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1 대한치주과학회지 2008;38: 법랑기질유도체가탈회치근표면에서치주인대섬유아세포의생물학적성상에미치는영향 이강운, 김태일, 설양조, 이용무, 구영, 류인철, 정종평, 한수부 * 서울대학교치의학대학원치주과학교실 Effects of enamel matrix derivatives on biologic activities of human periodontal fibloblasts to demineralized root surface Kang-Woon Lee, Tae-Il Kim, Yang-Jo Seol, Yong-Moo Lee, Young Ku, In-Chul Rhyu, Chong-Pyung Chung, Soo-Boo Han * Department of Periodontology, School of dentistry, Seoul National University ABSTRACT Purpose: The aim of this study was to investigate the effects of EMD on demineralized root surface using human periodontal ligament cells and compare the effects of root conditioning materials(tetracycline(tcn), EDTA). Material and Methods: Dentin slices were prepared from the extracted teeth and demineralized with TCN and EDTA. Demineralized dentin slices were incubated at culture plate with 25, 50 and 100 μg /ml concentration of EMD. Cell attachment, alkaline phosphatase activity test, protein synthesis assay and scanning electronic microscopic examination were done. Results: Cells were attached significantly higher in EMD treated group at 7 and 14 days. Cell numbers were significantly higher in EMD treated group. Alkaline phosphatase activity was significantly higher in EMD treated group at 7 and 14 days. Protein synthesis was significantly higher in EMD treated group at 7 and 14 days. Conclusion: Enamel matrix derivatives enhance the biologic activities of human periodontal ligament cells on demineralized root surface and its effects are dependent on the concentration of EMD. (J Korean Acad Periodontol 2008;38: ) KEY WORDS: Enamel matrix derivatives; PDL cell; Tetracycline; EDTA. 서론 치주질환으로인한치주조직의상실은치아발거의주요한원인중의하나이며, 약화되거나결손된치주조직을재생시키는것이치주치료의궁극적인지향점이다. 치주질환으로인해상실된치주조직의재생을위해서다양한술식이행해지고있다. 일반적인치주치료인기계적방법으로는이상적인치주조직의재생이아닌긴접합상피만으로치유되는것으로알려져있어, 진정한의미의조직재생을위한다 Correspondence: Dr. Soo-Boo Han Department of Periodontology, College of dentistry, Seoul National University, 28 Yeongon-Dong, Chongno-Ku, Seoul, , Korea. perioh@snu.ac.kr, Tel: , Fax: Received: Nov. 3, 2008; Accepted: Dec. 18, 2008 양한방법들이시도되어왔다. 자가골, 동종골이식또는이종골등을이용한골대체재이식, 치근면탈회, 차폐막을이용한조직유도재생술 (Guided Tissue Regeneration) 1) 등의방법이개발되어왔다. 근래들어생물학적방법을이용한재생술식이소개되었다. 그중법랑기질유도체 (Enamel Matrix Derivative, EMD) 는백악질의형성에관여하는아멜로제닌에대한연구에기초를두고있다 2). 이단백질은백악질, 치주인대, 지지골의배아형성시기에높은활성을보인다고알려져있으나, 그기전은아직명확히밝혀져있지않다. 시험관적연구를통하여 EMD 가세포의부착, 분화및생합성에영향을미쳐치주인대섬유아세포의부착을증가시키지만, 치은섬유세포나상피세포에서는효과가없다고알려져있다. 이는 EMD 679

2 이강운, 김태일, 설양조, 이용무 대한치주과학회지 2008 년 38 권 4 호 가치유의초기단계에서선택적인작용을함을의미한다고하였고 3), 다른연구에서는 EMD 의농도, 세포의밀도와증식조건, 실험디자인과방법, 시간, 재료등에따라차이를나타내며기여하였다고보고하였다 4). 또다른연구에서는 EMD 가치주인대섬유아세포와미분화된간엽세포에서뚜렷한분화촉진작용을나타낸다고하였으며 5), EMD 가치은섬유아세포보다치주인대섬유아세포에서그효과가더크게나타난다고하였다 6). 이는 EMD 의작용이초기재생단계에서상피의하방증식을억제하는방향으로나타나는것으로보이며, 상피세포에의한치유보다결합조직에의한치유를도와주는작용을한다고볼수있다 7). 또한 EMD 의적용은치주인대섬유아세포의대사활성을증가시키며세포외간질입자의생합성을증가시키고, 석회화에연관된유전자발현과치주세포분화에영향을미치며, 치주인대섬유아세포에서알칼리성인산효소발현을유도한다 3). 법랑기질유도체의다기능활동은포함되어있는법랑기질단백질에의해나타날수있다. 법랑기질단백질의주요한역할은생석회화를조절하는것이며, 또한성장인자와유사한작용을할수있는잠재성을가지고있다 6). 구연산등에의한치근면탈회가치주조직염증치료에효과가있다고보고된이후효소나산등을국소적으로적용해보려는시도들이있어왔다. 치주질환에이환된치근면에조직재생이일어나지않는원인으로는세균이나내독소에의한치근면의오염, 광물질의조성과밀도의변화, 교원질섬유의감소등이있으며, 이는치주질환에이환된치근면에서치주치료후접합상피로치유되는동물실험을통해서알수있다. 치석제거술이나치근활택술만으로는신생결합조직부착을재생하지못하며긴접합상피로치유가되게되는데, 치근면탈회가동반되면섬유아세포의이동과부착이촉진된다고보고되었다 8). 테트라싸이클린 (Tetracycline HCl, TCN) 을치근표면에도포하는것은세포독성인자를제거하고상아질간질교원섬유를노출시켜치유과정에서새로운섬유와결합할수있는근거를마련해주어접합상피의근단이동을방지함으로신생결합조직의부착을촉진시킨다고알려져있다. 구연산과 TCN 을비교했을때, TCN 으로탈회한경우가섬유아세포의부착이더많이일어났다는연구가있었고 9), TCN 과 EDTA(Ethylene diamine tetra acetic acid) 탈회후치주인대섬유아세포의부착을관찰했을때 TCN 이더효과적이었다는연구도있었다 10). 이연구의목적은치근활택술후 TCN 또는 EDTA 로탈회된치근면에서다양한농도의 EMD 의적용이치주인대섬유아세포의생물학적성상에미치는영향을알아보는데있으며, TCN 과 EDTA 로탈회를했을때어떤제제가더효과적인지비교해보고자한다. 재료및방법 1. 치주인대섬유아세포의배양실험에사용된치주인대섬유아세포는서울대학교치과병원에서교정치료를목적으로발거된건강한치아의치근에서분리하여사용하였다. 발거된치아를생리식염수로세척하고 1% 의항생제 (penicillin G sodium 10,000 units/ml, streptomycin sulfate 10,000 ug/ml, amphotericin B 25 ug/ml, Gibco, U.S.A) 가첨가된 α-mem(gibco, U.S.A) 에담근후, 치근의중앙 1/3 부분에서큐렛으로치주인대조직을조심스럽게박리한후배양접시에부착시켜배양하였다. 배양액으로는 10% 의 fetal bovine serum(fbs, Gibco, U.S.A) 과 1% 의항생제 (penicillin G sodium 10,000 units/ml, streptomycin sulfate 10,000 ug/ml, amphotericin B 25 ug/ml, Gibco, U.S.A) 를첨가한 α-mem 을사용하였고, 2-3 일마다배지를교환하였다. 세포들은 1:4의비율로계대배양하였으며, 3-4 회계대배양된치주인대섬유아세포를사용하였다. 2. 치근절편의준비잔존치조골의높이가치근단 1/3 이하이고최근 6개월간치주치료를받지않은치주질환을가진환자에서발거된치아를큐렛 (Hu-Friedy, Chicago, IL, USA) 을이용하여치근활택술을시행한후, 절단기 (Exakt, Exact cutting & grinding system, Hamburg, Germany) 를이용하여크기 mm의치아절편을얻었다. 실험에사용된절편은아무런처치를하지않은군을음성대조군 (Control, C) 으로, 치근면을 TCN 또는 EDTA 로탈회한군을양성대조군으로하였으며, TCN 또는 EDTA 탈회후 EMD 포함배지 (25, 50, 100 ug/ml) 에서배양된군을실험군으로하였다. 680

3 J Korean Acad Periodontol 2008;38(4) 법랑기질유도체가탈회치근표면에서치주인대섬유아세포의생물학적성상에미치는영향 3. 치근절편의탈회 6. 알칼리성인산효소활성의측정 준비한치근절편을증류수로충분히세척후 TCN과 EDTA 를이용하여탈회시켰다. TCN(Tetracycline HCl, Chonggeundang, Korea) 은 10% 농도로증류수에녹인후 3분간탈회시켰으며, EDTA(PrefGel, Biora, Sweden) 는 24% 의농도로 2분간적용시켜탈회하였다. 탈회시킨절편을다시잘세척한후모든절편을 1000 units/ml penicillin과 1000 ug/ml streptomycin 용액을넣은 α-mem 에 24시간을둔후, 100 units/ml penicillin과 100 ug/ml streptomycin 용액을넣은 α-mem 으로세척하였다. EMD(30 mg/ml) 는 10% 의 FBS 와 1% 의항생제용액 (penicillin G sodium 10,000 units/ml, streptomycin sulfate 10,000 ug/ml, amphotericin B 25 ug/ml, Gibco, U.S.A) 이함유된 α-mem 배지와 acetic acid 를이용하여각농도별로희석하였다. 4. 세포접종 치주인대섬유아세포의알칼리성인산효소활성을측정하였다. 1 mm MgCl 2, 25 mm sucrose, 5 mm tris-hcl buffer(ph=9.8), 그리고 2 mm p-nitro-phenylphosphate (Wako Pure Chemical, Osaka, Japan) 의반응액을미리준비하여, 7일, 14일째의치근절편을각각 10개씩 well에서꺼내어 25 mm의 sucrose 용액으로씻은후, 다시새로운 24 well 배양접시로옮겼다. 준비한반응액을각 well당 300 ul씩넣어치근절편이잠기도록하였다. 반응액과세포- 치근절편이들어있는 24 well 배양접시를 37 C 수조로옮겨반응이일어나도록하였고, 30분후에 24 well 배양접시를얼음위에위치시키고, 0.1 N 1.5 mm의 NaOH 를첨가함으로써반응을중지시켰다. 각 well에서반응이일어난용액을 200 ul씩 96well 배양접시로옮기고, spectrophotometery 를이용하여 405 nm에서흡광도를측정하였다. 알칼리성인산효소의활성은분해된 p-nitrophenol 의양으로나타내었다. 배양한치주인대섬유아세포를 0.25% 의 trypsin과 4 mm EDTA 를혼합한효소용액에넣고서 37 C에서 10분간반응시켜탈리시킨후, 원침 (1200 rpm, 4 C, 10분 ) 하여수집하였다. 10% 의 FBS와 1% 의항생제용액, 10 mm Naβglcerolphosphate(Sigma, U.S.A), 50 ug/ml의 L-ascorbic acid(sigma, U.S.A), 그리고 10-7 M Dexamethasone (Sigma, U.S.A) 이포함된 α-mem 배지를준비하고이배지에서수집된세포가 cell/ml 이되도록하였다. 24 well 배양접시 (Nunc, Rochester, NY, U.S.A) 에치근절편을 well당 1개씩위치시킨후세포가들어있는배지를 well 당 1 ml씩접종한후 95% air, 5% CO 2, 37 C 조건의배양기에서실험기간동안배양하였다. 7. 단백질양의측정알칼리성인산효소활성을측정한후, 세포가부착되어있는치근절편을 25 mm의 sucrose 에 2회세척후 10% 의 SDS(sodium dodecyl sulfate, Sigma, U.S.A) 를 100 ul씩첨가하여흔들어주면서세포를용해시킨후, 세포의단백질농도를 Bradford 의방법대로 Bio-Rad protein assay kit(bio-rad, U.S.A) 를이용해서 595 nm의흡광도로측정하였다. 흡광도를단백질양으로환산하기위하여 BSA 를표준으로하였다. 8. 주사전자현미경관찰 5. 세포수의측정배양 7일, 14일째에각 well의치근절편을 10개씩꺼내어각각 1.5 ml 튜브에넣고 500 ul의효소용액 (0.25% trypsin in 4 mm EDTA) 으로탈리시킨후, 곧바로튜브를진탕하여세포부유액이균일하도록혼합하고광학현미경하에서혈구측정기로세포수를측정하였다. 표면에세포가배양된치근절편을 1일, 14일째에새로운 24 well 배양접시로옮겨 well당 1.0 ml씩 2.5% glutaraldehyde를넣었다. 4 C에서 20분간고정한후, PBS로세척한후, 1% aqueous OsO 4 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA, USA) 를이용하여 20분동안후고정을하였다. 에탄올에서 70, 80, 90, 95, 100% 순서로계열탈수과정을거친후, 표본을금박한후에주사전자현미경으로관찰하였다. 681

4 이강운, 김태일, 설양조, 이용무 대한치주과학회지 2008 년 38 권 4 호 9. 통계처리통계분석을위하여 statview(version 5.01, The SAS Institute, CA, U.S.A) 프로그램을사용하였다. 모든데이터는각군간분류하여일원분산분석 (one-way ANOVA) 방법을사용하였다. 실험군간분산분석결과에서유의한차이는최소유의차검정법 (Fisherʼs protected least significance difference: PLSD) 으로사후검정법 (post-hoc test) 을수행하여차이를규명하였다. 결과 1. 세포수의측정배양 7일과 14일의세포수측정결과아무것도처리하지않은음성대조군과비교하였을때, 모든군에서유의성있게 높은세포증식을보였으며, TCN 탈회후 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서유의성있게가장높은세포증식이나타났다. 배양 7일및 14일모두 EDTA 탈회후 50 ug/ml 및 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 EDTA 로탈회만시킨군에비해통계학적으로유의성있는세포증식이관찰되었다 (p<0.05). 또한배양 7일과 14일모두 TCN 탈회후 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 TCN 으로탈회만시킨군에비해통계학적으로유의성있는세포증식이관찰되었다 (p<0.05). 배양 7일째 EDTA 탈회후 100 ug/ml 농도의 EMD에배양한군에서 25 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에비해통계학적으로유의성있는세포증식이관찰되었고, TCN 처리후 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 25 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군및 50 ug/ml 농도의 EMD에배양한군에비해통계학적으로유의성있는세포증식이관찰되었다 (p<0.05). Table 1. Cell numbers of PDL cells cultured on dentin slices at 7 and 14 days(numbers/mm²) C EDTA TCN EDTA+EMD TCN+EMD Day ±33.4 ±44.4 ±77.2 ±66.6 ±100.2* ±85.8* ±57.0 ±100.5 ±137.0** Day ± ± ± ± ±130.7* 1378 ±142.3* 1120 ± ± ±216.1** * Statistically significant difference between EDTA+EMD group and EDTA (p<0.05). ** Statistically significant difference between TCN+EMD group and TCN (p<0.05). Statistically significant difference between the EMD concentrations : confer Figure 1. Cell numbers of PDL cells Day 7 Day 14 C EDTA TCN EDTA+EMD 25 EDTA+EMD 50 EDTA+EMD 100 TCN+EMD 25 TCN+EMD 50 TCN+EMD 100 Figure 1. Cell numbers of PDL cells cultured on dentin slices at 7 and 14 days(number/mm²). * Statistically significant difference between EDTA+EMD group and EDTA (p<0.05). ** Statistically significant difference between TCN+EMD group and TCN (p<0.05). Statistically significant difference between the EMD concentrations within EDTA+EMD group (p<0.05). Statistically significant difference between the EMD concentrations within TCN+EMD group (p<0.05). 682

5 J Korean Acad Periodontol 2008;38(4) 법랑기질유도체가탈회치근표면에서치주인대섬유아세포의생물학적성상에미치는영향 배양 14일째 EDTA 탈회후 100 ug/ml 농도및 50 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 25 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에비해통계학적으로유의성있는세포증식이관찰되었고, TCN 처리후 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 25 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군및 50 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에비해통계학적으로유의성있는세포증식이관찰되었다 (p<0.05) (Table 1, Fig. 1). 2. 알칼리성인산효소활성의측정배양 7일째 TCN 으로탈회한군을제외하고는 7일및 14 일의모든군에서아무것도처리하지않은군에비해통계학적으로유의성있는알칼리성인산효소의활성이관찰되었다. 배양 7일및 14일모두 EDTA 탈회후 50 ug/ml 및 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 EDTA 로탈회만시킨군에비해통계학적으로유의성있는알칼리성인산효소의 활성이관찰되었다 (p<0.05). 또한배양 7일과 14일모두 TCN 탈회후 25 및 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 TCN 으로탈회만시킨군에비해통계학적으로유의성있는알칼리성인산효소의활성이관찰되었다 (p<0.05). 배양 7일및 14일째모두 EDTA 탈회후 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 25 ug/ml 농도및 50 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에비해통계학적으로유의성있는알칼리성인산효소의활성이관찰되었고, 50 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군은 25 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에비해통계학적으로유의성있는알칼리성인산효소의활성이관찰되었고, 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군은 50 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에비해통계학적으로유의성있는알칼리성인산효소의활성이관찰되었고, TCN 탈회후 25 ug/ml 농도및 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 50 ug/ml 배양한군에비해통계학적으로유의성있는알칼리성인산효소의활성이관찰되었다 (Table 2, Fig. 2). Table 2. ALP activity of PDL cells cultured on dentin slices at 7 and 14 days (nmolpnp/min/ μg protein) C EDTA TCN EDTA+EMD TCN+EMD Day ±10.3 ±14.9 ±12.7 ±16.4 ±14.4 * ±12.0 * ±11.6 ** ±10.6 ±9.8 ** Day ±12.3 ±15.8 ±7.0 ±7.8 ±8.7 * ±14.1 * ±13.4 ** ±11.2 ±9.2 ** * Statistically significant difference between EDTA+EMD group and EDTA (p<0.05). ** Statistically significant difference between TCN+EMD group and TCN (p<0.05). Statistically significant difference between the EMD concentrations : confer Figure 2. ALP activity of PDL cells C EDTA TCN EDTA+EMD 25 EDTA+EMD 50 EDTA+EMD 100 TCN+EMD 25 Figure 2. ALP activity of PDL cells cultured on dentin slices at 7 and 14 days (nmolpnp/min/ μg protein). * Statistically significant difference between EDTA+EMD group and EDTA (p<0.05). ** Statistically significant difference between TCN+EMD group and TCN (p<0.05). Statistically significant difference between the EMD concentrations within EDTA+EMD group (p<0.05). Statistically significant difference between the EMD concentrations within TCN+EMD group (p<0.05). 683

6 이강운, 김태일, 설양조, 이용무 대한치주과학회지 2008 년 38 권 4 호 3. 단백질양의측정배양 7일및 14일모두 EDTA 처리후 25 ug/ml 및 50 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 EDTA 로탈회만시킨군에비해통계학적으로유의성있는단백질합성이관찰되었다 (p<0.05). 또한배양 7일째 TCN 처리후 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 TCN 으로탈회만시킨군에비해통계학적으로유의성있는단백질합성이관찰되었다 (p <0.05). 배양 7일째 EDTA 처리후 50 ug/ml 농도의 EMD에배양한군에서 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에비해통계학적으로유의성있는단백질합성이관찰되었고, TCN 처리후 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 25 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에비해통계학적으로유의성있는 단백질합성이관찰되었고, 50 ug/ml 농도의 EMD에배양한군에서 25 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에비해통계학적으로유의성있는단백질합성이관찰되었다 (p<0.05). 배양 14일째 EDTA 처리후 50 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 25 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군및 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에비해통계학적으로유의성있는단백질합성이관찰되었고, TCN 처리후 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 25 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에비해통계학적으로유의성있는단백질합성이관찰되었고, 50 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 25 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에비해통계학적으로유의성있는단백질합성이관찰되었다 (p<0.05) (Table 3, Fig. 3). Table 3. Protein assay of PDL cells on dentin slices at 7 and 14 days ( μgprotein/mm 2 ) C EDTA TCN EDTA+EMD TCN+EMD Day ±0.60 ±1.41 ±1.22 ±1.76* ±1.36* ±1.50 ±1.40 ±1.52 ±1.41** Day ±1.03 ±1.11 ±1.21 ±1.58* ±1.85* ±1.19 ±1.42 ±1.41 ±1.57 * Statistically significant difference between EDTA+EMD group and EDTA (p<0.05). ** Statistically significant difference between TCN+EMD group and TCN (p<0.05). Statistically significant difference between the EMD concentrations : confer Figure 3. Protein assay of PDL cells C EDTA TCN EDTA+EMD 25 EDTA+EMD 50 EDTA+EMD 100 TCN+EMD 25 Figure 3. Protein assay of PDL cells on dentin slices at 7 and 14 days ( μg protein/mm²). * Statistically significant difference between EDTA+EMD group and EDTA (p<0.05). ** Statistically significant difference between TCN+EMD group and TCN (p<0.05). Statistically significant difference between the EMD concentrations within EDTA+EMD group (p<0.05). Statistically significant difference between the EMD concentrations within TCN+EMD group (p<0.05). 684

7 J Korean Acad Periodontol 2008;38(4) 4. 주사전자현미경 관찰 법랑기질유도체가 탈회 치근표면에서 치주인대섬유아세포의 생물학적 성상에 미치는 영향 배양 14일째의 주사전자현미경적 소견 또한 모든 군에서 1 일째에 비해 많은 부착세포를 관찰할 수 있었으며, 세포는 1 배양 1일 및 14일째에 각 군의 치근 절편에 부착된 치주 일째에 비해 더욱 편평한 방추사 모양을 띠며, 세포돌기가 인대섬유아세포들을 주사전자현미경을 통해 관찰하였다. 배 잘 발달된 소견을 보였다. 탈회 후 EMD액에 배양한 군은 양 1일째의 모든 군에서 치근절편 위에 잘 부착된 방추사 탈회만 한 군에 비해 부착된 세포수가 증가한 소견을 보였 모양의 치주인대섬유아세포가 관찰되었으나, 탈회 처리 후 으며, 치근절편상에 매우 편평하게 부착되는 양상을 나타내 여러 농도의 EMD에 배양한 군과 탈회처리만 한 군 사이에 었다(Fig. 4, 5). 는 별다른 세포부착 양상의 차이점을 발견할 수는 없었다. Figure 4. SEM views at day 1 after seeding of PDL cells( 300). A) Control; B) EDTA; C) TCN; D) EDTA+EMD25; E) EDTA+EMD50; F) EDTA+EMD100; G) TCN+EMD25; H) TCN+EMD50; I) TCN+EMD100 Figure 5. SEM views at day 14 after seeding of PDL cells( 300). A) Control; B) EDTA; C) TCN; D) EDTA+EMD25; E) EDTA+EMD50; F) EDTA+EMD100; G) TCN+EMD25; H) TCN+EMD50; I) TCN+EMD

8 이강운, 김태일, 설양조, 이용무 대한치주과학회지 2008 년 38 권 4 호 고찰 Hammarström 은손상된치주조직의재생에 enamel matrix protein(emp) 의사용은원래의치주조직과유사한조직재생이가능하다고하였다 11). 최근 EMD 는임상적으로치주조직의재생에널리사용되고있으나그작용기전에대하여는아직명확하게밝혀져있지는않다. EMD 의다양한생물학적효과는 EMD 에포함되어있는 EMP 에기인하며, 이단백질에포함되어있는다른성장인자즉 fibroblast growth factor, insulin-like growth factor, epidermal growth factor, PDGF-BB, TGF, interleukin 등을추출하려는노력이있었는데, Gestrelius 는 EMD 는성장인자를포함하고있지는않으며단지세포에대한활성기질 (vital matrix) 로작용한다고하였고, 원숭이를대상으로한실험에서 EMD 의적용이섬유아세포의증식에유의한결과를보인다고하였다 12). Lyngstadaas 는 EMD 의적용하에세포부착이증가된것을보임으로서이가정을뒷받침하였고 13) Haase 등은 EMD 에서 growth factor 를추출하지못했으며, EMD 는치주인대섬유아세포의 mrna 합성을증가시켜초기재생에기여한다고보고하였다 14). EMD 가생체또는실험실에서사용되었을때좋은결과를보인수많은연구들이보고되고있으며, 여러가설들이제기되었다 15-16). Hasse 등은배양된치주인대섬유아세포에서 EMD 의기질합성효과를조사한결과, 초기재생단계에서기질합성을크게조절할잠재력을가지고있다고하였고 14), Hakki 등은쥐의미분화세포를대상으로 EMD 를실험한결과, 미분화세포는백악아세포나골아세포로작용할잠재성을가지고있으며, EMD 는이러한세포의활동성을조절할수있고, 이것은치주조직의발생단계에서상피 -간엽상호작용이중요하다는것을제시한다고하였다 5). Ohyama 등은간엽세포에 EMD 를적용시킨결과알칼리성인산효소의활동성이유의성있게증가했다고하였고 17), Hoang 등은치주조직재생에 EMD 가효과가있는것은 EMD 의주성분인아멜로제닌이수산화인회석과선택적으로결합을하는경향을가지고있으며, 교원질이나헤파린과는결합을하지않기때문이라고하였다 2). 김등역시초기치유단계에서 EMD 가골밀도증가와신생골합성에서큰기여를나타냈다고보고하였다 18). 많은연구에서 EMD 를사용했을때의좋은결과에대해 보고하고있으나, 그렇지않은연구들도있었다. Chong 등은 EMD 와아멜로제닌이치주인대섬유아세포의증식에별기여를하지못한다고하였고, EMD 의다른구성요소가이러한증식및이동에관여하거나, 아멜로제닌이다른요소와복합작용이있어야만효과가나타날수있을것이라고보고하였고 19), Pischon 등은 organoid culture 상태에서 EMD 가단백질의합성을증가시킬수있으나, 기질광화작용 (mineralization) 은증가시키지못한다고하였다 20). 효과적인 EMD 의농도에대해서여러연구가진행되었는데, 어느농도가최적이라는결론은아직나오지않은상태이다. 실험에따라 0.03 ug/ml에서 30 mg/ml까지다양하게관찰되었다. Davenport 등은 25 ug/ml, 50 ug/ml, 75 ug/ml, 100 ug/ml 의농도로치주인대섬유아세포의활성과부착정도를관찰한결과, 활성은농도가높을수록감소하였다고하였으나부착은도와준다고하였다 21). Cattaneo 등은 100 ug/ml 의농도로치주인대섬유아세포의증식과형태를관찰하였고 15), Chano 등은 3 mg/ml과 30 mg/ml 의농도로쥐에대한실험을하였는데, EMD 가백악질의두께, 골의양, 오스테오폰틴이나시알로프로테인등에서효과를나타내지못했다고보고하였다 16). 정등은치주인대섬유아세포에대한 EMD 의효과에관한연구에서 100 ug/ml 의농도를사용하였고 22), 김등은 0.03 ug/ml 에서 300 ug/ml까지의농도로사용하였다 23). Rincon 등은 EMD 를농도별로치주인대섬유아세포, 치은섬유아세포등에적용시킨결과, EMD 의농도가 20 ug/ml 에서세포분화를가장잘촉진시켰다고하였다 24). Schlueter 등은미세혈관세포에대한 EMD 의효과를관찰하였는데, 25 ug/ml, 50 ug/ml, 100 ug/ml 의농도를사용하였고, EMD 의농도가 50 ug/ml 이하일때인간미세혈관내피세포의증식에대한효과가크게나타났다고하였고, 모든농도에서혈관생성이증가하였다고하였다 25). 이번실험에서는 25 ug/ml에서 100 ug/ml의농도를사용하였는데, 여러연구에서사용된농도중많은빈도를보이며중간정도에해당하는것을선택하였다. EMD 를적용시키기전치석제거술이나치근활택술을시행하거나치근면탈회를병행하여효과를높이고자하는노력들이있어왔으며, 인산, 구연산, TCN, EDTA 등이사용되었다. Davenport 등 21) 의실험과마찬가지로, 대다수의실험에서는탈회제제가한가지만사용되었으나, 이번실험에서는두가지탈회제제를비교하고자하였다. 본연구에서는치주염에이환된자연치를사용하였으며, 686

9 J Korean Acad Periodontol 2008;38(4) 법랑기질유도체가탈회치근표면에서치주인대섬유아세포의생물학적성상에미치는영향 치근활택술후세포형성을관찰하였다. 임상적상황을재현하기위해서실험에사용된치아표면을 TCN 과 EDTA 로탈회하였고, 가장많은실험에서사용된농도인 25 ug/ml, 50 ug/ml, 100 ug/ml 를사용하였다. 실험시 EMD 를적용시키는방법도다양하게행하여졌다. 배양액에 EMD 를희석시키는방법이많이사용되었고, 배지에 EMD 를코팅시키는방법도사용되었다 14). 배양액에희석시킬때증류수를사용한경우도있었으나, EMD 의단백질조성때문에생리적인 ph 에서는녹지않고산성에서용해도가증가한다는연구가있었다. 그래서이번연구에서는 5 mm acetic acid 를사용하여용해도를증가시켰다. Hoang 등은 EMD를배양액에희석시켜처리한군과배지에코팅시켜처리한군간의치주인대섬유아세포의증식을비교하였을때유의성있는차이가나타나지않았다고하였고, 법랑기질유도체가임상적으로적용되었을때치주인대세포의분화와이동을특정하게조절함으로써치주조직재생을촉진시킨다고하였다 6). EMD 는이종동물에서추출되는물질이기때문에임상적으로사용될경우안정성이보장이될지, 부작용은없는지의여부가중요한문제로대두될수있다. Yuan 등은돼지에서추출된 EMD 가 IgG 를포함하고있으며, 인체에사용시항원항체반응을유도할수있다고하였다. 그렇지만증가된항체가치주인대섬유아세포에대한 EMD 의기능의하나인 TGF-β1 의생산을방해하지는못한다고하였고 26), George 등은외과적골연하낭의처치에 EMD 를적용시켰을때, 6개월에서 24개월까지관찰한결과염증성치근흡수가관찰된경우가있었다고보고하였다 27). EMD 를사용할때, 다른요소를같이사용하여부가적인효과를얻고자하는연구들도진행되었다. Rodrigues 등은 EMD 와 TGF-β1 를치주인대세포에적용시킨결과, EMD 는치주인대세포의분화, 이동, 단백질합성, 알칼리성인산효소활성등을촉진시키고, TGF-β1 는세포부착을증가시키나, 두요소를결합시켰을때에는바라는효과가나타나지않았다고보고하였다 28). 이번실험에서는다른요소를같이사용하지않고 EMD 단독으로적용시켰다. Cattaneo 등은 EMD 로처리한치주인대섬유아세포를주사전자현미경으로관찰한결과, 납작한표면과부드럽고둥근외형을가진형태로보였고, 대조군의세포는다른형태를나타내는데이들은확장된모양, 거친형태등섬유아세포의전형적인특징을보인다고하였다 15). 이러한명백한외형적인변화는 EMD 처리된세포가기능적인분화를보였다는것을의 미하지만, 법랑아세포의구분은특별한표지자가없기때문에어렵다고하였다. 법랑아세포는다각형의형태를나타내며, 조골세포 ( 사각형형태 ) 모양이나편평한형태의두가지외형을보인다 29-30). 일부연구자들은알칼리성인산효소를조사하여백악아세포를구분하는데사용하였는데, 이효소가증등정도로나타나면치주인대섬유아세포이고, 활동성이보이지않으면백악아세포라고하였다 29-30). 그러나이번실험에서관찰한결과, 대조군과 EMD 에서배양한군을비교해보았을때외형상의차이를발견하기는어려웠고, 탈회후 EMD 액에배양한군은탈회만한군에비해부착된세포수가증가한소견을보였으며, 치근절편상에매우편평하게부착되는양상을나타내었다. 본연구에서세포수를관찰하였을때, 음성대조군이나 TCN 과 EDTA 로탈회한군, EMD 에배양한군을비교해보았을때, 치근탈회만시행된군은 7일, 14일모두 TCN 으로탈회한군이 EDTA 로탈회한군보다많이보였으나유의성은없었고, EMD 에배양된군은 7일, 14일모두 25 ug/ml 및 100 ug/ml 농도에서는 TCN 으로탈회된군이높았고 50 ug/ml 에서는 EDTA 로탈회된군이높이나타났다. 배양 7 일과 14일째 EDTA 탈회후 50 ug/ml 및 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 EDTA 로탈회만시킨군에비해통계학적으로유의성있는세포증식이관찰되었고, TCN 탈회후 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 TCN 으로탈회만시킨군에비해통계학적으로유의성있는세포증식이관찰되었다. 이러한결과는치근탈회만으로도세포수증가에효과가있음을입증하였고, 부가적으로 EMD 를처리하면더좋은결과를얻을수있음을보였다. EMD 의농도는저농도보다는 100 ug/ml 의고농도에서더많은세포수를보였는데, 이결과는 Davenport 21), Rincon 24), Schlueter 25) 등의실험과는다소다른양상을나타내었으나 Cattaneo 15) 의실험과는유사한양상을보였다. 알칼리성인산효소를관찰한결과, 치근탈회만시행된군은 7일째는 EDTA 로탈회한군이 TCN 으로탈회한군보다활성이높게나타났고, 14일째는 TCN 으로탈회한군이활성이높게나타났으나유의성은없었다. EMD 에배양한군은 7일, 14일째모두 EDTA 로탈회후 100 ug/ml 의농도를적용시켰을때가가장높게나타났고, 배양 7일및 14일모두 EDTA 탈회후 50 ug/ml 및 100 ug/ml 농도의 EMD에배양한군에서 EDTA 로탈회만시킨군에비해통계학적으로유의성있는알칼리성인산효소의활성이관찰되었다. 687

10 이강운, 김태일, 설양조, 이용무 대한치주과학회지 2008 년 38 권 4 호 이러한결과는 EDTA 가 TCN 보다치주인대세포의분화촉진에다소유리하게작용한다고해석할수있는데, 산성을띠는탈회물질이분화억제의영향을미친것으로추측되며, 유의성을찾기는어려웠다. 또한배양 7일과 14일모두 TCN 처리후 25 ug/ml 및 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 TCN으로탈회만시킨군에비해통계학적으로유의성있는알칼리성인산효소의활성이관찰되었는데, 50 ug/ml 농도의군에서 25 ug/ml 및 100 ug/ml 농도의군보다알칼리성인산효소의활성이유의성있게낮게관찰된것은의외의결과이며, 원인을찾기는어려웠으며, 앞으로추가연구가필요할것으로보인다. 단백질합성능을측정한결과, 7일, 14일모두 EDTA 로처리후 50 ug/ml 의농도를적용시켰을때가가장높게나타났고, EDTA 로만처리한군은대조군을제외하고 7일, 14 일모두가장낮게나타났다. 배양 7일및 14일모두 EDTA 처리후 25 ug/ml 및 50 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 EDTA 로탈회만시킨군에비해통계학적으로유의성있는단백질합성이관찰되었다. 100 ug/ml 농도의 EMD에배양한군에서유의성있게단백질합성이낮게관찰된것은의외의결과이며, 추가연구가필요한것으로보인다. 또한배양 7일째 TCN 처리후 100 ug/ml 농도의 EMD 에배양한군에서 TCN 으로탈회만시킨군에비해통계학적으로유의성있는단백질합성이관찰되었다. 이러한결과는, 치근면의탈회만으로는세포를증식시키는데에한계가있으나, EMD 와같이적용될경우세포의증식에부가적인효과가큰것으로생각된다. 본실험의결과는치근면의탈회후 EMD 에서배양한치주인대섬유아세포가증식, 분화, 부착에서부가적인효과를보이는것을관찰할수있으며, 이는임상에서도유용하게 EMD를사용할수있음을보여준다. 그러나가장적절한 EMD 의농도에대해서는보다많은연구가요구되며, EMD 와함께사용할수있는효과적인탈회제제에대해서도추가적인연구가필요할것으로사료된다. 참고문헌 1. Peter Eickholz. Long term result of guided tissue regeneration therapy with nonresorbable and bioabsorbable barrier. J Periodontol 2001;72: Hoang AM, Klebe RJ, Steffensen B, et al. Amelogenin is a cell adhesion protein. J Dent Res 2002;81: Van der Pauw MT, Van den Bos T, Everts V, Beertsen W. Enamel matrix derived protein stimulates attachment of periodontal ligament fibroblasts and enhances alkaline phosphatase activity and transforming growth factor β₁release of periodontal ligamental and gingival fibroblasts. J Periodontol 2000;71: Stuart J. Froum. A comparative study utilizing open flap debridement with and without enamel matrix derivative in the treatment of periodontal intrabony defects. J Periodontol 2001;72: Hakki SS, Berry JE, Somerman MJ. The effect of enamel matrix protein derivative on follicle cells in vitro. J Periodontol 2001;72: Hoang AM, Oates TW, Cochran DL. In vitro wound healing responses to enamel matrix derivative. J Periodontol 2000;71: Kawase T, Okuda K, Yoshie H, Burns DM. Cytostatic action of enamel matrix derivative (EMDOGAIN) on human oral squamous cell carcinoma-derived SCC25 epithelial cells. J Periodontal Res 2000;35: Pitaru S, Melcher AH. Organization of an oriented fiber system in vitro by human gingival fibroblast attached to dental tissue: relationship between cells and mineralized and demineralized tissue. J Periodontal Res 1987;22: Madison JG 3rd, Hokett SD. The effects of different tetracyclines on the dentin root surface of instrumented, periodontally involved human teeth: a comparative scanning electron microscopy study. J Periodontol 1997;68: Behavior of human periodontal ligament cells on CO2 laser irradiated dentinal root surfaces: an in vitro study. J Periodon Res 2004;39: Hammarström L, Gestrelius S. Periodontal regeneration in a buccal dehiscence model in monkeys after application of enamel matrix proteins. J Clin Periodontol 1997;24: Gestrelius S, Andersson C, Lidstrom D, Hammarstöm L, Somerman M. In vitro studies on periodontal ligament cells and enamel matrix derivative. J Clin Periodontol 1997;24: Lyngstadaas SP, Lunderberg E, Ekdahl H, Andersson C, Gestrelius S. Autocrine growth factors in human periodontal ligamental cells cultured on enamel matrix 688

11 J Korean Acad Periodontol 2008;38(4) 법랑기질유도체가탈회치근표면에서치주인대섬유아세포의생물학적성상에미치는영향 derivative. J Clin Periodontol 2001;28: Haase HR, Bartold PM. Enamel matrix induces matrix synthesis by cultured human periodontal fibroblast cells. J Periodontol 2001;72: Cattaneo V, Rota C, Silverstri M, et al. Effect of enamel matrix derivative on human periodontal fibroblast: proliferation, morphology and root surface colonization. An in vitro study. J Periodont Res 2003;38: Chano L, Tenenbaum HC, Lekic PC, Sodek J, McCulloch CA. Emdogain regulation of cellular differentiation in wounded rat periodontium. J Periodontal Res 2003;38: Ohyama M, Suzuki N, Yamaguchi Y, et al. Effect of enamel matrix derivative on the differentiation of C2C12 cells. J Periodontol 2002;73: You-Seok Kim, Hyun-Seon Jang, Ju-chol Park, et al. The effect of enamel matrix derivative(emd) in combination with deproteinized bovine bone material(dbbm) on the early wound healing of rabbit calvarial defects. J Korean Acad Periodontol 2005;35: Chong CH, Carnes DL, Moritz AJ, et al. Human periodontal fibroblast response to enamel matrix derivative, amelogenin, and platelet-derived growth factor-bb. J Periodontol 2006;77: Pischon N, Zimmermann B, Bernimoulin JP, Hagewald S. Effects of enamel matrix derivative on human osteoblasts and PDL cells grown in organoid cultures. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endodod 2006;102: Davenport DR, Mailhot JM, Wataha JC, et al. Effects of enamel matrix protein application on the viability, proliferation, and attachment of human periodontal ligament fibroblasts to diseased root surfaces in vitro. J clin Periodontol 2003;30: Jeong YJ, Kim KW, Kim TI, et al. The Effects of enamel matrix derivatives on the proliferation and gene expression of PDL fibroblast, SaOs 2 cells and Cementum derived cells. J Korean Acad Periodontol 2005;35: Kim DW, Chung CH, Lim SB, Ko SY. Effects of enamel matrix protein derivatives on the periodontal ligament like fibroblast and osteoblast like cells. J Korean Acad Periodontol 2003;33: Rincon JC, Haase HR, Bartold PM. Effect of Emdogain on human periodontal fibroblasts in an in vitro wound-healing model. J Periodontal Res 2003;38: Schlueter SR, Carnes DL, Cochran DL. In vitro effects of enamel matrix derivative on microvascular cells. J Periodontol 2007;78: Yuan K, Hsu CW, Tsai WH. The induction and possible subsequent effect of human antibodies against porcine enamel matrix derivative. J Periodontol 2006;77: St George G, Darbar U, Thomas G. Inflammatory external root resorption following surgical treatment for intrabony defects: a report of two cases involving Emdogain and a review of literature. J Clin Periodontol 2006;33: Rodrigues TL, Marchesan JT, Coletta RD, et al. Effects of enamel matrix derivative and transforming growth factor-beta 1 on human periodontal ligament fibroblasts. J Clin Periodontol 2007;34: Gao J, Symons AL, Haase H, Bartold PM. Should cementoblasts express alkaline phosphatase activity? Preliminary study of rat cementoblasts in vitro. J Periodontol 1999;70: Tenorio D, Cruchley A, Hughes FJ. Immunocytochemical investigation of the rat cementoblast phenotype. J Periodon Res 1993;28:

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