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유리 경
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1 Journal of Bacteriology and Virology Vol. 41, No. 1 p.1 7 DOI /jbv Review Article Recent Methodological Approaches to Human Microbiome Jin-Woo Bae * Department of Biology, Kyung Hee University, Seoul, Korea Human body is one of the most complex and diverse microbial ecosystem in which various microbes are living together with their hosts. Starting with Louis Pasteur's postulation that human health is dependent on gut-resident microbiota, microbes in the gastrointestinal tract have been studied using culture-based techniques. Cultivation has the great advantage that isolates can be recovered and used to further studies for their ability to utilize different substrates and other physiological properties. However, cultivation method is very labor-intensive and can not reveal representative microbial diversity of human intestinal tract. Only small fraction of the microbes residing in human intestine can be cultured and majority of intestinal microbes (approximately 60~70% of intestinal microbes) can not be come into view with currently available cultivation techniques. To avoid reliance on cultivation, many culture-independent molecular methods have been developed to analysis environmental microbes and our understanding of complex microbial communities has been greatly increased by molecular methods in recent decades. These culture-independent methods are mainly based on the use of microbial DNA sequences. Among prokaryotic DNAs targeted by molecular analysis, approximately 1.5 kb long 16S ribosomal DNA gene that encodes part of the small subunit (SSU) of ribosome is often used for analysis of microbial diversity. Molecular techniques introduced in microbial ecology have made it possible to study the composition of intestinal flora in a culture-independent way based on the detection of SSU rdna. Key Words: Intestinal microbiota, Culture-dependent method, Culture-independent method 서론 사람의몸에는 100조 ( 兆 ) 개이상의미생물이살고있으며, 이들미생물이지니는유전자의수는우리몸의전체유전자수보다최소한 100배이상많은것으로추정하고있다. 특히사람의대장은영양분이풍부하며, ~ cells/ml에달하는미생물이존재한다 (1). 이러한장내미생물은음식물소화에직접적으로관여하여사람조직의에너지대사를조절한다. 따라서장내미생물군집의변화는비만, 장염, 면역조절등에중요한역할을한다는연구들이끊임없이나오고있다. 이와같은연구 Received: February 6, 2011/ Revised: February 14, 2011 Accepted: February 19, 2011 * Corresponding author: Jin-Woo Bae. Department of Biology, Kyung Hee University, Seoul, Korea. Phone: , Fax: baejw@khu.ac.kr 결과들은사람건강에대한연구가장내미생물로연관되는이유이기도하다. 장내미생물에대한전통적인연구방법은배양법을이용한미생물의표현형적특징에국한되어진행되었다. 이와같은연구방법은장내미생물연구의기본토대를구축하였지만, 그결과장내미생물연구에대한편중된결과를나타내기도하였다. 이런한계점을극복하기위해미생물 16S rrna의염기서열의분석방법이도입되었다. 이어 fluorescence in situ hybridization (FISH), Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TGGE), Quantitative PCR, Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP), 16S rrna gene cloning, plasmid profiling 등이장내미생물의다양성을연구하는데적용되고있다 (2). 최근에는게놈과메타게놈연구에 'omics' 기술이도입되었고 next generation sequencing (NGS) 과 DNA microarray가장내미생물에대한연구에널리적용되고있음을주목할필요가있다. 이 1

2 2 J-W Bae 런방법은배양에기초한방법이나 small-subunit rrna 염기서열분석방법에의한기존연구보다환경미생물군집의다양성과개체밀도에대해더많은정보를얻을수있게해주었다. 본종설에서는장내환경에서특정미생물혹은다양한미생물을검출하고분석하기위한분자방법론적기술에대한특징과적용사례등을고찰하고자한다. 본론 1. 전통적방법의장내미생물군집분석 : 배지를이용한배양법 1980년대후반까지미생물의다양성을연구하기위해대부분의미생물학자들은선택배지를이용한배양방법과현미경을이용한미생물의형태를관찰하는방법을사용하여왔다. 배양배지는미생물을분리하는데사용되기때문에사람장내와비슷한 ph와그안에서이용가능한영양분과같은환경적요인을만족시켜야만한다. 따라서수적으로우세한미생물만분리해내는편중된결과가나올수있다. 또한형태를바탕으로미생물분류에는한계가있으며, 현미경으로관찰가능한대부분의 미생물들도이러한접근방법으로는배양가능하지않다는어려움이있다. 이와같은단점을보완하기위해아래와같은다양한분자방법론이채택되었다. 2. 분자방법론적접근에의장내미생물군집분석지난 30년간미생물다양성을연구하는데있어서분자방법론적접근은극적인변화를가져왔다. 예를들어, 발견되지않은미생물들은배양하기어렵거나 ( 난배양성 ) 현실적으로배양이되지않는 ( 비배양성 ) 미생물이대부분일것이다. 최근이들을인공적으로분리, 배양하지않고도직접이용하고자하는기술이개발되었다 (Table 1). 즉, 환경에존재하는미생물을직접배양하지않고, 그들의유전체 (metagenome) 를직접추출하여자연계의미생물생태계를조사하거나활용하려는메타게놈라이브러리구축및스크리닝기술이선진각국에서개발되었다. 따라서자연계의난배양성또는비배양성미생물을이용할수있는길이열렸다고할수있다. 현재메타게놈기술을이용한연구를통해서산업적으로유용하거나가치가높은신규유용물질을개발하려는연구가활발히진행되고있다. 특히 microarray와 next generation sequencing (NGS) 과같은기술의도입으로다양한환경시료들로부 Table 1. Notable features of molecular methods for studying the intestinal microbiota Methods Advantage Limitation Cultivation DGGE FISH Flow cytometry Q-PCR Microarray NGS Capable of isolation of microorganisms, physiological and biochemical test of isolates Monitoring of microbial community change Comparison analysis of microbial community in various samples Microbial detection and quantification in situ Detection and separation of targeted microorganisms Obtain ability of uncultured microbial genomes Quantitative analysis of specific microorganisms Very high-throughput Analysis of functional gene as well as 16S rrna gene Low cost and short time to obtain massive sequence data Lots of time and effort required Deficient reproducibility Difficult to isolate uncultivated microorganisms Inaccurate quantitative analysis due to PCR biases Requirement of sequencing to identify each band. Detectable only for dominant microorganisms Low specificity of designed probe Difficult to detect all of targeted microorganisms The same shortcomings as FISH Incorrect cytometry Very low-throughput Need of each different primer set and independent experiment for targeted microorganisms Difficult to design specific probe High cost Low sensitivity than Q-PCR with environmental sample Short read length PCR-induced artifacts and bias Requiring high-performance computer systems and bioinformatics tools

3 Methodological Approaches to Intestinal Microbiome 3 터얻은많은수의염기서열을단시간에분석할수있게되었다. 이들기술을이용해미생물다양성에대한정보를크게넓혀가고있다. 1) Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) 미생물환경생태연구에분자적기술의중요성은 1993년 Muyzer 등 (3) 이 DGGE 기술을이용해복잡한환경으로부터미생물의다양성을분석하면서시작되었다고할수있다. 이방법은다양한미생물의 16S rrna를 PCR로증폭시킨후 denaturing polyacrylamide 겔에한꺼번에로딩하여패턴을분석함으로써결과를도출한다. 분석은전기영동시겔내에존재하는 denaturants (urea와 formamide) 의농도구배에따라핵산의이중나선구조와변성구조즉, 염기서열이가지는 Tm 값의차이에의해핵산의이동속도가달라겔의특정위치에서이동을중단하면서밴드를형성하는원리를이용한것이다. 미생물집단의구성에관한좀더구체적인연구를위해기존에알려져있는장내우점종을대상으로종-특이적 (species-specific) primer를제작하여 DGGE를수행하기도한다. 장내미생물의다양성을알고자 DGGE 방법을이용할때의가장큰장점은여러샘플을동시에비교, 분석할수있다는점이다. 또한시간의흐름에따른복잡한미생물집단의관계를간단히모니터링할수있다. 따라서 DGGE 기술은음식과항생제복용, 환경적인변화등으로인한장내미생물의변화양상을모니터링하는데매우유용한기술이라고할수있다 (4). 이렇게미생물집단의분석이용이한장점이있지만, 타미생물그룹에비해상대적으로적은양이포함된미생물집단은그만큼증폭산물이적기때문에검출에제한이있을수있다. 또한 primer 합성시 mismatch가있어검출에오류가있을수있으며, DNA 증폭과정시오류발생, 불분명한 melting domains 때문에 sequencing의결과가정확하지못하다는단점도동시에존재한다. 2) Quantitative PCR (Q-PCR) Q-PCR 기술은표적유전자만을특이적으로증폭함으로써, 이증폭량을실시간으로확인하는기술이다. Q-PCR 의원리는 PCR 증폭시형광물질 (ethidium bromide, YO- PRO-1, SYBR green 등 ) 을같이넣어주어증폭시키면, 표적유전자의 double strand DNA와결합하여강한형광빛을발산한다. 여기서나오는형광강도를검출하여증폭 산물의생성량을실시간으로측정할수있다. 특히이방법은빠른검출속도와형광인자를이용한민감한검출방법이며, 높은감도로증폭이가능하며, 오염률을줄일수있는장점이있다. 샘플에자신이검출하고자하는표적이미량으로존재하여 FISH나일반 PCR로검출하기어려울경우라도 Q-PCR 방법으로는검출이가능하다. 종 -특이적 primer를제작하여 Q-PCR을수행하면소량의변화를보이는종도민감하게검출이가능하다. 이런빠르고민감한검출방법은기존의배양이나 PCR 방법으로다루기어려웠던미생물집단을검출하기위하여사용되었다. 그러나 PCR 당가장적합한 standard를만들어비교해야만하는단점이있다. 또한 standard는 target 과유사한조건에서 PCR 증폭이일어나야하며, 반응물의양을정확히알고있어야비교가가능하다. 그리고 target과 standard와의적정한비율범위를맞추기위해여러농도를실험해야한다는번거로움이있다. 3) Fluorescence in situ hybridization (FISH) FISH는표적이되는 DNA와 RNA에형광물질인 fluorescein-isothiocyanate (FITC), tetramethyl-rhodamineisothiocyanate (TRITC), 또는 cyanine dye (Cy3TM, Cy5TM) 를직접붙여검출하는방법이다. 기존에알려져있는염기서열정보를토대로 15~23 nucleotides 길이의 probe를제작하고, 이 probe의 5'-end에형광표지인자를붙여표적세포에붙이면형광현미경을통해육안으로관찰이가능하다. 이방법은인간의장과같이복잡한환경에서특정미생물집단을검출하기위한유용한기술이며 (5), 배양기술에서벗어나환경에서직접단일세포의동정이가능한기술이다 (6). 이렇게배양방법에서벗어나환경에서직접표적을검출할수있다는장점때문에 probe 를제작하여간편하게미생물검출에이용할수있다. 이렇게제작한하나의 probe는 oligonucleotide 제작시 mismatch의오류, 그리고기존에알려진 sequence 정보의부정확성으로인해정확한표적세포만을검출하기어렵다는결론에도달했다. 이를극복하기위하여다양한 probe 제작에관한연구가시작되었다. 특히종-특이적 probe를여러개를제작하여경쟁적으로사용할경우에는하나의 probe를사용하여검출하는것보다훨씬더나은결과를보이는것이입증되었고, 월등한특이성을보여주었다 (7). 인간장내에우점을형성하고있다고알려져있는미생물 (Bacteroides, Clostridium, Eubacterium,

4 4 J-W Bae Streptococcus, Lactococcus) 을대상으로 6개의 genus-specific probe를통해장내에형성되어있는각각의미생물이전체환경에서얼마나우점하고있는지, 더나아가우점종의변화에따라건강상태를체크하는데응용할수도있고, 정상적인장내환경을유지하기위해각미생물들이어떠한역할을하는지도설명이가능하게되었다 (6). 하지만우리가알고있는장내미생물의정보는극히일부인데반하여, 장내에형성된미생물은매우다양하고, 염기서열이유사한미생물들도많이존재하기때문에 species level로 probe를제작하여모든미생물을검출하기란어려운일일것이다. 따라서이것에적합한 probe 제작을어떻게하느냐가관건이라고할수있다. 4) Flow cytometry Flow cytometry는앞에서설명한 FISH 기술과같이세포에직접 fluorescent tag을붙이는과정을수반한다. 형광물질을붙인세포를특정형광검출기에통과시키면서특정대상만을검출하게되는데, 기계에서전자를쏘면형광의유무에따라다른전하를띄게함으로써표적만을골라낼수있다. 이렇게해서전체장내미생물집단에서특정미생물의수를산정하는것이가능하다 (5). 건강한사람의분변샘플을 flow cytometry를이용하여분석한결과, 기존의배양방법으로는검출되지않았던 Ruminococcus obeum-like bacteria를종-특이적 probe를제작하여검출하였다 (8). FISH의방법으로비교실험을수행한결과, 유사한결과를도출함으로써장내미생물의전체그룹중표적집단만을검출하기위한방법으로안정적이고적합한기술방식으로인정받고있다. Flow cytometry는다른어떤기술보다빠르고정확한동정능력을보이며이러한장점을통해사람에게서보여지는병원균을빠른시간내에보다쉽게검출할수있는응용가능성이있다. 3. 분자방법론에의거한대용량동시처리기술 (highthroughput technology) DNA microarrays는원래 1995년유전자발현프로파일링을하기위한용도로발달하였다 (9). 미생물생태학에서메탄순환, 미생물다양성, 생물지구화학의상관적요소등다방면의연구에적용되었다 (10~13). 반면, pyrosequencing (Roche, Inc.), Illumina (Solexa, Inc.) 와 SOLiD (Life Technologies, corp.) 를포함한 NGS 접근은여러시 료나전사체로부터수많은 DNA 단편을분석할때비용대비효과적이고신속하며높은염기서열분석을제공한다. 특히 pyrosequencing은다른 NGS 기술들에비해 read 의길이가상대적으로길기때문에미생물생태학연구에적합하다. 따라서 NGS 기술중에서도 pyrosequencing 이가장널리사용되고있다 (14). 오늘날복잡한미생물군집의분석을위해효과적이고경제적인면을고려함에따라, DNA microarray는 NGS로빠르게대체되고있다. 일부과학자들은병원체유전자형검사 (15) 와인간의장내미생물군집연구 (16) 를위해 pyrosequencing과 microarray를동시에사용하고있지만, 추세는과거 DNA microarray가차지하고있던범위를 NGS가광범위하게대치하고있다고할수있다. 1) Microarray 최근다루게되는유전자의수와, 연구범위가넓어지면서 high throughput 기술이각광받기시작하였고, microarray를이용한기술이각분야에적용되고있다. 수백개내지수천개의유전자 (oligonucleotides, cdna, genomic DNA) 를 slide glass에고정시키고, 알고자하는환경에서추출한 DNA를증폭시켜형광물질을붙인후유전자의발현변화를측정하는방법이다. Microarray는최근들어장내미생물연구에도적용되고있다 (17, 18). 한번의실험으로다량의유전자발현과구조정보를쉽게알수있기때문에, 장내와같은복잡한환경생태를연구하기에매우유용하다 (17). 하지만일부유사한염기서열을가지고있는종을구별해내기가어려울뿐아니라, 환경에서추출한 DNA 증폭시편견 (bias) 이일어나 hybridization 오류를범할수있다. 2) 차세대시퀀싱기술 (Next Generation Sequencing) (1) SOLiD (Life Technologies corp., Carlsbad, CA, USA) Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection (SOLiD) sequencer는아주작은비드 (beads) 에 DNA를고정한후 emulsion PCR을이용하여증폭하는방식을취한다. 2010년말에출시된 SOLiD TM 4 system은총 300기가베이스의염기서열을 12~16일만에얻을수있는데 DNA 절편당 50 베이스의매우짧은염기서열정보를얻게된다. 자성을띄는작은비드에 sequencing할 DNA가결합되

5 Methodological Approaches to Intestinal Microbiome 5 는데하나의비드에하나의 DNA만결합하게된다. 이때비드에생긴 clonal이늘어나고 emulsion PCR을통해비드에결합되어있는 DNA 절편이증폭하게된다. 증폭된 DNA 비드를 flow cell에붙여서 sequencing을하게되는데, 이때한 flow cell 당 1~18개의개별시료를 sequencing 할수있으며, 한번의작동으로최대 1,536개의복합시료를분석할수있다. 다른 NGS보다높은정확도를갖기때문에 single-nucleotide polymorphism (SNP) 나삽입, 결실등의변이정보를확인하는데많이사용되며, 미생물의 whole genome sequencing에사용되기도한다. (2) Illumina (Solexa, Inc., Hayward, CA, USA) Illumina는 DNA를짧은단편으로만든후 flow cell에접합할수있는 adapter를붙인다. 그뒤 adapter가붙은 DNA를 flow cell에뿌려 bridge amplification 을통해 DNA 증폭을한후 sequencing을하게된다. Hiseq 2000은한번의작동에 8일이소요된다. 그리고한번에 8개의샘플을동시에 sequencing 할수있으며, NGS 중가장저렴한비용으로운용할수있는특징이있다. 또한 100 base 정도의 DNA sequencing이가능하며한번에 150기가의염기서열을얻을수있다. 각 read의길이가짧지만최종적으로산출되는염기서열길이의합이크기때문에 whole genome sequencing이가능하다. 이와같은장점때문에장내미생물분석에사용되고있기도하다. 2010년 Nature 에게재된 MetHIT (Metagenomics of the Human Intestinal Tract) 프로젝트는 Illumina를이용하여얻은결과이다. 즉, 이를이용해서인체에존재하는 3백만개이상의미생물유래유전자들을선별하였고, 그결과 1,000~1,150여종의미생물이항상존재하며, 이중 160여종의장내미생물이필수미생물임을증명하였다 (19). (3) Pyrosequencing (Roche, Inc., Branford, CT, USA) Roche의 Genome Sequencer FLX (pyrosequencing) 는환경및장내미생물의 metagenome 분석으로광범위하게사용되는최신방법중하나이다. Sequencing-by-synthesis 방법을통해증폭된 PCR product로부터고도병렬 DNA 염기서열 reads (massive parallel DNA sequence reads) 을만들어낸다. Pyrosequencing은 SOLiD와비슷한방법인 bead에 adapter-ligated DNA 절편을붙여증폭하는방법은비슷하지만각염기를탐지하는방법에차이가있다. Pyrosequencing에서얻어지는데이터는뉴클레오티드가 결합할때방출되는 pyrophosphate로부터빛을검출하는원리로산출된다. Pyrosequencing 방법은다른 NGS보다 base 당분석비용이더비싸고더많은초기물질이필요하지만, 최근, 새로운 GS FLX Titanium series (Roche, USA) 로인해, de novo 염기서열분석에적합한더긴 read의길이를얻을수있다. 한번실행하는동안 100만 reads 이상의각 DNA 절편당 400 bases의서열분석이가능하여 high-throughput sequencing 도구로운용되었다. 또한샘플을구분하기위한 barcode의이용으로많은시료를한번에 sequencing이가능해졌으며, 이는표적군집의고도의시간적, 공간적다양성에의해많은양의시료분석이요구될때유용하다. 장내미생물군집분석에있어서 PCR은 pyrosequencing 에앞서수행되는단계이다. PCR 결과생기는 chimera, mutations, heteroduplex molecules 등의형성 (20) 이나 PCR 주형대 PCR 산물의비대칭적인비율 (21) 같이 PCR에의한오류는미생물군집의다양성을과도또는과소측정하는결과를낳을수있다. 하지만이런오류는 RDP II, Nellerophon (22) 등의키메라확인프로그램이나 PCR의 cycle 수제한등으로다소줄일수있다. Pyrosequencing 은이런단점이있음에도 ultra-deep sequencing이가능하기때문에분변시료에서지금까지밝혀지지않은분류군의장내미생물을동정할수있게되었다. 동시에이방법은다양한환경에적용되고있으며 (14, 16), genome sequencing에이용되기도한다 (23). 예를들어 Jeffrey Gorden의연구진은 Genome Sequencer FLX을이용하여 metagenome 분석을하였다. 그결과한어머니에게출생한쌍둥이들은유전적으로무관한타인들보다는장내박테리아군집의유사성을보였다. 그렇지만같은박테리아군집을갖는어머니와쌍둥이라고하더라도장내바이러스군집이서로다르며, 시간이지나도변하지않는다는것을발견하여 metagenome 연구에 pyrosequencing 이대단히효과적임을증명하였다 (24). 이와같이 NGS를이용한장내미생물에대한분석은지금까지분석의한계로인해알수없었던미생물의기능을설명하는데한발자국멀리볼수있는시각을주고있다. 결론분자적접근방법을이용한미생물연구에서몇몇환경

6 6 J-W Bae 시료는깊이있게연구되어야만한다. 이연구를위해오늘날 NGS 기술은큰잠재력을갖고있다. 과거에 microarry 는미생물연구의많은부분을차지하는연구방법이었으나, 오늘날그자리를현재의 NGS 기술로대치되고있는실정이다. 그렇지만이두가지방법이양자택일의기술로생각할수있지만, 미생물생태학에있어서는서로달리적용할수있는뚜렷한상호보완적특징을갖고있다. 즉, microarray는표적염기서열의일반적인연구에효과적인연구방법이다. 반면 NGS data는 microarray probe sets 설계에이용될수있어미생물유전자다양성의이해를가능케한다. 최근 NimbleGen (Roche Nimblegen, Inc., Madison, WI, USA) 은 probe hybridization 되는표적 DNA 절편들이염기서열분석과같은하위분석에사용될수있는 'sequence capture array' 를개발하였다. 이런결합적접근은환경미생물군집의상세한검사를가능하게하였고, 주어진환경안에서시간, 공간, 기능적규모의커버가필요한많은시료의깊이있는분석을통해미생물과그것의환경사이의관계를이해하는데많은기여를할수있을것이다. 참고문헌 1) Whitman WB, Coleman DC, Wiebe WJ. Prokaryotes: the unseen majority. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95: ) Amann RI, Binder BJ, Olson RJ, Chisholm SW, Devereux R, Stahl DA. Combination of 16S rrna-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Appl Environ Microbiol 1990;56: ) Muyzer G, de Waal EC, Uitterlinden AG. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rrna. Appl Environ Microbiol 1993;59: ) Favier CF, de Vos WM, Akkermans AD. Development of bacterial and bifidobacterial communities in feces of newborn babies. Anaerobe 2003;9: ) Namsolleck P, Thiel R, Lawson P, Holmstrom K, Rajilic M, Vaughan EE, et al. Molecular methods for the analysis of gut microbiota. Microb Ecol Health Dis 2004;16: ) Franks AH, Harmsen HJ, Raangs GC, Jansen GJ, Schut F, Welling GW. Variations of bacterial populations in human feces measured by fluorescent in situ hybridization with group-specific 16S rrna-targeted oligonucleotide probes. Appl Environ Microbiol 1998;64: ) Lay C, Sutren M, Rochet V, Saunier K, Dore J, Rigottier-Gois L. Design and validation of 16S rrna probes to enumerate members of the Clostridium leptum subgroup in human faecal microbiota. Environ Microbiol 2005;7: ) Zoetendal EG, Ben-Amor K, Harmsen HJ, Schut F, Akkermans AD, de Vos WM. Quantification of uncultured Ruminococcus obeum-like bacteria in human fecal samples by fluorescent in situ hybridization and flow cytometry using 16S rrnatargeted probes. Appl Environ Microbiol 2002;68: ) Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995;270: ) Bodrossy L, Sessitsch A. Oligonucleotide microarrays in microbial diagnostics. Curr Opin Microbiol 2004;7: ) Zhou J. Microarrays for bacterial detection and microbial community analysis. Curr Opin Microbiol 2003;6: ) Bae JW, Park YH. Homogeneous versus heterogeneous probes for microbial ecological microarrays. Trends Biotechnol 2006; 24: ) Wilson KH, Wilson WJ, Radosevich JL, DeSantis TZ, Viswanathan VS, Kuczmarski TA, et al. High-density microarray of small-subunit ribosomal DNA probes. Appl Environ Microbiol 2002;68: ) Lazarevic V, Whiteson K, Huse S, Hernandez D, Farinelli L, Osterås M, et al. Metagenomic study of the oral microbiota by Illumina high-throughput sequencing. J Microbiol Methods 2009;79: ) Akhras MS, Thiyagarajan S, Villablanca AC, Davis RW, Nyren P, Pourmand N. PathogenMip assay: a multiplex pathogen detection assay. PLoS ONE 2007;2:e ) Claesson MJ, O'Sullivan O, Wang Q, Nikkila J, Marchesi JR, Smidt H, et al. Comparative analysis of pyrosequencing and a phylogenetic microarray for exploring microbial community structures in the human distal intestine. PLoS ONE 2009;4: e ) Quince C, Lanzen A, Curtis TP, Davenport RJ, Hall N, Head IM, et al. Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data. Nat Methods 2009;6: ) Gomez-Alvarez V, Teal TK, Schmidt TM. Systematic artifacts in metagenomes from complex microbial communities. ISME J 2009;3:

7 Methodological Approaches to Intestinal Microbiome 7 19) Qin J, Li R, Raes J, Arumugam M, Burgdorf KS, Manichanh C, et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature 2010;464: ) Qiu X, Wu L, Huang H, McDonel PE, Palumbo AV, Tiedje JM, et al. Evaluation of PCR-generated chimeras, mutations, and heteroduplexes with 16S rrna gene-based cloning. Appl Environ Microbiol 2001;67: ) Polz MF, Cavanaugh CM. Bias in template-to-product ratios in multitemplate PCR. Appl Environ Microbiol 1998;64: ) Huber T, Faulkner G, Hugenholtz P. Bellerophon: a program to detect chimeric sequences in multiple sequence alignments. Bioinformatics 2004;20: ) Jeong H, Barbe V, Lee CH, Vallenet D, Yu DS, Choi SH, et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). J Mol Biol 2009;394: ) Reyes A, Haynes M, Hanson N, Angly FE, Heath AC, Rohwer F, et al. Viruses in the faecal microbiota of monozygotic twins and their mothers. Nature 2010;466:334-8.

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뉴스레터6호F?2??訝 February 2009 No.06 Roche Diagnostics Korea Co., Ltd. Focus Tech EDITORIAL February 2009 No.06 Contents Editorial 03 Focus 04 Product 10 Talk 12 Tech 14 Activity 19 Style 22 February 2009 No.06 02 03 FOCUS