J Koren So Foo Si utr 한국식품영양과학회지 43(), 63~64(24) http://x.oi.org/.3746/jkfn.24.43..63 보스웰리아추출물의골관절염억제효과연구 남다은 김옥경 심태진 2 김지훈 2 이정민,3 경희대학교의학영양학과 2 ( 주 ) 진용 3 경희대학교임상영양연구소 Effet of Boswelli serrt Extrts on Degenertive Osteorthritis in vitro n in vivo Moels DEun m, Ok Kyung Kim, Te Jin Shim 2, Ji Hoon Kim 2, n Jeongmin Lee,3 Dept. of Meil utrition, Kyung Hee University, Gyeonggi 4467, Kore 2 Jinyong Co. Lt., Gyeonggi 443734, Kore 3 Reserh Institute of Meil utrition, Kyung Hee University, Seoul 37, Kore ABSTRACT The inhiitory effets of Boswelli serrt (BW) extrts on egenertive osteorthritis were investigte in primryulture rt rtilge ells n monosoiumiooette (MIA)inue osteorthritis rt moel. To ientify the protetive effets of BW extrt ginst H 2O 2 (8 μm, 2 hr) in vitro, ell survivl ws mesure y MTT ssy. Cell survivl fter H 2O 2 tretment ws elevte y BW extrt t onentrtion of 2 μg/ml. In ition, BW extrt tretment signifintly reue n normlize the proutions of proinflmmtory ftors, nuler trnsription ftor κb, ylooxygense2, tumor nerosis ftorα, n interleukin6 t onentrtion of 2 μg/ml. Tretment of honroytes with BW extrt signifintly reue lipoxygense tivity n proution of prostglnin E 2, espeilly t onentrtion of 2 μg/ml. For the in vivo niml stuy, osteorthritis ws inue y intrrtiulr injetion of MIA into knee joints of rts. Consumption of iet ontining BW extrt ( n 2 mg/kg) for 3 ys signifintly inhiite the evelopment n severity of osteorthritis in rts. To etermine the geneti expression of rthriti ftors in rtiulr rtilge, reltime PCR ws pplie to mesure mtrix metlloproteinses (MMP3, MMP9, n MMP3), ollgen type I, ollgen type II, n ggren, n BW extrt h protetive effets t onentrtion of 2 mg/kg. In onlusion, BW extrt ws le to inhiit rtiulr rtilge egenertion y preventing extrellulr mtrix egrtion n honroyte injury. One n onsier tht BW extrt my e potentil therpeuti tretment for egenertive osteorthritis. Key wors: Boswelli serrt, osteorthritis, primry ulture, honroytes, monosoium iooette 서 퇴행성관절염 (osteorthritis) 은관절을보호하고있는연골의점진적인손상이나퇴행성변화로인해관절을이루는뼈와인대등에손상이일어나서염증과통증을수반하는만성퇴행성질환이다. 22년국민건강영양조사통계에따르면우리나라의골관절염유병률은만 세이상인구가운데전체 37.3% 를차지하며, 연령의증가에따라특히여성에서더높은유병률을나타내고있다 (). 퇴행성관절염또는골관절염은관절에일어난염증으로흔히통증, 강직및부종이동반되고그원인은퇴행성변화, 면역계이상, 감염, 외상, 대사장애등과더불어일상생활의활동장애및 론 Reeive 3 Mrh 24; Aepte 2 April 24 Corresponing uthor. Emil: jlee27@khu..kr, Phone: 82323779 운동장애를유발하여삶의질을저하시키는대표적인퇴행성질환이다 (2). 골관절염의발병과관련된인자들을크게분류해보면단백질가수분해효소 (proteolyti enzymes), ytokines, 그리고 nitri oxie(o) 가주요인자들로알려져있다 (36). uler trnsription ftor κb(fκb) 는면역과염증반응에관여하는여러유전자들의 trnsription ftor로, TFα와 IL6 등의염증관련 ytokine과염증효소인 lipoxygens(lo), ylooxygense2(cox 2) 및 mtrix metlloproteinses(mmps) 의전사를조절하는인자로알려져있으며, 연골조직에서의이러한물질대사과정은연골조직의퇴화에중추적인역할을하고있다 (7 9). 또한관절염발병시 MMP3, MMP9 그리고 MMP3 등의발현이증가하며, 이러한 MMPs 증가로인해연골을구성하는 ollgen mtrix를손상시켜퇴행성관절염을악화시키는것으로알려져있다 (8,). 이렇듯퇴행성관절염은만성적인질환으로근본적인치료요법이없기때문에
632 남다은 김옥경 심태진 김지훈 이정민 통증의완화및연골손상방지를주된치료목적으로하며, 비스테로이드성항염증제 (SAID), 진통제, 코르티코스테로이드, 관절강내하이알루론산주사등이관절염약물치료제로사용되고있다. 그러나기존치료약물의복용에따른부작용및장기복용부담등이문제점으로나타나면서최근들어관절염에대한건강기능식품의기호도및수요가급격히증가하고있으며, 또한이를반영하듯 2년국내의개별인정형건강기능식품총생산액의 3% 인 억원정도가관절과뼈건강에관한기능성제품으로높은비율을차지하는것으로나타났다 (). 관절및뼈건강관련건강기능성식품가운데대다수의경우 gluosmine과 honroitin이시장성을형성하고있지만 (2,3) 일부의학계에서기능성식품으로서의 gluosmine 효과에대한의문점을제기한바있고향후지속적인관절염건강기능식품의시장을유지, 형성하고골관절염관련기능성소재의개발을위해서는이를대체할방안이필요하며, 이러한시점에서새로운골관절염기능성의건강기능식품원료필요성이증대되고있다. 보스웰리아는인도전통아유르베다의학서에만성염증및관절염, 소염, 타박상, 호흡기질환및설사등에사용하였다고기록되어있으며, 높은소염진통효과로진통및염증치료에지속적으로사용되어온것으로알려져있다. 보스웰리아의주요성분은보스웰릭산 (oswelli i) 과테르페노이드형태의항산화물질들로, 이중보스웰릭산은보스웰리아의소염및진통효과를나타내는기능물질이다 (4). 보스웰릭산은 lipoxygense(lo) 의활성을저해시킴으로신체내염증반응물질및염증유발물질인 TFα, IL6 등의 ytokine 생성을억제하고, 연골조직을구성하는단백질의생성촉진과연골세포의 ell eth를저해시키는활성을나타내는것으로보고되고있다 (7,,6). 이러한근거에따라보스웰리아추출물은퇴행성골관절질환에유의한효과가있을것으로사료되나아직이에대한기전적, 효능적실험연구는미미한실정이다. 이에보스웰리아추출물이관절질환에미치는효능을실험적으로검증하고향후기능성식품소재의개발을위한가능성을확인하고자, 세포수준에서보스웰리아추출물의기전검증과약물로관절염을유발한 rt에서보스웰리아추출물섭취효능을관찰하여검증하였다. 재료및방법실험재료보스웰리아추출물 (Boswelli serrt extrt: Wokvel TM, mnufture y Phrmnz Ini) 은 ( 주 ) 진용 ( 수원, 한국 ) 으로부터분말형태로공급받아실험에사용하였다. 세포실험을위한실험재료의준비는분말형태의보스웰리아추출물을.2% 에탄올 (Merk, Drmstt, Germny) 에녹여사용하였으며, 동물실험에사용된보스웰리 아식이는주문시에분말형태로그대로첨가하여사용하도록하였다. 연골세포의분리및배양연골채취를위한실험동물은 4~6주령무게약 8~2 g 정도의 mle SprgueDwley rt을경추탈골하여 7% 알코올로피부를소독하여절개한후관절연골을 2~3 mm 정도크기로채취하였고채취한연골조직은 phosphte uffer sline(hylone Lortories, Logn, UT, USA) 용액에서보관하여 len enh로옮겼다..% EDTA CDMF(SigmAlrih Co., St. Louis, MO, USA) 용액에 3분씩 2회 inution 시키고 (37 C, % CO 2),.2% trypsin으로 시간 inution(37 C, % CO 2) 하였다. 2 mg/ml ollgense type I(SigmAlrih Co.) 을첨가하여 shker에 2 rpm으로 2시간동안처리하였다. 이렇게해서얻어진세포부유액을 µm pore size ell striner (BD Flon, Flnklin lkes, J, USA) 에여과한후,6 rpm으로 분간원심분리하여원심분리된세포를 Hnk's lne slt solution(hylone Lortories) 으로 3회세척한후연골세포를분리하였다. 분리된연골세포는 % FBS(Hylone Lortories) 와 DMEM(Hylone Lortories) 에 % peniillinstreptomyin(hylone Lortories) 과 % Lglutmine(Hylone Lortories) 그리고.% gentmyin(gio, Grn Isln, Y, USA) 을첨가하여 7T flsk에넣고 37 C, % CO 2 의조건하에서배양하였다. 이때 2~3일에한번씩배지를갈아주고약 4~일에계대하였으며세포의 pssge는 이하로사용하였다. Cell viility 측정실험동물에서분리한연골세포를 96well plte에 4 ells/well의농도로 % FBS를첨가한 DMEM 배양액에분주하여 2시간동안안정화시킨후, 보스웰리아추출물을농도별로처리하여 24시간 ( 독성시험 ) 또는 2시간 (H 2O 2 처리후세포재생시험 ) 동안배양하였다. 3(4,methylthizol2yl)2,iphenyltetrzolium romie(mtt) 시약을 2 μl 처리하여최대 3시간 37 C inutor에서배양한후배지와 MTT 시약을제거하고, DMSO 시약 2 μl 를가하여 6 nm에서 ELISA reer(versamaxsl2, Moleulr Devies, Seoul, Kore) 를이용하여측정하였으며 3회의측정으로그에대한평균값과표준오차를구하였다. Prostglnin E 2 측정염증성매개물질인 prostglnin E 2(PGE 2) 의발현확인을위해실험동물에서분리한연골세포를 96well plte에 4 ells/well의농도로 % FBS를첨가한 DMEM 배양액에분주하여 2시간동안안정화시킨후보스웰리아추출물을농도별로처리하고 lipopolyshrie(sigm
보스웰리아추출물의골관절염억제효과연구 633 Alrih Co.) μg/ml 처리하여 24시간배양후에상층액을따서 PGE 2 를측정하였다. 측정을위해 R&D Systems (Minnepolis, M, USA) 의 Prostglnin E 2 Assy kit을이용하여 R&D Systems의 protool을따라서실험을하였으며, ELISA reer(versamaxsl2, Moleulr Devies) 를이용하여측정하였다. Lipoxygenses(LO) 의측정보스웰리아추출물의 LO 저해활성을측정하기위해실험동물에서분리한연골세포를 96well plte에 4 ells/well의농도로 % FBS를첨가한 DMEM 배양액에분주하여 2시간동안안정화시킨후보스웰리아추출물을농도별로처리하고 lipopolyshrie(sigmalrih Co.) μg/ml 처리하여 24시간배양후에상층액을따서 LO 를측정하였다. 측정을위해 Cymn Chemil(Ann Aror, MI, USA) 의 Lipoxygense Inhiitor Sreening Assy kit 을이용하여 Cymn Chemil의 protool을따라서실험을하였으며, ELISA reer(moleulr Devies) 를이용하여측정하였다. 연골세포에서 Reltime polymerse hin retion 에의한유전자발현측정실험동물에서분리한연골세포를 6well plte에 6 ells/well의농도로 % FBS를첨가한 DMEM 배양액에분주하여 2시간동안안정화시킨후, 보스웰리아추출물을 LPS 또는 H 2O 2 와함께연골세포에 2시간동안처리한후.2% trypsinedta로세포를수집하여 Resy extrtion kit(qiage, Germntown, MD, USA) 로제조사 의 mnul에따라 totl RA를추출하고 DA의합성을위해 isript Selet DA Synthesis kit(biorad, Singpore, Singpore) 을이용하여 μg의 totl RA에 isript selet retion mix를 4 μl, Oligo(T) Primer set 2 μl(tle ), RA smple μl, ulesefree Wter 8 μl를각각넣고마지막에 isript Reverse Trnsriptse μl를넣어 pipette으로 up & own 하여골고루섞어주었다. 42 C에서 6분, 8 C에서 분간반응시킨후합성된 DA를 PCR 반응에사용하였다. Reltime PCR 실험시사용한기계는 Step One RelTime PCR system(applie Biosystems, Foster, CA, USA) 이며 iq SYBR Green Supermix(BIORAD) 의 protool에따라수행하였다. PCR을위한혼합액최종농도는 DA 2 μl(~ ng), 2X iq SYBR Green supermix μl, forwr & reverse primer 각 μl(2 nm), H 2O 7 μl가되도록하였다. 9 C에서 분간 hot strt 한후 9 C에서 초간, C에서 초, 72 C에서 3초간 4 yling으로 PCR을수행한후마지막으로 9 C에서 초, 6 C에서 분, 9 C 초간 polishing step을거쳐 PCR 분석을시행하였다. 반응에사용한 primer는 Tle 에제시하였다. 실험동물및군분류실험동물은 6주령의 mle SprgueDwley(SD) rt( 대한바이오링크, 충북, 한국 ) 을군당 8마리씩총 48마리를 ge에각각넣고일주일동안순화시킨뒤사용하였다. 사육실의온도는 2±2 C, 습도 ±% 로유지하였으며, 명암은 2시간주기로하였고물과고형사료는자유롭게공급하였다. 실험군분류는 Tle 2에제시하였다. Tle. Primer set sequene use for reltime PCR Sequene Forwr sequene nme GAPDH Aggren Collgen type Ⅰ Collgen type Ⅱ MMP3 MMP9 MMP3 COX2 FκB TFα IL6 TGG CCT CCA AGG AGT AAG AAA C GAA GTG GCG TCC AAA CCA A GAG CGG AGA GTA CTG GAT CGA GCA ACA GCA GGT TCA CGT ACA GAG TGT GGA TTC TGC CAT TGA G GCG CCA GCC GAC TTA TGT ACG TTC AAG GAA TCC AGT CTC TCT AGA GAA AGA AAT GGC TGC AGA GTT GCA CCA AGA CCG AAG CAA TT ACA AGG CTG CCC CGA CTA T GCC CTT CAG GAA CAG CTA TGA Reverse sequene CAG CAA CTG AGG GCC TCT CT CGT TCC ATT CAC CCC TCT CA CTG ACC TGT CTC CAT GTT GCA TCG GTA CTC GAT GAT GGT CTT G TTA TGT CAG CCT CTC CTT CAG AGA AAT CCT CTG CCA GCT GTG TGT GGA TAG GGC TGG GTC ACA CTT AGC AGG GCG GGA TAC AGT GAA ACC CCA CAT CCT CTT CCT T CTC CTG GTA TGA AGT GGC AAA TC TGT CAA CAA CAT CAG TCC CAA GA CBI referene BC87743. M_229. BC33728 L4844 M_3323.2 M_3. M_333. S67722. M_2767. X6639. M26744. Tle 2. Experimentl esign nimls (n=8/group) Groups Inue rthritis Dietry ministrtion Orlly ministrtion orml Shm CLX BW BW BW2 AI 93G iet AI 93G iet AI 93G iet AI 93G iet Boswelli mg/kg AI 93G iet Boswelli mg/kg AI 93G iet Boswelli 2 mg/kg Celeoxi mg/kg
634 남다은 김옥경 심태진 김지훈 이정민 식이및급여보스웰리아추출물제공에따른관절염예방및연골보호효과를관찰하기위해관절염유발 2주일전부터보스웰리아가첨가된식이를제공하고, 유발후 3주간지속적으로보스웰리아식이를제공하며관찰하였다. 보스웰리아추출물은 mg/kg, mg/kg, 2 mg/kg 농도로 AI93G iet에첨가하여시료를제조하였으며양성대조군으로는항관절염효과가있는약물인 Celeoxi(Pfizer, ew York, Y, USA) 를사용하였다 (7,8). Celeoxi(CLX) 투여군은존대를이용하여주 회일정시간에 mg/kg 으로경구투여하였으며, 식이는 3일에한번씩교환하고이때잔여무게 ( 일부 ge 안으로떨어진것을회수 ) 를측정하여섭취량을환산하였다. 물에대한접근은임의대로하였으며음용한양은 3일에한번씩측정하고새로운물로교환하였다. 관절염모델 6주령의 mle SD rt을이용하며 Zoletile(t. o. 66, Vir, Crros, Frne) 과 Rumpun(t. o. 4882, 바이엘코리아, Seoul, Kore) 을 2: 비율로희석한후에복강주사로마취시켰다. 마취시킨 rt의무릎주변을제모하고골관절염유발물질인 MIA(SigmAlrih Co.) 를 ml 주사기로양쪽무릎관절강내에 μl(6 mg/ml) 씩주사하였다. MIA 희석시에는 sline 용액을사용하고약물주사 7일후에관절부위부종정도와실험동물의걷는상태를관찰하여관절염유발확인후실험을진행하였다. 관절염유발동물연골에서 Reltime polymerse hin retion 에의한유전자발현측정관절염유발실험동물희생후, 동물에서분리한연골세포를 6well plte에 6 ells/well의농도로 % FBS 를첨가한 DMEM 배양액에분주하여 2시간동안안정화시킨후, 세포를수거하여 RA 추출및 DA 합성과정을거쳐유전자발현을측정하였다. 9 C에서 분간 hot strt 한후 9 C에서 초, C에서 초, 72 C에서 3초간 4 yling으로 PCR을수행한후마지막으로 9 C에서 초, 6 C에서 분, 9 C 초간 polishing step을거쳐 PCR 분석을시행하였다. 반응에사용한 primer는 Tle 에제시하였다. 통계처리모든실험은 3회반복실시하였으며얻어진결과는 SPSS 2. softwre(ibm, Cmrige, MA, USA) 를이용하여분석하였으며, 모든측정항목의결과는평균 (men)± 표준편차 (stnr evition, SD) 로표시하였다. 실험군간평균차이를 onewy AOVA로확인한후그룹간의통계적유의성을 Dunn's multiple rnge test를이용하여검증하였으며 % 이내에서통계적유의성을부여하였다 (P<.). Cell viility (%). 2 8 6 4 2 H 2O 2 8 µm e 결과및고찰 MTT에의한보스웰리아추출물의적정농도의결정 Primry ulture된연골세포에대한보스웰리아추출물의적정농도를결정하기위해 MTT ssy를수행한결과, 보스웰리아추출물 2 μg/ml 이상농도에서유의적으로세포생존률이감소하여독성이나타난것으로확인되었다 (t not shown). 골관절염실험에대한 in vitro 모델은 LPS 또는 H 2O 2 로염증을유발하는것이일반적으로알려져있다 (9,2). 골관절염의경우연골세포의사멸억제와세포재생에초점이맞추어져있으며, 단순염증유발의경우 LPS로충분하지만세포사멸을유도하기위해서는 H 2O 2 처리후실험을진행하는것이적절할것으로판단되어 (2), H 2O 2 8 μm에서 2시간처리후세포생존률을확인하였다. 그결과시험대조군에서 ~68% 정도의사멸을나타내는것으로확인되었다 (t not shown). 따라서이러한실험결과를바탕으로보스웰리아추출물과 H 2O 2 처리하였으며, H 2O 2 만을처리한대조군 (6.8%) 에비해 2 μg/ml 농도를처리한세포에서 73.% 수준까지세포생존률이증가하여연골세포사멸억제효과가나타났음을확인하였다. 또한 μg/ml와 μg/ml 농도에서역시대조군에비해각각 7.8% 와 68.% 로세포생존률이증가하여대조군에비해유의적으로연골세포재생효과가나타난것으로관찰되었다 (Fig. ). 따라서 ~2 μg/ml 농도에서세포사멸억제가가장효과적으로나타나는것을확인하였으며, 이에따라적정농도를,, 2 μg/ml로설정하여실험을진행하였다. 보스웰리아추출물의 FκB, TFα 및 IL6 생성억제활성 FκB는면역과염증반응관련여러인자의 trnsription ftor로, 염증관련 ytokine과염증효소등의전사를조절하는인자로알려져있다. 대부분의염증반응은 COX2, IL6, TFα 등의염증유발사이토카인이관련된 *P <. 2 3 4 e e 6 Conentrtion (μg/ml) Fig.. Cell viility of primry ulture rt rtilge ells, etermine y MTT regent, with tretment of BW extrt t vrious onentrtions. Dt re expresse s men±sd (n=3). Signifint ifferenes were etermine y Dunn's multiple rnge test t P<.. e 7 e 8 e 9 e
보스웰리아추출물의골관절염억제효과연구 63 것으로알려져있으며, 실험적인측면에서염증유발은대개 LPS를통해이루어지는데그활성화경로의중심에는 FκB가자리잡고있다. 우선 LPS 수용체를통해전달된활성화신호는 inhiitor κb(iκb) kinse(ikk) 를통해 IκB를인산화시킴으로 FκB를활성화시키는것으로인식되고있다 (22,23). 또한활성화된 FκB는핵으로이전하여 TFα를생성시키는데이렇게생성된 TFα는다시 FκB를재활성화시키는데이용되어 COX2를유전적으로합성하여염증반응을가속화시키는것으로알려져있다. 따라서 TFα의적절한생성조절은염증반응을조절하는중요한인자가되고있다. 또한골관절염의경우관절강내에서대식세포등에의한일련의염증반응으로 TFα와 COX2 등이과다생성되는것으로도알려져있다. 본실험에서는 primry ulture 를통해얻은 rt의연골세포에 LPS μg/ml 처리하여염증을유발하고, 앞선실험결과에따라결정된보스웰리아추출물의적정농도를처리한세포에서 FκB 억제활성을측정하였다. 아무것도처리하지않은정상세포에비해 LPS를처리한세포에서 FκB가.94배높게발현되어염증유발에의한 FκB 활성이증가하였음을확인하였다. 또한보스웰리아추출물을처리한세포에서유의적으로 FκB 활성이억제되었으며, 처리한모든농도에서정상군과비슷한수준으로활성이억제된것을확인하였다 (Fig. 2). 이러한실험결과에따라보스웰리아추출물이 FκB에의해조절되는또다른염증인자에영향을미칠것으로예상되어추가실험을진행하였다. 사이토카인은세포에서분비되는수용성단백질로특정신호물질에의해발현되며효소와는구별되게주변세포에의해영향을받으며반감기가매우짧아그작용하는범위도사이토카인이분비되는인접한세포들로국한되는특징을가지고있다. 관절염에있어서 IL, IL6, TFα는연골세포조직의이화작용에영향을주는사이토카인으로알려져있다 (24). IL은연골세포조직의이화작용에서금속단백분해효소의발현을유도하고 serum TGFβ가연골세포를증식시키도록하는것을방해한다 (2). 퇴행성관절염에 서는연골세포가 IL 수용체를 2배이상발현하고연골생성에관련된유전인자의합성을저해한다. TFα는연골세포에서 IL과비슷한역할을하며, 골관절염이진행되면서 TFα 수용체가연골세포와관절강조직세포에서발현되는것으로알려져있다 (26). 또한이러한 TFα는연골세포, 파골세포등을자극하여 IL6 같은염증성사이토카인의생성을촉진, 골관절염에서연골파괴의주요인자로알려져있다. 본실험에서연골세포에 LPS를 μg/ml 처리하여염증을유발하고, 앞선실험결과에따라결정된보스웰리아추출물의적정농도를처리한세포에서 TFα 및 IL6 생성억제활성을유전자발현측정법을통하여확인하였다. TFα의경우, 아무것도처리하지않은정상세포에비해 LPS를처리한세포에서 TFα 생성이 2배증가한것으로나타났으며, 특히 μg/ml 농도와 2 μg/ml 농도의보스웰리아추출물을처리한세포에서유의적으로 TFα 생성이낮아진것을확인할수있었다 (Fig. 3A). IL6의생성을유전자발현으로측정한결과역시보스웰리아추출물을처리한세포에서유의적으로 IL6 생성이억제되는것으로나타났으며, 특히 2 μg/ml 농도에서가장효과적으로생성을억제하는것을확인하였다 (Fig. 3B). 보스웰리아추출물의 lipoxygense 억제활성아라키돈산 (rhioni i) 대사는생체내염증반응 (A) Reltive mra expression. of TFα. 3 2.4.8.2.6 LPS µg/ml Conentrtion (µg/ml) *P <. 2 Reltive mra expression. of fkb. 3 2 (B) Reltive mra expression. of IL6. 3.6 3 2.4.8.2.6 LPS µg/ml Conentrtion (µg/ml) Fig. 2. Effet of BW extrt on geneti expression of FκB in primry ulture ells. Dt re expresse s men±sd (n=3). Signifint ifferenes were etermine y Dunn's multiple rnge test t P<.. 2 LPS µg/ml Conentrtion (µg/ml) Fig. 3. Effet of BW extrt on geneti expression of ytokines in primry ulture ells. A: TFα, B: IL6. Dt re expresse s men±sd (n=3). Signifint ifferenes were etermine y Dunn's multiple rnge test t P<.. 2
636 남다은 김옥경 심태진 김지훈 이정민 을비롯한항상성을조절하는주요기전의하나이다. 아라키돈산은체내염증생성화학전달물질인프로스타글란딘 (prostglnins) 과염증생성및알레르기반응의화학적전달물질인류코트리엔 (leuktrienes) 등의조절물질합성에사용된다 (27). LO 효소는류코트리엔생합성경로에관여하는핵심효소로, LO에의해생성된류코트리엔은면역조절, 천식, 염증및여러알레르기성증상에관여하는매개물질이다 (28). 따라서류코트리엔생합성경로의핵심인 LO 효소의활성측정을통해보스웰리아추출물의효능을검증하고자하였다. Primry ulture를통해얻은 rt의연골세포에 LPS를처리하여염증을유발하고, 앞선실험결과에따라결정된보스웰리아추출물의적정농도를처리한세포에서 LO 활성을측정하였다. 아무것도처리하지않은정상세포 (.4 µmol) 에비해 LPS를처리한세포에서 LO 활성이. µmol로증가하여염증이유발되었음을확인하였고, 보스웰리아추출물을함께처리한세포에서 LO 활성이유의적으로감소한것으로나타나보스웰리아추출물의 LO 억제활성을확인하였다. 특히 μg/ml와 2 μg/ml에서 LO 활성이.2 µmol로감소하여염증반응억제효능이나타난것을확인하였다 (Fig. 4). 보스웰리아추출물의 COX2, PGE 2 생성억제활성 PGE 2 생성을촉진하여염증을유발시키는 COX 효소는 COX과 COX2의두가지형태가존재한다. COX은지속적으로일정량생성되어여러종류의 prostglnin의합성에관여하여혈장의항상성, 위액분비, 혈소판응고등에관여하는반면, COX2의경우는 TFα와 LPS 등의외부인자에의해일시적으로유도 생성되어염증에관여하는것으로알려져있다 (29,3). COX2 발현을측정한결과, 정상세포에비해 LPS를처리한세포에서 COX2 발현이 6배증가했으며, 보스웰리아추출물 2 μg/ml에서농도의존적으로 2배이상 COX2의발현이감소된것으로확인되었다 (Fig. A). PGE 2 는염증반응에서 COX2의발현이증가함에따라 IL, TFα 등에의해영향을받아생산되고골관절염발병시관절연골 egrtion에관여하는인자이다 (3,32). 또한 COX2 발현에따라생성된 PGE 2 는골극 (osteophytes) 을형성하여비정상적인골성장및통증을나타내며이러한증상은퇴행성관절염에서흔히발생하는것으로잘알려져있다 (33). 본실험에서는 primry ulture를통해얻은 rt의연골세포에 LPS를처리하여염증을유발하고, 보스웰리아추출물의적정농도를처리한세포에서 PGE 2 생성억제활성을측정하였다. 그결과, 아무것도처리하지않은정상세포 (49.4 pg/ml) 보다 LPS를처리한세포에서 4.67 pg/ml로 PGE 2 생산이 68% 증가한것으로나타났으며, 반면보스웰리아추출물을처리한세포에서는 PGE 2 생산이 4% 이상감소한것으로나타났다. 특히 μg/ml 농도와 2 μg/ml 농도에서가장효과적으로 PGE 2 생산이감소된것을확인하였다 (Fig. B). 이러한실험결과는앞서살펴본 FκB와 TFα, IL6와같은염증성 ytokines 및 COX2 억제를통한염증발현을제어하는것을의미하기도한다. 이상의실험결과에따라서보스웰리아섭취시관절염증상을완화시키고연골보호와예방효능을지니는기능성소재로써활용가치및실용가능성이있을것으로기대할수있으며, 저농도에서보스웰리아추출물의효과적인작용이기능성소재로의활용및실용에더욱유리하게작용할것으로생각된다. (A) Reltive mra expression. of COX2. 8 6 4 2 LPS µg/ml Conentrtion (µg/ml) 2 LO Ativity (µmol/min/ml)..2.9.6.3 (B) PGE2 level (pg/ml). 2 6 2 8 4 LPS µg/ml Conentrtion (µg/ml) Fig. 4. Inhiitory effet of BW extrt on lipoxygense tivity in primry ulture ells. Dt re expresse s men±sd (n=3). Signifint ifferenes were etermine y Dunn's multiple rnge test t P<.. 2 LPS µg/ml Conentrtion (µg/ml) Fig.. Inhiitory effet of BW extrt on geneti expression in primry ulture ells. A: COX2, B: PGE 2. Dt re expresse s men±sd (n=3). Signifint ifferenes were etermine y Dunn's multiple rnge test t P<.. 2
보스웰리아추출물의골관절염억제효과연구 637 Tle 3. Weight gin n foo effiieny rtio (FER) Groups orml Shm CLX BW BW BW2 Inue rthritis Initil oy weight (g) Finl oy weight (g) Weight gin (g) ) FER 2) 88.6±4.44 86.6±6.3 88.3±4.8 87.8±4.48 8.33±6.64 83.7±. 38.23±.89 36.63±.97 38.88±. 39.4±9. 34.±7.37 3.23±3.94 9.2±4.6 74.94±9.9 7.24±.72 7.6±2.94 7.±23.87 7.82±9.48.93±..92±.93.97±.4.99±.4.897±.3.889±.36 ) Weight gin (g)=finl oy weight (g)initil oy weight (g). 2) FER (foo effiieny rte)=gin of oy weight (g)/ foo intke lories (kl/y). Dt re expresse s men±sd (n=8/group). Signifint ifferenes were etermine y Dunn's multiple rnge test t P<.. 실험기간중 mouse 체중의변화및식이섭취효율총실험기간 주동안매주 2회식이섭취량과체중을측정하였으며, 실험기간동안급여한물과식이는자유롭게섭취할수있도록공급하였다. 하루한마리의섭취량을계산하여칼로리로변환후식이섭취효율로나타내었다. 주동안 rt의몸무게변화에서는모든실험군에서유의적인차이가나타나지않았으며, 식이섭취효율의경우 BW2 군에서효율이감소한것으로나타났으나그룹간유의적인차이는없었으며, 이러한결과로미루어볼때보스웰리아추출물의섭취가몸무게증가및증상에영향을미치지않았다는것을확인하였다 (Tle 3). 골관절염유발동물모델에서보스웰리아추출물섭취의효능평가연골세포조직의생리학적 물리학적작용을유지시키는것은조직의동화작용 (nolism) 과이화작용 (tolism) 의균형에의한것으로인식된다. 동화작용에관여하는것으로는 ollgens, 금속단백분해효소조직억제 (tissue inhiitors of metlloprotenses, TIMPs), ggren을포함하는 proteoglyn 등이해당되는반면이화작용에는금속단백분해효소 (metlloproteinse; MMP), nitri oxie(o), TFα, ollgense, ggrense 등이해당된다. 본실험에서동화작용인자로서확인한 ollgen type Ⅰ은연골세포뿐만아니라일반적으로인체세포에서가장많이분포하고있으며, ollgen type Ⅱ는연골조직단백질의 % 를차지하고연골에분포하고있는 ollgen 종류중약 8~9% 를차지하고있는주요단백질이다. 따라서 ollgen type Ⅰ과 Ⅱ의형성은연골조직의상태를결정하는중요한인자이다. 골관절염유발동물에서채취한연골조직에서 ollgen type Ⅰ, ollgen type Ⅱ 및 ggren 유전자발현을측정하여보스웰리아추출물의섭취효능을평가하였다. 그결과보스웰리아추출물 2 mg/kg 섭취군인 BW2군에서골관절염유발대조군인 shm군에비해유의적으로유전자발현이증가한것을확인할수있었다. Collgen type Ⅰ의경우보스웰리아추출물섭취군이 shm 군과통계적유의성이나타나지는않았으나, 양성대조군인 CLX 약물투여군과비슷한수준으로 ollgen type Ⅰ 발현 이증가된것으로나타났다. Collgen type Ⅱ 유전자발현역시 CLX 약물투여군과비슷하게발현되었으며, 보스웰리아추출물섭취에따라농도유의적으로효과가나타났다 (Fig. 6A, 6B). 이러한결과는비록 ollgen type Ⅰ에서통계적유의성이나타나지않았다하더라도연골조직에서는 ollgen type Ⅱ가대부분을차지하고있다는점을감안할때보스웰리아추출물의섭취에따른골관절염에서의관절연골보호효과가나타난것으로생각된다. Aggren은연골조직에서대표적으로합성되는 proteoglyn ore protein의하나로서 ggregtion, hyluronn ining, ell hesion과 honroyte poptosis에관여하는구상단백질인 G, G2 그리고 G3로구성되어있으며주로관절에서외부의압력 (ompressive lo) 으로부터저항성을나타내어관절을유지시키는기능을하는것으로알려져있다 (34,3). 실험결과 shm군을제외한모든실험군에서유의적으로 ggren 발현이증가하였고, 특히 BW2군에서 CLX 약물투여군보다높은 ggren 발현이나타난것으로확인되었다 (Fig. 6C). 본실험에서이화작용인자로서확인한 MMPs의경우, 연골조직이파괴되면일반적으로활성화되어발현이증가한다. MMPs는골및연골의기질구성요소를파괴하는단백분해효소로서정상조직의분화, 창상치유, 기관형성, 생식, 혈관생성, 조직흡수및재형성등의과정에주요한역할을하며관절염등의병적인상태에서도발현되어병인에주요한역할을한다 (36,37). MMP3(Stromelysin) 은 proteoglyn의퇴화에결정적인역할을하는금속단백분해효소로관절강내 MMP3의증가는심각한연골손상과도연관지을수있으며, MMP3의경우 ollgen type Ⅱ의분해효소로관절연골의콜라겐생성및재생에중요한인자로알려져있다 (38). MMP9 역시퇴행성골관절염에서발현이증가하는주요한인자로알려져있으며, 따라서 MMP 3, MMP9 및 MMP3을이화작용인자에대한바이오마커로선정하여실험을진행하였다. 본실험에서의 MMPs 발현확인결과, MMP3의경우관절염이유발된 shm군에서 MMP3의발현이 6.배증가하여골관절염의유발이제대로된것으로확인되었고 CLX 및보스웰리아섭취군에서유의적으로 MMP3의발현이감소한것으로나타났다.
638 남다은 김옥경 심태진 김지훈 이정민 (A) Reltive mra expression of COL...2.9.6.3 orml Shm CLX BW BW BW 2 (A) Reltive mra Expression of MMP3. 8 6 4 2 orml Shm CLX BW BW BW 2 (B) Reltive mra expression of COL2...2.9.6.3 orml Shm CLX BW BW BW 2 (B) Reltive mra expression of MMP9. 4 3 2 orml Shm CLX BW BW BW 2 (C) Reltive mra expression of ggren...2.9.6.3 orml Shm CLX BW BW BW 2 Fig. 6. Geneti expression of noli ftors in MIA rt rtiulr rtilge. A: COL, B: COL2, C: ggren. Dt re expresse s men±sd (n=8/group). Signifint ifferenes were etermine y Dunn's multiple rnge test t P<.. (C) Reltive mra expression of MMP3. 8 6 4 2 orml Shm CLX BW BW BW 2 Fig. 7. Geneti expression of toli ftors in MIA rt rtiulr rtilge. A: MMP3, B: MMP9, C: MMP3. Dt re expresse s men±sd (n=8/group). Signifint ifferenes were etermine y Dunn's multiple rnge test t P<.. 특히 BW2군에서약물투여양성대조군인 CLX군과비슷한수치로감소한것이확인되었다 (Fig. 7A). MMP9와 MMP3에서역시보스웰리아섭취군에서모두유의적으로발현이감소되었으며 (Fig. 7B, 7C), 이상의실험결과에따라보스웰리아추출물섭취에따른골관절염에서의관절연골보호효과가나타난것으로생각된다. 따라서보스웰리아섭취시관절염증상을완화시키고연골보호및예방효능을지니는기능성소재로써활용가치및실용가능성이있을것으로기대할수있다. 요약본실험에서는 primry ulture 된연골세포 in vitro 실험모 델과 MIA로유발한골관절염 in vivo 실험모델을이용하여보스웰리아추출물의골관절염예방효과를확인하였다. 먼저 MTT 시험법을통해세포사용적정농도를 2 μg/ml 이하로결정하여연골세포사멸억제를확인하고, 이를근간으로골관절염동물실험모델에서골관절염예방효과를확인하였다. H 2O 2 처리에따른산화적독성으로연골세포사멸을유도한실험에서보스웰리아추출물은유의적으로세포사멸을억제하였으며이러한효과는 ~2 μg/ml 사이농도에서비교적높게나타났다. 세포실험에서는골관절염발병에따라관절연골에영향을미치는염증인자에대한기전연구를진행하였으며, 연골세포에 LPS를처리하여염증을유도한후보스웰리아추출물의효과를확인한실험결과면역과염증반응을조절하는 nuler trnsription ftor
보스웰리아추출물의골관절염억제효과연구 639 κb(fκb), 염증관련 ytokine IL6, TFα의발현이모두보스웰리아추출물처리시유의적으로감소하는것으로나타났으며특히 2 μg/ml 농도에서가장효과가뚜렷하고일관되게확인되었다. 또한이들 ytokine에의해생성되는 COX2 발현과 COX2에자극받아생성이촉진되는 PGE 2 생성을확인한결과역시 2 μg/ml 농도에서가장효과적으로생성이억제되어염증을조절하는것으로나타났다. 특히보스웰리아의기능성분으로알려진보스웰릭산 (oswelli is) 에의해억제되는 LO의경우, 염증반응유발의핵심인자를생성하는효소로알려져있으며이를직접적으로저해하는것으로알려진보스웰리아의효능을확인하고자실험을진행하였다. 실험결과염증을유도한연골세포에서보스웰리아추출물의처리에따라 LO 활성이감소하였으며, 이는곧보스웰리아추출물이염증을유발핵심효소인 LO 활성을효과적으로억제함으로써연골세포보호효과를나타낸것이다. 세포실험에서의기전결과를바탕으로골관절염을유발한동물모델에서의보스웰리아추출물의섭취에따른효과가나타날것으로기대되어관절염유발동물모델에서보스웰리아추출물의효능검증실험을진행하였으며, 세포실험결과및기존의연구내용을참고하여동물에서보스웰리아의섭취농도를 mg/kg, mg/ kg 및 2 mg/kg으로결정하고 AI93G iet에보스웰리아추출물분말을섞어보스웰리아 iet를제작하여실험기간동안제공하였다. 골관절염유발동물모델을만들기위해 SD rt의관절강에 MIA를 injetion 하였으며, 보스웰리아추출물섭취에따른관절염예방효과를관찰하기위해관절염유발 2주일전부터제작된식이를제공하고유발후 3주간지속적으로식이제공및관찰하였다. 연골의주요구성성분인 ollgen 및 ggren은골관절염발병시여러인자에의해분해되는것으로알려져있으며, 골관절염유발동물모델에서 ollgen type Ⅰ, ollgen type Ⅱ 및 ggren 유전자발현을실시간정량 PCR로측정하여변화를살펴보았다. 그결과골관절염유발 shm군에비해보스웰리아추출물섭취군에서유의적으로 ollgen type Ⅰ, ollgen type Ⅱ 및 ggren 발현이증가하였으며, 특히 BW2군에서 CLX 약물대조군과비슷한수준으로발현이증가하여관절연골의보호효과가가장좋은것으로확인되었다. 교원질합성을억제하고분해를촉진시키는 MMPs (MMP3, MMP9, MMP3) 의발현을실시간정량 PCR 로측정하여발현변화를살펴보았다. 그결과앞선다른실험결과와마찬가지로보스웰리아섭취군에서 MMPs 유전자발현이유의적으로낮아졌음을살펴볼수있었다. 특히 BW2군에서 MMPs 발현이유의적으로감소하였으며, 관절염에효과적으로사용되는약물인 CLX 투여양성대조군과비슷한수치를나타내었다. 이상의결과를통하여보스웰리아추출물은골관절염에서관절연골의보호효과가있으며, 이는골관절염발생시나타나는염증발현의기전적인측면뿐만아니라골관절염유발동물에서섭취효능까지모 두일관되게나타나골관절염에서의기능성소재로써개발가능성이충분할것으로생각된다. 또한추후실험을통해골관절염이유발된동물에서보스웰리아추출물섭취시관절연골의형태학적인변화및골상태의분석과더불어관절염유발동물의관절연골및혈액학적분석을진행하여동물에서기전적측면을보완하고보스웰리아추출물효능에대한추가적인검증을하고자한다. REFERECES. MOHW. 22. Kore Helth Sttistis 22: Kore tionl Helth n utrition Exmintion Survey (KHAES V3). Ministry of Helth n Welfre, Sejong, Kore. p 67, 678. 2. Grner BC, Stoker AM, Kuroki K, Evns R, Cook CR, Cook JL. 2. Using niml moels in osteorthritis iomrker reserh. J Knee Surg 24: 2264. 3. Wu W, Xu X, Di Y, Xi L. 2. Therpeuti effet of the sponin frtion from Clemtis hinensis Osek roots on osteorthritis inue y monosoium iooette through proteting rtiulr rtilge. Phytother Res 24: 3846. 4. WesheSolto DE, Swn RZ, Chung CS, Ayl A. 27. The poptoti pthwy s therpeuti trget in sepsis. Curr Drug Trgets 8: 493.. Herrington C, Hll PA. 28. Moleulr n ellulr themes in inflmmtion n immunology. J Pthol 24: 232. 6. Cmpo GM, Avenoso A, Cmpo S, D'Asol A, Trin P, Smà D, Cltroni A. 29. Glyosminoglyns moulte inflmmtion n poptosis in LPStrete honroytes. J Cell Biohem 6: 8392. 7. Ammon HRT. 2. Moultion of the immune system y Boswelli serrt extrts n oswelli is. Phytomeiine 7: 862867. 8. Roy S, Khnn S, Krishnrju AV, Surju GV, Ysmin T, Bghi D, Sen CK. 26. Regultion of vsulr responses to inflmmtion: inuile mtrix metlloproteinse3 expression in humn mirovsulr enothelil ells is sensitive to ntiinflmmtory Boswelli. Antioxi Reox Sign 8: 6366. 9. Prk B, Prs S, Yv V, Sung B, Aggrwl BB. 2. Boswelli i suppresses growth n metstsis of humn pnreti tumors in n orthotopi nue mouse moel through moultion of multiple trgets. PLoS One 6: e26943.. Sengupt K, Koll J, Krishnrju AV, Ylmnhili, Ro CV, Golkoti T, Ryhuhuri S, Ryhuhuri SP. 2. Cellulr n moleulr mehnisms of ntiinflmmtory effet of Aflpin: novel Boswelli serrt extrt. Mol Cell Biohem 34: 8997.. KHIDI. 2. Helth funtionl foo inustry evelopment ssistne report. Kore Helth Inustry Development Institute, Chunguk, Kore. p 8. 2. Lee JW, Do JH. 2. Mrket tren of helth funtionl foo n the prospet of ginseng mrket. J Ginseng Res 29: 26 24. 3. Kim HK. 24. Current sttus n prospet of nutreutils. Foo Inustry n utrition 9(): 4. 4. Siler ER, Surmnin LR, Rll B, Hoernlein RF, Ammon HP, Sfyhi H. 996. Aetylketoetoswelli i (AKBA): struture requirements for ining n lipoxygense inhiitory tivity. Br J Phrmol 7: 668.. Siiqui MZ. 2. Boswelli serrt, potentil ntiinflmmtory gent: n overview. Inin J Phrm Si 73:
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