특집 2 고효율로재조합단백질을생산하는 Baculovirus Expression System AB Vector (www.abvector.com) Baculovirus System 은곤충세포에서단백질을발현하는 viral system 으로 baculovirus 가곤충세포에감염되어증폭되는원리를이용한다. 곤충세포는대부분의 mammalian protein-targeting sequence 를인식하기때문에다양한단백질을발현시킬수있고, mammalian cell 에서수행되는많은 post-translational modification 이일어난다는장점이있다. 본고에서는다카라코리아에서판매되고있는 AB Vector 사의다양한 baculovirus system 제품에대해소개하고자한다. [1] 개요 : Baculovirus 핵심기술 Autographa califomica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) 는단백질발현연구에범용적으로사용되는 baculovirus로거염벌레 (armyworm) S. frugiperda에서유래한 cell line을 virus 증식에주로사용한다 1). 특정곤충종에만제한적으로감염되는 virus의특성상 mammalian cell에서증식하지않기때문에 biosafety level I 실험실에서도편리하게이용할수있다. 또한, 다른고등진핵생물발현시스템과비교하여매우높은효율로목적단백질을발현시킬수있을뿐만아니라, 목적단백질이본래의활성을가지는데필수적인단백질 modification 과정이대부분진행된다는큰장점이있다. 이러한장점때문에 baculovirus system은약제표적단백질 (drug target protein) 연구에필수적인시스템으로 human protein kinase 90% 이상이재조합 baculovirus로, 10% 이하가 E. coli system에의해생산된다. E. coli에서발현시킬경우활성에필수적인 phosphorylation 과정이진행되지않아대부분의 kinase 단백질이불활성화된다. 현재상업적으로판매되는스테로이드수용체 (steroid receptor) 역시모두재조합 baculovirus에서생산된다. E. coli에서는스테로이드수용체고유의 folding과생물학적활성을유지해주는 Hsp90 chaperone system 이없기때문에생산된스테로이드수용체는정확하지않은 folding으로인하여약제스크리닝에적합하지않다. 물론 E. coli는 Hsp90을가지고있지만진화적으로포유류의 Hsp90과는확연한차이가있고, 포유류 Hsp90-dependent protein 고유의 folding을형성할수가없다. 비용적인측면에서포유류단백질발현시스템은스테로이드수용체및 kinase를상업적으로생산하기에무리가있다. 포유류와 baculovirus 시스템모두 GPCRs와같은 transmembrane protein의발현을위해일상적으로이용되고있으나, 단지발현적인측면만보면포유류보다는낮다 2). 단백질발현을위해 AcMNPV virus를사용하는것은 Smith 그룹 3) 과 Pennock 그룹 4) 에의해처음보고되었다. 기초적인 baculovirus 기술은이두실험실에서독립적으로발전하였고, 이는 virus plaque의표현형을확인하는번거로운선별과정이포함되어있었지만, transfection 후얻어진 virus progeny의단 1 % 만이재조합체였다. Baculovirus system 은많은과학자들의연구를거쳐비약적으로발전하였고, 1993년재조합 baculovirus를고효율로생산하는 2 가지방법이확립되었다 5, 6). 정형화된실험방법으로먼저 BaculoGold (BD Pharmingen), BacPAK (Clontech), ProEasy, ProFold (AB Vector) 등의 vector가상업적으로 판매되었고, 후에 Bac-to-Bac 과같은 Invitrogen 사의 vector 가판매되기시작했다. 위의모든벡터는 baculovirus DNA 안에 polyhedrin site 에목적유전자를삽입하는방법은비슷하나, 재조합 baculovirus 의제조방법과순도및안정성을얻은재조합 baculovirus stock 에는차이가있다. ProEasy TM 는 100% 순도와안정적인재조합 baculovirus stock 을얻기에가장편리한 vector 이다. ProFold vector 는기존 vector 와달리 molecular chaperone 을이용하여생물학적활성을가진단백질의생산을늘리는데효과적이며, GFP marker 를포함하고있다. 핵심기술은그림 1 에모식도로나타내었다. 사이즈가약 134 kb 인 AcMNPV genome 은조작이어렵기때문에두과정을거쳐목적유전자를 genome 에삽입한다. 첫번째단계에서는 E. coli 에서는복제되지만곤충세포에서는복제되지않는 plasmid vector DNA 의 MCS 에목적유전자를삽입한다. 이러한 plasmid vector 를일반적으로 plasmid transfer vector 또는 donor plasmid 라부른다. Plasmid 의 MCS 양쪽으로강력한 baculovirus polyhedrin promoter 와 polyadenylation 서열, 필수적인 baculovirus 유전자 ORF 1629 가위치하고있다. 그림 1. Schematic representation of core baculovirus technology 두번째는 baculovirus genomic DNA 로목적유전자를옮기는 forced recombination 과정으로 genomic DNA 내에 insert 가삽입될위치에근접한 essential gene 서열을 Bsu36.I 제한효소로절단한다. 제한효소처리로선형화되어감염성이없어진 baculovirus DNA 를 insert 가포함된 plasmid transfer vector 와함께곤충세포에 co-transfection 한다. 2 가지 DNA 모두 polyhedrin locus 에서유래한 baculovirus 고유의 DNA 서열을포함하기때문에곤충세포안에서이중재조합현상이발생하여 transfer vector 로부터 essential gene 의일부가복원됨과동시에목적유전자가 virus genome 의 polyhedrin 영역으로옮겨진다. 그결과 baculovirus genomic DNA 가환상 (circular) 이되면서감염성을가지게되고, 목적단백질을발현하는재조합 baculovirus progeny 만을회수하게된다. 강력한 polyhedrin promoter 는세포전체단백질의 30% 이상을목적단백질로발현시킨다. Bsu36.I 가처리된 baculovirus DNA 는 6 Life Science & Biotechnology
특집 2 제한효소로잘리지않은극소량의 baculovirus DNA 를제외하고는거의 100% 에가까운재조합 baculovirus 를생산해낼수있다. [2] AB Vector Technology - ProEasy ProEasy - the easiest generation of recombinant baculoviruses ProEasy 기술은 transfection 후에 100% 재조합 virus의생산을보장한다. 위에설명한핵심기술을기반으로하지만전세대 ProEasy baculovirus ( 그림 2A) 와는달리재조합 baculovirus의생산, 번식을위한기본조건이적합하지않을경우바이러스가복제되지않는치사유전자 (lethal gene) 를포함하고있어더높은효율로유전자를발현시킬수있다 ( 그림 2B). 따라서어떠한경우에라도재조합 baculovirus가아닌비재조합 virus DNA 등은배재할수있다. TaKaRa Bio에서판매되는 ProEasy DNA (TaKaRa Code AV109, AV110) 안의치사유전자는제한효소 Bsu36.1을이용해제거할수있다. 핵심기술에서와같이선형화된 ProEasy DNA와 insert를포함하는 plasmid transfer vector 간의이중재조합이일어나고그결과높은수준으로목적단백질을발현하는재조합 baculovirus를제작하게된다 ( 그림 1). 차별화된 baculovirus system 위와같은장점에도 BaculoGold 또는 BacPAK6 DNA 재조합 baculovirus stock에는극소량의비재조합 baculovirus가포함되었을가능성이있다. 따라서 virus stock을희석하거나 plaque-purification을통해 virus stock을정제하는것을추천하며, 특히목적단백질이세포독성이있거나단백질대량생산에이용하는경우에는 stock 정제과정을진행하도록한다. 이경우낮은효율로증식하는재조합 baculovirus을선별하는장점을가지고있기때문에작은양의 parental baculovirus의 virus population이증가할수있다. Plaque-purified BaculoGold 또는 BacPAK6 virus stock은많은 passage 동안신뢰할수있으며, 실험실에서지속적으로사용하는데문제가없다. Transfection 후에재조합체의 100% 생산이가능하다는점에서 Invitrogen 사의 bacmid를기본으로한 Bac-to-Bac 기술을선호하는경우가있다. 하지만, transposon 서열이존재하는 Bac-to-Bac 재조합체는불안정적일가능성이있고그결과재조합 baculovirus의목적유전자가결실되어 virus가생산되는동안목적단백질의발현율이낮아질수있다 7). 특히목적유전자가세포독성이있거나초반에과발현되는경우에는이러한현상이나타날수있다. 이러한현상은 virus stock 을정제하더라도개선되지않으며, 근본적으로재조합 baculovirus에 transposon이존재하기때문에불안정하게된다. ProEasy 기술은이러한몇몇단점을피해 100% 순도의안정적인재조합 baculovirus stock을만들수있다. ProEasy 기술을통해만든재조합 baculovirus는 virus의안정성에문제를유발할가능성이있는 transposon과같은유전인자를포함하지않고, 쉽고간단한방법으로재조합 baculovirus를제작하는장점이있다. 그림 2. Comparison of core and ProEasy technologies A. Core technology. Polyhedrin site in the parental baculovirus is occupied by the E.coli β- galactosidase gene which is removed using Bsu36.I digestion in commercially available BacPAK6 and BaculoGold vectors. Small amount of parental baculovirus arising from undigested DNA could contaminate baculovirus progeny after transfection as it efficiently propagates. B. ProEasy technology. Polyhedrin site in the parental baculovirus is occupied by a lethal gene which does not allow propagation of parental baculovirus. Therefore, obtained recombinant baculovirus stocks are 100% recombinant. Plasmid Transfer Vector AB vector 에서는 ProEasy baculovirus genomic DNA 와함께사용하는매우다양한 plasmid transfer vector ( 그림 3) 를판매하고있다. 모든 plasmid transfer vector 는 E. coli 에서복제가능한같은 backbone 을가지고있고, polyhedrin promoter 의하류일부만다르게구성되어있다. 목적단백질은각각 GST, His, GFP, MBP 또는 dual His/ MBP, FLAG/ His tag 와함께발현하거나 pvl1393 plasmid 를이용하여 tag 없이목적단백질만발현시킬수있고, signal 서열이포함된 pab-bee, pab-bee -8xHis, pab-bee-fh plasmid 를이용하여분비형단백질또는막단백질로발현시킬수도있다. pab-bee 등에서제공되는 C-terminal His tag 는목적유전자의 ORF 마지막 stop codon 유무에따라 tagging 여부를결정할수있다. pacab3 vector 를이용하면 3 종이상의목적단백질을함께발현시킬수있다. BacPAK6 또는 BaculoGold vector 와함께사용할수있는 plasmid transfer vector 라면모두 ProEasy DNA 와함께사용할수있다. September 2010 7
pvl1393 ProFold -C1 (TaKaRa Code AV101) pab-gst pab-6xhis pvl-fh pab-6xhis-mbp pab-mbp pvl-gfp ProFold -ER1 (TaKaRa Code AV103) pab-bee pab-bee -8xHis pab-bee-fh pab-bee ProFold -PDI (TaKaRa Code AV106) ProEasy (TaKaRa Code AV109) Baculovirus genomic vector DNA cleaved with Bsu36.I ProGreen (TaKaRa Code AV100) 그림 3. Plasmid transfer vectors compatible with ProEasy. Target gene can be cloned into any of these plasmid vectors and transferred by forced recombination into ProEasy baculovirus genomic DNA. [3] AB Vector Technology- ProFold ProFold - 발현이까다로운단백질을위한 chaperone vector ProFold 은하나의 vector에서인간 chaperone 분자와목적단백질을동시에발현시키는기술로 AB Vector를통해서만이용할수있다. AB Vector 사에독점권이있는이기술을사용하여 chaperone 분자를코딩하는유전자를 polyhedrin 서열이있는 ( 추후목적유전자의삽입시이용 ) baculovirus DNA backbone에삽입시킨다. 몇몇목적단백질은제대로된 folding을형성하기어렵거나, 단백질응집 (inclusion body) 또는분해현상이일어나고유의생물학적활성을가진단백질을생산하기힘들다. 이러한문제의핵심은단백질이세포집단에서고유의접힘구조를형성하는데도움을주는확실한 chaperone 분자를필요로한다는것이다. 비록곤충세포가세포기능유지를위해적당한 chaperone을합성하지만, 비정상적으로많이발현되는목적단백질의 folding에는충분하지않을수있다. Baculovirus System에서는목적단백질의 folding을개선하기위해주요 chaperone 분자코딩유전자를 baculovirus genomic vector DNA에삽입하게된다 ( 그림 4). ProFold -C1 vector는인간의주요 chaperone인 Hsp40, Hsc70를포함하고있어목적단백질발현에기여한다. ProFold -ER1은 ER에서의단백질 folding을돕는소포체 (endoplasmic reticulum) 의주요 chaperone 분자를포함하며, Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) 또한발현하므로재조합 baculovirus 제작과함께후속실험에도도움을줄수있다. ProFold - PDI는 cycteine-rich protein의 folding을도와주는 disulfide isomerase (PDI) 를포함하여, GFP 유전자 그림 4. Schematic representation of ProFold vectors 는포함되어있지않다. AB Vector 의 ProGreen vector 는 chaperone 분자없이 GFP 유전자만가지고있어, 이를이용하여 chaperone 분자없이발현시킨단백질과 ProFold vector 로발현시킨단백질을비교하여목적유전자고유의활성을가지는지를확인하였다. 모든 vector 가목적단백질을높은수준으로발현시켰고, 단백질에따라차이는있었지만전체세포단백질의약 30% 까지목적단백질을발현시킬수있었다. 함께사용하는 plasmid transfer vectors ProEasy baculovirus genomic vector DNA 와함께사용하는 plasmid transfer vector 의선택범위는매우넓다. 그림 3 에나온 plasmid transfer vector 는모두 ProFold 또는 ProGreen baculovirus genomic DNA 와사용가능하다. 목적단백질은 GST, His, GFP, MBP 또는 His/ MBP, FLAG/His tag 를함께발현시킬수있고 pvl1393 plasmid vector 를이용하면 tag 없이발현시킬수있다. 또한분비형또는막단백질발현을위한강력한 signal sequence 를가진 pab-bee, pab-bee -8xHis, pab-bee-fh plasmid transfer vector 도판매하고있으며, 3 종이상의목적단백질을발현하는경우에는 pacab3 vector 를추천한다. 또한, BaculoGold, BacPAK6 vector 에서추천하는 BD Pharmingen 또는 Clontech 의 vector 와도함께사용할수있다. [4] 단백질발현과 chaperone 분자 단백질의 misfolding과 chaperone 분자 Ribosome으로부터단백질이빠져나올때, 일반적으로는구형으로접힌형태의단백질안쪽에위치하는소수성아미노산이밖으로노출되어있다. 마찬가지로세포질에서소포체의 lumen으로단백질사슬이이동 8 Life Science & Biotechnology
할때에도소수성아미노산은노출될수있다. 노출된소수성아미노산간의결합으로단백질사슬이일부접히고새로합성되어결과적으로단백질 (nascent protein) 이응집하게되고 inclusion body 를형성한다. Chaperone 분자는소수성아미노산간의결합으로인한단백질응집현상을막고, ATP 가수분해에의해단백질 (nascent protein) 의 folding 을활성화한다. 다만 chaperone 은새롭게합성되는단백질의양에따라소수성잔기를모두방어할만큼충분한양을필요로한다. 어떠한발현시스템에서도목적단백질의합성은자연상태보다빠르게진행되기때문에숙주세포가충분한양의 chaperone 분자를제공하지못하면 misfolding 이생길수밖에없다. 예를들면, polyhedrin promoter 를이용하는일반적인 baculovirus system 의경우세포내전체단백질발현량의 30% 이상을목적단백질로발현시킨다. Chaperone 의존적인많은목적단백질이 misfolding 되는것은곤충의 chaperone 을목적단백질과같은수준으로발현시켜해결할수있다. Misfolding 된단백질은분해되거나, 효소적분해가어려운형태로응집된다. 보통두가지과정은얼마나빨리응집현상이발생하느냐에따라응집이나분해가우세적으로일어나고정상적인구조를가진단백질은극히적은양만이합성된다. 실험이널리보급됨에따라, 단백질 misfolding 은단백질이매우낮은수준으로발현하거나 (misfolding 단백질은분해됨 ) 목적단백질이높은수준으로발현시킬수있었지만 inclusion body 를형성하는경우가많았다. 현상은매우다르지만, 근본적으로 chaperone 발현율에비해목적단백질이높은수준으로발현된다는점에서문제의원인은같다. 이러한문제는 AB Vector 가특허권을가진 ProFold vector 를사용하여목적단백질과 chaperone 을함께과발현시켜해결할수있다 ( 그림 5). ProFold vector 의사용목적단백질의기원에따라 ProFold vector 를선택한다. 예를들어, ProFold -ER1 은소포체에서단백질 follding 을담당하는 Calreticulin 과 Protein Disulfide Isomerase molecular chaperone 을발현한다 8-10). ProFold -C1 은세포질에서단백질 folding 을담당하는 chaperone 분자 Hsc70 과 Hsp40 의합성을발현한다. 그림 7 에서 Hsp40 이부분적으로 folding 되지않은발생초기단백질을잡고 Hsc70 로제공하는것을확인할수있다. 그러면 Hsc70 은 chaperone 의구조를변화시키고 ATP 가수분해를통해단백질을 folding 하여밖으로방출한다 11). Chaperone 에의한단백질 folding 실험은생물학적활성을가지기위한단백질의가용성과생산량을늘리기위해 E. coli expression system 에서널리사용되고있다 12-15). 그렇지만 chaperone 이제공된 E. coli System 에서도대부분의진핵유래단백질의생물학적인활성에필수적인 phosphorylation, disulfide bond 형성, N-linked glycosylation 등의단백질변형과정은일어나지않는다. 재조합 baculovirus system 은이러한변형단계를제공할수있고, 실제많은연구를통해 baculovirus system 에서 chaperone 에의한단백질 folding 이성공적으로진행됨을확인하였다. 이러한실험에서는일반적으로목적유전자를발현하는재조합 baculovirus 와 chaperone 분자를발현하는다른타입의 baculovirus 를곤충세포에함께도입시키는방법을이용한다 ( 그림 6A). 이와는반대로 ProFold vector 는하나의 genome 에서목적단백 질과다양한 chaperone 분자를생산하여효율을높이고목적유전자와 chaperone 간의정확한몰비를맞춰최적의활성을낼수있다 ( 그림 6B). 그림 5. ProFold vector improves the yield of soluble biologically active protein. Spodoptera frugiperda Sf9 cells were infected with recombinant baculoviruses expressing a protein of interest using either a conventional baculovirus vector (BacPAK6 ) or the ProFold -C1 vector which overexpresses Hsp40 and Hsc70 molecular chaperones along with the protein of interest. Cells were harvested at 60 h post infection, lysed in 50 mm Tris-HCl ph 8.0, 150 mm NaCl, 0.5% NP-40, and soluble and insoluble fractions were separated by centrifugation at 30,000g for 15 min. Proteins were separated in 11% SDS- PAGE and stained with Coomassie blue. 그림 6. Comparison of multi-vector chaperone systems used in prior studies (A) with Pro- Fold single vector chaperone system (B). September 2010 9
ProFold vector는 multi-vector system으로몇가지장점이있다. 첫째, 복수의 genome 대신하나의 vector gemone을사용하여숙주세포에대사적인스트레스를유발하지않는다. 약 134 kb의재조합 baculovirus genome은바이러스복제에필수적인많은단백질을암호화하고있고, 이는세포내단백질합성기구의주요용량을차지하고있다. 복수의 genome ( 그림 6A) 대신 1 개의재조합 baculovirus genome을도입함으로서 ( 그림 6B) 이러한소모를최소화하고목적단백질과 molecular chaperone의발현을최대화할수있다. 아마도가장중요한 ProFold TM 장점은거의모든세포에서동시에 molecular chaperone과목적단백질을예정된비율로합성하는것이다 (Fig. 6B). ProFold TM 시스템에서목적단백질의합성율은재조합 baculovirus 시스템에서얻을수있는최대치에가깝다. 또한, molecular chaperone의합성수준은잘발현된목적단백질과비교했을때더높지만이것이목적단백질의발현을약화시키는것은아니다. 예를들면, chaperone에대해비의존적으로 folding이일어나는 β -galactosidase를발현시켜일반적인 baculovirus vector와비교하였을때 ProFold TM vector는목적단백질을고발현시킬뿐만아니라, 동시에발현된 molecular chaperones도비슷한수준 (ProFold TM -C2와 ProFold TM -ER1 단백질프로파일 ) 으로발현시켰다. 이는단백질을코딩하는유전자를 baculovirus genome 내에서멀리위치시켜유전자발현을조절하는강력한 promoter간의간섭현상을줄임으로서가능했다. 복수의재조합 baculovirus를함께도입한세포는받아들인 3 가지타입의바이러스입자를얼마만큼도입했는지에따라목적단백질과 chaperone 분자를다른비율로발현시켰고, 그결과몇몇세포에서만효율적으로목적단백질이발현하고 folding하였다. 이러한사실을통해상호작용을하는단백질의대량생산에는복수의 vector를이용하는것보다하나의 vector genome을이용하는것이훨씬더효율적이라는사실을확실히확인할수있다 16). 그림 7. Drug target dependence on a molecular chaperone. A. The target is in complex with chaperone that keeps the target ligand-binding pocket in the conformation that allows ligand to bind. B. An isolated target has a different protein conformation that either does not allow ligand to bind, or allows it to bind with low affinity. At the same time target may be able to bind with comparable or better affinity to a slew of other compounds that would produce hits during screening, but would have little relevance to in vivo trials. Well known example is Hsp90 molecular chaperone that modulates various targets 18). AB Vector 는 Hsp90 에의해생산되는단백질양을높일수있도록 Hsp90 multi-chaperone system 을발전시켰고, chaperone 분자와복합체를이룬목적단백질의정제를위한기술도함께연구하였다. 목적단백질 -chaperone 복합체의정제예는그림 8 에서확인할수있다. Hsp90 multi-chaperone system and target protein-chaperone complexes Hsp90 는 Hsp70 에비해좀더특화된 molecular chaperone 이다 17). 본질적으로 Hsp90 은 Hsp70/Hsp40 folding 기작에추가되며몇몇단백질의고유구조를형성하기위해서필요하다. Hsp70 은소수성아미노산이노출되어있는다양한종류의단백질과결합하는반면, Hsp90 결합은 multi-protein hsp90/hsp70-based chaperone 기작에의해 Hsp90 과복합체를형성하는 signal transduction 단백질에국한되어있다. Hsp90 과결합하는단백질은간혹 Hsp90 과의복합체형성으로는불완전한생물학적활성을나타내는경우가있다 ( 그림 7). 그림 8. Purified target protein-chaperone complexes. Ligand-binding domains of the following receptors were produced using Hsp90 multi-chaperone system and purified. AhRaryl hydrocarbon receptor, major drug toxicity mediator; PXR- pregnane X receptor, major drug-drug interaction target; GR- glucocorticoid receptor, pain, depression, diabetes and obesity target ; MR-mineralocorticoid receptor, cardiovascular diseases target; PRprogesterone receptor, breast cancer, uterine fibrosis and endometriosis target target. HER-2- catalytic domain of HER-2 (ErbB2) receptor tyrosine kinase in complex with cdc37 molecular chaperone, major breast cancer target. Hsp90 chaperone 분자는 protein kinase 19), steroid/nuclear receptor 20~21), Hepatitis B, C, influenza 와 herpes virus polymerase 22~23), inflammasome component 26), enos-endothelial nitric oxide synthase 27), prostaglandin E synthase 28), telomerase 29) 과같은많은수의목적단백질의특성을조절하는결합파트너로서제공된다. 이들단백질은주요암, 당뇨, 염증, 통증, 알츠하이머, 심장혈관장애및 antiviral target 을대표하며, 지금까지완전한생물학적활성에필요한목적 protein-chaperone 복합체형태로는이용불가능하다. 10 Life Science & Biotechnology
관련제품 제품명 용량 TaKaRa Code ProGreen 2.5 μg AV100 ProFold-C1 2.5 μg AV101 ProFold-C2 2.5 μg AV102 ProFold-ER1 2.5 μg AV103 ProFold-PDI 2.5 μg AV106 ProFold-PDI* 2.5 μg AV107 ProFold-0 2.5 μg AV108 ProEasy 25 μl AV109 ProEasy 125 μl AV110 pvl1393 25 μg AV200 pacab3 25 μg AV201 pab-bee 25 μg AV202 pab-bee-8xhis 25 μg AV203 pab-bee-fh 25 μg AV204 pab-6xhis 25 μg AV205 pab-gst 25 μg AV206 pab-mbp 25 μg AV207 pab-6xhis-mbp 25 μg AV208 pvl-gfp 25 μg AV209 pvl-fh 25 μg AV210 NC (negative control) 1 ml (10 8 pfu/ ml ) AV300 GC (green control) 1 ml (10 8 pfu/ ml ) AV301 GCP (green control plasmid) 50 μl (0.2 μg / μl ) AV302 FoldHelper-ER3 2 ml (5 10 7 pfu/ ml ) AV400 FoldHelper-104 1 ml (10 8 pfu/ ml ) AV401 FoldHelper-104P 1 ml (10 8 pfu/ ml ) AV402 FoldHelper-57P 1 ml (10 8 pfu/ ml ) AV403 FoldHelper-P 1 ml (10 8 pfu/ ml ) AV407 C1 Kit 1 Kit AV500 C2 Kit 1 Kit AV501 ER1 Kit 1 Kit AV502 ER1-bee kit 1 Kit AV503 Controls Kit 1 Kit AV505 이와같이 Baculovirus Expression System 은 E. coli System 에비해높은효율로생물학적활성을가진목적단백질을생산할수있어다양한단백질생산에이용되고있다. Takara Bio 에서는 Baculovirus Expression System 에사용되는다양한 vector 와 viral genomic DNA 관련제품을판매하고있다 ( 자세한정보는 www.takara.co.kr 의각제품페이지를참조 ). 참고문헌 1. Carmeron et. al., Trands in Biotechnology., 7, 66-70, 1989 2. Akermoun et. al., Protein FxprPurif 2005., 44: 65-74 3. Smith et al. Mol Cell Biol., 3: 2156-65, 1983 4. Pennock et al., Mol Cell Biol., 4: 399-406, 1984. 5. Kitts and Possee. Biotechniques., 14: 810-7, 1993 6. Luckow et al., J Virol., 67: 4566-79,1993 7. Pijlman et al., J. Gen. Virol., 84: 2669-2678, 2003 8. Ireland et al., Methods Mol. Biol., 347:331-42, 2006; 9. Maattanen et al., Biochem. Cell Biol., 84: 881-9, 2007 10. Appenzeller-Herzog and Ellgaard, Biochim Biophys Acta., 1783:535-48, 2008 11. Meimaridou E et al., J. Mol. Endocrinol., 42: 1-9, 2009 12. Thomas et al., Appl Biochem Biotechnol., 66: 197-238, 1997 13. Xu et al., Biotechnol Prog., 21: 1357-65, 2005 14. Butcher et al., Appl Microbiol Biotechnol., 73: 1282-9, 2007; 15. Bleimling et al., Protein Expr Purif., Epub ahead of print, 2008 16. Belyaev et al., Gene, 156: 229-233, 1995 17. Pratt and Toft, Exp Biol Med (Maywood)., 228:111-33, 2003 18. Pratt et al., J Biol Chem., 283:22885-9, 2008 19. Caplan et al., Trends Cell Biol., 17:87-92, 2007 20. Pratt et al., J Biol Chem., 283:22885-9, 2008 21. Sumanasekera et al., J Biol Chem., 278:4467-73, 2003 22. Hu J et al., J Virol., 76:269-79, 2002 23. Miyamura T et al. EMBO J., 25:5015-25, 2006 24. Naito T et al., J Virol., 81:1339-49, 2007 25. Burch & Weller. J Virol., 79:10740-9, 2005 26. Mayor A. et al., Nature Immunology., 8:497-503, 2007 27. Chatterjee & Catravas. Vascul Pharmacol., 49:134-40, 2008 28. Tanioka et al., Biochem Biophys Res Commun., 303:1018-23, 2003 29. Elmore et al., Oncol Rep., 20:613-7, 2008 September 2010 11