The Korean Journal of Microbiology, Vol. 41, No. 1, March 2005, p. 18-23 Copyrightc2005, The Microbiological Society of Korea 새우양식장에서분리한 Lactobacillus sp. JK-8 의생리적특성 천재우 마채우 오계헌 * 순천향대학교생명과학부 이연구는새우양식장에서분리된 Lactobacillus sp. JK-8 의생리적특성을규명하기위하여실시되었다. 균주 JK- 8 을 MRS 배지에서배양하였고, 형태및생리학적특성에대하여조사하였으며, BIOLOG 시험을통하여이세균은 Lactobacillus 속으로동정되었다. 배양기간동안에균주 JK-8 의생장과 ph 변화를조사하였으며, 생성되는유기산 (lactic acid 와 acetic acid) 은 JK-8 배양의생장과비례하는것을확인하였다. Lactic acid 와 acetic acid 의농도는각각 192.8 mm 과 43.6 mm 이었으며, 초기 ph 7.0 은배양기간동안 3.8 로감소하였다. 8 가지대상세균에대하여 5 배로농축된배양상등액에처리하여살균효과를조사하였으며, 이연구에서모든대상세균들은배양 3 시간이내에완전히살균되었다. ph 조절을하지않은 JK-8 배양에서대상세균들에대한항균효과가있는것이관찰되었으나, ph 가조절된배양에서는거의관찰되지않았다. 대사산물로서 lactic acid 와 acetic acid 의분리하기위하여 HPLC 를사용하였으며, GC-MS 를이용하여이들대사산물을확인하였다. Key words killing effect, Lactobacillus sp. JK-8, marine bacterium, organic acid 양식산업은오늘날급속히성장하는수산업의한분야로서, 건강에대한인식의전환에따라수산물의수요가지속적으로증가하여경제적인중요성이인정되고있다. 우리나라는삼면이바다로서연안의대부분의면적이바다양식업으로이용되고있으며, 내륙에도많은수계가분포하고있어내수면양식업에도관심이모아지고있다 (11). 양식은제한된구역에서고밀도로사육하거나수질환경의악화등으로양식어류의면역력이저하되고병원성세균이나기생충에의한감염이쉬운환경에직면하는경우가많다 (8, 17). 현재국내에서는질병치료및감염예방을위해서단독또는사료에첨가되어여러종류의항생제들이사용되고있다 (11). 이러한항생제의계속적인사용은내성을갖는미생물의증가를초래하게되고내성균은사람에게전염될수있어양식어자체의장내세균총의파괴와함께항생제의축적으로생육에지장으로초래하거나식용시악영향을미칠수있다. 특히항생제의계속적인사용은장내에서서식하는유익세균들의생물학적균형을깨뜨려감염방어기작에이상이생겨병원성미생물의침입이용이하게된다 (8, 19). 따라서, 항생제남용을억제하고질병을예방할수있는 probiotics의개발이필수적으로대두되고있다. Probiotics는사람또는동물에대해장내균종의성질을개선시켜숙주에게유익한효과를주는살아있는미생물의단독또는혼합배양물을의미하며, 이들세균은장내균총의안정화, 유해세균의정착억제에따른부패산물생성감소및질병예방, 면역활성화작용, 항암작용, 콜레스테롤저하등의기능을갖고 *To whom correspondence should be addressed. Tel: 041-530-1353, Fax: 041-530-1350 E-mail: kyeheon@sch.ac.kr 있는것으로알려져있다 (7, 16). 오늘날 probiotics의이점이확대되면서여러산업분야에서널리응용되고있다. 이러한다양한산업분야가운데, 최근에노르웨이나벨기에를포함하는양식산업의선진국들에서는환경친화적인양식생산과양식장수질환경의개선을위한항생제를대처할대안으로 probiotics의연구가활발히진행되어지고있다. 또한일본에서는갑각류양식에서미생물학적질병통제에대한연구를수행해오고있다 (8, 19, 22). Probiotics로서널리이용되고있는대표적인미생물은유산균 (lactic acid bacteria) 으로 Pediococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Bifidobacterium 등이있다 (7, 17, 19). 특히 Lactobacillus와 Bifidobacterium은 probiotics로가장많이이용되고있는데, Lactobacilli는자연계뿐만아니라동물의장과발효식품등에서도쉽게발견되고, 탄수화물을최종대사산물인젖산으로전환시키는생리적특성을가지고있다 (10,16). 또한 Lactobacillus 종은다양한세균에대한항균활성에관한연구가많이진행되고있는데, 항균활성인자로서 organic acid, hydrogen peroxide, reuterin, diacetyl, acetaldehyde 그리고 bacteriocin 등이보고되고있다 (1, 21). Lactobacillus 종이생산하는 bacteriocin은그람양성, 음성세균에대해넓은항균스펙트럼을가지고있는것으로보고되고있다 (5, 13, 18, 20). Beatriz 등 (3) 은 Lactobacillus plantarum LL441에의해서생성되는 plantaricin C의항균활성실험에서세포막에구멍이뚫어져그람음성세균생장이억제된다고보고한바있다. 또한 Michael 등 (12) 의연구에서 Lactobacillus reutei LTH2584에의해생성되는 reutericyclin은 Bacillus subtilis와 Bacillus cereus에대해항균활성을갖고내생포자의발아을억제한다고보고하였다. 우리나라에서양식새우의생산량은 2001년도에 3,250톤이었던 18
Vol. 41, No. 1 새우양식장에서분리한 Lactobacillus sp. JK-8 의생리적특성 19 것이 2003년도에약 2,100톤으로크게감소되었는데이는양식기간중에발생한수질환경악화와질병이주요원인으로서많은경제적손실을입고있는실정이다 (11). 본연구에서는새우양식장에서분리한 Lactobacillus 종에대한생리학적특성조사를하였으며, 이균주를이용하여해양에존재하면서어류에질병을일으키는여러가지병원체에대한살균력을조사하고, 또한분석기기를이용하여살균물질을확인하였다. 균주의확보와배양조건 재료및방법 충남태안군소재순천향대학교부설해양수산연구소새우양식장에서채취한물시료를 0.3% CaCO 3 가포함된 MRS (Difco, Detroit, USA) 고체평판배지에도말하고 25 o C에서배양하여투명대형성이탁월하고, sheep blood agar 배지에도말하여비용혈성이확인된단일세균을선택분리하고 JK-8으로명명하였다. 배지는인공해수 (aquarium system, Instant Ocean, Sarrebourg, France) 를사용하여제조하였다. 세균의생장은분광광도계 (V-550 UV/Vis Spectrophotometer, Jasco, Japan) 를사용하여파장 660 nm 에서의흡광도로나타내었다. 세균 JK-8은배지에접종하여 25 o C에서분당 160 회로회전하는진탕배양기에서배양하였다. 분리세균의생리화학적특성조사및동정 분리세균 JK-8은 MRS 고체평판배지에서단일집락의모양을확인하고, 그람염색후위상차현미경으로세균의형태학적특정을조사하였다. 분리세균의생리생화학적특성은알려진방법에의하여실시하였다 (9). 분리세균 JK-8의동정은여러가지생리생화학적시험과 GP2 Microplate TM Identification System (BIOLOG, Hayward, USA) 를이용하여동정하였다. 사용된배지는 BUG agar와 5% 의 sheep blood를혼합하여만들었다. 세균현탁액을 Biolog Turbidimeter (BIOLOG, Hayward, USA) 를이용하여 20% 까지맞추고 GP2 MicroPlate의 96개의 well에각각 150 µl씩분주하 였고, 30 o C에서 4-6시간동안배양하였다. 배양된 MicroPlate의결과는직접확인하였으며, MicroLog TM database software를통해동정하였다. 분리세균 JK-8 의배양상등액제조 배양상등액의다른병원성세균에대한살균력을조사하기위하여먼저 Schellinger(21) 방법에따라배양상등액을제조하였다. 분리세균 JK-8을 MRS broth에접종하여 25 o C에서 48시간동안배양한후 2,000 g에서 10분간원심분리하여세균을제 거하고 0.2 µm syringe filter 로여과한후동결건조기를이용하여 5 배농축하였다. 농축배양상등액의살균측정 대상세균인 Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi, Edwardsiella tarda를각각액체배지에접종한후대수생장기를거치면서파장 660 nm에서 O.D. 값이 0.8일때, 원심분리용튜브에넣고 2,000 g에서 10 분간원심분리를실시하였다. 상등액은버리고얻어진균체를 10 ml phosphate buffer (ph 7.0) 로 3회세척하였다. 각각의대상세균을미리제조된 5배의농축배양상등액에세균의최종농도가 10 7-10 8 cells/ml 되게접종하였다. 농축된배양상등액으로처리된이들대상세균을각각 30분간격으로고체배지에 100 µl를평판도말하여 25 o C에서배양한후형성된집락을계수하여농축액의농도와노출시간에따른각세균의사멸율을측정하였다. 항균력확인배양상등액에서얻어진농축배양상등액의항균력은 plate diffusion assay 방법을통하여확인하였다. 대상세균을영양배지와 brain heart infusion (Difco, Detroit, USA) 고체배지에도말하고 paper disc를올려놓은후, 농축배양상등액 50 µl를흡수시켜 37 o C에서 24시간생장시켜 disc 주변에생성된투명대의크기를측정하였다. HPLC에의한유기산분석분리세균 JK-8에의해생성되는유기산분석을위하여 HPLC 로분석하였다. 분석에사용된 HPLC system은 SPD-10A UV/ Vis detector 가부착된 Shimazu 사의 LC-10AT 제품을사용하였으며, Supelco 사의 Supelcogel C-610H 컬럼 (300 mm 7.8 mm, 입자크기 9 µm) 을이용하였다. Mobile phase는 0.1% phosphoric acid를공극직경이 0.45 µm membrane filter (Pall-Gelman, East Hills, USA) 에여과하여사용하였다. HPLC 작동조건에서 mobile phase의 flow rate는 0.5 ml/min이었으며 UV detector의파장은 210 nm으로맞추어사용하였다. 유기산은분석용표준품과배양액으로부터채취한시료를대상으로정량분석하였다. Lactic acid와 acetic acid를각각 1:1의비율로혼합하여표준품을만들었으며, 0.45 µm syringe filter로여과하고, 10 µl Hamilton syringe를사용하여 HPLC injector 내에주사하여정량분석을위한표준곡선을작성하였다. 배양액내에생성된유기산을정량하기위하여채취한시료는 2,000 g에서 10분간원심분리한후 0.45 µm syringe filter로여과하여분석하였다. GC-MS에의한유기산확인분리세균 JK-8에의해생성된유기산은 GC-MS 분석을통하여구조를확인하였다. 사용된 GC-MS 시스템은 electron ionization dectector가장착된 Shimazu 사의 GCMC-QP5050 제품이었으며, 컬럼은 Shimazu 사의 CBP5-M25 capillary 컬럼 (25 m 0.22 mm, 입자크기 0.25 µm) 을사용하였다. GC-MS 작동조건에서 carrier gas는헬륨이었으며, flow rate는 1.5 ml/min이되도록하였고, injection volume은 1 µl, injector temperature는 250 o C, oven temperature에서 80 o C로시작하여 10 o C/min 상승시켜최종온도가 270 o C가될때까지총 15분간분석하였다. MS
20 Jae-Woo Chun et al. Kor. J. Microbiol data는 Shimazu 사의 library (NIST, Shimazu Co., Japan) 를이용하여분석하였다. 시료준비는배양액으로부터채취한시료를 2000 g에서 10분간원심분리하고상등액을동결건조하여수분 을제거하고, dimetyl sufoxide (Sigma Co., St. Louis, USA) 에녹여 0.45 µm syringe filter로여과하여사용하였다. 세균의분리및특성 결과및고찰 새우양식장에서채취한물시료로부터 0.3% CaCO 3 가포함된 MRS 고체평판배지에서투명대를형성하는 3개의유산균을선별하였다. 선별된유산균들가운데용혈성시험을통해비용혈성으로확인된균주인 JK-8을선정하여본연구에사용하였다. 분리세균은그람염색을통하여형태학적분석을실시하였으며, 위상차현미경으로관찰한결과그람양성세균의간상형으로관찰되었다. 집락의색깔은흰색으로불투명하였다. Table 1에서보여주는바와같이, indole 형성여부에있어서음성으로나타났으며, methyl red 시험에서는양성, 그리고 Voges-Proskauer 시험에서는음성으로조사되었다. Klingler iron agar 배지에서조사한 disulfhydrase에의한 H 2 S의형성은음성으로나타났으며, gelatinase와 catalase의존재여부시험에서도음성으로확인되었다. Oxidase 존재여부와 starch 분해여부시험에서도음성으로확인되었고, urease 존재여부에서도음성으로확인되었다. Simmon's citrate 이용여부에서는양성으로나타났으며, lithmus milk 시험에서펩톤화 (peptonization) 는이루어지지않았다. 분리세균의동정 형태학적및생리학적특성을관찰한유산균 JK-8에대하여동정을실시하였다. JK-8에대하여다양한탄소원이용여부를동정하는 BIOLOG system을사용하였고, 그결과를 Table 2에나타내었다. MicroLog TM database software를이용하여분석한결과, JK-8은 Lactobacillus plantanum으로동정되었으며, 본연구 Table 1. Morphological and physiological characteristics of the strain JK-8 Morphological characteristics Cell shape Long rod (approx. 5 µm) Gram staining Positive Physiological characteristics Indole production - Methyl red + Voges-Proskauer - Starch hydrolysis - Gelatin hydrolysis - Catalase - Oxidase - Simmon's citrate + H 2 S(KIA) - Litmus milk (peptonization) - Phenylalanine deaminase - Table 2. Physiological and biochemical characterization of the strain, JK-8 using the BIOLOG Analysis System Physiological & biochemical tests Water - D-Tagatose + α-cyclodextrin - D-Trehalose + β-cyclodextrin - Turanose + Dextrin + Xylitol - Glycogen - D-Xylose + Inulin - Acetic acid + Mannan - α-hydroxybutyric acid - Tween 40 - β-hydroxybutyric acid - Tween 80 - γ-hydroxybutyric acid + N-Acetyl-D-glucosamine + ρ-hydroxyphenyl acetic acid - N-Acetyl-D-mannosamine - α-ketoglutaric acid - Amygdain - α-ketovaleric acid + L-Alabinose - Lactamide - D-Arabitol - D-Lactic acid methylester - Arbutin - L-Lactic acid - Cellobiose + D-Malic acid - D-Fructose + L-Malic acid - L-Fucose + Methylpyruvate - D-Galactose - Mono-metylsuccinate - D-Galacturonic acid - Propionic acid - Gentiobiose + Pyruvic acid - D-Gluconic acid + Succinamic acid - α-d-glucose + Succinic acid - m-inositol - N-Acetyl L-glutamic acid - α-d-lactose + Alaninamide - Lactulose + D-Alanine - Maltose + L-Alanine - Maltoriose - L-Alanyl-glycine - D-Mannitol + L-Asparagine - D-mannose + L-Glutamic acid - D-Melezitose + Glycyl-L-glutamic acid - D-Melibiose - L-Pyroglutamic acid - α-methyl D-galactoside + L-Serine - β-methyl D-galactoside + Putrescine - 3-Methyl glucose + 2,3-Butanediol - α-methyl D-glucoside - Glycerol + β-methyl D-glucoside - Adenosine + α-methyl D-mannoside - 2-Deoxyadensine + Palatinose - Inosine - D-Psicose + Thymidine + D-Raffinose + Uridine - L-Rhamnose - Adenosine-5'-monophosphate - D-Ribose + Thymidine-5'-monophosphate - D-Salicin + Urudine-5'-monophosphate - Sedohepulosan - Fructose-6-phosphate + D-Sorbitol + Glucose-6-phosphate - Stachyose - Glucose-6-phosphate - Sucrose - D-L-α-Glycerolphosphate -
Vol. 41, No. 1 새우양식장에서분리한 Lactobacillus sp. JK-8 의생리적특성 21 에서는 Lactobacillus sp. JK-8 로명명되었다. 분리세균의생장에따른 ph 변화와항균활성새우양식장에서분리한 Lactobacillus sp. JK-8을 MRS 액체배지에접종하고세균의생장과유기산생성, 그리고배양기간중의 ph 변화를 6시간간격으로측정하였다 (Fig. 1). Lactobacillus sp. JK-8은배양 12시간이후부터 36시간까지빠르게생장하였으며, 이와관련하여 ph도급격하게감소되었다. 배양초기의 ph는 7.0이었으나 48시간이지난최종 ph는 3.8로측정되었다. JK-8의생장에따른유기산생성은 HPLC를이용하여정량분석한결과, 배양시간이경과됨에따라 ph는감소하였으며이에반비례하여 lactic acid와 acetic acid는증가하는것으로나타났다. 접종한지 48시간지난후 lactic acid와 acetic acid는각각 192.8 mm과 43.6 mm이생성되었다. 이분리균주는이들유기산을배지내로분비하여 ph 감소에직접적인영향을미치는것이확인되었다. Elisabeth 등 (6) 은우유에서분리한 Lactobacillus 종과 Lactococcus 종이 lactic acid를생성시켜배양 24시간이후에 ph 를 5 이하로감소시키고 Bacillus cereus의생장을억제한다고보고한바있다. 또한 Schillinger 등 (21) 은 Lactobacillus는탄수화물로부터 lactic acid와 acetic acid를형성해 ph를감소시키고항균활성을나타낸다고보고하였다. 분리균주 JK-8의항균활성확인은 plate diffusion assay 방법을이용하여배양상등액을대상세균에노출시켜항균활성을확인하였으며, 배양기간이경과함에따라 disc 주변에투명대가커지는것이관찰되었다. Ogunbanwo 등 (14, 15) 은 Lactobacillus sp. OG1에의한항균물질생성에대한연구에서대수성장기부터항균물질을생성하고정지기에항균물질을최대로생성하며대수생장기후반기에강한항균활성을나타낸다고보고하였다. 본연구와병행하여동일한조건에서분리한 Lactobacillus sp. JK- 11는 JK-8에서생성되는유기산과비교하여현저히적은양의 45.7 mm lactic acid와 11.8 mm acetic acid를생성하였으며, 배양 48시간이후에 ph는 7.0에서 5.4로감소하였다. 그러나 JK- 11 배양에서살균효과를가지는 4 kda의 bacteriocin이생성되는것을확인하였다 (JK-11의결과는본논문에포함하지않았음 ). Fig. 2. Killing of pathogens by 5x culture supernatant of the strain JK-8; control ( ), Vibrio parahemolyticus ( ), V. harveyi ( ), Staphylococcus aureus ( ), Salmonella typhimurium ( ), Shigella sonei ( ), Escherichia coli ( ), Streptococcus pyrogenes ( ), Edwardsiella tarda ( ). At each time interval, the number of colony-forming units per ml of culture was determined. 농축배양상등액에대한병원성세균의살균율 배양상등액에의한병원성세균의살균율을측정하기위해서분리세균 JK-8의배양상등액을 5배농축시킨후, 이농축상등액을새우양식에서잠재병원성세균 (potentially pathogenic bacteria) 으로간주되는 8가지세균에대하여노출시키고, 30분간격으로평판도말하여살균율을관찰하였다 (Fig. 2). Vibrio parahaemolyticus 와 Vibrio harveyi는 30분이내에모두사멸되어 Lactobacillus sp. JK-8에가장민감한것으로나타났다. Salmonella typhimurium, Shigella sonnei와 Edwardsiella tarda 는배양상등액에노출된지 1 시간이지나면서집락을관찰할수없었으며, Escherichia coli는 2시간이내에집락을관찰되지않았다. 그람양성세균인 Staphylococcus aureus와 Streptococcus pyogenes는농축액에덜민감하여서노출된후각각 1시간 30분과 3시간이내에모두사멸되었다. JK-8의항균물질을확인하기위하여 catalase를처리하고 ph를중성으로만든농축배양액과처리하지않은상등액을 plate diffusion assay 방법으로비교하였다 (Fig. 3). 병원균 Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi, Edwardsiella tarda에대한항균활성실험에서 ph가조절되지않은농축상등액은뚜렷한투명대가형성되었지만, ph가조절된농축배양액에서는종류에따라희미한투명대가형성되거나거의형성되지않았다. 이러한결과를통해서볼때, JK-8의살균력은주로배양기간동안생성되는유기산에기인하는하는것으로사료된다. Fig. 1. Growth of the strain JK-8, measured as optical density ( ), associated with the parallel formation of lactic acid ( ) and acetic acid ( ), and ph changes ( ). HPLC와 GC-MS에의한유기산분석 Lactobacillus sp. JK-8의배양기간동안대사물질로서배양액에서생성되는유기산을조사분석하였다. 배양초기에는거의존재하지않았던유기산이배양이진행됨에따라 JK-8 균주의생장과비례하여생성되었다. 얻어진배양액시료는 HPLC를이용하여분석하였으며, lactic acid와 acetic acid가혼합된 authentic
22 Jae-Woo Chun et al. Kor. J. Microbiol Fig. 3. Inhibition of target pathogens by 5x culture supernatant of the strain JK-8. Filter discs soaked with the supernatants were placed onto lawn plates of Vibrio parahemolyticus (A), V. harveyi (B), and Edwardsiella tarda (C), respectively; ph of the supernatants were adjusted to 7.0 (1) or non-adjusted (ph 3.8) (2). standard와 비교하여 16.326 min과 19.301 min에서 동일한 peaks 내는 것으로 보고하였다. 그러나 lactic acid 생성세균이 해양에서 가 탐침되었다(Fig. 4). 이들 두 peaks는 잠정적으로 각각 lactic 분리되어 양식장에서 발생하는 질병을 조절할 목적으로 연구하는 acid와 acetic acid로 명명하였다. 사례는 거의 발표된 바 없다. 본 연구는 향후 이 분리세균을 호염 배양중에 생성된 유기산을 확인하기 위하여 48시간이 경과한 성 프로바이틱스로 활용하는 방향으로 진행될 것이다. 배양액을 동결건조하고 물 층을 제거한 후 DMSO에 녹여서 1 µl를 GC-MS에 injection하여 분석하였다(Fig. 5). GC-MS로 분석 감사의 글 한 결과, retention time이 2.850 min인 peak A는 acetic acid였으 며 6.492 min인 peak C는 lactic acid로 확인되었다. Retention time이 5.517 min인 peak B는 분석을 위한 용매로 사용된 DMSO 본 연구는 해양수산부의 수산특정연구개발사업의 지원을 받아 수행되었으며 이에 감사드립니다. 였으며 이들 peak는 각각 MS library를 통해 확인되었다. 젖산 형성 세균에 의한 병원성 미생물의 살균효과는 많은 연 구가 진행되고 있으며 이에 대한 많은 관심이 집중되고 있다. Aslim 등(2)은 치즈 제조장에서 분리한 유산균 19종은 Staphylococcus aureus, Yersinia enterococlitica, 그리고 Escherichia coli에 대해 항균효과를 가진다고 보고하였다. 또한 Bernet-Camard 등(4) 은 사람에서 분리한 Lactobacillus acidophilus LA1이 Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhi-murium, Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, 그리고 Enterobacter cloacae와 같은 병원성 세균에 대해 살균효과를 나타 Fig. 4. HPLC chromatograms of a authentic mixture (A) and of culture samples of JK-8 at the beginning (B) and after 24 hrs (C) and 48 hrs of incubation (D). Fig. 5. GC-MS data for the culture analyzed after 48 hrs of incubation. MS fragmentation patterns of the compounds representing the two peaks (A and C) in the TIC are indicated and the respective chemical structures of the compounds are also given. Peak B was DMSO used as a solvent.
Vol. 41, No. 1 새우양식장에서분리한 Lactobacillus sp. JK-8 의생리적특성 23 참고문헌 1. Aly, S., A.T. Cheik, H.N. Imael, and S.T. Alfred. 2004. Antimicrobial activities of lactic acid bacteria strains isolated from burkina faso fermentated milk. J. Nutri. 3, 174-179. 2. Aslim, B. Z.N. Yuksekdag, E. Sarikaya, and Y. Beyatli. 2004. Determination of the bacteriocin-like substances produced by some lactic acid bacteria isolated from Turkish dairy products. Swiss Soc. Food Sci. & Techno. 37, 663-667. 3. Beatriz, G., G. Erwin, R.S. Edmund, J.M. Arnold, E.S. Juan, and N.K. Wil. 1996. Bactericidal mode of action of plantaricin C. Appl. Environ. Microbiol. 62, 2701-2709. 4. Bernet-Camard, M.R., V. Lievin, D. Brassart, J.R. Neeser, A.L. Servin, and S. Hudault. 1997. The human Lactobacillus acidophilus strain LA1 secretes a nonbacteriocin antibacterial substance(s) active in vitro and in vivo. Appl. Environ. Miocrobiol. 63, 2427-2753. 5. Chung, W. B., W. S. Soe, J. Y. Cha and Y. S. Cho. 2003. Isolation and characterization of Lactobacillus sp. FF-3 for probiotics production from korean dongchimi. Kor. J. Food. Presevation 3, 406-410. 6. Elisabeth, R., G. I. Andersen-Borge, T. Langsrud, and T. Sorhaug. 2003. Inhibition of Bacillus cereus by strains Lactobacillus and Lactococcus in milk. Int. J. Food Microbiol. 89, 205-212. 7. Fuller, K. 1989. Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 66, 1365-378. 8. Gatesoups, F.J. 1999. The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture 180, 147-165. 9. Gerhart, P., R.J. Fellows, D.C. Cataldo, R.M. Nester, W.A. Wood, N.R. Kreig, and G.B. Phillips. 1981. Methods for General and Molecular Bacteriology. American Society for Microbiology. USA. 10. Leal-Sanchez, M.V., R. Jimennz-Diaz, A. Maldonado-Barragan, A. Garrido-Fernandez and J. L. Ruiz-Barba. 2002. Optimization of bacteriocin production by batch fermentation of Lactobacillus plantarum LPCO10. Appl. Environ. Microbiol. 69, 4465-4471. 11. Lim, H.J., J.H. Park and I.K. Jang. 2004. Effect of probiotics on water quality in the shrimp (Fenneropenaeus chinensis) ponds. J. Kor. Fish. Soc. 37, 91-97. 12. Michael, G.G., H. Alexandra, W Jens, J. Gunther and P.H Walter. 2000. Characterizaton of reutericyclin produced by Lactobacillus reuteri LTH2584. Appl. Environ. Microbiol. 66, 4325-4333. 13. Mortvedt, C.I., J. Nisen-Meyer, K. Sletten, and I.F. Nes. 1991. Purification and amino acid sequence of lactocin S, A bacteriocin produced by Lactobacillus sake l45. Appl. Environ. Microbiol. 57, 1829-1834. 14. Ogunbacwo, S.T., A.L. Sanni, and A.A. Onilude. 2003. Influence of cultural conditions on the production of bacteriocin by Lactobacillus brevis OG1. Afr. J. Biotechnol. 2, 179-184. 15. Ogunbacwo, S.T., A.L. Sanni, and A.A. Onilude. 2003. Characterization of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum F1 and Lactobacillus brevis OG1. Afr. J. Biotechnol. 2, 219-227. 16. Orrhge, K. and C.E. Nord. 2000. Bifidobacteria and lactobacilli in human health. Drugs Exp. Clin. Res. 26, 95-111. 17. Paek, N.S., Y.B. Lim, and Y.M. Kim. 2001. Antibacterial activity and growth promotion in aquacultured fish by probiotics. Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 29, 56-61. 18. Park, K.J. and Y.W. Ryu. 1995. Antibacterial activity of Lactobacillus sp. KJ-5 isolated from pig feces. Kor. J. Biotechnol. Bioeng. 10, 553-560. 19. Ringo, E. and F. J. Gatesoupe. 1998. Lactic acid bacteria in fish: a review. Aquaculture 160, 177-203. 20. Rufino, F.D., L.R. Jose, P.C. Declan, H. Helge, F.N. Ingolf, H.S. Jnut, and J.W. Philip. 1995. Purification and partial amino acid sequence of plantaricin S, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum LPCO10, the activity of which depends on the complementary action of two peptides. Appl. Environ. Microbiol. 61, 4459-4463. 21. Schillinger, U., F.K. Lucke. 1989. Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat. Appl. Environ. Microbiol. 55(8), 1901-1906. 22. Yang, B.G., J.G. Lee, and M.S. Heo. 2003. Antibacterial activity of Lactobacillus sakei BK19 against fish pathogenic bacteria. Kor. J. Microbiol. 39, 56-61. (Received February 18, 2005/Accepted March 11, 2005) ABSTRACT : Physiological Characterization of Lactobacillus sp. JK-8 Isolated from Shrimp Aquaculture Pond Jae-Woo Chun, Chae-Woo Ma, and Kye-Heon Oh* (Department of Life Science, Soonchunghyang University, Asan, Chungnam 336-745, Korea) The purpose of this work was to investigate the physiological characteristics of Lactobacillus sp. JK-8 isolated from a shrimp aquaculture pond. The strain JK-8 was grown on MRS media, and morphological and physiological characteristics of the strain were examined. The bacterium was identified as a strain of the genus Lactobacillus on the basis of BIOLOG test. Strain JK-8 produced both lactic acid and acetic acid, which were responsible for the ph decrease during growth. Concentrations of lactic acid and acetic acid increased to 192.8 mm and 43.6 mm, respectively, and the initial ph 7.0 of the cultures decreased to 3.8 at the end of incubaction. The bacteriocidal effect against eight target bacteria was examined with 5-fold concentrated culture supernatants. All bacteria tested in this work were completely killed within 3 hrs after treatment with the culture supernatant. The bacteriocidal effects were clearly observed, only when the ph of the culture supernatants were not adjusted. HPLC was used to reslove lactic acid and acetic acid in the culture solution, and GC-MS was used to verify the metabolites.