246 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(5): (2015) 표되어왔다 [11-14]. 동치미를발효시키는대표적인젖산균으로는 Leuconostoc, Lactobacillus, P

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민영 승
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1 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(5): (2015) ISSN / eissn 연구논문 발효된물김치인동치미에서분리한혼합젖산균의생리활성증진에대한연구 최문섭, 김동민, 오계헌 * Studies on the Enhanced Physiological Activities of Mixed Lactic Acid Bacteria Isolated from Fermented Watery Kimchi, Dongchimi Moon-Seop Choi, Dong-Min Kim, and Kye-Heon Oh* Received: 16 July 2015 / Revised: 16 October 2015 / Accepted: 28 October The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: The aim of this study was to investigate the efficacy of enhanced physiological activities in cultures isolated from Korean fermented watery Kimchi, Dongchimi, of single lactic acid bacteria (LAB), and when these three are mixed LAB as probiotics. Using the BIOLOG system and 16S rrna sequencing, the isolates were characterized, and identified and assigned to Leuconostoc mesenteroides DK-3, Leuconostoc dextranicum DK-6, and Lactobacillus curvatus DK-13, respectively. Growth rate and ph changes, production of organic acids as metabolites, and physiological activities of the single and mixed LAB cultures, were monitored and compared. In mixed LAB cultures after 72 h of incubation, the maximum concentrations of lactic acid and acetic acid were approximately mm and mm, respectively, and ph changed from 7.00 to Mixed LAB cultures were able to eliminate 96.3% of nitrite. Activities of antioxidant and β- galactosidase were 60.3% and 16.8 units/mg, respectively. Significant antibacterial activity of the concentrated supernatants was demonstrated against several food-poisoning bacteria. Physiological activities obtained from the mixed LAB cultures have been shown to be considerably higher than those of single LAB cultures. In conclusion, these studies demonstrate that compared to the single cultures, all physiological activities in mixed LAB cultures are significantly enhanced. 순천향대학교생명시스템학과 Department of Life Science and Biotechnology, Soonchunhyang University, Asan 31538, Korea Tel: , Fax: kyeheon@sch.ac.kr Keywords: Dongchimi, Physiological activity, Lactic acid bacteria 1. INTRODUCTION 사회가급격히발전함에따라현대인들은건강에대하여많은관심을가지고있으며, 포만감을위한식품그자체로서뿐만아니라건강기능을포함하는식품에대하여관심을가지고있다. 인간은오랜기간동안음식의맛, 풍미, 식감의변화뿐만아니라, 병원성미생물의억제를위해발효식품의제조에젖산균을사용하였다 [1-3]. 프로바이오틱스의대표적인미생물로서, 미국식품의약국에서안전하다고인정한미생물에속한다. 젖산균은장내균총안정화 [4], 면역력증강 [5], 항암작용 [6], 콜레스트롤저하 [7] 등을하며, 또한이들이생산하는박테리오신 (bacteriocin) 은세균이생산하는천연항균성단백질로병원성미생물에대하여효과적인살균력이나타나는것으로알려져있다 [8,9]. 젖산균은발효에의한특징뿐만이아니라건강및영양학적으로증진을주는중요한미생물로서, 이러한젖산균은발효된채소및과일, 유제품, 가공육류, 동물의점막을포함한여러곳에서분리되었다 [10]. 동치미는한국의대표적인발효식품인김치의한종류로서, 일반적인김치와다르게무와마늘, 생강, 양파, 파등이포함된여러양념을버무리고물을넣어발효시킨김치이며, 매운맛이다른김치에비해덜하고발효중에생성되는유기산에의해독특한풍미를나타낸다. 김치의발효에관여하는젖산균의분리와분리균주의특성에대한여러연구가발

2 246 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(5): (2015) 표되어왔다 [11-14]. 동치미를발효시키는대표적인젖산균으로는 Leuconostoc, Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus 속등이알려져있다 [15]. 동치미에존재하는다양한종류의이들젖산균의복합적인작용으로발효가진행되며, 이과정에서무우에포함된당류가젖산및아세트산을포함하는유기산으로전환되고이런유기산은신맛과좋은품질을보존해주는것으로알려져있다. 이러한젖산균들은청색증을나타내는메트헤모글로빈혈증 (methemoglobinaemia) 의원인물질인아질산염소거능 [16], 활성산소를제거하는항산화능 [17], 유당불내증을완화시킬수있는 β-galactosidase 활성 [18] 과같은몇가지특징적인생리활성을가지며, 락토페리신 (lactoferricin) 과같은여러기능적및항균활성물질을분비하여병원성미생물에대한살균력이있는것으로보고되었다 [19]. 본연구에서는발효중인동치미에서우점종으로서 Leuconostoc mesenteroides DK-3, Leuconostoc dextranicum DK-6, Lactobacillus curvatus DK-13의 3가지균주를분리하여각각의생리화학적및계통학적특성을조사하였다. 단일배양과혼합배양을이용하여, 항산화능, 아질산염소거능측정, β- galactosidase 활성, 항균활성등의생리활성을측정하고비교분석하였다. 2. MATERIALS AND METHOD 2.1. 세균의분리및특성조사가정에서담그어 3 일동안숙성시킨동치미국물 10 ml 를생리식염수 50 ml 가담긴플라스크에넣은후, 진탕배양기에서 20 분간교반시켰다. 시료를 10-2 으로희석한후, 100 μl 를 0.002% bromophenol blue 가첨가된 MRS (Difco, Sparks, MD, USA) 고체평판배지에도말후, 24 시간동안 30 o C 에서배양하였다. 순수배양기법으로동치미에서 DK-3, DK-6, DK-13 의세가지젖산균을분리하였으며 MRS 액체배지에접종하여진탕배양기 (30 o C, 160 rpm) 에배양을유지하며본실험에이용하였다. GP2 MicroPlate TM (Biolog, Hayward, CA) 를사용하여각균주의특성을분석하였다. 순수배양된단일집락을 5% 혈액이포함된 trypticase soy agar (TSA) 고체평판배지에도말한후, 30 o C 에서 24 시간배양하였다. 배양된균주는생리식염수에현탁하여 GP2 MicroPlate TM 에접종한후, BIOLOG automated Micro-Station instrument 을이용하여각분리균주의탄수화물이용패턴을조사하였다 S rrna 염기서열분석및계통수작성동치미에서분리한세가지젖산균의계통수를작성하기위해 16S rrna 에대하여 PCR 을실시하였다. 27F primer (5'- AAGGAACACCAGTGGCGAAGG-3') 와 1492R primer (5'- CCAGGCGGTCAACTTAATGCG-3') 를사용하여 16S rrna 유전자를증폭하였으며 PCR Premix (GenDEPOT, USA) 를 이용하여 PCR 을수행하였다. 변성 (94 o C, 30 초 ), 냉각 (60 o C, 30 초 ), 신장 (72 o C, 45 초 ) 의세단계를 35 회반복한후, 72 o C 에서 15 분동안유지하였다. 증폭된 DNA 절편은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen Co., Germany) 를이용하여정제하였고이를통해부분적인염기서열을 ABI373 Automated sequencer (Foster City, CA, USA) 를이용하여서열을결정하였으며 BLAST database (NCBI, Bethesda, MD, USA) 를통하여분석하였다. 분석된 16S rrna sequences 는 Clustal X software ( 를이용하여염기서열을정리하였으며 MEGA4 package (Biodesign Institute, Tempe, AZ, USA) 를이용하여계통수를작성하였다 생장에따른 ph 변화및유기산정량분석 HPLC 를이용하여젖산균이생장하면서생성하는젖산과아세트산을분석하였다. 72 시간동안진탕배양하였으며 12 시간마다배양액을채취하여원심분리 (4 o C, 13,000 rpm) 한후, 상등액을취하여 0.20 μm 인 membrane filter (Pall-Gelman, USA) 에여과하여사용하였다. HPLC 시스템은 UV/VIS-151 detector 가부착된 Glison 사의 321 pump 로구성되었으며 (Gilson, Inc., USA), column 은 Supelcogel C-610H column (300 mm 7.8 mm 입자크기 5 μm) 을사용하였다. Mobile phase 는 0.1% phosphoric acid 를공극직경이 0.45 μm 인 membrane filter (Pall-Gelman, USA) 에여과하여사용하였으며, flow rate 는 0.5 ml/min, UV detector 의파장은 210 nm 에서분석하였다. 유기산의분석용표준물질로젖산과아세트산을각각 1:1 의비율로혼합하여표준물질을만들었으며, 0.45 μm syringe filter 로여과한후, Hamilton syringe 를사용하여 HPLC injector 내에 20 μl 를주사하였다 아질산염소거능분리균주의아질산염소거능은 Ito 등 [20] 의방법을이용하여측정하였다. MRS 액체배지 9 ml 에 sodium nitrite 를최종농도가 150 μg/ml 가되도록혼합한후, 단일및혼합배양에접종하였다. 72 시간동안진탕배양하였으며매 12 시간마다배양액을채취하여원심분리 (4 o C, 13,000 rpm) 한후, 상등액을취하여 0.02% sulfanilamide 와 0.1% N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride, 5 N HCl 을각각 1 ml 씩첨가하여암실에서 5 분간반응시킨후, 538 nm 에서흡광도를측정하였다 항산화능측정분리균주를 MRS 액체배지에접종한후, 72 시간동안배양하면서매 12 시간간격으로시료를채취하였다. 채취한시료는원심분리 (4 o C, 13,000 rpm) 하여준비된상등액을취하여사용하였다. 2.5 ml 의시료에 1 ml 의 0.3 mm DPPH 용액을넣고 30 분동안반응시킨후, 518 nm 에서흡광도를측정하였다. 다음식을이용하여항산화활성을백분율로변환시켰다. AA% = 100 [(Abs sample Abs blank ) 100] / Abs control ] AA, antioxidant activity; Abs, absorbance

3 동치미에서분리한혼합젖산균의생리활성증진 247 blank: 배양상등액 2.5 ml+ 에탄올 1 ml control: 0.3 mm DPPH 용액 1 ml+ 에탄올 2.5 ml 2.6. β-galactosidase 활성 β-galactosidase 활성은 Miller 의방법 [21] 으로측정하였다. 분리균주를각각 MRS 액체배지에각각접종한후, 72시간동안진탕배양하였으며, 12시간마다 3 ml의배양액을취하여원심분리한후, 균체만을회수하였다. 동량의 Z buffer (60 mm Na 2 HPO 4 7H 2 O, 40 mm NaH 2 PO 4, 10 mm KCl, 1 mm MgSO 4 7H 2 O, 50 mm β-mercaptoethanol, ph 7.0) 를첨가하여 Table 1. Biochemical characteristics of isolates, DK-3, DK-6, and DK-13 obtained from Dongchimi Isolates Isolates DK-3 DK-6 DK-13 Substrates Substrates DK-3 DK-6 DK-13 α-cyclodextrin + D-Trehalose + + β-cyclodextrin + Turanose + + Dextrin + Xylitol Glycogen D-Xylose + Inulin Acetic acid Mannan + α-hydroxy butyric acid Tween 40 β-hydroxy butyric acid Tween 80 γ-hydroxy butyric acid N-Acethyl-D-glucosamine β-hydroxy phenyl acetic acid N-Acethyl-D-mannosamine + α-keto glutaric acid Amygdain + + α-keto valeric acid L-Arabinose Lactamide D-Arabitol D-Lactic acid methylester + Arbutin + + L-Lactic acid Cellobiose + + D-Malic acid D-Fructose L-Malic acid L-Fucose Methyl pyruvate + + D-Galactose + + Mono-methyl succinate D-Galacturonic acid Propionic acid Gentiobiose + + Pyruvic acid + + D-Gluconic acid + + Succinamic acid α-d-glucose Succinic acid m-inositol N-Acetyl-L-glutamic acid + α-d-lactose + Alaninamide Lactulose D-Alanine Maltose + + L-Alanine Maltotriose + L-Alanylglycine D-Mannitol + L-Asparagine D-Mannose L-Glutamic acid D-Melezitose Glycyl-L-glutamic acid D-Melibiose + L-Pyroglutamic acid α-methyl D-galactoside + + L-Serine β-methyl D-galactoside + + Putrescine 3-Methylglucose + 2,3-Butanediol α-methyl D-glucoside + + Glycerol β-methyl D-glucoside + + Adenosine + α-methyl D-mannoside 2-Deoxyadenosine + Palatinose + + Inosine + D-Psicose Thymidine + D-Raffinose + Uridine + L-Rhamnose Adenosine-5'-monophosphate D-Ribose + + Thymidine-5'-monophosphate D-Salicin + + Uridine-5'-monophosphate Sedoheptulosan Fructose-6-phosphate D-Sorbitol Glucose-1-phosphate Stachyose + Glucose-6-phosphate Sucrose + + D-L-α-Glycerolphosphate +, positive reaction;, negative reaction.

4 248 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(5): (2015) 균체를재현탁시켜 A 600 을측정하였다. 현탁된시료 0.5 ml 를취하여 0.5 ml 의 Z buffer 와잘혼합하고 100 μl 의 chloroform 과 50 μl 의 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate) 를첨가하여혼합한다음 30 o C 에서 5 분간반응시켰다. 그후 ONPG (onitrophenyl-β-d-galactoside, 4 mg/ml) 가첨가된 0.2 ml 의 phosphate buffer 를첨가하여 15 분간 30 o C 의배양기에서반응시켰으며, 1 ml 의 1 M Na 2 CO 3 를첨가하여종결시켰다. 흡광도는 420 nm 와 550 nm 에서측정하여 β-galactosidase 의활성을각각계산하였다 항균활성조사분리세균의항균력은 disc diffusion assay 방법 [22] 을통하여조사하였다. MRS 액체배지에 30 o C 에서 24 시간동안배양한후, 원심분리하여상등액을취하여공극직경이 0.45 µm 인 syringe filter 로여과한후동결건조시켜 20 배로농축하였다. 항균활성조사에사용된균주들은식중독유발과관련된균주들로 Bacillus cereus ATCC 14579, Escherichia coli ATCC 9637, Salmonella enteritidis ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 12600, Shigella sonnei ATCC Listeria monocytogenes ATCC 를사용하였다. L. monocytogenes를제외한균주들은 LB 액체배지에접종한후, 24시간배양하여사용하였으며, L. monocytogenes은 BHI 액체배지에접종하여사용하였다. 액체배지에접종한후, 이들세균들은 24시간동안배양하여사용하였으며, 배양된균주들을고체평판배지에도말하고, paper disc를올려놓은후, 농축시킨배양상등액 20 µl를흡수시켜 30 o C에서 24시간배양시켜, disc 주변에투명대의형성유무를확인하는방식으로조사하였다. 활성 = 1,000 (A A 550 ) / (tv A 600 ) t: 반응시간 ( 분 ) v: 분석에사용된배양의양 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 세균의분리및특성조사가정에서담근동치미로부터 DK-3, DK-6, DK-13 의세가지젖산균을분리하였다. 각분리균주에대하여 BIOLOG system (Hayward, CA, USA) 와 GP2 MicroPlate TM 로각균주들의다양한탄수화물의이용여부를확인하였다 (Table 1) S rrna 염기서열계통수분석동치미에서분리한세가지균주로부터얻어진 16S rrna 를 universal primer 을이용하여증폭하였다. 16S rrna 염기서열 Fig. 1. Phylogenetic analyses of three isolates, Leuconostoc mesenteroides DK-3 ( ), Leuconostoc dextranicum DK-6 ( ) and Lactobacillus curvatus DK-13 ( ) related lactic acid bacteria based on 16S rrna sequence comparisons. Bootstrap values at nodes of the dendrogram indicate the percentage of occurrence of the branching order in 500 bootstrapped trees. The bar scale represent 1 nucleotide substitution per 100 nucleotides.

5 동치미에서분리한혼합젖산균의생리활성증진 249 분석은 NCBI의 BLAST를사용하여상동성을비교하였다. 그결과, DK-3는 Leuconostoc mesenteroides (99%), DK-6는 Leuconostoc dextranicum (99%), 그리고 DK-13은 Lactobacillus curvatus (99%) 로각각동정되었으며, Leuconostoc mesenteroides DK-3, Leuconostoc dextranicum DK-6, Lactobacillus curvatus DK-13로각각명명하였다. 16S rrna 염기서열분석에근거하여다른균주들과의유연관계를 Fig. 1에나타내었다 생장에따른 ph 변화및유기산정량분석세가지단일배양 (DK-3, DK-6, DK-13) 과이들의혼합배양을 MRS 액체배지에접종하여진탕배양기 (30 o C, 160 rpm) 에배양시키면서각배양의생장에따른 ph 의변화와유기산생성을 12 시간간격으로 HPLC 를이용하여측정하였다 (Fig. 2). 배양초기의 ph 7.0 에서배양후 36 시간만에단일배양인 DK-3, DK-6, DK-13 의 ph 는각각 3.87, 3.88, 3.63 이었으며, 동일시간경과후혼합배양은 ph 3.50 으로최저치에도달하였다. 또한 72 시간배양후최종 ph 는단일배양에서각각 4.12, 4.01, 3.84 로, 그리고혼합배양에서는 3.62 로다소증가되는것으로나타났다. 배양상등액에서생산되는주요대사산물로서젖산과아세트산의농도를측정하였다 (Fig. 3). 배양후 48 시간이경과하였을때젖산과아세트산의생성은최고치를나타내었으며, DK-3 의경우에 mm 과 49.7 mm, DK-6 의경우에 mm 과 28.1 mm, DK-13 의경우에 mm 과 mm 를생산하였다. 반면에혼합배양의경우에는 mm 과 mm 이생성되었으며, 이수치는각단일배양에서생산된젖산과아세트산생성과비교하여현저하게많은양이생산되었음을보여주었다. 발효가잘된김치에서분리한 Lactobacillus plantarum YK- 9 의배양액으로부터젖산 mm 과아세트산 mm 이생산되었으며, 특히묵은지에서분리한 L. sakei JK-17 의배양액에서생성된젖산과아세트산은각각 mm 과 mm 이었다고보고하였다 [10,11]. 이들결과와비교하여동치미에서분리된세가지단일배양과혼합배양에서생성된유기산들은다른김치나묵은지에서의유기산들과비교하여낮게측정되었다. 반면에이결과는동치미에서분리된혼합배양에의한이들유기산생산과비교하여낮은것으로확인되었다. 새우양식장에서분리한 Lactobacillus sp. JK- 8 배양액에서생성된젖산과아세트산은각각 192 mm 과 43.6 mm 이었으며 [23], 요구르트에서분리한 L. casei SK-7 배양액에서각각 mm 과 mm 이생성되었는데 [24], 이결과는동치미에서의유기산생산결과와비교하여낮은것으로확인되었다. 이는원래젖산균의출처인동치미는액상으로서세균의생장을위한고형물질과발효및관련영양소도적게포함되어있기때문으로, 분리된젖산균들에의한유기산생성에는초기농화에사용된시료, 배양조건, 성상등이중요하게영향을미치는것으로사료된다 아질산염소거능각단일배양과혼합배양의아질산염소거능을측정하기위하여, 12 시간간격으로각배양액의아질산염농도를측정하였다 (Fig. 4). 단일및혼합배양의아질산염소거능은 12 시간이후에급격히증가하였으며, 배양후 72 시간이경과하였을때, 단일배양인 DK-3 에서 80%, DK-6 에서 56.75%, DK-13 에서 50.25%, 그리고혼합배양의경우 96.3% 로측정되었다. 단일배양의경우모든배양액은 60 시간까지소거능이지속적으로증가한후에증가가둔화된반면에, 혼합배양은 72 시간까지계속적으로증가하였다. 발효된올리브에서분리한 L. plantarum, L. fermentum, L. mesenteroides 의아질산소거능은각각 91.7%, 99.3%, 75% 였으며, 묵은지에서분리한 L. sakei JK-17 에서는 94.8% 라고보고된바있다 [15,25]. 이들결과를동치미에서분리한단일및혼합배양에서의아질산염소거 Fig. 2. Changes in viable counts (open) and ph values (closed) of individual cultures, DK-3 (circle), DK-6 (square), DK-13 (triangle), and their mixed culture (diamond) during the incubation period. Error bars represent standard deviations based on three independent replicates. Fig. 3. Formation of major organic acids, lactic acid (A) and acetic acid (B), in pure cultures, DK-3 (, ), DK-6 (, ), DK-13 (, ), and their mixed culture (, ) during incubation period. Error bars represent standard deviations based on three independent replicates.

6 250 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(5): (2015) Fig. 4. Nitrite depletion by pure cultures, DK-3 ( ), DK-6 ( ), DK-13 ( ), and their mixed culture ( ) during incubation period. Error bars represent standard deviations based on three independent replicates. 능결과와비교하였을때, 단일배양에서는낮게나타났지만, 혼합배양과비교했을때는우수한것으로확인된다. 아질산염은체내에서 2 급및 3 급아민류 (amines) 와반응하여발암물질인니트로스아민 (nitrosamine) 을생성하는것으로알려져있어 [26], 아질산염소거능은젖산균의기능성으로서중요한것으로사료된다 항산화능각단일배양과혼합배양에서항산화능을알아보기위하여 DPPH 를이용한라디칼소거능을조사하였다 (Fig. 5). 이들모든배양후 24 시간까지급격하게항산화능이증가한후, 60 시간이후에는일정수준으로유지되는것으로나타났다. DK-3, DK-6, DK-13 의단일배양에서최종항산화능은각각 51.6%, 33.4%, 26.1% 로측정되었으나, 혼합배양에서는항산화능이 60.3% 로크게증진되는것이관찰되었다. 김치에서의항산화능은분리된젖산균의종류에따라차이가있는것으로보인다. 배추김치로부터분리한 B. licheniformis KS-17 과 KS-20 에서 40% 이내 [14], Pediococcus pentosaceus K-1 에서 47.9% [10], 그리고묵은지에서분리한 L. sakei JK-17 에서 53.8% [15] 등의항산화능에관한결과가보고된바있다. 이전의결과들과비교하였을때, 동치미에서의항산화능은분리젖산균의단일배양에서비슷하거나낮았으나, 혼합배양에서는높은것으로나타났다. 활성산소는인체내에서 DNA, 단백질, 지질등에서산화적변이의원인이되며, 노화와암을유발하는요인이되는것으로보고되었다 [27-29]. 이러한활성산소를제거하는항산화능은매우중요한요인으로판단되며분리젖산균의혼합배양이항산화능의증진에기여할것으로사료된다 β-galactosidase 활성각단일배양과혼합배양에서 β-galactosidase 활성을알아보기위하여효소액에대한기질의분해도를측정하였다 (Fig. 6). 모든배양에서이효소의활성은접종후 24 시간까지급격히증가하여최대치에도달하였으며, 그후감소하기시작하였다. 단일배양인 DK-3, DK-6, DK-13 에서최대활성은각각 11.2, 9.8, 9.0 units/mg 였으며, 혼합배양의경우에는 16.8 units/mg 로단일배양과비교하여상당히높게나타났다. 요구르트에서분리한 L. casei SK-7 와 L. bulgaricus YK-11 에서 β-galactosidase 최대활성은각각 14.9 units/mg 와 13.1 units/ mg 라고보고된바있으며 [23], 이들활성은동치미에서분리한각단일배양에서의활성보다는높았으나, 혼합배양에서의활성보다는낮은것으로밝혀졌다. β-galactosidase 은유당불내증을완화시킬수있는것으로보고되었으며 [18], 이 Fig. 5. Antioxidant capacity of pure cultures, DK-3 ( ), DK-6 ( ), DK-13 ( ), and their mixed culture ( ) during incubation period, measured as optical density and DPPH radical scavenging capacity. Error bars represent standard deviations based on three independent replicates. Fig. 6. β-galactosidase activity by pure cultures, DK-3 ( ), DK-6 ( ), DK-13 ( ), and their mixed culture ( ) during incubation period, measured as optical density and calculated relative activity. Error bars represent standard deviations based on three independent replicates.

동치미에서분리한혼합젖산균의생리활성증진 251 Fig. 7. Antibacterial activity by 20-fold concentrated supernatants from mixed cultures. Paper discs soaked with the supernatants were placed onto lawn plates of B.

7 동치미에서분리한혼합젖산균의생리활성증진 251 Fig. 7. Antibacterial activity by 20-fold concentrated supernatants from mixed cultures. Paper discs soaked with the supernatants were placed onto lawn plates of B. cereus (A), E. coli (B), S. enteritidis (C), L. monocytogenes, (D), S. aureus (E), S. sonnei (F), respectively. 러한결과를바탕으로유제품에함유되어있는젖당의분해에관여하는효소로서장내락타아제가존재하지않거나활성이낮은사람들의젖당불내성을개선할수있는생리활성요인으로사료된다 항균활성조사혼합배양의항균활성시험은농축된배양상등액을그람양성세균인 B. cereus, L. monocytogenes, S. aureus 와그람음성세균인 E. coli, S. enteritidis, S. sonnei 의식중독원인세균에노출시키고 24 시간동안배양하여, disc 주변의투명대형성여부를통하여항균활성을확인하였다 (Fig. 7). DK-3, DK-6, DK-13 의단일균주배양상등액에서는낮은항균활성이확인되었지만 ( 자료미공개 ), 세균주가섞인혼합배양에서는실험대상균주들모두에대하여상당히높은항균활성이나타나는것으로확인되었다. 동치미에서분리한젖산균의항균활성은다른김치나요구르트에서분리한젖산균의항균활성과유사한것으로보인다 [11,14]. 항균활성에관한요인은박테리오신, 유기산, 과산화수소등이알려져있지만, 본연구에서분리세균의배양액을 ph 조절및가열한후에항균활성조사를통하여밝혀진항균활성은유기산에기인하는것으로판단된다. 우리나라에는수백가지의김치가알려져있으며, 동치미또한옛날부터우리식탁에서건강을위한식품으로애용되어왔다. 이러한동치미를비롯하여여러종류의발효식품에서분리된젖산균들은식품의맛과풍미를증진시키거나생물체내에서방어기작에중요한역할을하며 [4,5,19], 특히항균활성에관여하는요소인유기산, 박테리오신등이포함되어있는것으로알려져있다 [8,9]. 이러한동치미는젖산균 에의한시원한맛과풍미로많은주목을받아왔으나자극적인냄새때문에과거음료로개발에서문제가제기된바있으며, 상대적으로발효에관여하는여러젖산균의생리활성, 기능성, 젖산균들의상호관계에의한상승효과등과관련된연구들은상대적으로미진하였던것이사실이다. 따라서추후동치미가가지는여러가지장점이분명히있는만큼, 단점을보완하는연구를지속적으로수행함과함께, 본연구를통해서밝혀진동치미에서분리된젖산균들의혼합배양에의한여러가지유익한기능성의증진을통하여국민건강에기여할수있도록추진되어야할것이다. 4. CONCLUSION 본연구는한국의발효물김치인동치미로부터분리한프로바이오틱으로서젖산균단일배양과이들세가지혼합배양의몇가지생리활성증진을비교하기위한목적으로실시하였다. BIOLOG 시스템과 16S rrna 염기서열분석을통하여균주의특성을조사하고동정하였으며, 그결과이들균주를 Leuconostoc mesenteroides DK-3, Leuconostoc dextranicum DK-6, Lactobacillus curvatus DK-13로각각명명하였다. 16S rrna 염기서열분석에근거하여각균주들의계통수를작성하였다. 단일및혼합젖산균배양의생장률과생장기간중의 ph 변화, 대사산물로서유기산생성, 여러가지생리활성특성을모니터링하여비교하였다. 배양 72시간후에혼합젖산균배양에서생성되는젖산및아세트산의최대농도는대략 mm과 mm이었으며, ph는 7.00에서 3.62로변화하였다. 혼합젖산균배양액은주어진아질산염을 96.3%

8 252 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(5): (2015) 소거하였다. 항산화및 β-galactosidase 활성은각각 60.3% 와 16.8 units/mg 으로측정되었다. 이들농축된배양상등액은몇가지식중독원인세균들에대하여항균활성을보여주었다. 혼합젖산균배양으로부터얻어진생리활성은단일젖산균배양에서얻어진생리활성보다상당히높았다. 결론적으로, 이들연구를통해서유산균혼합배양은동일한단일배양들과비교하여조사된모든생리활성이현저하게증진되는것으로나타났다. Acknowledgements 본연구는순천향대학교의학술연구지원사업의일부지원으로수행되었음. REFERENCES 1. Balcazar, J. L., D. Vendrell, I. de Blas, I. Ruiz-Zarzuela, J. L. Muzquiz, and O. Girones (2008) Characterization of probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from intestinal microbiota of fish. Aquaculture 278: Baek, H., H. R. Ahn, Y. S. Cho, and K. H. Oh (2010) Antibacterial effects of Lactococcus lactis HK-9 isolated from feces of a new born infant. Kor. J. Microbiol. 46: Ahn, H. R., J. S. So, and K. H. Oh (2011) Characterization and antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from vaginas of women of childbearing age. Kor. J. Microbiol. 47: Kang C. H., K. O. Chung, and D. M. 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(1) 04. 오계헌.fm Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 28(1): 1823 (2013) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2013.28.1.18 연구논문 장기간발효김치인묵은지에서분리한 Lactobacillus sakei JK17 의기능성조사 김동선, 조형우, 김대한, 오계헌 * Functional