer들은 Bioneer (Daejeon, Korea) 사에서주문합성하여사용하였다. 중합효소연쇄반응에의한 AMP의 mrna 발현분석 Total RNA는역전사반응에의하여 cdna를만들어주형으로사용하고적절한 primer 에의해표적유전자를증폭시켰다. Reverse Transcription Premix (5X, ELPis) 를이용하여총반응액이 50 μl가되도록 nuclease free water를가한후 42 에서 1시간, 94 에서 5분반응하여 cdna 를얻었다. cdna 중 1 μl를취하여 Prime Taq Premix (2X, GENET Bio) 를이용해중합효소연쇄반응을시행함으로써 cdna 증폭반응을실시하였다. 전기영동에의한 PCR 산물의검색 PCR이끝난후증폭된 PCR 산물을 5 μl 취하여 1 μg/ ml의 ethidium bromide가포함된 1.2% agarose gel에 0.5% Tris Acetate EDTA (TAE) buffer 상에서 100 V로 20분동안전기영동을수행하였다. 이동한 DNA 띠의위치를자외선투사기상에서관찰하였다. Standard marker로는 ELPis biotech 사에서제조한 100 bp DNA ladder marker를사용하였다. 결과 Salmonella Typhimurium 성장억제활성이있는 Bacillus species의분리배양우리나라청국장에서 B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. licheniformis, B. smithii 및 B. subtilis 등이분리배양되었다. 이들중에 Salmonella Typhimurium의성장억제기능이있는균을알아보기위하여 Agar well diffusion inhibition assay를실시하였다. Fig. 1에서와같이 well의직경이 5 mm이었는데 B. subtilis (1800) 는 12 mm, B. lentus (1900) 는 16 mm, 또다른 B. lentus (2720) 는 12 mm의투명억제대를관찰할수있었다. 이결과에따라 B. subtilis와 B. lentus를 Salmonella Typhimurium의성장억제활성이있는균으로결정하였다. 액체배지에서혼합배양으로 Bacillus species에의한 Salmonella Typhimurium 의성장억제 B. subtilis와 B. lentus를 72시간그리고 Salmonella Typhimurium은 24시간액체배양하여동량을혼합배양하였다. B. subtilis와 B. lentus가 MacConkey 우무평판배지위에서집락형성을하지못하는것을이용하여 Salmonella Typhimurium의집락수를측정하였다 (Fig. 2). 배양 24시간에 Salmonella Typhimurium만배양한경우대조군 Salmonella Typhimurium의균집락수는 9 10 8, B. subtilis 와 Salmonella Typhimurium을함께배양한경우 Salmonella Typhimurium은 2.7 10 8, B. lentus과함께배양한경우 Salmonella Typhimurium은 3.0 10 8 이었다. 그러나배양 5일에 Salmonella Typhimurium만배양한경우 3 10 8 이었으나, B. subtilis와 Salmonella Typhimurium을함께배양한경우 Salmonella Typhimurium은 5 10 4, B. lentus와함께배양한경우 Salmonella Typhimurium이 3.5 10 4 으
124 YJ Lim, et al. Figure 1. Detection of antimicrobial activity of B. subtilis (BS) or B. lentus (BL) with Salmonella Typhimurium (ST) by agar well diffusion assay. The indicator organism (Salmonella Typhimurium) in the 0.7% soft agar was spread on the surface of solid agar medium. Pasteur pipette was used to create 5 mm wells in the overlaid base agar plate. The well was filled with 30 μl of the cell free supernatant of Bacillus species. The plates were incubated and examined for the clear zones around the wells. Bacillus species isolated from a traditional fermented soybean paste displayed a wide range of antimicrobial activity against Salmonella Typhimurium. S. typhi: Salmonella typhimurium, 1800: Bacillus subtilis, 1900: Bacillus lentus-1, 2720: Bacillus lentus-2. 로 4 log만큼의미있는감소를보였다. 이에더하여 Agar well diffusion inhibition assay와는다르게배양 7일에 Salmonella Typhimurium만배양한경우 2 10 8, B. subtilis와 Salmonella Typhimurium을함께배양한경우 Salmonella Typhimurium은 3 10 4 이었으나 B. lentus와함께배양한경우 Salmonella Typhimurium이모두사멸되었다. 이와같은결과로혼합배양 7일에 B. subtilis는 Salmonella Typhimurium의성장을감소시켰으나 B. lentus 는 Salmonella Typhimurium을사멸시킬수있었다. 초파리경구감염에서 Bacillus species가초파리생존율에미치는영향 B. subtilis와 B. lentus가 in vitro에서 Salmonella Typhimurium의성장을억제시키는현상이관찰되었다. Bacillus species는토양과물등의자연에존재하며, 김치와청국장등발효식품의섭취를통하여장관에정상균 Figure 2. The effect of co-cultured B. subtilis (BS) or B. lentus (BL) with Salmonella Typhimurium (ST) to inhibit the growth of ST in broth. BS or BL were mixed at a ratio of approximately 1:1 and co-cultured in broth at 24 h interval for 7 days. They were plated on MacConkey agar plate to determine viable cell count of ST. BL resulted in the complete killing of ST within 7 days co-cultured in broth, but BS did not observed the bactericidal effect. 무리로존재한다. Salmonella Typhimurium은경구감염으로장염을일으킨다. 동물의장관에서는정상균무리와병원균과의직접적인관계뿐만아니라장관의획득면역과장상피세포에의한선천면역등이복합적으로서로작용하게된다. 따라서 in vivo 동물의장관에서 Bacillus species와 Salmonella Typhimurium의상호관계연구가요구되었다. 포유동물에서 Salmonella 침습을막는선천면역은 Goblet cell에서생산되는점액과 Paneth cell에서생산되는 defensin과같은 AMP가중요한역할은한다. 초파리는세균에의한장관상피세포손상을보호하는 chitinous matrix 와같은물리적기구와장관의세균증식을일정하게유지하는데기여하는장관상피세포에서생산되는 ROS와 AMP와같은화학적기구를가지고있다. 그러므로초파리도소화기계의선천면역기능을분석할수있는간단하고도효과적인모델이될수있다. 성인암컷초파리에 B. subtilis, B. lentus, Salmonella Typhimurium, B. subtilis와 Salmonella Typhimurium 그리고 B. lentus와 Salmonella Typhimurium을경구로섭취하게하여 9일동안관찰하면서생존율을각각관찰하였다 (Fig. 3). B. subtilis는 5일까지 96% 의생존율을보였으나 7일째부터는 85% 로감소하였다. B. lentus는 6일까지 96% 이었
AMPs on the Growth Inhibition of Salmonella Typhimurium in Drosophila 125 Figure 3. Survival analysis of D. melanogaster that were oral feeding with B. subtilis (BS), B. lentus (BL), Salmonella Typhimurium (ST), BS/ST and BL/ST. Adult female flies were fed 5% sucrose in nutrient broth containing BS, BL, ST, BS/ST and BL/ST for 24 h, then transferred to sterile food. Survival rate (%) were determined over indicated time. 으며 8일에는 90% 로감소하였다. Salmonella Typhimurium 은생존율이날마다감소하여 3일에 94%, 4일에 85%, 7일에 75% 로감소하였다. B. subtilis와 Salmonella Typhimurium 을동시에섭취시켰을때는 2일에 90%, 6일에 84% 로감소하였다. 그러나 7일째에 70% 까지감소하였다. B. lentus 와 Salmonella Typhimurium을함께섭취시켰을때는 2일에 93% 로감소하였으나 5일까지유지되었으며 7일부터 90% 를유지하였다. 이상의결과로 B. subtilis와 B. lentus 각각은초파리생존율을 90% 로유지하였으나 Salmonella Typhimurium은 75% 의낮은생존율을보였다. B. subtilis 는 Salmonella Typhimurium과함께초파리생존율감소를 Salmonella Typhimurium 단독보다 5% 이상낮추었다. 반면에 B. lentus는 Salmonella Typhimurium에의한초파리생존율 75% 를 90% 로오히려 15% 정도높이는결과가관찰되었다. 초파리경구감염에서 Bacillus species가 Salmonella Tyhimurium 의성장억제에미치는영향 Salmonella Typhimurium은조건무산소세균으로포식세포또는포식세포이외의상피세포내에서생존할수있다. 세포내에서 salmonella-containing vacuole로알려진변형된포식소체안에서증식하여생존한다. 초파리에서는공포가없이상피세포안에서발견된다. 성인암컷 Figure 4. Effect of oral feeding with B. lentus (BL) or B. subtilis (BS) on eradication of Salmonella Typhimurium (ST) in D. melanogaster. Adult female flies were fed 5% sucrose in nutrient broth containing ST, BL/ST and BS/ST for 24 h, and then transferred to sterile food. Guts were dissected and crushed at various times after ingestion using micropestle, and then homogenate was serially diluted in LB medium. The number of colony forming units (CFU) was determined through growth overnight at 37 on MacConkey agar. 초파리에 Salmonella Typhimurium, B. subtilis와 Salmonella Typhimurium 그리고 B. lentus와 Salmonella Typhimurium을경구로섭취하게하여 4일동안관찰하면서매일몸통을취하여생리식염수를넣어분쇄하였다. 이를 MacConkey 우무평판배지위에배양하여 Salmonella Typhimurium의균수를측정하였다 (Fig. 4). 24시간후 3가지조건에서 Salmonella Typhimurium은모두 1 10 4 의균집락이관찰되었다. Salmonella Typhimurium 단독을경구감염시킨후 2일에는 3.3 10 4, 4일에는 6.2 10 6 으로점차균수가증가하는증식이관찰되었다. B. subtilis와 Salmonella Typhimurium을동시에경구감염시킨경우에는 2일에 1.8 10 7 으로증가하였으나점차감소하여 4일에 1.3 10 6 으로감소되었다. 그러나 B. lentus와 Salmonella Typhimurium을동시에감염시킨경우에는 2일에 3.6 10 5, 3일에 3.8 10 6 으로증가하였으나 4일에는 Salmonella Typhimurium이배양되지않았다. 이상의결과로초파리의장관에서 B. subtilis는 Salmonella Typhimurium의성장을억제시키지만 B. lentus는 Salmonella Typhimurium 을사멸시키는것이확인되었다.
126 YJ Lim, et al. Figure 5. Synergistic induction of antimicrobial peptides (AMPs) genes of D. melanogaster that were oral feeding with B. subtilis (BS), B. lentus (BL), Salmonella Typhimurium (ST), BS/ST and BL/ST. Total RNA was isolated from fly intestine treated with different combinations of BS, BL and ST for 6, 24 and 48 h as indicated. The RNA samples were analyzed by RT-PCR. rp49 was used as the experimental expression standard. 초파리경구감염에서 Bacillus species가 AMP 발현에미치는영향초파리는선천면역을담당하는 AMP를생산하여침습된병원균을제거한다. 초파리의 AMP는 Toll pathway 에의하여발현이유도되는 Drosomycin과 Metchnikowin, Imd pathway에의하여유도되는 Diptericin 및두 pathway 의상호조절에의하여발현되는 Cecropin, Defensin 및 Attacin 등이있다. Imd patway는그람음성세균과 Bacillus species에의하여인지되어활성화되며 Toll pathway는그람양성균에의하여활성화된다. 초파리에 B. subtilis, B. lentus, Salmonella Typhimurium, B. lentus와 Salmonella Typhimurium 그리고 B. subtilis와 Salmonella Typhimurium 을경구투여하고배양시간별로초파리몸통을분쇄하여얻은 RNA로부터 Diptericin, Attacin, Cecropin, Defensin 등의유전자발현정도를 RT- PCR 방법으로측정하였다 (Fig. 5). B. lentus는경구섭취후 6시간에 Diptericin, Attacin, Cecropin 등이발현되었으나 24시간후부터는발현이매우약하였다. B. subtilis는모두발현이미미하였다. Salmonella Typhimurium은 Defensin을약하게발현하였다. B. lentus와 Salmonella Typhimurium을동시에섭취시킨경우 B. lentus 단독에서보다 Diptericin, Attacin, Cecropin의발현이 48시간에까지지속되었다. 반면에 B. subtilis와 Salmonella Typhimurium은대상 AMP 의발현이관찰되지않았다. 이상의결과로 B. lentus는 Diptericin, Attacin, Cecropin의발현을유도하며 B. lentus 은 Salmonella Typhimurium와협력하여 Diptericin, Attacin, Cecropin의발현을 24시간까지지속시켰다. 고찰본연구에서청국장으로부터분리배양된 B. subtilis와 B. lentus가 in vitro에서 Salmonella Typhimurium의성장을억제하였으며 B. lentus는 Salmonella Typhimurium으로경구감염된초파리의생존율을상승적으로증가시키는결과를얻을수있었다. 즉, B. subtilis와 B. lentus가한천구멍확산억제시험으로 Salmonella Typhimurium의성장을억제시키는것을확인할수있었다. 또한액체배지동시배양법에서 B. subtilis는 Salmonella Typhimurium의성장을 4 log (10 4 ) 이상감소시켰으며 B. lentus는 Salmonella Typhimurium을완전사멸시켰다. 일반적으로 Bacillus는다른 Bacillus species와포도알균과같은그람양성균에항미생물작용이있다. 그러나 B. megaterium 22에서생산되는 megacin 22는 Salmonella Typhimurium과 S. aureus의성장을억제하였다 (22) 고한다. 그러므로 B. lentus와 B. subtilis는 Salmonella Typhimurium에대한항생물질과의병합치료또는대체치료제로개발할가치가있다고생각되었다. 최근 Salmonella Typhimurium의치료에 fluoroquinolone 과 ceftriaxone이흔히사용되고있으나이들에대한내성균과다제내성균이증가하고있다. 건강인의장관에는병원균의집락형성을효과적으로막는정상균무리가있다.
AMPs on the Growth Inhibition of Salmonella Typhimurium in Drosophila 127 이들은영양분을가장효과적으로이용할수있도록하며, 장관세포와장관면역계의발달을촉진시킨다. 프로바이오틱스는정상균무리와의공생을촉진하여직접적으로병원균과경쟁을한다. 그러므로프로바이오틱스는소화관감염의효과적인대체치료제가될수있다 (12, 23). 프로바이오틱스로많이사용되고있는유산균 (LAB) 은박테리오신이나과산화물등의생산을통하여장내병원균의성장을억제시키는것으로알려져있다 (24, 25). 무균마우스실험에서 Lactobacillus acidophilus LA1의배양액이 Salmonella Typhimurium을포함한그람음성및포도알균을포함한그람양성에항미생물기능이있었다 (24) 고한다. 유산균에비하여아포형성 Bacillus species는열에안정하며실온에보관이가능한장점이있다. 또한위산에도견딜수있어장까지도달할수있으며무산소조건에서도증식할수있어장관에존재할수있다. Bacillus 의서식처는토양이며곡식, 야채그리고저온살균우유에도존재한다. 사람은토양에서유래된균을이용한발효식품의섭취로획득된다. 콩발효식품으로 B. subtilis는일본의 Natto와서아프리카 dawadawa와나이지리아의 okpehe 생산에이용되며 (26) 우리나라에서는청국장, 된장또는김치등의발효에이용된다. 프로바이오틱스로서 Bacillus species는면역증강, 항미생물작용및경쟁적배제등의기능이알려져있다. 그러므로 B. subtilis와 B. lentus는 Salmonella Typhimurium의경구감염에대한대체치료제로의적용가능성이높다. 유럽공동체에서는동물의사료매개감염질환을예방할목적으로 E. faecium NCIMB 10415를동물사료첨가물로승인되어광범위하게사용되고있다. 그러나새끼돼지에게 Salmonella Typhimurium DT104를경구감염시킨후 E. faecium을경구투여하여도 Salmonella 균의배설을감소시키지못하였다 (27) 고한다. 이와같이 in vitro 에서관찰되었던세균과세균간의상호관계또는세균과숙주세포와의단순한상호관계가 in vivo에서는관찰되지않을수있다. 그러므로소화관에서프로바이오틱스에의한병원균의치료효과를관찰하기위하여서는실험동물을대상으로한평가가요구된다. 그러나동물모델의선정에서장내정상균무리와의관계, 숙주의면역반응, 윤리문제, 순응도의문제및고비용등이장애가되고있다. 동물의장관에서는정상균무리와병원균과의직접적인관계뿐만아니라장관의획득면역과장상피세포에의한선천면역등이복합적으로서로작용하게된다. 포유동물 에서 Salmonella 침습을막는선천면역은 Goblet cell에서생산되는점액과 Paneth cell에서생산되는 Defensin과같은 AMP가중요한역할을한다. 초파리는장의발달, 재생및질환등을조절하는신호경로면에서사람의장내질환모델로사용될수있을만큼유사성이매우높다 (28). 초파리는 AMP의생산과탐식과같은선천면역을조절하는기전을알아내는우수한실험동물모델이다. 초파리는 Salmonella Typhimurium에의한전형적인감염질환을일으키지는않지만경구감염에의하여선천면역반응을유도할수있으며초파리순환계와세포내로침습할수있다 (29). 초파리장관상피세포에서생산되는 ROS 와 AMP는장관의세균증식을일정하게유지하는데관여한다. 그러므로초파리도소화기계의선천면역기능을분석할수있는간단하고도효과적인실험동물모델이될수있다. 성숙한암컷초파리에 B. subtilis, B. lentus와 Salmonella Typhimurium을경구감염시키고 9일동안생존율을관찰하여 Bacillus species가 Salmonella Typhimurium 감염에미치는영향을조사하였다. B. subtilis는 85% 그리고 B. lentus는 90% 의생존율을보였다. Salmonella Typhimurium 의생존율은 75% 로 B. subtilis나 B. lentus에비하여낮은생존율을보였다. 다음에는 Salmonella Typhimurium 감염에의한생존율에 B. subtilis와 B. lentus가어떠한영향을미치는지를관찰하였다. B. lentus와 Salmonella Typhimurium 을동시에경구감염시켰을때 90% 의생존율을보여 B. lentus는 Salmonella Typhimurium에의한치사효과를보완하였다. 그러나 B. subtilis와 Salmonella Typhimurium을동시에경구감염시켰을때에는 70% 로각각을경구감염시켰을때보다상승적으로치사율을증가시켰다. 초파리경구감염으로장관상피세포의손상과장관형태의소실등의형태학적변화가특징적으로관찰되었다. 장관상피세포의손상은정상적인소화기능에장애를주어죽음에이르게하였다고생각되었다. 이상의결과로 B. subtilis는 Salmonella Typhimurium와함께초파리생존율감소를 Salmonella Typhimurium 단독보다 5% 이상낮추었다. 반면에 B. lentus는 Salmonella Typhimurium에의한초파리생존율오히려 15% 정도높이는결과가관찰되었다. 경구감염을통하여초파리장관에서 B. subtilis와 B. lentus가 Salmonella Typhimurium의성장억제에미치는영향을조사하였다. Salmonella Typhimurium는조건무산소세균으로포식세포또는포식세포이외의상피세포내
128 YJ Lim, et al. 에서생존할수있다. 세포내에서 salmonella-containing vacuole로알려진변형된포식소체안에서증식하여생존한다. 초파리에서는공포가없이상피세포안에서발견된다 (29). 성인암컷초파리에경구감염후몸통을생리식염수를넣어분쇄하였다. 이를 MacConkey 우무평판배지위에배양하여 Salmonella Typhimurium의균수를측정하였다. 24시간후 Salmonella Typhimurium 단독, B. subtilis와 Salmonella Typhimurium 및 B. lentus와 Salmonella Typhimurium의 3가지조건에서 Salmonella Typhimurium 은모두 1 10 4 의균집락이관찰되었다. Salmonella Typhimurium 단독을경구감염시킨후 4일에는 6.2 10 6 으로점차균수가증가하였다. B. subtilis와 Salmonella Typhimurium을동시에경구감염시킨 4일에 1.3 10 6 이관찰되었다. 그러나 B. lentus와 Salmonella Typhimurium을동시에감염시킨경우에는 2일에 3.6 10 5 이었으나 4일에는 Salmonella Typhimurium이배양되지않았다. 이상의결과로초파리의장관에서도 in vitro에서와유사하게 B. lentus는 Salmonella Typhimurium을사멸시키는것이확인되었다. 적응면역기구가없는초파리는선천면역을담당하는 AMP를생산하여침습된미생물에대응한다. Imd pathway 는그람음성세균과 Bacillus species에의하여인지되고활성화되어 Diptericin이발현된다. Toll pathway는그람양성균에의하여활성화되어 Drosomycin과 Metchnikowin가유도된다. Attacin, Cecropin 및 Defensin 등은두 pathway의상호조절에의하여발현된다 (30). 초파리장관에서 B. subtilis와 B. lentus가 Salmonella Typhimurium의성장을억제시키는기전과 AMP의역할과의관계를조사하였다. B. lentus는경구섭취후 6시간에 Diptericin, Attacin, Cecropin 등이발현되었으나 24시간후부터는발현이매우약하였다. B. subtilis는모두발현이미미하였다. Salmonella Typhimurium는 Defensin만을약하게발현시켰다. B. lentus 와 Salmonella Typhimurium을동시에섭취시킨경우 B. lentus 단독에서보다 Diptericin, Attacin, Cecropin의발현이 48시간에까지지속되었다. 반면에 B. subtilis와 Salmonella Typhimurium은 AMP의발현이관찰되지않았다. 이상의결과로 B. lentus는 Diptericin, Attacin, Cecropin의발현을유도하며 Salmonella Typhimurium과협력하여 Diptericin, Attacin, Cecropin의발현을상승적으로높게그리고 48시간까지지속시켰다. In vitro에서와유사하게초파리의장관에서도 B. lentus가 Salmonella Typhimurium을사멸시킨 것은 B. lentus와 Salmonella Typhimurium이협력하여 Imd pathway를통한활성화의결과로평가되었다. 초파리에서세균의경구감염은선천면역반응의 Imd 경로에의하여조절되는 Diptericin과 Attacin을장관상피세포에서선택적으로발현시킨다. 초파리에게 Pseudomonas entomophila 또는 Serratia marcessens와같은그람음성균이경구감염되면 Imd 경로가활성화되고장관상피세포에서 ROS와 AMP가생산되어침습균이제거된다 (31, 32) 고한다. 이때발현되는 AMP가경구감염을일으킨세균을제거하는데중요한역할을하며, 두개의서로다른 pathogen recognition signal이협동하여더넓은범위의 AMP가활성화된다 (30) 고한다. 이상의결과로 B. lentus는한천구멍확산억제시험과액체배지를이용한동시배양법으로 Salmonella Typhimurium 의성장을억제시키는결과를얻을수있었다. 초파리경구감염에서는 B. lentus가 Salmonella Typhimurium에대한반응과의상승작용으로 Imd 경로의 Diptericin, Attacin 및 Cecropin의발현을상승적으로증가시켜 Salmonella Typhimurium의성장을억제시키는결과를얻을수있었다. 그러므로청국장에서유래된 B. lentus는 in vitro와초파리장관에서 Salmonella Typhimurium에의한감염을제어할수있을것으로생각된다. 참고문헌 1) Kim S. Salmonella serovars from foodborne and waterborne diseases in Korea, 1998-2007: total isolates decreasing versus rare serovars emerging. J Korean Med Sci 2010;25:1693-9. 2) Atassi F, Servin AL. Individual and co-operative roles of lactic acid and hydrogen peroxide in the killing activity of enteric strain Lactobacillus johnsonii NCC933 and vaginal strain Lactobacillus gasseri KS120.1 against enteric, uropathogenic and vaginosis-associated pathogens. FEMS Microbiol Lett 2010;304:29-38. 3) Chenoll E, Casinos B, Bataller E, Astals P, Echevarría J, Iglesias JR, et al. Novel probiotic Bifidobacterium bifidum CECT 7366 strain active against the pathogenic bacterium Helicobacter pylori. Appl Environ Microbiol 2011;77:1335-43. 4) Pineiro M, Stanton C. Probiotic bacteria: legislative framework-- requirements to evidence basis. J Nutr 2007;137: 850S-3S. 5) Jung JY, Lee SH, Kim JM, Park MS, Bae JW, Hahn Y, et al.
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