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1 레티노인산에의한각질형성세포에서의 IL-8 발현의기전 연세대학교대학원 의학과 정예리

2 레티노인산에의한 각질형성세포에서의 IL-8 발현의기전 지도김수찬교수 이논문을박사학위논문으로제출함 2003 년 12 월일 연세대학교대학원 의학과 정예리

3 정예리의박사학위논문을인준함 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 연세대학교대학원 2003 년 12 월일

4 감사의글 학위의과정과더불어삶의모든과정에함께하여주신하나님께감사드립니다. 피부과의사로서, 의학을연구하는학자로서모범이되어주시고깊은배려와따뜻한지도로이끌어주신김수찬교수님께진심으로감사를드립니다. 또한, 바쁘신와중에도연구계획단계에서마무리단계까지많은조언을해주신이민걸교수님, 이수곤교수님, 유욱교수님, 신명헌교수님께깊은감사를드립니다. 박사실험과정에서처음부터끝까지함께해주었던정승용, 오성민대학원생에게도감사를드립니다. 전공의시절과전임의과정을거치면서늘많은격려와애정어린가르침으로이끌어주신피부과학교실원여러분에게도감사의마음을전합니다. 항상부족하고미숙한저를사랑으로이해하시고보살펴주시는양가부모님과논문완성의기쁨을함께하고싶습니다. 마지막으로늘곁에서후원을아끼지않은사랑하는남편과저의분신이자삶의전부인딸신혜와태중의아기에게이논문을바칩니다. 저자씀

5 < 차례 > 국문요약 1 Ⅰ. 서론 3 Ⅱ. 재료및방법 6 1. 실험재료 6 2. 실험방법 6 가. HaCaT 세포배양 6 나. 레티노인산의처리 6 다. 실시간정량 PCR 을이용한사이토카인의 mrna 정량 7 라. EMSA 를이용한 NF-κB 의활성도측정 9 마. NF-κB 억제제처리후 IL-8 mrna 의발현 10 바. IκBdN DNA 를 transfection 시킨후 IL-8 mrna 의발현 11 사. IL-1ra 처리후 IL-8 mrna 의발현 11 아. Phospho-IκB-α 항체를이용한 western blot 12 Ⅲ. 결과 1. 레티노인산투여후 HaCaT 세포에서의사이토카인발현량측정을위한실시간정량 PCR 실험 NF-κB 억제제를사용했을때와 IκB 에대한 dominant negative mutant 를 HaCaT 세포에 transient transfection 시켰을때의 IL-8 mrna 실시간정량 PCR 의결과 NF-κB 억제제투여전후의레티노인산처리후 HaCaT 세포에서의 NF-κB 결합활성도측정을위한 EMSA IL-1ra 가레티노인산에의한 IL-8 mrna 발현에미치는영향 Phospho-IκB-α항체를이용한 western blot 23 Ⅳ. 고찰 24 Ⅴ. 결론 28 참고문헌 29 영문요약 34

6 표차례 표 1. 실시간정량 PCR 을위한사이토카인 primer 및 hybridization probe 염기서열 14

7 그림차례 그림 M, 10-7 M 및 10-8 M 레티노인산투여후 1, 6, 12, 24 시간후 HaCaT 세포에서발현된사이토카인 mrna 측정결과 16 그림 2. NF-κB 억제제를투여한후 10-6 M 및 10-7 M 레티노인산투여 12 시간후 HaCaT 세포에서발현된 IL-8 mrna 측정결과 18 그림 3. IκBdN mutant 를 HaCaT 세포에 transient transfection 시킨후 10-6 M 및 10-7 M 레티노인산처리 12 시간후의 IL-8 mrna 의실시간정량 PCR 19 그림 4. NF-κB 에대한억제제투여전과후에 10-6 M 및 10-7 M 레티노인산처리 12 시간후 HaCaT 세포에서발현된 NF-κB 결합활성도 20 그림 5. NF-κB 억제제투여전후의 10-6 M 및 10-7 M 레티노인산처리 24시간후 HaCaT 세포에서발현된 NF-κB 결합활성도 21 그림 6. IL-1ra 가레티노인산에의한 IL-8 mrna 발현에미치는영향 22 그림 7. Phospho-IκB-α 항체를이용한 western blot 23

8 국문요약 레티노인산에의한각질형성세포에서의 IL-8 유전자발현의기전 IL-8은 C-X-C 케모카인에속하는대표적인호중구의화학주성인자로여러가지염증반응에서중요한역할을하며각질형성세포를포함한여러세포에서만들어진다. IL-8은평상시에는분비가이루어지지않다가 TNF-α, IL-1, phobol 12-myristate 13-acetate(PMA), lectins, 바이러스등에의해유도되어분비된다. IL-8의프로모터중심부에는 nuclear factor(nf)-κb element를포함한 activating protein(ap)-1, AP-2, AP-3, 부신피질호르몬수용체, NF-IL-6와 octamer factors가있어여러가지세포에서 IL-8의분비를조절하고있다. 이중에서 NF-κB는 IL-8 유전자발현에핵심적인역할을한다. 레티노인산은비타민 A의유도체로서면역학적반응과염증반응을조절한다. 이중에서 all-trans retinioc acid(atra) 는레티노이드의자연산화물로서건선이나여드름, 광노화피부등의피부질환치료제로서널리사용되고있다. 하지만이러한임상적인유용성에비해레티노인산은국소적외용제로사용할때접촉성피부염을흔히일으킬수있기때문에그사용에제한이있다. 레티노인산은각질형성세포에서 IL-1, TNF-α, IL-8 mrna 발현을증대시키며각질형성세포와진피섬유모세포에서이들사이토카인을분비시킨다. 이들사이토카인이레티노인산에의한접촉성피부염발생에중요한역할을하리라믿어진다. 본연구에서는레티노인산에의해각질형성세포주인 HaCaT세포에서 IL-1과 IL-8 mrna의발현이증가되는것을확인하였다. 그리고 electrophoretic mobility shift assay(emsa) 를이용하여 IL-8 유전자발현에 NF-κB가관여함을관찰하였다. 이는 NF-κB 억제제를사용했을때와 I-κB에대한

9 dominant negative mutant의 cdna를 HaCaT세포에도입한후발현시켜 NF-κB 활성을방해하였을때 IL-8 mrna 발현이저하됨을관찰함으로써확인할수있었다. 또한레티노인산을투여후세포질내에 IκB의인산화가증가하는것을확인하였다. 결론적으로저자는레티노인산이각질형성세포에서 NF-κB를통하여 IL-8 유전자발현에영향을증가시킨다는것을알수있었지만 IL-8유전자에는전형적인레티노인산의반응단위가없으므로직접적인자극보다는다른경로가있을것으로추정하였다. 중간자극제로서가능성이있는 IL-1의영향으로 NF-κB가활성화되어 IL-8 유전자가발현되는지를알기위하여 IL-1 receptor antagonist(ra) 를사용하였으나 IL-1ra가레티노인산에의한 IL-8 유전자발현에는영향을미치지않았다. 따라서레티노인산이 IκB kinase를통해각질형성세포에서 IκB의인산화를촉진시켜 NF-κB로의해리를유도시켜 IL-8의발현을촉진시켰다고추정해볼수있었다. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ 핵심되는말 : 레티노인산, IL-8, NF-κB, HaCaT세포

10 레티노인산에의한각질형성세포에서의 IL-8 발현의기전 < 지도교수김수찬교수 > 연세대학교대학원의학과 정예리 Ⅰ. 서론 레티노이드는합성과자연상태의비타민 A로여러가지세포들의분화와성장에영향을준다. 그리고여러면역세포들의활성화및성숙과분화에관여하는사이토카인유전자의발현을조절할수있다 1-3. 레티노이드는생체내에서레티노인산 (retinoic acid: RA) 으로변형되어기능을한다. 세포내활성상태인레티노인산은각질형성세포의증식과분화를조절할뿐아니라피지선을억제하여건선이나여드름치료제로사용된다. 그리고진피의콜라겐분해효소를억제하여피부주름의개선제로활발히이용된다 1-3. 그러나레티노인산의국소도포는홍반과인설을동반한자극성피부염을유발하므로그사용에제한이있다 4-6. 이러한자극성피부염같은염증반응의원인으로사이토카인이관여되리라생각되며, 레티노인산을국소도포한마우스피부에서와레티노인산투여후배양각질형성세포에서 IL-1과 IL-8 유전자발현이증가됨이보고된바있다 7, 8. 레티노인산은핵내에서레티노인산수용체 (retinoic acid receptor; RAR) 와결합하여 레티노인산과레티노인산수용체의복

11 합체 를형성한다. 이복합체가전사인자로작용하여표적유전자의전사개시를위한표적유전자프로모터 (target gene promotor) 의레티노인산반응영역 (retinoic acid response elements;rare) 에결합하여표적유전자의발현을유도하여여러가지기능을나타낸다 그러나레티노인산에의한각질형성세포의사이토카인발현이어떤기전에의한것인지아직밝혀져있지않다 13, 14. IL-8은호중구나 T세포의화학주성에관계하거나세포사이의결합이나호중구의활성화또는 histamine의분비를조절하는등여러가지역할을하는사이토카인으로여러세포에서자극특이적인방법으로전사수준이나전사후수준에서조절되어분비된다. 인간의 IL-8 promoter의 5 flanking region에는 AP-1, AP-2, AP-3, glucocorticoid receptor, NF-κB, NF-IL-6등의전사인자가결합할수있는여러가지모티브 (motif) 가있어 IL-8의분비를조절한다. 이중에서 NF-κB는 IL-8 유전자발현에핵심적인역할을한다 15. NF-κB는면역반응과염증반응을매개하는중요한전사인자로서 사이토카인발현에중요한역할을한다. NF-κB 경로는여러가지 다양한신호에의하여자극되는데이러한신호에의하여 NF-κB에붙어있는 IκB가 IκB kinase(ikk) 에의해인산화되면서분리되면 NF-κB가세포질에서핵내로이동하게되고마침내여러가지유전자들의발현을활성화시키게된다. 그중에서도 IL-1 및 IL-8, TNF-α는 NF-κB에의해서활성화되며다시 NF-κB를직접적으로자극하여자가조절성고리를형성하여다른사이토카인을생산하게하여염증반응을증폭시킨다 16. NF-κB는사이토카인생성외에도부착분자와 nitric oxide(no) 및 cyclooxygenase(cox-2) 와같

12 은효소의생산도유발하여염증반응을일으키며세포고사를억제하여세포를보호하는역할도함께하고있다 17, 18. 이에본연구는각질형성세포에레티노인산투여후 IL-1, TNFα, IL-8, MCP-1의 mrna 유전자발현을실시간정량 PCR을이용하여측정하였다. 그리고사이토카인발현에주로관여하는전사인자인 NF-κB의작동여부를 electrophoretic motility shift assay(emsa) 를이용하여확인하고, NF-κB에대한억제제와 Iκ B에대한 dominant negative mutant를이용하여 NF-κB가작동하지않았을때의 IL-8의발현여부를확인하였다. 그리고레티노인산이 IκB의인산화를증가시켜 NF-κB의활성화를유도하는지알아보았다. 또한레티노인산이 NF-κB를통하여 IL-8 유전자발현에영향을줄때직접적인자극보다는다른경로가있을것으로추정하였다. 그래서중간자극제로서가능성이있는 IL-1의영향으로 NFκB가활성화되어 IL-8 유전자가발현되는지를알기위하여 IL-1 receptor antagonist(ra) 를이용하여 IL-1의영향을배제한후레티노인산에의한 IL-8 유전자발현을확인하였다.

13 Ⅱ. 재료및방법 1. 실험재료 본실험에사용된 HaCaT세포는 Norbert E. Fusenig교수 (Heidelberg, Germany) 로부터분양받아실험에사용하였다. HaCaT세포는형질전환된각질형성세포로정상각질형성세포와형태및반응양식이동일하면서계대배양이제한되지않아유지하기가편한장점이있다. 2. 실험방법 가. HaCaT세포배양 HaCaT세포는 10% fetal bovine serum(fbs; Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 과 1% antibiotic/antimycotic(gibco BRL) 을첨가한 RPMI-1640(Gibco BRL) 을세포배양액으로이용하였다. 37, 5% CO 2 incubator에서배양하였으며 culture flask면적 의 80% 정도를차지하면 0.05% trypsin 과 53 mm EDTA 를첨가 한 Hanks' balanced salt solution(hbss with phenol red, without Ca 2+ or Mg 2+ ) 으로세포를 culture flask 로부터분리하였 다. 그후 20% FBS 가포함된배양액으로 trypsin 을중화한후원심 분리를이용하여여러차례계대배양하였다. 나. 레티노인산의처리 10% FBS 가포함된배양액으로배양된 HaCaT 세포가 culture

14 flask면적의 80% 정도를차지하면, 각 culture flask에 0.1% ethanol, 10-6 M,10-7 M 및 10-8 M의레티노인산을 2% FBS가포함된배양액에각각첨가하여 1시간, 6시간, 12시간, 24시간동안배양하였다. 실험에사용한레티노인산 (all-trans-retinoic acid; ATRA)(Sigma, St, Louis, MO, USA) 은 99.9% 의 ethanol에녹여 10-3 M 농도의 stock solution으로만든다음실험에필요한최적농도로희석하여사용하였다 다. 실시간정량 PCR를이용한사이토카인 mrna의정량 (1) RNA분리및정량배양한 HaCaT세포로부터 RNA를분리하기위하여 TRIzol reagent(gibco BRL) 500 μl를첨가하였다. 그후 cell scraper로 flask 바닥으로부터 HaCaT세포를분리하여 microtube에옮겼다. 실온에 5분간두었다가, chloroform(sigma) 200 μl를첨가하여 vortex하였다. 실온에서 3분간두고, 4 에서 13,000rpm으로 15분간원심분리한후상층액만분리하여새로운 microtube에옮겼다. 분리한상층액에 isopropyl alcohol(sigma) 500 μl를첨가하여 vortex후 10분간실온에두었다가 13,000 rpm으로 15분간원심분리하였다. 상층액을제거한후 75% ethanol 1 ml를첨가하고살짝 vortex한다음 13,000rpm으로 10분간원심분리하였다. 남아있는 ethanol을공기중에서완전히건조시켜제거한후 microtube 바닥의 RNA pellet에 0.1% DEPC ddh 2 O 100 μl를첨가하여다시녹였다. 각대조군과실험군으로부터분리한 RNA를 60 water bath 에서 10분간가열시켜 single strand로분리한후

15 spectrophotometer(biophotometer, Eppendorf, Hamburg, Germany) 를이용하여 RNA 농도및순수도를측정하였다. (2) 역전사반응 (Reverse transcription) 각각의대조군과실험군으로부터분리하여정량, 보정한 RNA 1 μg에 RNA PCR Kit Ver2.1(TaKaRa, Shiga, Japan) 를이용하여역전사반응을실행하였다. 약술하면 10 x RNA PCR buffer, 5 mm MgCl 2, 10 mm dntp mixture, 40 units/ μl RNase inhibitor, 2.5 pmol/ μl Oligo-dT primer, 5 units/ μl reverse transcriptase를각각최종반응농도 1 x RNA PCR buffer, 5 mm MgCl 2, 1 mm dntp mixture, 1 units/ μl RNase inhibitor, μm Oligo-dT primer, 0.25 units/ μl reverse transcriptase가되도록조절하여 RNase free dh 2 O를이용해최종부피를통일하였다 분, 95 1분, 4 5분의 thermal cycling condition으로 cdna로역전사시켰다. (3) 실시간정량 PCR (Real time quantitative polymerase chain reaction) cdna와표적사이토카인유전자의 primers로디자인한 Light Cycler probes 그리고 Light Cycler reaction protocol에따라만든 mixture를섞어만든각각의반응혼합액을 capillary에, 한실험개체당 20 μl씩채운다음, 95 1분 (1회), 95 10초 (1회), [60 15초, 72 8초 ](40회) 의 thermal cycling condition에서 Light Cycler(Roche, Mannheim, Germany) 를이용하여실시간정량 PCR을진행시켰다. 실시간정량 PCR에사용된각사이토카인의

16 primers 및 Light Cycler probes는표 1과같다. Human glucose-6-phosphate dehydrogenase(h-g6pdh) housekeeping gene을 human endogenous control gene으로이용하였다. 최종 PCR 증폭산물의양은 h-g6pdh standard를 5x10 6 에서 5X10 2 까지 10배단위로단계적으로희석하여각각의 cycle에해당하는실험군의양으로나누어비교정량하였다. 라. EMSA를이용한 NF-κB 활성도측정 (1) HaCaT세포로부터 nuclear extract제작 T75 플라스크에키운 HaCaT세포를 PBS로 2회세척하고 PBS 1 ml를넣은후 scraper로세포를긁어 1.5 ml eppendorf tube에옮겼다. 1,200 rpm으로 5분간원심분리한후상층액을제거하고 ph 7.9의 10 mm HEPES, 1.5 mm MgCl 2 와 10 mm KCl, 0.5 mm DTT, 0.2 mm PMSF로구성된 buffer액 400 μl를넣고다시녹인후얼음위에 10분간두었다. 그후 4 에서 3분간 12,000 rpm으로원심분리한후다시상층액을제거하였다. ph7.9의 20 mm HEPES, 20% (V/V) glycerol, 420 mm NaCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.2 mm EDTA, 0.5 mm DTT와 0.2 mm phenylmethanesulfonyl fluoride(pmsf) 로구성된 buffer액 100 μl를넣고 vortex한후 20 분간얼음위에두었다. 4 에서 3분간 12,000 rpm으로원심분리한후상층액 (nuclear extract) 을단백농도 2 μg / μl로맞춘후 -7 0 에보관하였다. (2) Gel-shift assay Nuclear extract 10 μg과 5 X incubation buffer 5 μl, 증류수

17 25 μl을섞은후 4 에서 15분간방치하고 P 32 label된 NF-κB oligonucleotide(promega, Madison, WI, USA) probe 2 μl를넣고실온에서 20분간방치하였다. NF -κb의 probe은 NF-kB oligo (1.75 pmol/ul) 2 μl와 T4 polynucleotide kinase 10 x buffer 1 μl, r 32 P-ATP 1 μl, dh 2 O 5 μl와 T4 polynucleotide kinase 1 μl를섞어총용량 10 μl을 37 에서 10분간둔후 0.5 M EDTA 1μl으로 stop reaction을일으켰다. 89 μl의 TE buffer를첨가한후 unincorporated nucleotide를제거하기위하여 G-25 spin column통과시켜 1300 rpm 으로 5분간원심분리후하층액만취하여만들었다. NF-κB의염기서열은다음과같다. NF-κB: 5 -AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3', 3'-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5'. Probe를첨가후상온에서 20분간보관한후 0.1% bromphenol blue(bpb) dye를각샘플마다 2 μl씩넣고 6% non denaturing polyacrylamide gel에 150V, 10 ma에서 2시간전기영동시켰다. Gel 조성 (6%) 은다음과같다. polyacrylamide: bis (29:1) 9 ml, 증류수 33 ml, 5 x TBE 2.25 ml, 10% ammonium persulfate(aps) 450 μl, TEMED 22.5 μl. 전기영동이끝나면 vacuum gel dry와 (Bio-Rad) 건조시킨후 X-ray film에노출하여감광시켰다. 마. NF-κB 억제제처리후 IL-8 mrna의발현 NF-κB의억제제로는 Bay (Biomol, Plymouth, PA, USA) 을사용하였다. 10 μm의 Bay 를레티노인산투여 1시간전에 HaCaT세포에주고실시간정량 PCR을시행하여 IL-8 mrna의발현여부를확인하였다.

18 바. I-κB dominant negative(dn)dna를 transfection 후 IL-8 mrna의발현 I-κBdN은 IκB molecule에서해리되는데필수선행과정인인산화가일어나는 32번과 36번 serine residue를포함하는 N-terminal 부위를절단시킨 mutant로 NF-κB활성을방해하는역할을수행한다 19. Transfection 시키기하루전 24 well-plate(2-6 x 10 4 ) 에 HaCaT 세포를 plating 하여 24 시간후 50-80% 정도차지할수있 게한후세포들을 serum free media로세척하여 FBS를제거하였다 μg I-κBdN DNA와 25 μl serum free media, 4 μl Plus TM reagent(gibco) 넣고상온에서 15분간두었다 μl Lipofectamine TM reagent(gibco) 을 25 μl serum free media를이용하여희석한후전술한 I-κBdN DNA mixture에섞어상온에서 45 분둔후 0.2 ml의 transfection medium (without serum) 로 media를대치하였다. 150 μl media를추가로섞은후세척된 HaCaT세포들위로도포한후 37 에서 5시간정도 incubation 후 0.4 ml의 serum이정상보다두배함유한 growth media를첨가한후 24시간후 media를갈아주었다. Transfection efficiency는 480 nm파장의빛하에서전체세포중녹색형광을내는세포의비율로정하였는데, 대략약 50% 의 transfection efficiency를얻었다. Transfection시킨후 12시간, 24시간후에레티노인산을투여후에 IL-8 mrna 측정을위해실시간정량 PCR를시행하였다. 사. IL-1ra 처리후 IL-8 mrna 발현 IL-1 수용체를억제하기위해 IL-1ra(R&D systems, Minneapolis,

19 MN, USA) 50 ng/ ml을레티노인산처리 24시간전에배양한 HaCaT세포에미리투여하였다. IL-1ra처리 24 시간후에레티노인산 10-6 M 및 10-7 M을투여한후전술한방법에의해 IL-8 mrna 발현을실시간정량 PCR을이용하여정량하였다. 아. Phospho-IκB-α항체를이용한 western blot 레티노인산을처리하여 12시간, 24시간배양한 HaCaT세포에배양액을제거한후 PBS buffer를이용하여세포를세척한후 PBS buffer를제거하였다. 100 μl의 SDS sample buffer를이용하여세포를해리시킨후즉시 scraper를이용하여세포를바닥에서떼어낸후 micro tube로옮겨서 10-15초간초음파로분해한후 정도로 5분간가열후얼음에보관하였다. 이후에 5분간 microcentrifuge하고 SDS-PAGE gel에세포추출액을 20 μl씩넣어 nitrocellulose membrane에 transfer하였다. SDS sample buffer의조성은 62.5 mm Tris-HCl, 2% w/v SDS, 10% glycerol, 50 mm DTT, 0.1% w/v bromophnel blue이다. Transfer 후에 nitrocellulose membrane을 25 ml TBS로 5분간상온에서보관후 25 ml의 blocking buffer를이용하여상온에서 3시간둔후 Phospho-IκB-α항체 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) 와 10 ml primary antibody dilution buffer를첨가한후 4 에서약간씩흔들어주며하룻밤두었다. 다음에 TBS-Tween을이용하여 5분간 3차례세척한후 HRP-conjugated secondary antibody(1:2000) 와 HRP-conjugated anti-biotin antibody(1: 1000) 와 blocking buffer를이용하여 1시간상온에서진동을주며보관후 TBS-Tween을이용하여 3차례세척하였다.

20 Blocking buffer의조성은 1 x TBS, 0.1% Tween-20 with 5% w/v nonfat dry milk 를 150 ml되게만든다음, 15 ml 10 x TBS와 135 ml water를넣어섞는다. 그후 7.5 g의 nonfat dry milk를더넣고잘섞은다음 0.15 ml Tween-20 (100%) 을섞었다. Primary antibody dilution buffer의조성은 1 x TBS, 0.1% Tween-20 with 5% BSA를 20 ml되게만든다음 2 ml 10 x TBS와 18 ml water를섞은후 1.0 g의 BSA를넣고섞을때 20 μl Tween-20 (100%) 을넣었다. 세척한 membrane을 10 ml LumiGLO(0.5 ml 20 x LumiGLO, 0.5 ml 20 x Peroxide and 9.0 ml Milli-Q water) 을첨가후 1분간상온에서약간흔들어주면서관찰후 membrane이마르지않는한도내에서과도한용액은제거후비닐랩 (saran wrap) 으로싼후 10초간 X-ray film에현상시켰다.

21 표 1. 실시간정량 PCR 을위한사이토카인 primer 및 hybridization probe 염기서열 IL-1a TNF-α IL-8

22 MCP-1

23 Ⅲ. 결과 1. 레티노인산투여후 HaCaT세포에서의사이토카인발현량측정을위한실시간정량 PCR실험 (1) 10-6, 10-7 및 10-8 M 레티노인산투여후 1, 6, 12, 24시간후 HaCaT세포에서발현된사이토카인 mrna측정결과 ( 그림 1) 10-6, 10-7 및 10-8 M 레티노인산투여 1, 6, 12, 24시간후 HaCaT세포에서발현된사이토카인 mrna 측정결과, 10-6, 10-7, 10-8 M 농도에서 IL-8(A), IL-1(B) mrna 발현이증가되었으나, TNF-α, MCP-1 mrna는발현되지않았다.

24 그림 , 10-7, 10-8 M의레티노인산을투여 1, 6, 12, 24시간후 HaCaT세포에서발현된 IL-8 mrna를측정한결과 IL-8 mrna의발현은 1, 6, 12, 24 시간에증가되었으나 (A), IL-1 mrna 발현은 1, 6 시간초기에는증가하다가다시감소하였으며, TNF-α, MCP-1 mrna는발현되지않았다.

25 2. NF-κB 억제제를사용했을때와 IκB에대한 dominant negative mutant를 HaCaT세포에 transient transfection시켰을때의 IL-8 mrna 실시간정량 PCR의결과 (1) NF-κB 억제제를투여한후 10-6 및 10-7 M 레티노인산투여 12시간후 HaCaT세포에서발현된 IL-8 mrna 측정결과 ( 그림 2) NF-κB 억제제 (Bay ) 투여후 10-6 및 10-7 M 레티노인산투여 12시간후 HaCaT세포에서발현된 IL-8 mrna 측정결과, 10-6, 10-7 M 두농도에서 IL-8 mrna 발현이저하되었다. control 10-6 M RA 10-7 M RA 10-6 M RA + NF-κB inhibitor 10-7 M RA + NF-κB inhibitor 그림 2. NF-κB 억제제 (Bay ) 투여후 10-6 및 10-7 M 레티노인산투여 12시간후 HaCaT세포에서발현된 IL-8 mrna 측정결과, 10-6, 10-7 M 두농도에서 IL-8 mrna 발현이현저히저하되었다.

26 (2) IκBdN mutant를 HaCaT세포에 transient transfection 시킨후 10-6 및 10-7 M 레티노인산처리 12시간후의 IL-8 mrna의실시간정량 PCR( 그림 3) IκBdN을 HaCaT세포에 transient transfection 시킨후 10-6 및 10-7 M 레티노인산투여 24시간후 HaCaT세포에서발현된 IL-8 mrna 측정결과, 10-6, 10-7 M 두농도에서 IL-8 mrna 발현이현저히저하되었다. control 10-6 M RA 10-7 M RA 10-6 M RA + I-κBdN mutant 10-7 M RA + I-κBdN mutant 그림 3. IκBdN을 HaCaT 세포에 transient transfection 시킨후 10-6 및 10-7 M 레티노인산투여 24시간후 HaCaT세포에서발현된 IL-8 mrna 측정결과, 10-6, 10-7 M 두농도에서 IL-8 mrna 발현이현저히저하되었다.

27 3. NF-κB 억제제투여전후의레티노인산처리후 HaCaT세포에서의 NF-κB결합활성도측정을위한 EMSA (1) NF-κB에대한억제제투여전과후에 10-6 및 10-7 M 레티노인산처리 12시간후 HaCaT세포에서발현된 NF-κB 결합활성도 ( 그림 4) 10-6 및 10-7 M 레티노인산투여 12시간후 HaCaT세포에서 NF-κB결합활성도발현된측정결과, 10-6, 10-7 M 두농도에서농도에비례하여 NF-κB결합활성도가증가되었다 (A). 반면에 NF-κB에대한억제제를투여했을경우에는 NF-κB 결합활성도에는큰변화가없었다 (B). RA P N EtOH C A NF-κB B NF-κB 10-6 및 10-7 M의레티노인산투여 12시간후 NF-κB의활성도가증가되었으나 (A) NF-κB 억제제투여후에는 NF-κB 활성의증가가없었다 (B). (A: NF-κB 억제제투여전, B: NF-κ B억제제투여후 )(P: probe only, N: normal, EtOH: ethanol, RA: retinoic acid, C: competitor).

28 (2) NF-κB 억제제투여전후의 10-6 및 10-7 M 레티노인산처리 24시간후 HaCaT 세포에서발현된 NF-κB 결합활성도 ( 그림 5) 10-6 및 10-7 M 레티노인산투여 24시간후 HaCaT 세포에서 NF-κB결합활성도측정결과, 10-6, 10-7 M 두농도에서농도에비례하여 NF-κB결합활성도가증가되었다 (A). 반면에 NF-κB에대한억제제를투여했을경우에는 NF-κB 결합활성도에는큰변화가없었다 (B). RA P N EtOH C A NF-κB B NF-κB 그림 및 10-7 M의레티노인산투여 24시간후 NF-κB의활성도가증가되었으나 (A) NF-κB 억제제투여후에는 NF-κB 활성의증가가없었다 (B). (A: NF-κB 억제제투여전, B: NF-κ B 억제제투여후 ) (P: probe only, N: normal, EtOH: ethanol, RA: retinoic acid, C: competitor). 본실험결과는 2회의독립적인실험의결과이다.

29 4. IL-1ra가레티노인산에의한 IL-8 mrna 발현에미치는영향 ( 그림 6) IL-1ra처리전후에레티노인산을 10-6, 10-7 M 투여하여 IL-8 mrna의발현을비교하였을때 IL-1ra를처리하지않은좌측의그래프와 IL-1ra처리후의우측의그래프에서 IL-8 mrna발현에큰차이가없는것으로관찰되었다. control 10-7 M RA + IL-1ra 10-7 M RA 10-6 M RA + IL-1ra 10-6 M RA 그림 6. IL-1ra 의처리전후에레티노인산을투여한후 IL-8 mrna 발현을본결과 IL-1ra 는레티노인산에의한 IL-8 mrna 발현에영향을미치지못하였다.

30 5. Phospho-IκB-α 항체를이용한 western blot( 그림 7) 10-6 M 레티노인산투여 12 시간과 24 시간모두에서세포질내의 인산화된 IκB 의농도가증가되는것을확인하였다. RA 12hrs RA 24hrs C 10-6 M 10-7 M C EtOH 10-6 M 10-7 M 그림 M 의레티노인산투여후 HaCaT 세포질내에 IκB 의 인산화가증가되었다 (C: control, EtOH: ethanol, RA: retinoic acid). 본실험결과는 2 회의독립적인실험의결과이다.

31 Ⅳ. 고찰 각질형성세포는표피를구성하는세포로단순한물리적장벽의기능뿐만아니라많은종류의사이토카인을분비하여면역기능과염증반응에관여한다 20. 외부의자극을받으면각질형성세포는 IL-1α, TNF-α와같은일차사이토카인을분비하여 IL-8이나 MCP-1, IP-10과같은케모카인의생성을유도함으로써활성화된염증세포들이자극부위로모여들게하여염증반응을일으킨다 레티노인산의국소도포로유발될수있는자극성피부염은다른화학물질에의한전형적인자극성피부염에비하여다소지연되어나타나며레티노인산으로인한염증유발기전에 IL-1, TNF-a, IL-8, IL-10 등의사이토카인이관여하고있음이보고되었으나 24 이들염 증성사이토카인이발현되는기전에대해서는아직정확히밝혀져있지않다 본연구에서도레티노인산투여후 IL-1, IL-8같은사이토카인의증가를확인하였는데 IL-1은자극초기에만증가하였으나 IL-8은레티노인산투여 24시간후에도증가하는모습을보였다. 레티노인산이유전자발현을조절하는방법으로몇가지가알려져있는데첫째로레티노인산은핵수용체인레티노인산수용체 (RARα, β,γ) 와레티노이드 X 수용체 (retinoid X receptor, RXRα,β,γ) 에결합하고이들수용체에특이한 DNA 염기서열에결합하여리간드에의한전사조절에관여하게된다 10, 28. 즉, RAR은대개 RXR과서로합하여이형이랑체 (heterodimer) 를형성하는데이이형이랑체는특정유전자위쪽프로모터에존재하는특이한호르몬반응단위에결합함으로써특정유전자의발현을전사적으로활성화시킨다 10. 레티노인산수용체에의한유전자발현조절의또다른방법으로는서로

32 연관되지않는전사인자와의단백 - 단백의직접결합에도의한다. 즉, 레티노인산은 AP-1 에반응하는유전자에대해서억제하는역할을 하는데이는 RAR 이 AP-1 전사인자복합체중하나인 c-jun 과 결합하여 AP-1이반응영역 (response element) 에결합하는것을방지하며대표적인예가 collagenase promoter이다 29, 30. 마지막으로 RAR과연관이전혀없는여러유전자들도레티노인산이다른전사인자를활성화시키거나억제시킴으로써유전자발현을조절하게된다 31. NF-κB는여러가지사이토카인과스트레스또는생물리학적인자극에의해활성화되어여러유전자의발현에영향을미침으로써염증반응과면역반응에핵심적인역할을하는전사인자이다. NF-κB 는 Rel 족에속하는여러단백의이형체를형성하는데불활성화상태에서는 IκB라는 NF-κB의억제제에의해세포질내에머물러있다 가활성화되면 IκB 는 IκB kinases(ikk) 에의해인산화되면서분 해되고 NF-κB는핵안으로들어가유전자와결합한다 16. 이러한 NF-κB 경로는여러다양한자극에의해세포마다특이하게활성화되어유전자발현에서로다른효과를유발할수있다 32. IL-8은 C-X-C케모카인에속하는 8.4 kda의케모카인으로써단핵구 / 대식세포, 섬유모세포, 혈관내피세포, 활막세포, 각질형성세포, 상피세포등다양한세포와위암세포나뇌신경종양등의종양세포에서도생산된다 33. IL-8의전형적인유도인자는염증반응의자극으로 IL-1, TNF, bacterial lipopolysaccharides, 바이러스, 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, double-stranded RNA 등이있다. IL-8 유전자의 3' flanking region 에는 ATTTA 모 티브가존재하여여러가지사이토카인을불안정화시키는역할을하

33 고, IL-8 의프로모터인 5 flanking region 에는여러가지전사인 자, 즉 AP-1, AP-2, AP-3, HSE, HNF-a, IRF-1, glucocorticoid 수용체, NF-κB, NF-IL-6 와 octamer factor 가 결합할수있는유전자를포함한다 34, 35. IL-8 유전자의전사시작부 위에서 -94 에서 -70 nucleotide 가 NF-κB 와 NF-IL-6 에의해 유도되거나억제되는부위로추정되고있다. 이부위는여러염증성사이토카인에의해서 IL-8이발현되는부위와일치하므로 NF-κB 가 IL-8유전자의전사에핵심적인역할을한다고추정할수있다 35. 본연구에서는레티노인산을 HaCaT세포에투여하였을때시간에따른차이는있었지만 IL-1과 IL-8의증가를확인할수있었다. 또한레티노인산에의해 IL-8이증가되는기전이 NF-κB의경로에의한것이라는가설하에 EMSA를이용하여레티노인산투여후농도와시간에따라 NF-κB 발현의변화를확인하였으며 NF-κB에대한억제제를투여한후레티노인산을처리하면 IL-8의발현이억제되는것을알수있었다. 또이를좀더명확히확인하기위해 Iκ B에대한 dominant negative mutant를이용하여 transient transfection시킨후 NF-κB 경로를폐쇄한후에같은실험을한결과레티노인산에의한 IL-8의발현은 NF-κB를통해서이루어진다는것을확인할수있었다. 또한레티노인산처리후세포질내에인산화된 IκB의양이증가되는것을확인하였다. 하지만레티노인산에의해서여러가지세포나종양세포에의해서 IL-8이증가하는것은증명되어있으나 IL-8 유전자의조절부위에전형적인레티노인산의반응단위가존재하지않으므로레티노인산이어떻게 IL-8의발현을증가시키는지에대해서는밝혀져있지않으며다만 NF-κB와연관된다고추정하고있다. 여기에대해서는레티노인산에의한자극,

34 예를들면 IKK 의증가와같은자극에의해서 NF-κB 로부터 IκB 의해리를촉진하여 NF-κB의핵내진입을용이하게할수있다는가설과, 레티노인산이 NF-κB 단위단백의합성을증가시키거나 Iκ B의수준을억제하는등의의견이제시되고있으나아직증명되지는않았다 34. 또한스테로이드수용체에속하는부신피질호르몬수용체나에스트로겐수용체, 프로제스테론수용체, 안드로겐수용체등이 실험실상에서 NF-κB 와물리적으로연결되어 NF-κB 의작용을 억제한다는실험연구와유사하게 NF-κB와 RXR이서로물리적으로연결되어사이토카인발현을억제한다는가설도존재한다 13. 저자들은이에레티노인산투여후초기에만증가하는 IL-1 같은일차사이토카인이중간자극제역할을하여 IL-1이 IL-1수용체에결합후 IKK를활성화시켜 NF-κB가핵내로진입하여 IL-8의프로모터에결합하여 IL-8유전자발현을조절할수있다는가설을세우고 IL-1수용체에대한길항제를처리하여 IL-1에의한 NF-κ B의활성화를억제했을때 IL-8의발현이증가되는지를확인하였다. 결과에서보듯이 IL-1ra처리후에레티노인산을처리하였을때발현되는 IL-8 mrna의양은큰차이가없어 IL-1이어떤중간자극제의역할을하여 IL-8유전자발현에영향을미쳤다고볼수는없었다. 결론적으로레티노인산을각질형성세포에처리후 NF-κB 작동에의해 IL-8 유전자가발현이증가된것은레티노인산이 IKK에의한 IκB의해리를증가시켜 NF-κB의핵내진입을용이하게하여 IL-8 유전자발현에영향을미쳤을거라고여겨진다. 하지만레 티노인산이어떤경로로 IKK 를활성화시키는가에대해서는 계속 연구가진행되어야할것이다.

35 Ⅴ. 결론 레티노인산을각질형성세포에투여하였을때증가하는대표적사이토카인인 IL-8의유전자발현에레티노인산이어떤경로로작용하는지를알아보고자본연구를시행하였으며, 다음과같은결론을얻었다. 1. 레티노인산을각질형성세포에투여하였을때 IL-1과 IL-8 mrna 발현이증가하였다. 2. 레티노인산을각질형성세포에투여하면각질형성세포내의 IκB의인산화가증대되었고 NF-κB가활성화되었다. 3. 레티노인산에의한 IL-8 유전자의발현에 IL-1은중간자극제로서관여하지않았다. 결론적으로레티노인산에의한각질형성세포의 IL-8 유전자발현의증가는 NF-κB를통해서이루어짐을알수있었다. 그리고 NFκB의활성은 IL-1에의한영향과는관련이없음을확인하였으며레티노인산에의해 IKK활성화로인해 IκB의인산화와해리를촉진하여 NF-κB의작동을용이하게했을것으로추정한다.

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40 the composite octamer of the Interleukin-2 enhancer by AP-1, Oct-2 and retinoic acid receptor. J Exp Med 1994; 180: Segars JH, Nagata T, Bours V, Medin JA, Franzoso G, Blanco JCG, et al. Retinoic acid induction of major histocompatibility complex class I genes in NTera-2 embryonal carcinoma cells involves induction of NF-kappa B(p50-p65) and retinoic acid receptor beta-retinoid X receptor beta heterodimers. Mol Cell Biol 1993; 13: Schooley K, ZHV P, Dower SK, Qwarnstrőm EE. Regulation of nuclear translocation of nuclear factor-kappa B rela: evidence for complex dynamic at the single cell level. Biochem J 2003; 369: Roebuck KA. Regulation of Interleukin-8 gene expression. J Interferon Cytokine Res 1999; 19: Chang MM-J, Harper R, Hyde DM, Wu R. A novel mechanism of retinoic acid-enhanced Interleukin-8 gene expression in air way epithelium. Am J Respir Cell Mol Biol 2000; 22: Kunsch C, Lang RK, Rosen CA, Shannon MF. Synergistic transcriptional activation of the Interleukin-8 gene by NF-kappaB p65(rela) and NF-IL-6. J Immunol 1994; 153:

41 Abstract A mechanism of retinoic acid-enhanced IL-8 gene expression in keratinocytes. Yae Lee Chung Department of Medicine The Graduate School, Yonsei University (Directed by Professor Soo-Chan Kim) IL-8 is a member of the C-X-C chemokine family and an important chemoattractant for neutrophils and has been implicated in a variety of inflammatory diseases. It has been reported to be produced by variety of cell types, including keratinocytes. The production of IL-8 is normally not constitutive, but is induced mainly by inflammatory mediators like TNF-α, or IL-1 and also by PMA, lectins and viruses. The core IL-8 promoter contain a nuclear factor(nf)-κb element that is required for activation in all cell types studied, activating protein(ap-1), AP-2, AP-3, glucocorticoid receptor, NF-IL-6, and octamer factors, etc. Unlike other transcriptional factors, NF-κB site is essential for induction for gene expression. Retinoic acid (RA), a derivative of Vitamin A, is a modulator of immunologic and inflammatory responses. All-trans retinioc acid(atra), one of the naturally oxidized substances of retinoids, is clinically used for treatment of psoriasis, acne, photo-aging dermatoses and other skin diseases. However,

42 the use of RA is restricted to the application because it induces irritant contact dermatitis. RA has been reported to induce up-regulation of IL-1, TNF-α, IL-8 mrna and release in dermal fibroblasts and keratinocytes. In this study, a stimulation of IL-8 gene expression by RA was demonstrated in HaCaT keratinocytes. Inhibition and transient transfection assay revealed the involvement of NFκB binding site of IL-8 gene in RA-enhanced promoter activity. Electrophoretic mobility shift assay(emsa) demonstrated that RA enhanced DNA-NF-κB complex formation, especially with the p65 subunit. We concluded that RA is able to cause transactivation of IL-8 gene, which dose not contain classical RA response elements in its regulatory region. The stimulation of RA on the expression of IL-8 mrna was related to activation of NF-κB binding activity, which is essential for enhanced IL-8 gene expression. However, there is no evidence to support a direct interaction between RA-mediated transcriptional machinery and IL-8 gene transcription. We suspected the mechanism of involvement of IL-1 as an intermediate stimulus in the RA-mediated IL-8 up regulation in HaCaT cells. However, there is no evidence to support a IL-1 as a intermediate stimulus betweeen RA-mediated transcriptional machinery and IL-8 gene transcription. Therefore, our result suggested that the IL-8 gene expression by HaCaT cell after RA stimulation results from the activation of IKK and dissociation of IκB from NF-κB and the transcription of NF-κB to the nucleus

43 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Key Words : retinoic acid, IL-8, NF-κB, HaCaT cell