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도경 함
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1 J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 46(3), 36~313(217) 복분자자죽염의마우스대식세포주및복강대식세포에대한면역증진효과 박희전 1 * 김석호 2 * 정소희 1 박희란 1 김진형 2,3 송지영 1 1 ( 재 ) 베리앤바이오식품연구소 2 주식회사노터스생명과학바이오식품연구부 3 주식회사노터스 Immunostimulatory Effects of Purple Bamboo Salts Composed with Rubus coreanus in Raw264.7 Cells and Mouse Peritoneal Macrophages Heejeon Park 1*, Sokho Kim 2*, Sohee Jeong 1, Heeran Park 1, Jin-Hyung Kim 2,3, and Jiyoung Song 1 1 Berry&Biofood Research Institute 2 Department of Biofood Research, Knotus Life Science Inc. 3 Knotus Co., Ltd. ABSTRACT Purple bamboo salt (PuBS) is commonly used as a medicinal food in Korea and has beneficial potentials such as antioxidant and anti-inflammatory effects. Rubus coreanus is called Bokbunja, which is used as a traditional medicine for treating asthma, impotence, and allergic diseases in Korea. The aim of present study was to investigate the immunostimulatory effect of PuBS composed with Rubus coreanus (PuBS-R). We performed comparative analysis between PuBS and PuBS-R in Raw264.7 cells, which is a mouse macrophage cell line, and peritoneal macrophages isolated primarily from the mouse peritoneal cavity. We evaluated cytotoxicity and the immune cytokine response in PuBS- and PuBS-R-treated cells. Both PuBS and PuBS-R did not have any cytotoxicity in Raw264.7 cells up to 5 μg/ml. Gene and protein levels of immune cytokines such as tumor necrosis factor-α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ), interleukin (IL)-1, and IL-12 were significantly elevated by PuBS-R more than PuBS in Raw264.7 cells. Moreover, we evaluated the immunostimulatory effects of PuBS-R on mouse primary peritoneal macrophages. Protein levels of inducible nitric oxide synthase, TNF-α, IFN-γ, IL-1, and IL-12 were significantly higher in PuBS-R-treated peritoneal macrophages than PuBS-treated peritoneal macrophages. These results suggest the potential immunostimulatory effect of PuBS-R for immunity against harmful infection. Key words: Rubus coreanus, purple bamboo salt, macrophage, immune cytokine, immunostimulatory 서 외계환경에대한생체의방어능력인면역력의중요성은최근전세계적으로유행한급성호흡기증후군, 조류독감, 에볼라등의등장으로더욱대두하고있다. 외계환경의부조화및생체항상성의교란, 병원체의침입과같은외부위협에의한생체방어능력인면역력은외부자극에가장먼저반응하는비특이적면역과특정병원체가생체의최초방어선을뚫고침입하면이를항원으로인식하여선별적으로제거하는특이적면역이있다 (1). 대식세포 (macrophage) 나자연살해세포 (natural killer cell), 호중구 (neutrophil), 단핵구 (monocyte) 등의비특이적면역은가장먼저인체를병원 Received 8 December 216; Accepted 17 February 217 Corresponding author: Jiyoung Song, Berry & Biofood Research Institute, Jeonbuk 56417, Korea jysong@gbri.re.kr, Phone: * These authors contributed equally to this work. 론 균들로부터방어하는선천면역의주요세포들이다 (2). 특히대식세포는병원체가상피세포장벽을침투하였을시생체방어에있어최초로반응하는세포로항원제시세포 (antigen presenting cell) 로서의기능도수행하며, 특이적면역과관련하여 T세포반응에영향을미친다 (3). 더불어병원체에감염되어정상적인기능을상실한세포나암세포등도제거하고, 면역반응을높이는산화질소 (nitric oxide; NO) 와 tumor necrosis factor-α(tnf-α) 와같은사이토카인 (cytokine) 등을분비하기도한다 (4). 따라서최근에는생체의특이적면역이반응하기전에침입한병원체를신속하게제거할수있는선천성면역기능과관련하여그중가장많은역할을하고있는대식세포를활성화시키는천연물질의연구가활발히진행되고있다. 관련연구중현재보고된것들의예를들면천연물추출물을처리한 Raw264.7 대식세포주에서면역증강효과연구 (4), 사과씨에탄올추출물의대식세포활성에미치는영향연구 (5),

2 복분자자죽염의마우스대식세포주및복강대식세포에대한면역증진효과 37 울금이면역조절에미치는영향연구 (6) 등이있다. 대식세포의표면에는 immunoglobulin G의 Fc, 보체, interferon(ifn), TNF 및병원체에대한수용체가존재한다. 먼저강한탐식능으로이물질을 lysomal enzyme, 활성산소매개물, 과산화수소등으로제거하고, lactoferrin, lysozyme 등으로도없앤다. 위의탐식과정에제거되지않은이물질은 TNF-α, NO 등으로제거하며, 이후특이적면역을유도하기위해탐식된항원을적절히분해하여 T세포에제시하고, interleukin(il)-1, IL-6, IL-8, IL-12 등을분비하여면역계를활성화시킨다 (7). 자죽염 (purple bamboo salt; PuBS) 은대나무에소금을채워구운죽염을용융시켜재결정시킨것으로 3년된대나무통에천일염을넣고입구를황토로막아가마에아홉번굽는것을반복하여제조한다. 아홉번구워제조한자색의소금이자죽염이며주성분은 Na와 Cl이나미네랄및다양한미량원소를포함한유용한물질로알려져있다 (8). 특히자죽염과관련되어밝혀진생체에이로운효능은항염증 (9), 항산화 (1), 구강내세균증식억제 (11), 치은염감소 (12), 대장암세포증식억제 (8) 등이보고되어있다. 복분자 (Rubus coreanus) 는장미과의식물로우리나라중부이남에서자라는높이 2~3 m의식물이다. 5~6월에꽃이피며 7~8월에열매가성숙되어붉은색에서흑색으로완숙된다 (13). Rubus 속에속하는식물종류는 red raspberry, purple raspberry, black raspberry 등이있다 (14). 현재당뇨병, 성욕감퇴, 정액루, 유뇨증, 천식및알레르기관련질병에효능이있는것으로보고되었다 (15). 또한, 외래종복분자로알려진 Rubus occidentalis가항염증효과가있는것으로밝혀져국내토종복분자와의비교연구 (13) 를통해생체의면역계통에영향을미칠수있다는가능성을제시하였다. 현재까지자죽염및복분자와관련해비특이적면역의주요한인자인대식세포와관련하여면역자극및증강에대한연구는진행되지않았다. 따라서본연구에서는복분자를혼입해제조한복분자자죽염 (PuBS-R) 이대식세포의활성에미치는영향을연구할뿐만아니라, 일반자죽염 (PuBS) 과그효능을비교평가하고자한다. 재료및방법시험시료비교평가를위해사용된 PuBS 와 PuBS-R 은전북고창에서생산되고가공된제품을 ( 주 ) 태성식품 ( 고창, 한국 ) 으로부터제공받았다. PuBS는천일염 1% 로제조되었으며구성비상 NaCl 93% 이상인것을사용하였다. PuBS-R은 PuBS 6%, 복분자분말 25%, 삼백초, 곽향, 단삼, 감초, 오가피, 현미를동량추출한혼합물 15% 로구성된환제품을사용했다. 세포에처리하기위해실험농도에맞춰증류수에희석해사용했다. 양성대조군으로사용하기위한 lipopolysaccharide (LPS) 는 Escherichia coli 에서분리한것으로 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA) 에서구입하였다. 세포배양 Raw264.7 세포는마우스기원의대식세포주로서 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA) 에서구입하여사용했다. Peritoneal macrophage를분리하기위해 C57BL/6 마우스는 8주령수컷 1마리를사용하였으며, 온도 23±3 C, 상대습도 55±15%, 환기횟수 1~2회 /h, 조명시간 12시간 ( 오전 8시점등 ~ 오후 8시소등 ) 및조도 15~3 Lux로설정한 ( 주 ) 노터스생명과학실험동물실에서사양하였다. 모든동물은 ( 주 ) 노터스생명과학의실험동물윤리위원의승인및허가에따라사용되었으며, 실험동물사용및관리에따른국제기준을준수하였다 (KLS-2168). Peritoneal macrophage는 C57BL/6 마우스복강에 3% thioglycollate(sigma-aldrich Co.) 를주입하고, 4일뒤경추탈골하여희생시킨다음복강에인산완충용액 (PBS; Sigma-Aldrich Co.) 을넣어 peritoneal macrophage를분리하였다. 분리된 macrophage는세척하여배양배지로부유한후실험에사용하였다. 세포의배양을위하여 1% 열불활화한우태아혈청 (Wellgene, Seoul, Korea) 과 1% penicillin 및 streptomycin(gibco, Grand Island, NY, USA) 을포함한 Dulbecco s modified Eagle s medium(dmem; Wellgene) 배양액에서배양하였다. 세포는 37 C, 5% CO 2 조건에서배양하였고, 2일마다배지를교환하였으며, 세포의증식에따른과밀도현상을해소하기위하여계대배양하였다. 세포증식률 PuBS와 PuBS-R이 Raw264.7 세포에미치는잠재적인독성이나영향을평가하기위해세포증식률을평가하였다. Raw264.7 세포를 1% FBS와 1% penicillin+streptomycin이포함한 DMEM에현탁후, 48-well plate에 cells/well의밀도로분주한뒤 24시간동안안정화시켰다. 안정화후배양배지를이용하여처리시험물질을조제한다음세포에처리하였다. 배지를제거하고 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-tetrazolium bromide(mtt; Sigma- Aldrich Co.) 를.5 mg/ml 농도로처리후 2시간동안배양하면서환원반응을유도한후, formazan 결정을 dimethylsulfoxide(dmso; Sigma-Aldrich Co.) 용액으로용해한후, Epoch 2 Microplate-Reader(BioTek, Winooski, VT, USA) 를이용하여흡광도 (54 nm) 를측정하였다. LPS와시험물질이처리되지않은조건에서배양한대조군을기준으로시험물질처리군의세포증식률 (%) 을계산하였다. 유전자분석 TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL-1 등사이토카인의발현에미치는효과를유전자단위에서확인하기위하여 real time

3 38 박희전 김석호 정소희 박희란 김진형 송지영 Table 1. Gene primer sequences Gene name Primer sequence (5-3 ) Position cdna Gene Bank ID TNF-α FP: CAA CAT ACT GCT AAC CGA CTC CT RP: TGA GGG TCT TCA GCT TCT CAC NM_1548 IFN-γ IL-12 IL-1 GAPDH FP: GGA AGC ACG GCA GCA GAA TA RP: AAC TTG AGG GAG AAG TAG GAA TGG FP: CGT CGT AGC AAA CCA CCA AG RP: TTG AAG AGA ACC TGG GAG TAG ACA FP: CAG CAA CAA CAT AAG CGT CA RP: CCT CAA ACT TGG CAA TAC TCA FP: CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA RP: CCT GCT TCA CCA CCT TCT TGA NM_8352 NM_13693 NM_ NM_ RT-PCR(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 을수행하였다. TRIzol 시약 (Sigma-Aldrich Co.) 을이용하여 Total RNA 를분리한후 Nano drop(thermo, Waltham, MA, USA) 을이용하여 mrna를정량하였다. 정량후동일한농도 (1 ng/μl) 의 RNA를 random primer를사용하여 cdna로역전사시켰다. 각각의샘플을 cdna synthesis kit(toyobo, Osaka, Japan) 을처리해 37 C에서 15분, 5 C에서 5분, 98 C에서 5분간 PCR(Bio-Rad) 에서반응시켰다. 역전사된 cdna를이용하여 target cytokine의유전자발현을 real time RT-PCR을이용하여확인하였다. Wizbiosolution (Seongnam, Korea) 의 SYBR을각각의샘플에처리하여 95 C에서 5분, 그리고 1초반응시킨뒤 6 C에서 2초반응시키는것을총 4회반복증폭하였다. Melt curve는 65 C에서 95 C 사이로확인하였다. 실험에사용된 primer 의염기서열은 Table 1에기재하였다. 사이토카인단백질분석 PuBS와 PuBS-R이 Raw264.7 세포및 peritoneal macrophage의면역증강에미치는영향을확인하기위해상기언급한실험구성으로배양한세포의상층액을회수한후면역관련사이토카인을확인하였다. 회수한세포상층액은 1, rpm에서 1분간원심분리하여깨끗한상층액만을취득하 였다. 취득한상층액에서 TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL-1, 그리고 inducible nitric oxide synthase(inos) 의분비량을효소면역측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) kit(ebioscience, San Diego, CA, USA) 을사용하여측정하였다. 간략히설명하자면각각의 kit에포함된항체코팅된 96-well plate에 5 μl의샘플을처리한후, assay buffer 5 μl를처리했다. Biotin-Conjugate solution 을각 well에 5 μl씩처리한후빛이차단된상온에서 2시간반응시켰다. 3번세척한후 Streptavidin-HRP solution 을 1 μl씩처리해빛이차단된상온에서 1시간반응시켰다. 3번세척후 TMB solution 1 μl를 1분동안반응시킨다음, stop solution을 1 μl 처리하여반응을멈추게하고 Epoch 2 Microplate-Reader(BioTek) 를사용해 45 nm에서흡광도를확인하였다. 통계처리모든실험은 3번이상반복하여평균값과오차를구하여나타내었고, 통계처리는 SPSS(Statistical Package for Social Science, version 2., SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계프로그램을이용하여 one way ANOVA paired T-test로분석하였으며, 실험군간의유의성은 P<.5 수준에서비교하였다. A 14. Cell proliferation B 14. Cell proliferation Percentage of control Percentage of control Control LPS Control LPS Fig. 1. Effect of PuBS and PuBS-R on the proliferation of Raw264.7 cells. Cells in 48-well plate (5 1 5 cells/well) were treated with the indicated concentration of (A) PuBS, (B) PuBS-R (5, 1, 5, 1, 5, and 1, µg/ml), or LPS (1 µg/ml) for 24 h. Percentage of control means (sample O.D value 54 nm/control O.D value 54 nm) 1. A significant difference at P<.1 level compared to the control.

4 복분자자죽염의마우스대식세포주및복강대식세포에대한면역증진효과 39 결과및고찰세포독성및증식률평가세포에처리할 PuBS와 PuBS-R의최적농도를결정하기위해 MTT assay를수행하였다 (Fig. 1). PuBS와 PuBS-R 을 5~1, μg/ml 농도로 Raw264.7 세포에 24시간동안처리한결과 PuBS의경우 5 μg/ml까지이렇다할세포독성을보여주지않다가 1, μg/ml 농도처리시정상대조군에비해낮은세포증식률로서독성을보였다 (Fig. 1A). 그러나 PuBS-R을처리한세포의경우오히려 5 μg/ml 이상처리시세포가유의하게증식하는결과를확인할수있었다 (Fig. 1B). 이것은고농도의 NaCl을함유한 PuBS보다 PuBS-R이대식세포에미치는악영향이적다는것뿐만아니라대식세포의증식에도도움을준다는것을나타낸다. 이실험결과에따라이후실험에선공통적으로 5, 1, 5 μg/ml 농도로 PuBS와 PuBS-R을처리하였다. 대식세포주에서면역관련사이토카인유전자변화앞서실험에서정한농도대로 PuBS와 PuBS-R을처리한 Raw264.7 세포에서 mrna를분리하여분석하였다. TNFα, IFN-γ, IL-12, IL-1을확인하였다 (Fig. 2). 선천성면역반응의중요인자로여겨지는 TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL- 1 등과같은사이토카인은대식세포가활성화되면발현이증가하게되고이를통해다른면역세포들의면역반응을촉진시키는역할을하게된다. TNF-α는대식세포및 Th1 세포로부터생성되는사이토카인으로단핵구및다른면역세포를자극하여백혈구의유주및보충등에중요한역할을하는 chemokine을분비하게해백혈구의활성을통해병원체를제거한다 (16). IFN-γ는 T세포에작용하여 Th1세포 (T helper 1 cell) 의분화를촉진시킴과동시에 Th2세포 (T helper 2 cell) 의증식을억제하여미생물성병원체의침입시최전선에서방어하는사이토카인이다 (17). IFN-γ는 T 세포, B세포, 호중구, 자연살해세포, 혈관내피세포에작용하여활성화시킬수있으며, 대식세포활성화인자로작용하여 MHC class Ⅰ, Ⅱ 발현을증가시키기도한다. IL-12와 IL- 1 등은 NO 같은염증관련인자의생성을촉진하는것으로알려져있으며, IL-12의경우대식세포주에서주로생성되어다른면역세포, 주로면역반응초기에자연살해세포와 T세포에작용하여 IFN-γ의생산을유도하는세포성면역작용을한다 (18). IL-1의경우 Th1세포에서생산되는 TNF-α, IL-1β, IL-6 등의생산을억제하여여러가지면역관련사이토카인생성균형을조절하는역할을하는것으로알려져있다 (19). 이들사이토카인발현에미치는효과를측정하기위하여다음과같은실험군에서유전자를분석하 C A Relative fold to GAPDH. Relative fold to GAPDH TNF-α * Control LPS IL-12 Control LPS B Relative fold to GAPDH. D Relative fold to GAPDH IFN-γ Control LPS IL-1 Control LPS Fig. 2. Stimulatory effect of PuBS and PuBS-R on the expression of cytokine (A) TNF-α, (B) IFN-γ, (C) IL-12, and (D) IL-1 mrna levels in Raw264.7 cells. The levels of mrnas for cytokines were determined by real time RT-PCR using total RNA extracted from Raw264.7 cells treated with the indicated concentrations of PuBS, PuBS-R (5, 1, and 5 µg/ml), or LPS (1 µg/ml) for 24 h. A significant difference at * P<.5, P<.1, P<.1 level compared to the control. A significant difference at P<.1 level compared to the PuBS (5 µg/ml). A significant difference at P<.1 level compared to the PuBS (1 µg/ml). A significant difference at P<.1 level compared to the PuBS (5 µg/ml).

5 31 박희전 김석호 정소희 박희란 김진형 송지영 였다. 어떤처리도하지않은정상대조군 (control), LPS만을처리한양성대조군, PuBS와 PuBS-R을농도별로처리한실험군이발현하는사이토카인을 real time RT-PCR을통하여측정하였다. Fig. 2에서확인할수있듯이 TNF-α는정상대조군보다 LPS를처리한양성대조군에서 3배많은양의 TNF-α를발현하였다. PuBS의경우 5, 1 μg/ml 농도처리시오히려유의하게감소하는경향을보였고, 5 μg/ml 처리시유의하게증가하는것이확인되었다. PuBS- R의경우 1 μg/ml 이상처리시정상대조군보다유의하게증가하였고, 같은농도의 PuBS 처리군과비교시에도유의하게증가한것을확인할수있었다. IFN-γ의경우정상대조군보다모든실험군에서농도의존적으로발현이증가하는경향을확인할수있었다. PuBS와 PuBS-R 군끼리같은농도에서비교시 PuBS-R 군이유의하게높게발현하는결과를보였다. 이것은 IL-12와 IL-1에서도동일한유전자발현경향을보였고, 따라서 Raw264.7 세포에서 PuBS- R은농도의존적으로각각의면역유도유전자발현을증가시켰으며, 그증가는같은농도의 PuBS 와비교시에우월한것으로나타났다. 대식세포주에서면역관련사이토카인단백질변화상기확인한유전자실험과같은세포실험군에서분리한 단백질로실험을진행하였다. 확인한유전자종과같이 TNFα, IFN-γ, IL-12, IL-1 등의단백질생성량을평가하였다. Fig. 3에서확인할수있듯이전반적인경향은각각의유전자발현과비슷한양상을보였다. TNF-α의경우 PuBS-R 5 μg/ml 처리시가장높은단백질발현정도를보여줬으며, PuBS-R을처리한군이같은농도의 PuBS를처리한군보다유의하게높은단백질생성량을보였다. IFN-γ, IL-1 등도 TNF-α와같은경향을보였다. IL-12 단백질의경우 PuBS 5과 1 μg/ml 농도를처리한군에서는정상대조군과유의한차이를보이지않았고, PuBS-R 5 μg/ml를처리한군도정상대조군과는유의한생성량차이가없었으나같은농도의 PuBS를처리한군과비교시유의하게증가하였다. 이러한결과는 Raw264.7 세포에 PuBS-R이면역관련사이토카인에미치는영향이유전자단계평가와동일하다는것을나타내며, 앞선결과의신뢰성을더해주었다. Peritoneal macrophage 에서면역관련사이토카인단백질변화대식세포주에서실험한결과를바탕으로 C57BL/6 마우스의복강에서분리한대식세포를초대배양해 PuBS와 PuBS-R이미치는영향을평가했다. Fig. 4에서확인할수있듯이대식세포주에서확인했던결과와비슷한경향을확 A pg/ml (45 nm) TNF-α B pg/ml (45 nm) IFN-γ Control LPS Control LPS C pg/ml (45 nm) IL-12 # D pg/ml (45 nm) IL-1 * ## + Control LPS Control LPS Fig. 3. Stimulatory effect of PuBS and PuBS-R on the cytokine production of (A) TNF-α, (B) IFN-γ, (C) IL-12, and (D) IL-1 in Raw264,7 cells. Raw264.7 cells were treated with the indicated concentrations of PuBS, PuBS-R (5, 1, and 5 µg/ml), or LPS (1 µg/ml) for 24 h. Culture supernatants were then isolated and analyzed using ELISA kit for cytokines. A significant difference at * P<.5, P<.1, P<.1 level compared to the control. A significant difference at # P<.5, ## P<.1, P<.1 level compared to the PuBS (5 µg/ml). A significant difference at + P<.5, ++ P<.1, P<.1 level compared to the PuBS (1 µg/ml). A significant difference at P<.1 level compared to the PuBS (5 µg/ml).

6 복분자자죽염의마우스대식세포주및복강대식세포에대한면역증진효과 311 A pg/ml (45 nm) TNF-α * + B pg/ml (45 nm) IFN-γ C pg/ml (45 nm) Control LPS IL-12 Control LPS E 16 inos $ ## 1 pg/ml (45 nm) Control LPS D pg/ml (45 nm) Control LPS IL-1 Control LPS Fig. 4. Stimulatory effect of PuBS and PuBS-R on the cytokine production of (A) TNF-α, (B) IFN-γ, (C) IL-12, (D) IL-1, and (E) inos in mouse peritoneal macrophages. Mouse peritoneal macrophages were treated with the indicated concentrations of PuBS, PuBS-R (5, 1, and 5 µg/ml), or LPS (1 µg/ml) for 24 h. Culture supernatants were then isolated and analyzed using ELISA kit for cytokines. A significant difference at * P<.5, P<.1, P<.1 level compared to the control. A significant difference at ## P<.1, P<.1 level compared to the PuBS (5 µg/ml). A significant difference at + P<.5, ++ P<.1, P<.1 level compared to the PuBS (1 µg/ml). A significant difference at $ P<.5, P<.1 level compared to the PuBS (5 µg/ml). 인할수있었다. TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL-1, inos 등의면역관련사이토카인을단백질단위에서확인하였다. 당연하게도대식세포주에서실험했을때와유사한경향을보였지만 IFN-γ, IL-12 등의특정단백질발현량절대값이대식세포주에서실험한결과값과비교해볼때초대배양한 peritoneal macrophage에서더높았다. 이것은아마도생체내에서바로분리한대식세포에 PuBS와 PuBS-R이더민감하게작용하여자연살해세포를포함하는 2차비특이적면역계에신속히영향을미칠것으로생각된다. TNF-α는 PuBS와 PuBS-R 모두 5, 1, 5 μg/ml 농도전구간에서정상대조군보다높게발현되었다. IFN-γ는 PuBS 5 μg/ ml 처리시정상대조군과차이가없었고, PuBS-R을처리한군이같은농도를처리한 PuBS 처리군보다두배이상높게발현되었다. IL-12의경우모든실험군에서전반적으로증가하였고, PuBS-R 5 μg/ml 처리한군만이같은농도의 PuBS를처리한군보다높은결과값을보였다. IL- 1에서는 5, 1 μg/ml 농도의 PuBS 처리군만이정상대조군보다높은 IL-12 생성량을보였다. PuBS-R을처리한군은정상대조군보다두배이상높은생성량을보였으며, 이것은 PuBS를같은농도처리한군과비교해서도마찬가지였다. 마지막으로우리는 inos의생성량을확인하였다. 앞서설명했다시피대식세포에면역자극성물질을처리하면 TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL-1 등의사이토카인과 NO와같은염증관련인자의생성을촉진하는것으로알려져있다 (19). 특히 NO는 free-radical로서산화력을가지고있으며, 심혈관계, 신경계및면역계의전달물질로서세포내항상성유지, 신경전달물질의운반, 항암작용등의기능을한다 (2). 이것이과량생성되면심각한염증을유발하여생체에여러악영향을유발할수있으나, 정상범위에서벗어나지않는 NO 생성은비특이적면역의중요한인자로여겨진다 (21). 따라서본연구에서는이러한 NO를생산하는인자인 inos의생성량을 ELISA 실험을통해 peritoneal

7 312 박희전 김석호 정소희 박희란 김진형 송지영 macrophage에서확인하였다. 다른면역관련사이토카인과같이 PuBS와 PuBS-R을처리한모든군에서정상대조군보다유의하게증가하였으며, PuBS와 PuBS-R을비교하였을시에도 PuBS-R을처리한군이 PuBS를같은농도로처리한군보다유의하게증가하였다. 이러한결과를종합하여볼때전통적으로기능성식품또는약으로사용된자죽염과복분자를조합한복분자자죽염, PuBS-R이비특이적면역의초기반응세포인대식세포에있어빠르고높은면역반응을유도한다는것을알수있었다. 기존의일반적인자죽염, PuBS 역시대식세포를자극하여면역관련사이토카인을유도하고증가시켰지만그정도가 PuBS-R에비해낮았고, 복분자를조합한 PuBS-R 이세포의정상적인증식에서도안전하다는결과를확인가능했다. 요약본연구에서는전통적인기능성식품이자의약품으로사용되었던자죽염 (PubS) 과복분자를조합한복분자자죽염 (PuBS-R) 을사용해비특이적, 선천성면역에중요한역할을하는대식세포에서의영향을확인하였다. PuBS-R은마우스대식세포인 Raw264.7 세포에서 1, μg/ml 농도처리시세포의증식을유발하였으며, 그에반해 PuBS를 1, μg/ml 처리시유의하게세포증식률이억제되었다. 이어서면역관련사이토카인 TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL- 1 등을유전자단계와단백질단계에서평가하였다. 그결과 PuBS-R은 5, 1, 5 μg/ml에서유의한증가율을보였고, 무엇보다이것은 PuBS 군에비해서도월등한증가율을확인할수있었다. 마지막으로마우스의복강에서분리한 peritoneal macrophage에 PuBS-R을처리후 TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL-1, inos를단백질단계에서평가한결과, Raw264.7 세포에서얻은결과와동일한결과를확인할수있었다. 이러한결과로미루어보아 PuBS-R은인체의대식세포활성의증가를통해비특이적, 선천성면역력을증가시킬것으로판단되며, 이러한결과를바탕으로추후실험동물을이용한 in vivo 후속연구를통해 PuBS-R의면역증강기능성식품개발이가능할것으로생각된다. 감사의글본연구는 복분자장어푸드테라사업단 의 푸드테라피연구사업 과제에의해이루어진것이며, 본연구를잘수행할수있게도와주신박우정이사장님과문규환소장님, 주식회사노터스생명과학에감사드립니다. 좋은연구시료를제공해주신주식회사삼보죽염에도감사를표합니다. REFERENCES 1. London NR Jr, Tharakan A, Ramanathan M Jr The role of innate immunity and aeroallergens in chronic rhinosinusitis. Adv Otorhinolaryngol 79: Locati M, Mantovani A, Sica A Macrophage activation and polarization as an adaptive component of innate immunity. Adv Immunol 12: Birk RW, Gratchev A, Hakiy N, Politz O, Schledzewski K, Guillot P, Orfanos CE, Goerdt S. 21. Alternative activation of antigen-presenting cells: concepts and clinical relevance. Hautarzt 52: Ortiz-Andrellucchi A, Sánchez-Villegas A, Rodríguez-Gallego C, Lemes A, Molero T, Soria A, Peña-Quintana L, Santana M, Ramírez O, García J, Cabrera F, Cobo J, Serra- Majem L. 28. Immunomodulatory effects of the intake of fermented milk with Lactobacillus casei DN1141 in lactating mothers and their children. Br J Nutr 1: Byun MW Immunomodulatory activities of apple seed extracts on macrophage. J Korean Soc Food Sci Nutr 42: Yoo SA, Kim OK, Nam DE, Kim Y, Baek H, Jun W, Lee J Immunomodulatory effects of fermented Curcuma longa L. extracts on RAW cells. J Korean Soc Food Sci Nutr 43: Jeong JB, Hong SC, Jeong HJ, Koo JS Anti-inflammatory effects of ethyl acetate fraction from Cnidium officinale Makino on LPS-stimulated RAW and THP-1 cells. Korean J Plant Res 25: Zhao X, Song J, Lee JH, Kim SY, Park KY. 21. Antioxidation and cancer cell (HT-29) antiproliferation effects Rubus coreanus Miquel bamboo salt. Cancer Prev Res 15: Shin HY, Lee EH, Kim CY, Shin TY, Kim SD, Song YS, Lee KN, Hong SH, Kim HM. 23. Anti-inflammatory activity of Korean folk medicine purple bamboo salt. Immunopharmacol Immunotoxicol 25: Huh K, Kim YH, Jin DQ. 21. Protective effect of an aged garlic-bamboo salt mixture on the rat with the alcohol-salicylate induced gastropathy. Yakhak Hoeji 45: Sohn WS, Yoo YC, Kim CR The effect of NaCl and bamboo salt on the growth of various oral bacteria. J Korean Acad Oral Health 15: Kim CY, Chung SC, Sohn WS Comparison of the anti-plaque and anti-inflammatory effect of the dentifrices containing NaCl and bamboo salt. J Korean Acad Oral Health 15: Yang HM, Lim SS, Lee YS, Shin HK, Oh YS, Kim JK. 27. Comparison of the anti-inflammatory effects of the extracts from Rubus coreanus and Rubus occidentalis. Korean J Food Sci Technol 39: Cha HS, Lee MK, Hwang JB, Park MS, Park KM. 21. Physiocochemical characteristics of Rubus coreanus Miquel. J Korean Soc Food Sci Nutr 3: Moon GS Constituents and uses of medicinal herbs. Ilweolseogak, Seoul, Korea. p Kiemer AK, Vollmar AM. 21. The atrial natriuretic peptide regulates the production of inflammatory mediators in macrophages. Ann Rheum Dis 6: iii68-iii Chang TT, Stevens SR. 22. Atopic dermatitis: the role of recombinant interferon-gamma therapy. Am J Clin Dermatol 3: Watford WT, Moriguchi M, Morinobu A, O Shea JJ. 23. The biology of IL-12: coordinating innate and adaptive im-

8 복분자자죽염의마우스대식세포주및복강대식세포에대한면역증진효과 313 mune responses. Cytokine Growth Factor Rev 14: Kang BK, Kim KBWR, Ahn NK, Choi YU, Kim M, Bark SW, Pak WM, Kim BR, Park JH, Bae NY, Ahn DH Immuno-stimulating activities of skipjack tuna Katsuwonus pelamis cooking juice concentrates on mouse macrophages and spleen cells. Kor J Fish Aquat Sci 47: Lowenstein CJ, Snyder SH Nitric oxide, a novel biologic messenger. Cell 7: Kim JJ, Lee SW, Park KW, Seo KI, Yee ST Effect of Flammulina velutipes extracts cultivated with oriental herbal plants on the activation of immune cells. J Life Sci 22:

γ

경락경혈학회지 Vol.27, No.1, pp.87 106, 2010 Journal of Meridian & Acupoint Dept. of 1 Meridian & Acupoint, 3 Acupuncture & Moxibustion, College of Oriental Medicine, Daejeon University 2 Division of Clinical