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1 한국자연보호학회지, 제 10 권제 2 호 (2016) Korean Journal of Nature Conservation Vol. 10, No. 2, pp ISSN (Pring) ISSN (Online) DNA 보존을위한 FTA 카드의관속식물분류군별적용성조사 김상태 * 성신여자대학교생물학과 (2016 년 10 월 2 일접수 ; 2016 년 12 월 13 일수정 ; 2016 년 12 월 15 일채택 ) Test of DNA Preservation with FTA Card in Various Tracheophytes Sangtae Kim* Dept. of Biology, Sungshin Women s Univ., Seoul 01133, Rep. of Korea (Received 2 October 2016; Revised 13 December 2016; Accepted 15 December 2016) Abstract The FTA card is a quick and easy method to preserve DNA from plant tissues. Its applicability has only been tested in some economically important plants and in research model plants such as rice, potato, tomato, and Arabidopsis. Therefore, DNA preservation with FTA cards in various tracheophytes (196 taxa) was tested in this study based on PCR using DNA barcoding primers. The results indicated that DNAs were successfully preserved with FTA cards in 76.74% of the tested samples and each taxon showed a different preservation rate. Especially, most families in monocots showed high preservation rates (100%) while Asteraceae showed low preservation rate (28.57%) compared to other families. Stored FTA cards were tested again after five years under the same experimental conditions as the previous test. The results showed that DNA was preserved in 54.26% of the samples, indicating that 29.9% of DNA-preserved samples are degraded after five years. However, Araceae, Amaryllidaceae, Asparagaceae, Liliaceae, Melanthiaceae, Brassicaceae, Araliaceae, and Asteraceae samples, of which DNA preservation was confirmed five years earlier showed a 100% preservation rate. This study suggests that the FTA card is a useful tool for DNA preservation in various plant taxa, of which preservation is confirmed in this study (or closely related taxa) and is applicable in the field of population genetics, phylogeny, identifications, inspections, etc. Keywords: FTA card, DNA preservation, Asteraceae, monocots 1. 서론 식물의집단유전, 계통연구및검역등의분야에있어서많은시료들의유전자를빠르게수집하여간편하고신뢰성있게보존하는것은연구의성패를좌우할수있다. 이러한관점에서 FTA (Flinders Technology Associates) 카드는빠르고간편하게 DNA 를수집하고보존하여이를이용하여후속연구및검사를수행할수있는좋은도구이다 ( Whatman사가특허를보유하고있는 FTA 카드는종이재질에흡수된혈액, 구강세포시료, 식물잎조직및박테리아등의생물시료를보존할수있는기술이다 (Rogers and Burgoyne, 1997; Hide et al., 2003; *Corresponding Author: Tel: +82-(0) amborella@sungshin.ac.kr Lampel et al., 2004). FTA 카드에시료를짓이겨묻히면시료는단백질의비활성화와함께유리기 (free radical) 가제거되며, FTA card에스며든 DNA는물리적으로포획되는데, 이렇게포획된 DNA는 DNase, 산화, UV, 박테리아, 곰팡이등에의한 DNA파괴로부터보호되어상온에서장기간보존이가능하게된다 (Kubo and Fujita, 2006). DNA가보존된 FTA 카드는천공기를이용하여작은조각으로만든후 ( 그림 1) 유기물을이용하지않는간단한과정에의해이조각에포함된 DNA를정제할수있고, 이카드조각을 PCR에직접이용할수있어보존된카드로부터의후속연구및검사가매우간편하게진행될수있다 ( FTA plantsaver card protocol 참조 ). 개발초기에 FTA 카드는주로혈액시료를보존하

2 90 김상태 여병의진단및법의학적적용에이용되었고 (Becker et al., 2004), 이후다른동물세포와박테리아로부터의 DNA보존에이용되어유전자감식, 제약산업, 생물종감별, 검역, 계통연구등의분야에서광범위하게활용되고있다 (Rogers and Burgoyne, 1997; Becker et al., 2004). 그러나식물분야에있어서의이용은현재까지매우제한적으로, 주로토마토, 담배, 벼, 옥수수와같은작물의연구나애기장대와같이연구를위한모델식물에서의적용을주대상으로할뿐 (Lin et al., 2000), 분류, 계통학적측면에서다양한식물군에서의 FTA card의적용성은아직테스트된적이없다. 간편하고쉬운이용, 그리고소량의조직으로 DNA를보존할수있다는장점으로 FTA card는다양한식물군의분류, 계통, 진화연구와멸종위기종식물의유전다양성, 집단유전및보존연구등에활용될수있는무한한가능성을지니고있다. 본연구에서는지구표면을우점하고있는다양한관속식물들에대한시료수집을통하여다양한분류군들에서 FTA card에의한 DNA 보존을테스트하여분류군특성에따른활용성을파악하고자하며, 또한상온에서의보존연한에따른보존지속성도평가하고자한다. FTA card는그활용성이확인된분류군 에대해서는분류, 계통, 진화, 유전다양성보존및검역분야의연구및이용에있어서강력한도구로사용될수있을것이다. 2. 재료및방법 2.1. 재료본연구에사용된재료는한국자생종들을중심으로무작위적으로선택한관속식물 78과 175속 196분류군으로 2011년 3월부터 10월까지자생지에서의채집및천리포수목원에식재되어있는식물들을이용하였다 ( 표 1). 채집하여이용한시료들은확증표본을남겨성신여자대학교표본관 (SWU) 에보관하였으며, 천리포수목원에식재되어있는식물들의이용시에는천리포수목원의관리번호를기록하였다 ( 표 1). 실험에사용된모든재료는생체를채집하여 Whatmann 사의식물전용 FTA plantsaver 카드 (Cat. No. WB120065) 를이용하여 1 cm 2 정도의잎조직을문질러파쇄시키면서카드에흡수시켰고 ( 그림 1), 완전히건조시킨후실리카겔을넣은지퍼백에넣어 17~24도의상온에보관하였다. FTA 카드에의한 DNA 보존성을건조보존한식물의잎조직과비교하기위하여실험을위 Table 1. List of taxa included in this study and the result of PCR with plant DNA preserved on FTA cards Detection of PCR bands Taxa (number of families included) Extracted FTA card FTA card Voucher information a DNA from (2011) dried leaves (2016) PTERIDOPHYTES (6) Selaginellaceae Selaginella involvens (Sw.) Spring 바위손 S. Kim (SWU) A-001 Equisetaceae Equisetum hyemale L. 속새 * # S. Kim (SWU) A-002 Osmundaceae Osmunda japonica Thunb. 고비 S. Kim (SWU) A-003 Pteridaceae Pteridium aquilinum var. latiusculum (Desv.) Underw. 고사리 S. Kim (SWU) A-004 Aspidaceae Onoclea sensibilis var. interrupta Maxim. 야산고비 S. Kim (SWU) A-006 Polystichum polyblepharum (Roem.) C. Presl 나도히초미 S. Kim (SWU) A-005 Polypodiaceae Pyrrosia lingua (Thunb.) Farw. 석위 CHOL A-007 GYMNOSPERMS (5) Cycadaceae Cycas revoluta Thunb. 소철 * S. Kim (SWU) A-008 Ginkgoaceae Ginkgo biloba L. 은행나무 CHOL A-009 Taxaceae Taxus cuspidata Siebold & Zucc. 주목 S. Kim (SWU) A-011 Torreya nucifera (L.) Siebold & Zucc. 비자나무 CHOL A-010 Pinaceae Cedrus deodara (Roxb.) Loudon 개잎갈나무 CHOL A-014 Pinus parviflora Siebold & Zucc. 섬잣나무 S. Kim (SWU) A-012 Pinus densiflora Siebold & Zucc. 소나무 S. Kim (SWU) A-013 Cupressaceae Juniperus chinensis L. 향나무 S. Kim (SWU) A-134 Sample ID

3 DNA 보존을위한 FTA 카드의관속식물분류군별적용성조사 91 ANGIOSPERMS (65) BASAL ANGIOSPERMS (5) Austrobaileyales Schisandraceae Illicium anistatum L. 붓순나무 CHOL A-015 Kadsura japonica (L.) Dunal 남오미자 CHOL A-017 Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. 오미자 S. Kim (SWU) A-016 Chloranthales Chloranthaceae Chloranthus japonicus Siebold 홀아비꽃대 S. Kim (SWU) A-018 MAGNOLIIDS (3) Piperales Aristolochiaceae Asarum sieboldii Miq. 족도리풀 S. Kim (SWU) A-024 Saururaceae Houttuynia cordata Thunb. 약모밀 * S. Kim (SWU) A-022 Saururus chinensis (Lour.) Baill. 삼백초 S. Kim (SWU) A-023 Magnoliales Magnoliaceae Magnolia biondii Pamp. 비욘디목련 S. Kim (SWU) A-020 Magnolia obovata Thunb. 일본목련 S. Kim (SWU) A-019 Magnolia virginiana L. 버지니아목련 S. Kim (SWU) A-021 MONOCOTS (11) Alismatales Araceae Acorus calamus L. 창포 S. Kim (SWU) A-027 Arisaema amurense f. serratum (Nakai) Kitagausa 천남성 S. Kim (SWU) A-026 Symplocarpus renifolius Schott ex Miq. 앉은부채 S. Kim (SWU) A-025 Asparagales Amaryllidaceae Allium fistulosum L. 파 * CHOL A-045 Allium microdictyon Prokh. 산마늘 # CHOL A-038 Allium sacculiferum Maxim. 참산부추 CHOL A-041 Lycoris chinensis var. sinuolata K. H. Tae & S. C. Ko 진노랑상사화 CHOL A-029 Narcissus tazetta var. chinensis Roem. 수선화 CHOL A-028 Asparagaceae Asparagus officinalis L. 아스파라가스 S. Kim (SWU) A-039 Liriope platyphylla F. T. Wang & T. Tang 맥문동 S. Kim (SWU) A-036 Polygonatum odoratum var. pluriflorum (Miq.) Ohwi 둥굴레 * S. Kim (SWU) A-035 Smilacina japonica A. Gray 풀솜대 S. Kim (SWU) A-047 Yucca gloriosa L. 유카 CHOL A-030 Asphodelaceae Hemerocallis middendorffii Trautv. & C. A. Mey. 큰원추리 CHOL 20A-1089 A-043 Iridaceae Crocus sativus L. 샤프란 CHOL A-031 Belamcanda chinensis (L.) DC. 범부채 S. Kim (SWU) A-032 Orchidaceae Cymbidium goeringii (Rchb. f.) Rchb. f. 보춘화 CHOL A-033 Dioscoreales Dioscoreaceae Dioscorea quinqueloba Thunb. 단풍마 S. Kim (SWU) A-034 Liliales Liliaceae Erythronium japonicum (Baker) Decne. 얼레지 CHOL A-040 Fritillaria ussuriensis Maxim. 패모 CHOL A-046 Lilium longiflorum Thunb. 백합 CHOL A-037 Lilium tigrinum Ker-Gawl. 참나리 S. Kim (SWU) A-051 Lilium tsingtauense Gilg 하늘말나리 S. Kim (SWU) A-050 Tulipa gesneriana L. 튜울립 S. Kim (SWU) A-044 Melanthiaceae Heloniopsis koreana Fuse, N. S. Lee & M. N. Tamura 처녀치마 CHOL A-042 Paris verticillata M. Bieb. 삿갓나물 S. Kim (SWU) A-049 Veratrum maackii var. japonicum (Baker) T. Shimizu 여로 S. Kim (SWU) A-048 COMMELINIDS (2) Poales Juncaceae Juncus effusus var. decipiens Buchenau 골풀 * S. Kim (SWU) A-052 Poaceae(Graminae) Digitaria diliaris (Retz.) Koel. 바랭이 S. Kim (SWU) A-053 EUDICOTS (46) Basal eudicots (4) Ranunculales Berberidaceae Epimedium koreanum Nakai 삼지구엽초 S. Kim (SWU) A-057

4 92 김상태 Jeffersonia dubia (Maxim.) Benth. & Hook. f. 깽깽이풀 CHOL A-055 Leontice microrrhyncha S. Moore 한계령풀 CHOL A-056 Papaveraceae Chelidonium majus var. asiaticum (Hara) Ohwi 애기똥풀 S. Kim (SWU) A-059 Corydalis speciosa Maxim. 산괴불주머니 S. Kim (SWU) A-062 Corydalis ternata Nakai 들현호색 CHOL A-061 Dicentra spectabilis (L.) Lem. 금낭화 * # S. Kim (SWU) A-060 Hylomecon vernalis Maxim. 피나물 S. Kim (SWU) A-058 Ranunculaceae Aconitum ciliare DC. 놋젓가락나물 CHOL A-064 Aconitum pseudolaeve Nakai 진범 S. Kim (SWU) A-073 Adonis pseudoamurensis W. T. Wang 개복수초 S. Kim (SWU) A-068 Aquilegia buergeriana var. oxysepala (Trautv. & Meyer) Kitam. 매발톱 S. Kim (SWU) A-071 Caltha palustris L. 동의나물 S. Kim (SWU) A-065 Cimicifuga heracleifolia var. heracleifolia Kom. 승마 S. Kim (SWU) A-074 Hepatica asiatica Nakai 노루귀 CHOL A-063 Pulsatilla cernua var. koreana (Yabe ex Nakai) U.C. La 할미꽃 S. Kim (SWU) A-067 Thalictrum actaefolium var. brevistylum Nakai 은꿩의다리 S. Kim (SWU) A-069 Trollius hondoensis Nakai 금매화 S. Kim (SWU) A-070 Buxales Buxaceae Buxus koreana Nakai ex T. H. Chung & al. 회향목 CHOL A-054 CORE EUDICOTS (42) Basal Core eudicots (4/19) Saxifragales Crassulaceae Hylotelephium spectabile (Boreau) H. Ohba 큰꿩의비름 CHOL A-086 Sedum kamtschaticum Fisch. & Mey. 기린초 S. Kim (SWU) A-087 Sedum sarmentosum Bunge 돌나물 * S. Kim (SWU) A-085 Hamamelidaceae Corylopsis coreana Uyeki 히어리 CHOL (SWU) A-088 Paeoniaceae Paeonia japonica (Makino) Miyabe & Takeda 백작약 S. Kim (SWU) A-072 Paeonia suffruticosa Andr. 모란 S. Kim (SWU) A-066 Saxifragaceae Mukdenia rossii (Oliv.) Koidz. 돌단풍 S. Kim (SWU) A-089 Rodgersia podophylla A. Gray 도깨비부채 S. Kim (SWU) A-090 ROSIDS (22) ROSIDS I / FABIDAE (10) Celastrales Celastraceae Euonymus japonicus Thunb. 사철나무 S. Kim (SWU) A-094 Oxalidales Oxalidaceae Oxalis corniculata L. 괭이밥 S. Kim (SWU) A-103 Malpighiales Euphorbiaceae Daphniphyllum macropodum Miq. 굴거리나무 CHOL A-101 Violaceae Viola rossii Hemsl. 고깔제비꽃 S. Kim (SWU) A-102 Fabales Fabaceae Cassia mimosoides var. nomame Makino 차풀 S. Kim (SWU) A-097 Kummerowia striata (Thunb.) Schindl. 매듭풀 S. Kim (SWU) A-098 Sophora flavescens Solander ex Aiton 고삼 S. Kim (SWU) A-099 Trifolium repens L. 토끼풀 * S. Kim (SWU) A-096 Wisteria floribunda (Willd.) DC. 등 S. Kim (SWU) A-095 Fagales Fagaceae Fagus engleriana Seem. ex Diels 너도밤나무 S. Kim (SWU) A-100 Rosales Elaeagnaceae Elaeagnus glabra Thunb. 보리장나무 CHOL (SWU) A-104 Moraceae Ficus elastica Roxb. 인도고무나무 S. Kim (SWU) A-105 Rosaceae Agrimonia pilosa Ledeb. 짚신나물 # CHOL A-111 Filipendula palmata (Pall.) Maxim. 단풍터리풀 S. Kim (SWU) A-108 Kerria japonica (L.) DC. 황매화 CHOL A-112 Malus baccata Borkh. 야광나무 CHOL A-110 Potentilla anemonefolia Lehm. 가락지나물 * S. Kim (SWU) A-114 Prunus mandshurica var. glabra Nakai 개살구나무 S. Kim (SWU) A-116 Raphiolepis indica var. umbellata (Thunb.) Ohashi 다정큼나무 S. Kim (SWU) A-107 Raphiolepis umbellata var. integerrima Rehder 둥근잎다정큼나무 CHOL A-109 Sanguisorba officinalis L. 오이풀 S. Kim (SWU) A-113 Stephanandra incisa (Thunb.) Zabel 국수나무 CHOL A-106

5 DNA 보존을위한 FTA 카드의관속식물분류군별적용성조사 93 Urticaceae Laportea bulbifera (Siebold & Zucc.) Wedd. 혹쐐기풀 S. Kim (SWU) A-117 ROSIDS II / MALVIDAE (12) Geraniales Geraniaceae Geranium thunbergii Siebold & Zucc. 이질풀 S. Kim (SWU) A-092 Pelargonium inquinans Aiton 제라늄 S. Kim (SWU) A-091 Myrtales Lythraceae Lythrum anceps (Koehne) Makino 부처꽃 S. Kim (SWU) A-093 Brassicales Brassicaceae Cardamine flexuosa With. 황새냉이 S. Kim (SWU) A-120 Cardamine leucantha (Tausch) O.E. Schulz 미나리냉이 * S. Kim (SWU) A-119 Draba nemorosa L. 꽃다지 S. Kim (SWU) A-118 Malvales Thymelaeaceae Daphne kiusiana Miq. 백서향 S. Kim (SWU) A-121 Sapindales Aceraceae Acer palmatum Thunb. 단풍나무 * S. Kim (SWU) A-125 Anacardiaceae Rhus chinensis Mill. 붉나무 S. Kim (SWU) A-122 Rutaceae Dictamnus dasycarpus Turcz. 백선 * S. Kim (SWU) A-123 Sapindaceae Koelreuteria paniculata Laxmann 모감주나무 S. Kim (SWU) A-124 Caryophyllales Amaranthaceae Achyranthes japonica (Miq.) Nakai 쇠무릎 S. Kim (SWU) A-075 Phytolaccaceae Phytolacca acinosa Roxb. 자리공 S. Kim (SWU) A-076 Polygonaceae Aconogonon alpinum (All.) Schur 싱아 S. Kim (SWU) A-082 Bistorta manshuriensis (Petrov ex Kom.) Kom. 범꼬리 S. Kim (SWU) A-077 Fallopia japonica (Houtt.) Ronse Decr. 호장근 S. Kim (SWU) A-080 Persicaria filiformis (Thunb.) Nakai ex Mori 이삭여뀌 S. Kim (SWU) A-081 Persicaria perfoliata (L.) H. Gross 며느리배꼽 S. Kim (SWU) A-083 Rumex acetosa L. 수영 S. Kim (SWU) A-079 Rumex crispus L. 소리쟁이 CHOL 20A-1262 A-078 Portulacaceae Portulaca oleracea L. 쇠비름 S. Kim (SWU) A-084 ASTERIDS (16) Basal Asterids (5) Cornales Cornaceae Cornus kousa F. Buerger ex Miq. 산딸나무 S. Kim (SWU) A-126 Cornus officinalis Siebold & Zucc. 산수유 S. Kim (SWU) A-127 Ericales Ericaceae Rhododendron mucronulatum Turcz. 진달래 S. Kim (SWU) A-128 Primulaceae Lysimachia barystachys Bunge 까치수염 S. Kim (SWU) A-132 Lysimachia davurica Ledeb. 좁쌀풀 S. Kim (SWU) A-131 Primula sieboldii E. Morren 앵초 S. Kim (SWU) A-130 Pyrolaceae Pyrola japonica Klenze ex Alef. 노루발 S. Kim (SWU) A-129 Theaceae Camellia japonica L. 동백나무 S. Kim (SWU) A-133 ASTERID I / LAMIIDS (9) Boraginales Boraginaceae Symphytum officinale L. 컴프리 S. Kim (SWU) A-136 Trigonotis peduncularis (Trevis.) Benth. ex Hemsl. 꽃마리 S. Kim (SWU) A-135 Gentianales Gentianaceae Gentiana squarrosa Ledeb. 구슬붕이 * S. Kim (SWU) A-137 Lamiales Lamiaceae Lamium amplexicaule L. 광대나물 S. Kim (SWU) A-138 Lamium purpureum L. 자주광대나물 S. Kim (SWU) A-140 Lycopus lucidus Turcz. 쉽싸리 S. Kim (SWU) A-141 Meehania urticifolia (Miq.) Makino 벌깨덩굴 S. Kim (SWU) A-139 Perilla frutescens var. acuta Kudô 소엽 # S. Kim (SWU) A-143 Phlomis umbrosa Turcz. 속단 S. Kim (SWU) A-145 Salvia chanryoenica Nakai 참배암차즈기 S. Kim (SWU) A-146

6 94 김상태 Scutellaria insignis Nakai 광릉골무꽃 S. Kim (SWU) A-144 Stachys japonica Miq. 석잠풀 S. Kim (SWU) A-142 Oleaceae Fraxinus rhynchophylla Hance 물푸레나무 * S. Kim (SWU) A-148 Ligustrum japonicum Thunb. 광나무 S. Kim (SWU) A-147 Phrymaceae Phryma leptostachya var. asiatica H.Hara 파리풀 S. Kim (SWU) A-149 Plantaginaceae Plantago asiatica L. 질경이 S. Kim (SWU) A-150 Scrophulariaceae Antirrhinum majus L. 금어초 S. Kim (SWU) A-151 Veronica persica Poir. 큰개불알풀 S. Kim (SWU) A-152 Verbenaceae Clerodendrum trichotomum Thunb. 누리장나무 S. Kim (SWU) A-153 Solanales Solanaceae Scopolia japonica Maxim. 미치광이풀 S. Kim (SWU) A-154 ASTERID II / CAMPANULIDS (7) Apiales Apiaceae(Umbelliferae) Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm) Benth. & Hook.f. 구릿대 * S. Kim (SWU) A-156 Angelica gigas Nakai 참당귀 * S. Kim (SWU) A-159 Angelica purpuraefolia T.H.Chung 지리강활 S. Kim (SWU) A-158 Angelica tenuissima Nakai 고본 S. Kim (SWU) A-155 Bupleurum falcatum L. 시호 S. Kim (SWU) A-161 Cnidium officinale Makino 천궁 S. Kim (SWU) A-162 Pimpinella brachycarpa (Kom.) Nakai 참나물 S. Kim (SWU) A-160 Sanicula chinensis Bunge 참반디 S. Kim (SWU) A-157 Araliaceae Aralia continentalis Kitagawa 독활 S. Kim (SWU) A-164 Fatsia japonica (Thunb.) Decne. & Planch. 팔손이나무 S. Kim (SWU) A-166 Hedera rhombea (Miq.) Bean 송악 S. Kim (SWU) A-165 Kalopanax pictus (Thunb.) Nakai 음나무 S. Kim (SWU) A-167 Aquifoliales Aquifoliaceae Ilex cornuta Lindl. & Paxton 호랑가시나무 S. Kim (SWU) A-168 Asterales Asteraceae(Compositae) Arctium lappa L. 우엉 * S. Kim (SWU) A-187 Artemisia japonica Thunb. 제비쑥 S. Kim (SWU) A-179 Artemisia selengensis Turcz. ex Besser 물쑥 S. Kim (SWU) A-181 Artemisia stolonifera (Maxim.) Kom. 넓은잎외잎쑥 S. Kim (SWU) A-183 Aster scaber Thunb. 참취 S. Kim (SWU) A-186 Atractylodes japonica Koidz. 삽주 * S. Kim (SWU) A-177 Cacalia firma Kom. 병풍쌈 S. Kim (SWU) A-175 Carpesium macrocephalum Franch. & Sav. 여우오줌 S. Kim (SWU) A-184 Chrysanthemum boreale Makino 산국 S. Kim (SWU) A-176 Crepidiastrum lanceolatum (Houtt.) Nakai 갯고들빼기 S. Kim (SWU) A-169 Farfugium japonicum (L.) Kitam. 털머위 S. Kim (SWU) A-180 Galinsoga parviflora Cav. 별꽃아재비 S. Kim (SWU) A-185 Ligularia fischeri (Ledeb.) Turcz. 곰취 S. Kim (SWU) A-170 Parasenecio auriculatus (DC.) H.Koyama 귀박쥐나물 S. Kim (SWU) A-171 Petasites japonicus (Siebold & Zucc.) Maxim. 머위 S. Kim (SWU) A-172 Syneilesis palmata (Thunb.) Maxim. 우산나물 S. Kim (SWU) A-182 Synurus deltoides (Aiton) Nakai 수리취 S. Kim (SWU) A-178 Tagetes minuta L. 만수국아재비 S. Kim (SWU) A-173 Taraxacum platycarpum Dahlst. 민들레 S. Kim (SWU) A-174 Campanulaceae Adenophora erecta S.T.Lee, J.G.Lee & S.T.Kim 선모시대 S. Kim (SWU) A-191 Adenophora remotiflora (Siebold & Zucc.) Miq. 모시대 S. Kim (SWU) A-193 Asyneuma japonicum (Miq.) Briq. 영아자 S. Kim (SWU) A-188 Campanula punctata Lam. 초롱꽃 S. Kim (SWU) A-190 Campanula takesimana Nakai 섬초롱꽃 * S. Kim (SWU) A-189 Codonopsis ussuriensis (Rupr. & Maxim.) Hemsl. 소경불알 S. Kim (SWU) A-192 Dipsacales Caprifoliaceae Viburnum wrightii Miq. 산가막살나무 S. Kim (SWU) A-195 Weigela subsessilis (Nakai) L.H.Bailey 병꽃나무 S. Kim (SWU) A-194 Valerianaceae Patrinia scabiosaefolia Fisch. ex Trevir. 마타리 S. Kim (SWU) A-197 Valeriana fauriei Briq. 쥐오줌풀 S. Kim (SWU) A-196 a SWU, Herbarium of Sungshin Women s University; CHOL, accession number of plants in the Chollipo Arboretum *Taxa, of which DNA sequences of PCR bands are determined # Taxa, of which PCR tests have performed seven times independently

7 DNA 보존을위한 FTA 카드의관속식물분류군별적용성조사 95 Figure 1. The FTA Plant card and punching tool. Plant leaves are squashed on the card and DNA is preserved in the card at room temperature. PCR can be performed with a piece of punched card after the DNA purification step inside the PCR tube (arrow). 해채집한모든시료는따로실리카겔과함께지퍼백에넣어서건조하여상온에보관하였다 ( 그림 2) 방법채집즉시 FTA 카드에보존된시료는 1~6개월이후일률적으로 DNA 추출및 PCR을실시하여 DNA 의보존성및분류군별활용성을확인하였다. 재료가보존된 FTA 카드는직경 1.5 mm의 Harris Uni-Core (Ted Pella, Inc. USA) 전용펀치 ( 그림 1) 를이용하여카드조각으로잘라내어 200 ul PCR tube에넣어 DNA 추출과 PCR 반응을위한전처리를실시하였다. 전처리는 FTA plantsaver 카드의사용자지침서대로수행하였는데, 이는천공된카드를 1) 200 ul의 FTA Purification Reagent (Whatman, Cat. No ) 에서 4분간처리하여이물질을씻어내는과정을 2회실시하고, 2) 200 ul의 TE 0.1 (10 mm Tris, 0.1 mm EDTA) 용액으로 2회씻어낸후완전히건조시키는과정이다. PCR tube 안에서전처리를실시한 FTA 카드조각으로이후즉시 PCR 과정을수행하였다. 분류군별시료에따른 FTA 카드의 DNA 보존성을테스트하고자보존된시료에대하여식물분야의계통및 DNA 바코드연구에많이이용되는엽록체유전체의 atpf~atph intergenic spacer 구간 (Pennisi, 2007) 을 PCR로증폭하였다 ( 그림 2). PCR에이용한 primer들은관속식물에대한 universal primer로알려져있는 Lahye et al. (2008) 의 ATPF (5 -ACTCGCA CACACTCCCTTTCC-3 ) 와 ATPH (5 -GCTTTTATGG AAGCTTTAACAAT-3 ) 이다. PCR은 PCR master mix (Geneall, Seoul, Korea) 를이용하여 20 ul 부피로수행하였는데, 각각의반응은 1) 전처리를거친천공된 FTA 카드조각과, 2) 10 ul의 2X mastermix, 3) 각각 1ul씩의 primer들 (10mM), 4) 8ul의 deionized water 를포함한다. PCR 온도조건은 95 o C에서 3분간 predenaturation 후, 95 o C 30초, 55 o C 30초, 72 o C 45초의반응을 35회반복하고, 이후 72 o C에서 7분간반응시켜완전한 double strand product를만들어냈다. 이반응은 Mastercycler(BioRad, Hercules, USA) 를이용하여수행하였다. PCR product들은 1.5% agarose gel 에서 15분간전기영동을실시하여사진촬영후반응의성공여부을기록하고, 이를이용하여분류군별보존성을파악하였다. PCR에실패한시료가 FTA 카드에의한 DNA 보존이이루어지지않아서인지아니면 primer 서열의불일치등의다른요인때문인지를파악하기위해서다음과같은추가실험을실시하였다 ( 그림 2). PCR 이실패한분류군들에대해서생체를건조하여보존한잎조직을이용하여 DNA를추출하고, 추출한 DNA에의해 FTA 카드시료와같은조건의 PCR을실시하였다. 이들시료에대한 DNA 추출은 GENEALL Plant SV mini kit (GeneAll, Seoul, Korea) 를이용하였으며, 추출한 DNA는 Nanodrop (Thermo Scientific, USA) 을이용하여 10 ng/ul 농도로희석하여 FTA 카드에보존된시료의 PCR 조건에서 1ul의 deionized water 대신 1ul의 DNA를넣어 PCR을실시하였다. FTA 카드에의한식물 DNA의보존연한을테스트하고자 FTA 카드에시료를흡착하여상온보존한시료들에대하여이후약 5년이지난 2016년 7월에같은조건의 PCR을실시하였다. Band를형성한 PCR 반응물들이실제엽록체유전체의 atpf~atph interspacer 구간인지진위를파악하고자무작위로선택된 20개의시료에대하여염기서열을결정한후 ( 표 1; * 로표시 ) 이들염기서열을 GenBank에서 Blast search를통하여최상위검색점수를갖는염기서열이같은종또는속에해당하는분류군인지확인하였다. DNA 염기서열결정은 AB 3730 DNA analyzer 에의해수행하였으며, 분석결과는 SEQUENCHER (ver. 4.8; Gene Codes, Co., USA) 를이용하여 forward 와 reverse 염기서열을비교하고, chromatogram의질을확인후최종염기서열을결정하였다.

8 96 김상태 Figure 2. Workflow for the evaluation of DNA preservation for plant samples stored using the FTA card. 3. 결과및토의 FTA 카드로관속식물 196 분류군의시료채취가이루어진이후약 1~6개월이지난 2011년 10월에 PCR 테스트를실시한결과 99개의분류군에서 atpf~atph 구간의 PCR product가확인되었다 ( 표 1, 2). PCR에실패한분류군은 97개로서이들분류군들이 DNA 보존이실패한것인지아니면 PCR primer 염기서열의불일치에의한것인지확인하여야함으로이들분류군들에대하여실리카겔에보존된잎조직에서추출된 DNA를이용한같은조건의 PCR을시도하였다. 그결과이들중 30 분류군에서성공적으로 band가형성되었으나, 67 분류군에서는여전히 band를형성하지못하여이들분류군에서최초의 PCR 반응실패는 FTA 카드에의한 DNA 보존실패에의함이아니라사용프라이머의염기서열불일치등다른원인때문일가능성을제시하고있다. 그러므로 196시료에대하여 67 분류군을제외한 129 분류군을모수로이들중 99 시료에서 PCR이성공하였으므로전체테스트한시료에대하여 FTA 카드에의해 DNA가잘보존된비율은 76.74% 이며, 23.26% 의시료에서는 DNA 보존에실패하였음을확인하였다 ( 표 1, 2). 분류군별 DNA 보존성을살펴보면, 전체고사리류에서는 100% 의값을갖지만 ( 표 2; 그림 3C), 포함된일곱시료들중 PCR 반응에실패한다섯시료에서실리카겔에의해정상적으로보존된후정제된 DNA 에의한 PCR도실패하여결과적으로두분류군만 이의미있는데이터를생성였다. 그러므로고사리류에서의결과는 FTA 카드에의한 DNA 보존성을파악하기에는부족하였다. 그러나본결과는 Lahye et al. (2008) 가제시한 atpf~atph 구간에대한 primer들은고사리류에서작동하지않을가능성이많음을제시하고있다. 나자식물은 50.00% 의분류군에서 DNA 가보존되었으며, 전체피자식물에서는 71.58% 다 ( 표 2; 그림 3C). FTA 카드에의한 DNA의보존은 1) 최초로 FTA 카드에조직을파쇄시켜묻힐때 DNA의흡착이잘이루어지는지와, 2) 흡착이일어난이후에 DNA가잘보존되는지로구분하여생각할수있다. 전자는각분류군의특성에따라다양하게존재하는이차대사산물등의세포내용물질이 DNA 흡착방해물질이존재하는지여부가, 그리고후자에서는흡착된 DNA 를파괴시키는요소들을얼마나포함하는지가 DNA 보존성에영향을미칠것이다. 최신피자식물분류체계인 APG IV 분류체계 (APG, 2016) 에서인식하고있는주요분류군들에있어서 FTA 카드에의한분류군별 DNA 보존성을살펴보면, 진정쌍자엽류 (eudicots) 가 71.74% 이고, 진정쌍자엽류내의주요분류군인콩류 (rosids I; Fabids), 아욱류 (rosids II; Malvids), 꿀풀류 (asterids I; Lamiids), 초롱꽃류 (asterids II; Campanulids) 에서는 69.23~80.00% 정도의보존성을보이는데, 특히단자엽류 (monocots) 에서는 93.10% 에이르는매우높은보존성을보인다 ( 표 2). 시료의수가 3개이상으로의미있는값을제공할수있는과들의비교에서는단자엽류의수선

9 DNA 보존을위한 FTA 카드의관속식물분류군별적용성조사 97 Table 2. Success rate of DNA preservation with FTA cards for various taxa and DNA survival rates after five years Higher ranks Families Taxa Year DNA preservation rate after five years TRACHEOPHYTES 76.74% 54.26% 70.71% PTEROPHYTES % 50.00% 50.00% GYMNOSPERMS 50.00% 25.00% 50.00% ANGIOSPERMS 77.24% 55.28% 71.58% Basal Angiosperms % 50.00% 50.00% MONOCOTS 93.10% 86.21% 92.59% EUDICOTS 71.74% 45.65% 63.64% Basal Eudicots 75.00% 56.25% 75.00% CORE EUDICOTS 71.05% 43.42% 61.11% Basal Core eudicots 66.67% 66.67% % ROSIDS 74.19% 48.39% 65.22% ROSIDS I (FABIDS) 69.23% 38.46% 55.56% ROSIDS II (MALVIDS) 77.78% 55.56% 71.43% ASTERIDS 69.05% 38.10% 55.17% Basal Asterids 0.00% 0.00% 0.00% ASTERID I (LAMIIDS) 80.00% 33.33% 41.67% ASTERID II (CAMPANULIDS) 70.83% 45.83% 64.71% Araceae 66.67% 66.67% % Amaryllidaceae % % % Asparagaceae % % % Liliaceae % 83.33% 83.33% Melanthiaceae % % % Papaveraceae 80.00% 60.00% 75.00% Ranunculaceae 50.00% 37.50% 75.00% Fabaceae 66.67% 33.33% 50.00% Rosaceae 71.43% 57.14% 80.00% Brassicaceae % % % Polygonaceae 83.33% 16.67% 20.00% Lamiaceae 83.33% 16.67% 20.00% Apiaceae 80.00% 40.00% 50.00% Araliaceae 66.67% 66.67% % Asteraceae 28.57% 28.57% % Campanulaceae % 83.33% 83.33% 화과 (Amaryllidaceae), 비짜루과 (Asparagaceae), 백합과 (Liliaceae), 멜란지움과 (Melanthiaceae) 와함께십자화과 (Brassicaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae) 가 100% 의높은보존성을보이고있었다. 이는 FTA카드에의한 DNA 보존성테스트가이루어지지않은분류군이라도위의과에해당하는식물들은성공적 DNA 보존이이루어질가능성이높음을제시하고있다. 국화과 (Asteraceae) 식물들은 28.57% 의매우낮은보존성을보이고있었다 ( 표 2). 국화과식물들은일반적으로 polyacetylene, terpenoid, sesquiterpene lactone과같은이차대사산물들을많이갖고있어 (Jude et al., 2016) 이들이 FTA 카드에의한 DNA의낮은보존성과연관이있을가능성이있으며, 테스트가이루어지지않은국화과식물들의 FTA 카드사용은지양되어야할것이다. 최초의실험이있은 2011년이후 5년간상온에서 FTA 카드를보존하였고, 2016년 7월에 2011년과동일한실험을반복하여흡착된 DNA의보존성을실험하였다 ( 그림 4). 그결과실험에사용한전체관속식물에대하여 54.26% 만이 FTA 카드에의한 DNA 보존이확인되어최초실험대비 70.71% 가보존되었고, 5년의기간동안 29.29% 의시료에서는 DNA의 de-

10 98 김상태 Figure 3. A and B, rate of successful DNA preservation using FTA card for taxonomic groups higher than the orders (A) and families (B) of the APG IV system (APG, 2016). C and D, rate of DNA samples that survived after five years. Families with more than three samples were selected (B and D). gradation이이루어졌음을확인하였다 ( 표 2; 그림 2B). 최초실험에서높은보존성을보인단자엽식물에있어서는 5년후 86.21% 가보존되어최초실험대비 92.59% 의높은시간적보존성을보이고있다 ( 표 2; 그림 2B). 과별비교에있어서는전체관속식물이최초실험대비 5년후전반적으로 75% 이상의비교적높은보존성을보이고있지만, 콩과 (Fabaceae) 는 50%, 마디풀과 (Polygonaceae) 는 20%, 꿀풀과 (Lamiaceae) 는 20%, 산형과 (Apiaceae) 는 50% 만의보존성을보여이들분류군에있어서는다른분류군들보다 DNA의빠른분해가이루어지고있음을제시하고있다 ( 표 2; 그림 2B). 이에반해 5년전천남성과 (Araceae), 수선화과 (Amaryllidaceae), 비짜루과 (Asparagaceae), 백합과 (Liliaceae), 멜란지움과 (Melanthiaceae), 십자화과 (Brassicaceae), 두릅나무과 (Araliaceae), 국화과 (Asteraceae) 시료들중 DNA 흡착및보존이확인된시료들은 5년동안 100% DNA 보존이이루어짐을확인할수있었다 ( 표 2; 그림 2B). 이결과는이들분류군에서는 FTA 카드에 DNA 흡착이잘이루어진이후에는높은보존연한을보임을제시하고있다. 위의실험과는별도로실험결과에대한신뢰성을높이고자 FTA 카드에의한식물 DNA의보존이각각의시료에서일정하게일어나는지를테스트하였다. 2011년과 2016년실험에서무작위로선별된다섯분류군에대하여 ( 표 1, # 로표시 ) 분류군당일곱번의동일한실험을실시하였는데, 그결과각각의분류군에서독립적인일곱번모두동일한수준의단일 PCR band를형성하여한시료내에서의 DNA 보존성은동일함을확인하였다 (data not shown). 엽록체의 trnh-psba 구간에대한 primer들은 DNA 바코딩에이용하는 universal primer들이어서 (Lahye et al., 2008; Pennisi, 2007) 결과에서보여주는생성된 PCR band 가엽록체의 trnh-psba 구간이아닐가능성은매우낮다고판단되지만, 본연구에서는생성된 PCR band 에대하여무작위로 20개를선택하여이들의염기서열을결정하였다. 생성된염기서열에대한 blast 검색결과테스트에사용된모든염기서열이 GenBank에

11 DNA 보존을 위한 FTA 카드의 관속식물 분류군별 적용성 조사 99 Figure 4. An example of agarose-gel electrophoresis pictures of PCR products to confirm DNA preservation status for various tracheophytes samples stored using the FTA card. PCRs of the chloroplast atpf~atph region performed using FTA cards stored for five years at room temperature (18~25oC). Numbers indicated on each lane are matched with the sample ID in table 1. 등록된 해당 식물과로부터 유래된 염기서열과 가장 확인된 바 있는데(Lin et al., 2000), 이들은 모두 경 높은 유사도를 보였다. 이는 PCR 결과에서 제시된 제적으로 중요한 작물 또는 연구를 위한 모델식물들 band의 유무로 FTA 카드에 의한 DNA 보존성을 보 이다. 본 연구에서는 다양한 관속식물에 대하여 FTA 여주는데 대한 신뢰성을 높이는 결과이다. 카드에 의한 DNA 보존성 및 보존 연한 테스트의 결 식물 시료의 FTA 카드에 의한 DNA 보존성은 지 과를 제시하였다. 테스트가 이루어진 분류군 또는 이 금까지 애기장대(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.), 들의 근연 분류군들에 있어서 FTA 카드는 향후 분 대마(Cannabis sativa L.), 카사바(Manihot esculenta 류, 계통, 보존 연구에 있어서 바로 사용할 수 있는 Crantz), 코카(Erythroxylum coca Lam.), 옥수수(Zea 강력한 도구가 될 것으로 생각된다. FTA 카드에 의 mays L.), 난과식물(Orchid sp.), 파파야(Carica papaya 한 DNA 보존은 1) 전수조사가 필요하여 많은 수의 L.), 페튜니아(Petunia sp.), 양귀비(Papaver somniferum 시료가 필요하고, 또한 2) 한 시료당 채취할 수 있는 L.), 감자(Solanum tuberosum L.), 벼(Orzya sativa L.), 조직이 제한되어 있는 희귀식물 또는 멸종위기식물의 콩(Glycine max L.), 사탕무(Beta vulgaris L.), 사탕수 분류, 계통, 진화 연구에 있어서 널리 활용될 수 있 수(Saccharum officinarum L.), 담배(Nicotiana tabacum 을 것이다. L.), 토마토(Solanum lycopersicum L.)에서 성공적으로

12 100 김상태 4. 결론 References FTA 카드는식물조직에포함된 DNA를빠르고간편하게보존할수있는방법이다. 그러나지금까지 FTA 카드에의한 DNA 보존성은벼, 감자, 토마토같은몇몇경제작물및애기장대와같은모델식물에서만이이루어졌다. 본연구에서는다양한관속식물 196분류군에대하여 DNA 바코드프라이머에의한 PCR을이용해 FTA 카드를이용한 DNA 보존이이루어질수있는지검사하였다. 그결과실험에이용된전체관속식물의 76.74% 의분류군에서성공적인 DNA 보존이이루어졌고, 분류군별로 DNA 보존성에대한차이를확인하였다. 특히단자엽식물들은대부분의과에서 100% 의매우높은보존율을보였고, 국화과식물들에있어서는 28.57% 의낮은보전성을나타내었다. FTA 카드에의한 DNA 보존연한을검사하고자시료가묻은 FTA 카드를 5년간보존한후동일한실험을한결과 DNA 보존율은 54.26% 로서 5년전대비 29.9% 의시료에서 DNA가분해되었음보여주었다. 그러나 5년전성공적 DNA 보존이확인된수선화과, 비짜루과, 멜란지움과, 십자화과, 두릅나무과, 국화과식물들의시료에있어서는 5년후에도 100% 의보존성을보였다. 관속실물의집단유전, 계통, 진화연구및감별, 검역과같은이용에있어서 FTA 카드에의한 DNA 보존성에대한분류군별특성을보여주는본실험결과는향후동일분류군및근연분류군에대한 FTA 카드활용을판단할수있는자료를제공하고있다. 감사의글본연구는 2014년도성신여자대학교학술연구조성비에의해지원받았음을밝힙니다. 본연구의재료수집과자료정리에도움을주신이정은, 박지은, 노은숙님께감사드리며, 또한다양한식물재료수집을허락해주신천리포수목원에감사드립니다. APG (The Angiosperm Phylogeny Group) An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG IV. Botanical Journal of the Linnean Society, 181: Becker S., Franco, J. R., Simarro, P. P., Stich, A., Abel, P. M., and Steverding, D Real-time PCR for detecting Trypanosoma brucei in human blood samples. Diagnostic Microbiology and Infectious Diesease 50: Hide, G., Hughes, J. M., and McNuff, R A rapid and simple method of detection of Blepharisma japonicum using PCR and immobilisation on FTA paper. BMC Ecology 3: 7. Judd, W. S., Campbell, C. S., Kellogg, E. A., Stevens, P. F., and Donoghue M. J Plant Systematics A Phylogenetic Approach. 4 th ed. Sinauer, Sunderland. Pp Kubo S. and Fujita, Y Application of FTA technology to extraction of sperm DNA from mixed body fluids containing semen. Legal Medicine 8: Lahaye, R., van der Bank, M., Bogarin, D., Warmer, J., Bupulin, F., Gigot, G., Maurin, O., Duthoit, S., Barraclough, T. G., and Savolainen, V DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots. Proceedings of National Academy of Science, USA 105: Lampel, K. A., Dyer, D., Kornegay, L., and Orlandi, P. A Detection of Bacillus spores using PCR and FTA Filters. J. Food Protection 67: Lin, J.-J., Fleming, R., Kuo, J., Matthews, B. F., and Saunders, J. A Detection of plant genes using a rapid, nonorganic DNA purification method. BioTechniques 28: Pennisi, E A Barcode for Plants. Science 318: Rogers, C. and Burgoyne, L Bacterial typing: storing and processing of stabilized reference bacteria for polymerase chain reaction with preparing DNA an example of automatable procedure. Analytical Chemistry 247: