공개특허 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C07K 16/22 ( ) A61K 39/395 ( ) A61K 47/42 ( ) C12P 21/

Transcription

1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C07K 16/22 ( ) A61K 39/395 ( ) A61K 47/42 ( ) C12P 21/08 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 ( 국제 ) 2011 년 05 월 13 일 심사청구일자 없음 (85) 번역문제출일자 2012 년 12 월 13 일 (86) 국제출원번호 PCT/US2011/ (87) 국제공개번호 WO 2011/ 국제공개일자 (30) 우선권주장 2011 년 11 월 17 일 61/334, 년 05 월 14 일미국 (US) 61/425, 년 12 월 21 일미국 (US) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2013년10월08일 (71) 출원인 애브비인코포레이티드 미국일리노이주 놀스시카고놀스워키건로드 1 (72) 발명자 우청빈 중국상하이푸둥 602 아파트먼트 #14 진슈로드 300 암브로시도미니크제이. 미국매사추세츠주 슈루즈베리아버드라이브 4231 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 장훈 전체청구항수 : 총 122 항 (54) 발명의명칭 IL-1 결합단백질 (57) 요약 IL-1α 및 IL-1β 에결합하는단백질이, IL-1- 관련장애를치료하고예방하며진단하기위한및, 세포, 조직, 시료, 및조성물에서 IL-1α 및 IL-1β 를검출하기위한조성물및방법에서이들의용도와함께기술되어있다

2 (72) 발명자 시에춘 - 밍 미국매사추세츠주 뉴턴올드필드로드 22 갸유르타리끄 미국매사추세츠주 홀리스턴워싱턴스트리트

3 특허청구의범위청구항 1 제1의 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n( 여기서, VD1은제1의중쇄가변도메인이고 ; VD2는제2의중쇄가변도메인이며 ; C는중쇄불변도메인이고 ; X1은링커 (linker) 이며단, 이것은 CH1이아니며 ; X2는 Fc 영역이고 ; n은독립적으로 0 또는 1이다 ) 를포함하는제1 폴리펩타이드쇄 ; 및제2의 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n( 여기서, VD1은제1의경쇄가변도메인이고 ; VD2는제2의경쇄가변도메인이며 ; C는경쇄불변도메인이고 ; X1은링커이며단, 이것은 CH1이아니며 ; X2는 Fc 영역을포함하지않고 ; n은독립적으로 0 또는 1이다 ) 를포함하는제2의폴리펩타이드쇄를포함하는결합단백질로서, 상기제1의폴리펩타이드쇄에서, VD1은서열번호 60 내지 148, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 및 210으로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하고 ; VD2는서열번호 213 및 227로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하며 ; 상기제2의폴리펩타이드쇄에서, VD1은서열번호 149 내지 189, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209 및 211 로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하고 ; VD2는서열번호 216 및 229로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하며 ; 상기결합단백질은사람 IL-1β 및사람 IL-1α에결합하는, 결합단백질. 청구항 2 제1의 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n( 여기서, VD1은제1의중쇄가변도메인이고 ; VD2는제2의중쇄가변도메인이며 ; C는중쇄불변도메인이고 ; X1은링커이며단, 이것은 CH1이아니고 ; X2는 Fc 영역이며 ; n은독립적으로 0 또는 1이다 ) 를포함하는제1의폴리펩타이드쇄 ; 및제2의 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n( 여기서, VD1은제1의경쇄가변도메인이고 ; VD2는제2의경쇄가변도메인이며 ; C는경쇄불변도메인이고 ; X1은링커이며단, 이것은 CH1이아니며 ; - 3 -

4 X2는 Fc 영역을포함하지않고 ; n은독립적으로 0 또는 1이다 ) 를포함하는제2의폴리펩타이드쇄를포함하는결합단백질로서, 상기제1의폴리펩타이드쇄에서, VD1은서열번호 213 및 227로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하고 ; VD2는서열번호 60 내지 148, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 및 210으로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하며 ; 상기제2의폴리펩타이드쇄에서, VD1은서열번호 216 및 229로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하고 ; VD2는서열번호 149 내지 189, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209 및 211로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하며 ; 상기결합단백질은사람 IL-1β 및사람 IL-1α에결합하는, 결합단백질. 청구항 3 제1항에있어서, 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 212, 217, 226, 230, 232, 234, 및 236으로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는, 결합단백질. 청구항 4 제1항에있어서, 상기제2의폴리펩타이드쇄가서열번호 215, 218, 228, 231, 233, 235, 및 237로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는, 결합단백질. 청구항 5 제2항에있어서, 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 219 및 221로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는, 결합단백질. 청구항 6 제2항에있어서, 상기제2의폴리펩타이드쇄가서열번호 220 및 222로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는, 결합단백질. 청구항 7 제1항또는제2항에있어서, 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 212의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 215, 228, 231, 233 및 235로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하고 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 217의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 218 및 237로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하며 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 219의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 220의아미노산서열을포함하고 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 221의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 222를포함하고 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 226의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 228, 215, 231, 233, 및 235로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하며 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 230의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 231, 215, 228, 233, 및 235로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하고 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 232의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 233, 215, 228, 231, 및 235로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하며 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 234의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 235, 215, 228, 231, 및 233으로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하고 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 236의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는 - 4 -

5 서열번호 237의아미노산서열을포함하는, 결합단백질. 청구항 8 제7항에있어서, 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 212를포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 215를포함하거나 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 217을포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 218을포함하거나 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 219를포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 220을포함하거나 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 221을포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 222를포함하거나 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 226을포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 228을포함하거나 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 230을포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 231을포함하거나 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 232를포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 233을포함하거나 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 234를포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 235를포함하거나 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 236을포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 237을포함하는, 결합단백질. 청구항 9 제1항또는제2항에있어서, 상기결합단백질이 2개의제1의폴리펩타이드쇄및 2개의제2의폴리펩타이드쇄를포함하는, 결합단백질. 청구항 10 제1항또는제2항에있어서, X1 또는 X2가서열번호 26 내지 57, 233, 224, 및 225로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열인, 결합단백질. 청구항 11 제1항또는제2항에있어서, 상기 Fc 영역이천연의서열 Fc 영역및가변서열 Fc 영역으로이루어진그룹으로부터선택되는, 결합단백질. 청구항 12 제1항또는제2항에있어서, 상기 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 및 IgD로부터의 Fc 영역으로이루어진그룹으로부터선택되는, 결합단백질. 청구항 13 제1항또는제2항에따른결합단백질을포함하고, 면역부착분자, 영상화제 (imaging agent), 치료제및세포독성제로이루어진그룹으로부터선택되는제제를추가로포함하는결합단백질접합체. 청구항 14 제13항에있어서, 상기제제가방사선표지 (radiolabel), 효소, 형광성표지, 발광성표지, 생물발광성표지, 자기표지, 및바이오틴으로이루어진그룹으로부터선택되는영상화제인, 결합단백질접합체

6 청구항 15 제14항에있어서, 상기영상화제가 3 H, 14 C, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I, 177 Lu, 166 Ho, 및 153 Sm으로이루어진그룹으로부터선택되는방사선표지인, 결합단백질접합체. 청구항 16 제13항에있어서, 상기제제가항-대사물질, 알킬화제, 항생제, 성장인자, 사이토킨, 항-혈관형성제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소및세포자멸사제로이루어진그룹으로부터선택되는치료제또는세포독성제인, 결합단백질접합체. 청구항 17 제1항또는제2항에있어서, 상기결합단백질이결정화된결합단백질인, 결합단백질. 청구항 18 제17항에있어서, 상기결정화된결합단백질이담체-미함유약제학적제어방출결정화된 IL-1β 결합단백질인, 결정화된결합단백질. 청구항 19 제18항에있어서, 상기결정화된결합단백질이가용성대응물보다생체내반감기가더큰, 결정화된결합단백질작제물. 청구항 20 제17항에있어서, 상기결정화된결합단백질이생물학적활성을유지하는, 결정화된결합단백질. 청구항 21 (a) 제17항에기재된결정화된결합단백질을포함하는제형, 및성분 (ingredient); 및 (b) 적어도하나의중합체담체를포함하는, 결정화된결합단백질을방출시키기위한조성물. 청구항 22 제21항에있어서, 상기중합체담체가폴리 ( 아크릴산 ), 폴리 ( 시아노아크릴레이트 ), 폴리 ( 아미노산 ), 폴리 ( 무수물 ), 폴리 ( 뎁시펩타이드 ), 폴리 ( 에스테르 ), 폴리 ( 락트산 ), 폴리 ( 락틱-co-글리콜산 ) 또는 PLGA, 폴리 (b-하이드록시부티레이트 ), 폴리 ( 카프로락톤 ), 폴리 ( 디옥사논 ); 폴리 ( 에틸렌글리콜 ), 폴리 (( 하이드록시프로필 ) 메타크릴아미드, 폴리 [( 오가노 ) 포스파젠 ], 폴리 ( 오르토에스테르 ), 폴리 ( 비닐알코올 ), 폴리 ( 비닐피롤리돈 ), 말레산무수물-알킬비닐에테르공중합체, 플루로닉폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로즈및셀룰로즈유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 하이알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산화다당류, 이들의블렌드및공중합체로이루어진그룹중하나이상으로부터선택되는중합체인, 조성물. 청구항 23 제21항에있어서, 상기성분이알부민, 수크로즈, 트레할로즈, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β- 사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌글리콜및폴리에틸렌글리콜로이루어진그룹으로부터선택되는, 조성물. 청구항 24 제1항또는제2항에기재된결합단백질, 및약제학적으로허용되는담체를포함하는약제학적조성물. 청구항 25 제24항에있어서, 적어도하나의추가의제제를추가로포함하는, 약제학적조성물. 청구항 26 제25항에있어서, 상기추가의제제가치료제 ; 영상화제 ; 세포독성제 ; 혈관형성억제제 ; 키나제억제제 ; 동시

7 자극분자차단제 ; 부착분자차단제 ; 항-사이토킨항체또는이의기능성단편 ; 메토트렉세이트 ; 사이클로스포린 ; 라파마이신 ; FK506; 검출가능한표지또는리포터 ; TNF 길항제 ; 항류마티스제 ; 근육이완제 ; 마약 ; 비-스테로이드성소염약물 (NSAID); 진통제 ; 마취제 ; 진정제 ; 국소마취제 ; 신경근차단제 ; 항미생물제 ; 항건선제 ; 코르티코스테로이드 ; 단백동화스테로이드 ; 적혈구형성인자 ; 면역제 ; 면역글로불린 ; 면역억제제 ; 성장호르몬 ; 호르몬대체약물 ; 방사성의약품 ; 항우울제 ; 정신병치료제 ; 자극인자 ; 천식의약 ; 베타작용제 ; 흡입성스테로이드 ; 에피네프린또는이의유사체 ; 사이토킨 ; 및사이토킨길항제로이루어진그룹으로부터선택되는, 약제학적조성물. 청구항 27 제13항에기재된바와같은결합단백질접합체및약제학적으로허용되는담체를포함하는약제학적조성물. 청구항 28 제27항에있어서, 상기결합단백질접합체가방사선표지, 효소, 형광성표지, 발광성표지, 생물발광성표지, 자기표지, 및바이오틴으로이루어진그룹으로부터선택되는영상화제를포함하는, 약제학적조성물. 청구항 29 제28항에있어서, 상기영상화제가 3 H, 14 C, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I, 177 Lu, 166 Ho, 및 153 Sm으로이루어진그룹으로부터선택되는방사선표지인, 약제학적조성물. 청구항 30 제27항에있어서, 상기결합단백질접합체가항-대사제, 알킬화제, 항생제, 성장인자, 사이토킨, 항-혈관형성제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소및세포자멸사제로이루어진그룹으로부터선택되는치료제또는세포독성제를포함하는, 약제학적조성물. 청구항 31 제1항또는제2항에기재된결합단백질의폴리펩타이드쇄아미노산서열을암호화하는뉴클레오타이드서열을포함하는분리된핵산분자. 청구항 32 제31항에따른하나이상의분리된핵산분자를포함하는벡터. 청구항 33 제32항에있어서, 상기벡터가 pcdna, ptt, ptt3, pefbos, pbv, pcdna3.1 TOPO, pef6 TOPO, 및 pbj로이루어진그룹으로부터선택되는, 벡터. 청구항 34 제32항에따른벡터를포함하는숙주세포. 청구항 35 제34항에있어서, 상기숙주세포가원핵세포인, 숙주세포. 청구항 36 제35항에있어서, 상기원핵숙주세포가에스케리키아콜라이 (Escherichia coli) 인, 숙주세포. 청구항 37 제34항에있어서, 상기숙주세포가진핵세포인, 숙주세포. 청구항 38 제37항에있어서, 상기진핵세포가원생생물세포, 동물세포, 식물세포및진균세포로이루어진그룹으로부 - 7 -

8 터선택되는, 숙주세포. 청구항 39 제38항에있어서, 상기진균세포가효모세포인, 숙주세포. 청구항 40 제39항에있어서, 상기효모세포가사카로마이세스세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 인, 숙주세포. 청구항 41 제38항에있어서, 상기동물세포가포유동물세포, 조류세포, 및곤충세포로이루어진그룹으로부터선택되는, 숙주세포. 청구항 42 제41항에있어서, 상기포유동물세포가 CHO 세포또는 COS 세포인, 숙주세포. 청구항 43 제41항에있어서, 상기곤충숙주세포가곤충 Sf9 세포인, 숙주세포. 청구항 44 제34항에기재된숙주세포를, 결합단백질을생산하기에충분한조건하에서배양배지속에서배양함을포함하는, 결합단백질을생산하는방법. 청구항 45 제44항의방법에따라생산되는결합단백질. 청구항 46 사람 IL-1 단백질을, 제1항또는제2항에기재된결합단백질과접촉시켜, 사람 IL-1 단백질활성이감소되도록함을포함하는, 사람 IL-1 활성을감소시키는방법. 청구항 47 IL-1 활성이유해한장애로고생하는사람대상체에서사람 IL-1 활성을감소시키는방법으로서, 상기사람대상체에게제1항또는제2항에기재된결합단백질또는이의결정 (crystal) 을투여함으로써상기사람대상체에서사람 IL-1 활성이감소되도록함을포함하는, IL-1 활성이유해한장애로고생하는사람대상체에서사람 IL-1 활성을감소시키는방법. 청구항 48 IL-1 활성이유해한장애에대해대상체를치료하는방법으로서, 상기대상체에게제1항또는제2항에기재된결합단백질또는이의결정을투여함으로써치료가달성되도록함을포함하는, IL-1 활성이유해한장애에대해대상체를치료하는방법. 청구항 49 제48항에있어서, 상기장애가당뇨병 ; 포도막염 ; 신경병증성통증 ; 골관절염성통증 ; 염증성통증 ; 류마티스관절염 ; 골관절염 ; 소아만성관절염 ; 패혈성관절염 ; 라임관절염 (Lyme arthritis); 건선관절염 ; 반응성관절염 ; 척추관절병 (spondyloarthropathy); 전신홍반루푸스 (SLE); 크론병 (Crohn's disease); 궤양성대장염 ; 염증성장질환 ; 자가면역당뇨병 ; 인슐린의존성진성당뇨병 ; 갑상샘염 ; 천식 ; 알레르기질환 ; 건선 ; 피부염 ; 피부경화증 ; 이식대숙주질환 (graft versus host disease); 장기이식거부 ; 장기이식과관련된급성면역질환 ; 장기이식과관련된만성면역질환, 사르코이드증 (sarcoidosis) ; 죽상경화증 ; 파종성혈관내응고 (DIC); 가와사키병 (Kawasaki's disease); 그레이브병 (Grave's disease); 콩팥증후군 ; 만성피로증후군 ; 베게너육아종증 (Wegener's granulomatosis); 헤노흐-쉔라인자반증 (Henoch-Schoenlein purpurea); 신장의미세 - 8 -

9 혈관염 ; 만성활성간염 ; 자가면역포도막염 ; 패혈쇼크 ; 독성쇼크증후군 ; 패혈증증후군 ; 악액질 ; 전염병 ; 기생충질환 ; 급성횡단성척수염 ; 헌팅턴무도병 ; 파킨슨병 ; 알츠하이머병 ; 뇌졸중 ; 원발성담즙성간경변 ; 용혈성빈혈 ; 악성종양 (malignancy); 심부전 ; 심근경색 ; 애디슨병 (Addison's disease); 산발성다분비선결핍유형 I; 다분비선결핍유형 II ( 슈미트증후군 ); 급성호흡곤란증후군 (ARDS); 탈모증 ; 원형탈모증 ; 혈청반응음성인관절병증 ; 관절병증 ; 라이터질환 (Reiter's disease); 건선관절병증 ; 궤양성대장염관절병증 ; 장병원성윤활막염 ; 클라미디아 ; 예르시니아 (Yersinia) 및살모넬라관련관절병증 ; 척추관절병증 ; 아테롬성질환 / 동맥경화 ; 아토피성알레르기 ; 자가면역수포성질환 ; 보통천포창 ; 낙엽상천포창 ; 유사천포창 ; 선형 IgA 질환 ; 자가면역성용혈성빈혈 ; 쿰즈 (Coombs) 양성용혈성빈혈 ; 후천성악성빈혈 ; 소아악성빈혈 ; 근육통성뇌염 / 로얄프리질환 (Royal Free disease); 만성피부점막칸디다증 ; 거대세포동맥염 (GCA); 원발성경화간염 ; 잠복성자가면역간염 ; 후천성면역결핍증 (AIDS); 후천성면역결핍관련질환 ; B형간염 ; C형간염 ; 일반적인다양한면역결핍증 ( 보통의가변성저감마글로불린혈증 ); 확장성심근병증 ; 여성불임증 ; 난소기능상실 ; 조기폐경 ; 섬유성폐질환 ; 잠복성섬유화폐포염 ; 사후염증성간질성폐질환 ; 간질성폐렴 ; 결합조직질환관련간질성폐질환 ; 혼합된결합조직질환관련폐질환 ; 전신경화증관련된간질성폐질환 ; 류마티스관절염관련간질성폐질환 ; 전신홍반루푸스관련폐질환 ; 피부근육염 / 다발근육염관련폐질환 ; 쇼그렌질환 (Sjoegren's disease) 관련폐질환 ; 강직성척추염관련폐질환 ; 혈관염성확산폐질환 ; 헤모시덴린증관련폐질환 ; 약물유발간질성폐질환 ; 섬유증 ; 방사선섬유증 ; 폐쇄세기관지염 ; 만성호산구성폐렴 ; 림프구침윤성폐질환 ; 감염후간질성폐질환 ; 통풍성관절염 ; 자가면역간염 ; 제1형자가면역간염 ( 전형적자가면역또는루포이드간염 ); 제2형자가면역간염 ( 항-LKM 항체간염 ); 자가면역매개된저혈당증 ; 흑색극세포증을동반한타입 B의인슐린내성 ; 부갑상샘저하증 ; 골관절염 ; 원발성경화담관염 ; 건선 1형 ; 건선 2형 ; 특발성백혈구감소증 ; 자가면역중성구감소증 ; 신장질환 NOS; 사구체신장염 ; 신장의미세혈관염 ; 라임질환 ; 원반모양홍반루푸스 ; 특발성남성불임 ; 질소산화물-관련남성불임 ; 정자자가면역 ; 다발성경화증 (1차진행성 ; 2차진행성 ; 재발완화성을포함한모든하위유형 ); 교감안염 ; 결합조직질환에부수적인폐고혈압 ; 굿패스춰 (Goodpasture) 증후군 ; 결절성다발의폐발현 ; 급성류마티스열 ; 류마티스척추염 ; 스틸병 (Still's disease); 전신경화증 ; 쇼그렌증후군 ; 타카야스 (Takayasu) 병 / 동맥염 ; 자가면역저혈소판증 (AITP); 특발성저혈소판증 ; 자가면역갑상선질환 ; 갑상선기능항진증 ; 갑상선종의자가면역갑상선기능저하증 ( 하시모토병 ); 위축성자가면역갑상선기능저하증 ; 원발성점액수종 ; 수정체성포도막염 ; 원발성혈관염 ; 백반증 ; 급성간질환 ; 만성간질환 ; 알코올성간경변 ; 알코올유발간손상 ; 쓸개즙정체 ; 특이한간질환 ; 약물유발간염 ; 비알콜성지방간염 ; 알레르기 ; 그룹 B 스트렙토코커스 (Streptococci) (GBS) 감염 ; 정신장애 ( 예를들어 ; 우울증및정신분열증 ); Th2 유형및 Th1 유형매개질환 ; 급성및만성통증 ( 통증의상이한형태들 ); 암 ( 예를들어, 폐, 유방, 위, 방광, 결장, 췌장, 난소, 전립선, 및직장암 ); 조혈성악성종양 ; 백혈병 ; 림프종 ; 무베타지방단백혈증 ; 말단청색증 ; 급성및만성기생성또는감염성과정 ; 급성백혈병 ; 급성림프모구백혈병 (ALL); T-세포 ALL; FAB ALL; 급성골수성백혈병 (AML); 급성또는만성세균감염 ; 급성췌장염 ; 급성신부전 ; 아데노암종 (adenocarcinomas); 심방이소성박동 ; AIDS 치매병변군 ; 알코올유도간염 ; 알레르기성결막염 ; 알레르기성접촉피부염 ; 알레르기성비염 ; 동종이식거부 ; 알파-l-안티트립신결핍증 ; 근육위축가쪽경화증 ; 빈혈 ; 협심증 ; 전각세포변성 ; 항-CD3 치료요법 ; 항인지질증후군 ; 항-수용체과민성반응 ; 대동맥및말초동맥류 ; 대동맥박리 ; 동맥고혈압 ; 동맥경화 ; 동정맥루 ; 운동실조증 ; 심방세동 ( 지속성또는발작성 ); 심방조동 (atrial flutter); 심방심실블록 ; B 세포림프종 ; 뼈이식거부 ; 골수이식 (BMT) 거부 ; 번들브랜치블록 (bundle branch block); 버킷림프종 (Burkitt's lymphoma); 화상 ; 심장성부정맥 ; 심장마비증후군 ; 심장종양 ; 심근병증 ; 심폐바이패스염증반응 ; 연골이식거부 ; 소뇌피질변성 ; 소뇌장애 ; 혼란성또는다초점성심방빈맥 ; 화학치료요법관련장애 ; 만성골수구성백혈병 (CML); 만성알코올중독 ; 만성염증성병리 ; 만성림프성백혈병 (CLL); 만성폐쇄성폐질환 (COPD); 만성살리실산의중독 ; 결장직장암종 ; 울혈성심부전 ; 결막염 ; 접촉성피부염 ; 폐심장증 ; 관상동맥질환 ; 크로이츠펠트-야콥병 (Creutzfeldt-Jakob disease); 배양물음성패혈증 ; 낭성섬유증 ; 사이토킨치료요법관련장애 ; 권투선수치매 ; 탈수초병 ; 뎅기열출혈성발열 ; 피부염 ; 피부과병태 ; 진성당뇨병 ; 당뇨병성동맥경화질환 ; 광범위레비소체병 (diffuse Lewy body disease); 확대울혈성심근병증 ; 기저신경절의장애 ; 중년의다운증후군 ; CNS 도파민수용체를차단하는약물에의해유도된약물-유발운동장애 ; 약물민감도 ; 습진 ; 뇌척수염 ; 심내막염 ; 내분비병증 ; 후두개염 ; 엡슈타인-바바이러스감염 (Epstein-Barr virus infection); 지단홍통증 ; 추체외로및소뇌장애 ; 가족성적혈구포식성림프조직구증 ; 태아가슴샘임플란트제거 ; 프리드리히 (Friedreich) 운동실조증 ; 기능성말초동맥장애 ; 진균성패혈증 ; 가스괴저 (gas gangrene); 위궤양 ; 사구체신염 ; 모든장기또는조직의이식거부 ; 그람음성패혈증 ; 그람양성패혈증 ; 세포내유기체로인한육아종 ; 모발세포백혈병 ; 할레르보르덴-스파츠병 (Hallervorden-Spatz disease); 하시모토의갑상샘염 ; 건초열 ; 심장이식거부 ; 혈색소침착증 ; 혈액투석 ; - 9 -

10 용혈성요독성증후군 / 혈전용해성혈소판감소성자반증 ; 뇌출혈 ; A형간염 ; His 번들부정맥 ; HIV 감염 /HIV 신경병증 ; 호지킨병 ; 운동과다장애 ; 과민성반응 ; 과민성폐렴 ; 고혈압 ; 운동과다장애 ; 시상하부-뇌하수체-부신축평가 ; 특발성애디슨병 (Addison's disease); 특발성폐의섬유증 (IPF); 항체매개된세포독성 ; 무력증 ; 유아척추근육위축 ; 대동맥의염증 ; 인플루엔자 a; 이온화방사선노출 ; 홍채섬모체염 / 포도막염 / 시각신경염 ; 허혈-재관류손상 ; 허혈성뇌졸중 ; 소아류마티스관절염 ; 소아척추근육위축 ; 카포시육종 ; 신장이식거부 ; 레지오넬라 ; 리슈만편모충증 ; 나병 ; 피질척수계의병변 ; 지방부종 ; 간이식거부 ; 림프부종 ; 말라리아 ; 악성림프종 ; 악성조직구증 ; 악성흑색종 ; 수막염 ; 수막구균혈증 ; 대사증후군편두통두통 ; 특발성편두통두통 ; 미토콘드리아성멀티시스템장애 ; 혼합된결합조직질환 ; 단클론성감마글로불린병증 ; 다중골수종 ; 다중시스템변성 (Menzel; Dejerine-Thomas; Shy-Drager; and Machado-Joseph); 중증근육무력증 ; 마이코박테리움아비움인트라셀룰라에 ; 마이코박테리움결핵 ; 골수형성이상증후군 ; 심근경색 ; 심근허혈성장애 ; 코인두암종 ; 신생아만성폐질환 ; 신염 ; 콩팥증 ; 신경변성질환 ; 신경성 I 근육위축 ; 호중구감소증발열 ; 비- 호지킨림프종 ; 복부대동맥및이의분지의폐색 ; 폐색성동맥장애 ; OKT3 치료요법 ; 고환염 / 부고환염 ; 고환염 / 정관절제술반전시술 ; 병원처방 ; 골다공증 ; 췌장이식거부 ; 췌장암종 ; 악성종양의신생물딸림증후군 / 고칼슘혈증 ; 부갑상샘이식거부 ; 골반염증성질환 ; 다년생비염 ; 심낭질환 ; 말초죽상경화성질환 ; 말초혈관장애 ; 복막염 ; 악성빈혈 ; 주폐포자충폐렴 ; 폐렴 ; POEMS 증후군 ( 다발신경병, 오가노메갈리, 내분비병증, 단클론감마글로불린증, 및피부변화증후군 ); 후재관류증후군 ; 후펌프증후군 ; 후-MI 심장절개증후군 ; 자간전증 ; 진행성핵상마비 ; 원발성폐고혈압 ; 방사선치료요법 ; 레이노드 (Raynaud) 현상 ; 레이노드질환 ; 레프섬 (Refsum) 질환 ; 일반적인협소한 QRS 빈맥 ; 신장혈관고혈압 ; 재관류손상 ; 제한심근병증 ; 육종 ; 노인무도병 ; 레비소체의노인치매 ; 혈청반응음성관절병증 ; 쇼크 (shock); 낫세포빈혈 ; 피부동종이식거부 ; 피부변화증후군 ; 작은창자이식거부 ; 고형종양 ; 특정부정맥 ; 척추운동장애 ; 척수소뇌변성 ; 연쇄구군근육염 ; 소뇌의구조병변 ; 아급성경화성번뇌염 ; 실신 ; 심혈관계매독 ; 전신아나필락시스 ; 전신염증성반응증후군 ; 전신발병소아류마티스관절염 ; 모세혈관확장증 ; 폐쇄혈전혈관염 ; 혈소판감소 ; 독성 ; 이식 ; 외상 / 출혈 ; 유형 III 과민성반응 ; 유형 IV 과민증 ; 불안정협심증 ; 요독증 ; 요로성패혈증 ; 두드러기 ; 판막심장질환 ; 정맥류 ; 혈관염 ; 정맥질환 ; 정맥혈전증 ; 심실세동 ; 바이러스및진균감염 ; 바이러스성뇌염 / 무균수막염 ; 바이러스- 관련식혈세포성증후군 ; 베르닉케-코르사코프 (Wernicke-Korsakoff) 증후군 ; 윌슨병 (Wilson's disease); 모든장기또는조직의이종이식거부 ; 급성관상동맥증후군 ; 급성특발성의다발신경염 ; 급성염증탈수초다발성신경병증 ; 급성허혈 ; 성인스틸병 ; 원형탈모증 ; 아나필락시스 ; 항인지질항체증후군 ; 재생불량성빈혈 ; 동맥경화 ; 아토피성습진 ; 아토피성피부염 ; 자가면역피부염 ; 스트렙토코커스감염과관련된자가면역장애 ; 자가면역창자병증 ; 자가면역청력손실 ; 자가면역림프구증식증후군 (ALPS); 자가면역심근염 ; 자가면역조기폐경 ; 눈꺼풀염 ; 기관지확장증 ; 수포성유사천포창 ; 심혈관질환 ; 파국적항인지질증후군 ; 복강질환 ; 자궁경부척추증 ; 만성허혈 ; 반흔성유사천포창 ; 다발성경화증에대한위험을갖는임상적으로분리된증후군 (CIS); 결막염 ; 어린시절발병정신장애 ; 누낭염 ; 피부근육염 ; 당뇨병성망막증 ; 디스크이탈증 ; 디스크탈출증 ; 약물유발면역용혈성빈혈 ; 심내막염 ; 자궁내막증 ; 안구내염 ; 상공막염 ; 다형홍반 ; 주요다형홍반 ; 임신성유사천포창 ; 귈라인-바레 (Guillain-Barre) 증후군 (GBS); 건초열 ; 휴즈증후군 ; 특발성파킨슨병 ; 특발성간질성폐렴 ; IgE로인한알레르기 ; 면역용혈성빈혈 ; 봉입체근염 ; 감염성눈염증성질환 ; 염증성탈수초질환 ; 염증성심장질환 ; 염증성신장질환 ; 홍채염 ; 각막염 ; 건조각막결막염 ; 쿠쓰마울 (Kussmaul) 질환또는쿠쓰마울-마이어질환 ; 랜드리마비 ; 랑게르한스세포조직구증 ; 그물울혈반 ; 황반변성 ; 현미경적다발성혈관염 ; 모부스베흐테레프 (Morbus Bechterev); 운동신경세포장애 ; 점막유사천포창 ; 다발성장기부전 ; 중증근육무력증 ; 골수혈성이상증후군 ; 심근염 ; 신경근장애 ; 신경병증 ; 비-A 비-B 형간염 ; 시각신경염 ; 골용해 ; 소수관절 JRA; 말초동맥폐색성질환 (PAOD); 말초혈관장애 (PVD); 말초동맥 ; 질환 (PAD); 정맥염 ; 결절다발동맥염 ( 또는결절동맥주위염 ); 다발연골열 ; 류마티스성다발성근육통 ; 백모증 ; 다관절 JRA; 다내분비선결핍증후근 ; 다발근육염 ; 류마티스성다발성근육통 (PMR); 후-펌프증후군 ; 원발성파킨슨증 ; 2차파킨슨증 ; 전립샘염 ; 순수적혈구세포무형성 ; 원발성부신기능부전 ; 재발성시각신경척수염 ; 재협착 ; 류마티스심장질환 ; SAPHO ( 윤활막염, 여드름, 농포증, 뼈과다증및골염 ); 2차아밀로이드증 ; 쇼크폐 ; 골막염 ; 좌골신경통 ; 2차부신기능부전 ; 실리콘관련된결합조직질환 ; 스네돈-윌킨슨 (Sneddon-Wilkinson) 피부병 ; 강직척추염 ; 스티븐스-존슨 (Stevens-Johnson) 증후군 (SJS); 전신염증성반응증후군 ; 측두동맥염 ; 톡소플라스믹망막염 ; 독성표피괴사용해 ; 횡척수염 ; TRAPS ( 종양괴사인자수용체타입 1 (TNFR) 관련정기증후군 ); 흑색가시세포증을동반한타입 B의인슐린저항성 ; 제1형알레르기반응 ; 제II형당뇨병 ; 두드러기 ; 보통간질성폐렴 (UIP); 봄철결막염 ; 바이러스성망막염 ; 보그트-코야나기-하라다 (Vogt-Koyanagi-Harada) 증후군 (VKH 증후군 ); 습윤황반변성 ; 상처치유 ; 예르시니아및살모넬라관련관절병증으로이루어진그룹으로부터

11 선택되는, 방법. 청구항 50 제48항에있어서, 상기대상체에대한상기투여가비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 기관지내, 복부내 (intraabdominal), 관절낭내, 연골내, 강내 (intracavitary), 복강내 (intracelial), 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내 (intracervical), 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장횡경막내, 복강내, 흉강내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼러스 (bolus), 질, 직장, 볼, 설하, 비강내및경피로부터선택되는적어도하나의방식에의해수행되는, 방법. 청구항 51 제1항또는제2항에기재된결합단백질또는이의결정을제2 제제의투여전에, 제2 제제의투여와동시에또는제2 제제의투여후에투여하는단계를포함하는, IL-1이유해한장애로고통받는환자를치료하는방법으로서, 상기제2 제제는사람 IL-1β에결합할수있는항체, 또는이의단편 ; 사람 IL-1α에결합할수있는항체, 또는이의단편 ; 메토트렉세이트 ; 코르티코스테로이드 ; 베타-작용제 ; 류코트리엔의길항제 ; 류코트리엔수용체의길항제 ; ADVAIR; IgE 억제제 ; 항-IgE 항체 ; XOLAIR; 포스포디에스테라제억제제 ; PDE4 억제제 ; 크산틴 ; 항콜린성약물 ; 비만세포-안정화제 ; 크로몰린 ; IL-4 억제제 ; IL-5 억제제 ; 에오탁신 /CCR3 억제제 ; 히스타민의길항제 ; 히스타민수용체의길항제 ; 프로스타글란딘 D의길항제 ; 수용체 DP1의억제제 ; CRTH2의억제제 ; TNF 길항제 ; TNF 수용체의가용성단편 ; ENBREL; TNF 효소길항제 ; TNF 전환효소 (TACE) 억제제 ; 무스카린성수용체길항제 ; TGF-베타길항제 ; 인터페론감마 ; 페르페니돈 ; 화학요법제, 레플루노미드 ; 시롤리무스 ( 라파마이신 ) 또는이의유사체, CCI-779; COX2 또는 cpla2 억제제 ; 비-스테로이드성소염약물 (NSAID); 면역조절제 ; p38 억제제 ; TPL-2 억제제, MK-2 억제제 ; NFκB 억제제 ; 부데노시드 ; 상피성장인자 ; 사이클로스포린 ; 설파살라진 ; 아미노살리실레이트 ; 6-머캅토푸린 ; 아자티오프린 ; 메트로니다졸 ; 리폭시게나제억제제 ; 메살라민 ; 올살라진 ; 발살라지드 ; 항산화제 ; 트롬복산억제제 ; IL-1 수용체길항제 ; 성장인자 ; 엘라스타제억제제 ; 피리디닐- 이미다졸화합물 ; TNF, LT, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL- 29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, EMAP-II, GM-CSF, FGF, 또는 PDGF의항체또는작용제 ; CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90에대한항체 ; FK506; 마이코페놀레이트모페틸 ; 이부프로펜 ; 프레드니솔론 ; 아데노신작용제 ; 항혈전제 ; 상보체억제제 ; 아드레날린제 ; 키나제억제제 ; IL-1β 전환효소억제제 ; T-세포시그날링억제제 ; 메탈로프로테이나제억제제 ; 안지오텐신전환효소억제제 ; 가용성사이토킨수용체 ; 가용성 p55 TNF 수용체 ; 가용성 p75 TNF 수용체 ; 가용성 IL-1RI; 가용성 IL-1RII; 가용성 IL-6R; 소염성사이토킨 ; IL-4; IL-10; IL-11; 및 TGF-β로이루어진그룹으로부터선택되는, 방법. 청구항 52 6개의 CDR: 하기에정의된바와같은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3를포함하는항원결합도메인을포함하는, 사람 IL-1β에결합할수있는결합단백질 : CDR-H1: X 1 -Y-D-M-S ( 서열번호 190)( 여기서, X 1 은 S, K 또는 R이다 ); CDR-H2: Y-X 2 -S-X 4 -G-G-X 7 -G-T-Y-Y-P-D-X 14 -X 15 -K-G( 서열번호 191)( 여기서, X 2 는 I 또는 V이고 ; X 4 는 S 또는 H이며 ; X 7 은 G 또는 A이고 ; X 14 는 T 또는 S이며 ; X 15 는 V 또는 A이다 ); CDR-H3: G-G-V-X 4 -K-G-X 7 -F-D-X 10 ( 서열번호 192)( 여기서, X 4 는 T 또는 Y이고 ;

12 X 7 은 Y 또는 C이며 ; X 10 은 V, E, L, M, Q, 또는 Y이다 ); CDR-L1: R-A-S-G-N-I-X 7 -X 8 -X 9 -L-X 11 ( 서열번호 193)( 여기서, X 7 은 H, Y, 또는 W이고 ; X 8 은 N, G, T, Q, E, H, D, 또는 K이며 ; X 9 는 Y 또는 W이고 ; X 11 은 T, A, 또는 N이다 ); CDR-L2: X 1 -A-K-X 4 -L-X 6 -X 7 ( 서열번호 194)( 여기서, X 1 은 N, Q, 또는 D이고 ; X 4 는 T, N, I, E, 또는 S이며 ; X 6 은 A, M, 또는 E이고 ; X 7 은 D, E, S, 또는 A이다 ); 및 CDR-L3: Q-X 2 -F-W-X 5 -X 6 -P-X 8 -X 9 ( 서열번호 195)( 여기서, X 2 는 H 또는 Q이고 ; X 5 는 S, N, T, K, R, 또는 M이며 ; X 6 은 I 또는 L이고 ; X 8 은 Y 또는 A이며 ; X 9 는 T, I, 및 N이고 ; 단, CDR-H1이 S-Y-D-M-S ( 서열번호 17) 인경우, CDR-H2는 Y-I-S-S-G-G-G-G-T-Y-Y-P-D-T-V-K-G ( 서열번호 1 8) 일수없으며 ; CDR-H3는 G-G-V-T-K-G-Y-F-D-V ( 서열번호 19) 일수없고 ; CDR-L1은 R-A-S-G-N-I-H-N-Y-L-T ( 서열번호 20) 일수없으며 ; CDR-L2는 N-A-K-T-L-A-D ( 서열번호 21) 일수없고 ; CDR-L3는 Q-H-F-W-S-I-P-Y-T ( 서열번호 22) 일수없다. 청구항 53 제52항에있어서, 적어도하나의 CDR이하기로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는, 결합단백질 :

13 - 13 -

14 - 14 -

15 - 15 -

16 - 16 -

17 - 17 -

18 - 18 -

19 - 19 -

20 - 20 -

21 - 21 -

22 - 22 -

23 - 23 -

24 - 24 -

25 청구항 54 제 52 항에있어서, 적어도 3 개의 CDR 이하기로이루어진 CDR 세트의그룹으로부터선택되는 CDR 의세트로부터기 원하는, 결합단백질 :

26 - 26 -

27 - 27 -

28 - 28 -

29 - 29 -

30 - 30 -

31 - 31 -

32 - 32 -

33 - 33 -

34 - 34 -

35 - 35 -

36 - 36 -

37 - 37 -

38 청구항 55 제 54 항에있어서, 2 개의 CDR 세트로부터의 CDR 을포함하는, 결합단백질

39 청구항 56 제 55 항에있어서, 상기 2 개의 CDR 세트가하기로이루어진그룹으로부터선택되는, 결합단백질 :

40 청구항 57 제52항, 제53항및제56항중의어느한항에있어서, 사람수용체골격을추가로포함하는, 결합단백질. 청구항 58 제57항에있어서, 상기사람수용체골격이서열번호 7 내지 10, 13 내지 16, 25, 240 내지 316, 및 317 내지 381로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는, 결합단백질. 청구항 59 제57항에있어서, 상기사람수용체골격이적어도하나의골격영역아미노산치환을포함하고, 여기서상기골격의아미노산서열이상기사람수용체골격의서열에대해적어도 65% 동일하며상기사람수용체골격과동일한적어도 70개의아미노산잔기를포함하는, 결합단백질. 청구항 60 제57항에있어서, 상기사람수용체골격이키이 (key) 잔기에서적어도하나의골격영역아미노산치환을포함하며, 상기키이잔기는 CDR에인접한잔기 ; 글리코실화부위잔기 ; 드문잔기 (rare residue); 사람 IL-1β와상호작용할수있는잔기 ; CDR과상호작용할수있는잔기 ; 정규잔기 (canonical residue); 중쇄가변영역과경쇄가변영역사이의접촉잔기 ; 베르니에영역 (Vernier zone) 내잔기 ; 및쵸티아 (Chothia)-정의된가변중쇄 CDR1과카밧 (Kabat)-정의된제1의중쇄골격사이에서오버랩되는영역내잔기로이루어진그룹으로부터선택되는, 결합단백질. 청구항 61 제60항에있어서, 카밧번호매김에의한상기키이잔기가 2H, 4H, 24H, 26H, 27H, 29H, 34H, 35H, 37H, 39H, 44H, 45H, 47H, 48H, 49H, 50H, 51H, 58H, 59H, 60H, 63H, 67H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H, 91H, 93H, 94H, 2L, 4L, 25L, 29L, 27bL, 33L, 34L, 36L, 38L, 43L, 44L, 46L, 47L, 48L, 49L, 55L, 58L, 62L, 64L, 71L, 87L, 89L, 90L, 91L, 94L 및 95L로이루어진그룹으로부터선택되는, 결합단백질. 청구항 62 제57항에있어서, 상기결합단백질이컨센서스 (consensus) 사람가변도메인을포함하는, 결합단백질

41 청구항 63 제52항, 제53항및제56항중의어느한항에있어서, 상기결합단백질이서열번호 60 내지 189로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을갖는적어도하나의가변도메인을포함하는, 결합단백질. 청구항 64 제63항에있어서, 상기결합단백질이 2개의가변도메인을포함하는, 결합단백질. 청구항 65 제64항에있어서, 상기 2개의가변도메인이하기로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는, 결합단백질 :

42 청구항 66 제52항, 제53항및제56항중의어느한항에있어서, 상기결합단백질이 IL-1의생물학적기능을조절할수있는, 결합단백질. 청구항 67 제52항, 제53항및제56항중의어느한항에있어서, 상기결합단백질이 IL-1을중화시킬수있는, 결합단백질. 청구항 68 제52항, 제53항및제56항중의어느한항에있어서, 상기결합단백질이표면플라스몬공명에의해측정된것으로서, 적어도약 10 2 M -1 s -1 ; 적어도약 10 3 M -1 s -1 ; 적어도약 10 4 M -1 s -1 ; 적어도약 10 5 M -1 s -1 ; 및적어도약 10 6 M -1 s -1 로이루어진그룹으로부터선택되는 IL-1β에대한결합속도상수 (on rate constant; K on ) 를갖는, 결합단백질

43 청구항 69 제52항, 제53항및제56항중어느한항에있어서, 상기결합단백질이표면플라스몬공명에의해측정된것으로서, 약 10-3 s -1 이하 ; 약 10-4 s -1 이하 ; 약 10-5 s -1 이하 ; 및약 10-6 s -1 이하로이루어진그룹으로부터선택되는 IL-1β에대한해리속도상수 (K off ) 를갖는, 결합단백질. 청구항 70 제 52 항, 제 53 항및제 56 항중의어느한항에있어서, 상기결합단백질이약 10-7 M 이하 ; 약 10-8 M 이하 ; 약 10-9 M 이하 ; 약 M 이하 ; 약 M 이하 ; 약 M 이하 ; 및 M 이하로이루어진그룹으로부터선택 되는 IL-1β 에대한해리상수 (K D ) 를갖는, 결합단백질. 청구항 71 제52항에기재된결합단백질을포함하고, 링커또는면역글로불린불변도메인을추가로포함하는 IL-1β 결합단백질작제물. 청구항 72 제71항에있어서, 상기 IL-1β 결합단백질이면역글로불린분자, 이황화물연결된 Fv, 단클론항체, scfv, 키메라항체, CDR-이식된항체, 디아바디 (diabody), 사람화된항체, 다중특이적항체, Fab, 이중특이적항체, Fab', 이특이적항체, 및 F(ab') 2, DVD-Ig TM 및 Fv로이루어진그룹으로부터선택되는, IL-1β 결합단백질작제물. 청구항 73 제71항에있어서, 상기 IL-1β 결합단백질작제물이, 사람 IgM 불변도메인, 사람 IgG4 불변도메인, 사람 IgG1 불변도메인, 사람 IgE 불변도메인, 사람 IgG2 불변도메인, 및사람 IgG3 불변도메인, 및사람 IgA 불변도메인으로이루어진그룹으로부터선택되는중쇄면역글로불린불변도메인을포함하는, IL-1β 결합단백질작제물. 청구항 74 제71항에있어서, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 및서열번호 6으로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을갖는면역글로불린불변도메인을포함하는, IL-1β 결합단백질작제물. 청구항 75 제71항에기재된 IL-1β 결합단백질작제물을포함하고, 면역부착분자, 영상화제, 치료제및세포독성제로이루어진그룹으로부터선택되는제제를추가로포함하는, IL-1β 결합단백질접합체. 청구항 76 제75항에있어서, 상기제제가방사선표지, 효소, 형광성표지, 발광성표지, 생물발광성표지, 자기표지, 및바이오틴으로이루어진그룹으로부터선택되는영상화제인, IL-1β 결합단백질접합체. 청구항 77 제76항에있어서, 상기방사선표지가 3 H, 14 C, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I, 177 Lu, 166 Ho, 및 153 Sm으로이루어진그룹으로부터선택되는, IL-1β 결합단백질접합체. 청구항 78 제75항에있어서, 상기제제가항-대사물질, 알킬화제, 항생제, 성장인자, 사이토킨, 항-혈관형성제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소및세포자멸사제로이루어진그룹으로부터선택되는치료제또는세포독성제인, IL-1β 결합단백질접합체

44 청구항 79 제71항에있어서, 상기결합단백질이사람글리코실화패턴을보유하는, IL-1β 결합단백질작제물. 청구항 80 제52항에있어서, 상기결합단백질이결정화된결합단백질인, IL-1β 결합단백질. 청구항 81 제71항에있어서, 상기 IL-1β 결합단백질작제물이결정화된 IL-1β 결합단백질작제물인, IL-1β 결합단백질작제물. 청구항 82 제75항에있어서, 상기 IL-1β 결합단백질접합체가결정화된결합단백질인, IL-1β 결합단백질접합체. 청구항 83 제80항에있어서, 상기결정화된 IL-1β 결합단백질이담체-비함유약제학적제어방출형결정화된 IL-1β 결합단백질인, 결정화된 IL-1β 결합단백질. 청구항 84 제81항에있어서, 상기결정화된 IL-1β 결합단백질작제물이담체-비함유약제학적제어방출형결정화된 IL- 1β 결합단백질작제물인, 결정화된 IL-1β 결합단백질작제물. 청구항 85 제82항에있어서, 상기결정화된 IL-1β 결합단백질접합체가담체-비함유약제학적제어방출형결정화된 IL- 1β 결합단백질접합체인, 결정화된 IL-1β 결합단백질접합체. 청구항 86 제80항에있어서, 상기결정화된 IL-1β 결합단백질이가용성대응물보다생체내반감기가더큰, 결정화된 IL-1β 결합단백질. 청구항 87 제81항에있어서, 상기결정화된 IL-1β 결합단백질작제물이, 가용성대응물보다더큰생체내반감기를갖는, IL-1β 결합단백질작제물. 청구항 88 제82항에있어서, 상기결정화된 IL-1β 결합단백질접합체가, 가용성대응물보다더큰생체내반감기를갖는, 결정화된 IL-1β 결합단백질접합체. 청구항 89 제80항에있어서, 상기결정화된 IL-1β 결합단백질이생물학적활성을유지하는, 결정화된 IL-1β 결합단백질. 청구항 90 제81항에있어서, 상기결정화된 IL-1β 결합단백질작제물이생물학적활성을유지하는, 결정화된 IL-1β 결합단백질작제물. 청구항 91 제82항에있어서, 상기결정화된 IL-1β 결합단백질접합체가생물학적활성을유지하는, 결정화된 IL-1β 결합단백질접합체

45 청구항 92 (a) 제80항에따른결정화된 IL-1β 결합단백질, 제81항에따른결정화된 IL-1β 결합단백질작제물, 또는제 82항에따른결정화된 IL-1β 결합단백질접합체, 및성분 (ingredient) 을포함하는제형 ; 및 (b) 적어도하나의중합체담체를포함하는, 제80항에따른결정화된 IL-1β 결합단백질, 제81항에따른결정화된 IL-1β 결합단백질작제물, 또는제82항에따른결정화된 IL-1β 결합단백질접합체를방출시키기위한조성물. 청구항 93 제92항에있어서, 상기중합체담체가폴리 ( 아크릴산 ), 폴리 ( 시아노아크릴레이트 ), 폴리 ( 아미노산 ), 폴리 ( 무수물 ), 폴리 ( 뎁시펩타이드 ), 폴리 ( 에스테르 ), 폴리 ( 락트산 ), 폴리 ( 락틱-co-글리콜산 ) 또는 PLGA, 폴리 (b-하이드록시부티레이트 ), 폴리 ( 카프로락톤 ), 폴리 ( 디옥사논 ); 폴리 ( 에틸렌글리콜 ), 폴리 (( 하이드록시프로필 ) 메타크릴아미드, 폴리 [( 오가노 ) 포스파젠 ], 폴리 ( 오르토에스테르 ), 폴리 ( 비닐알코올 ), 폴리 ( 비닐피롤리돈 ), 말레산무수물-알킬비닐에테르공중합체, 플루로닉폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로즈및셀룰로즈유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 하이알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산화다당류, 이들의블렌드및공중합체로이루어진그룹중하나이상으로부터선택되는중합체인, 조성물. 청구항 94 제92항에있어서, 상기성분이알부민, 수크로즈, 트레할로즈, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β- 사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌글리콜및폴리에틸렌글리콜로이루어진그룹으로부터선택되는, 조성물. 청구항 95 제52항에기재된결합단백질, 및약제학적으로허용되는담체를포함하는약제학적조성물. 청구항 96 제95항에있어서, 적어도하나의추가의제제를추가로포함하는, 약제학적조성물. 청구항 97 제96항에있어서, 상기추가의제제가치료제 ; 영상화제 ; 세포독성제 ; 혈관형성억제제 ; 키나제억제제 ; 동시- 자극분자차단제 ; 부착분자차단제 ; 항-사이토킨항체또는이의기능성단편 ; 메토트렉세이트 ; 사이클로스포린 ; 라파마이신 ; FK506; 검출가능한표지또는리포터 ; TNF 길항제 ; 항류마티스제 ; 근육이완제, 마약, 비-스테로이드성소염약물 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소마취제, 신경근차단제, 항미생물제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 단백동화스테로이드, 적혈구형성인자, 면역제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장호르몬, 호르몬대체약물, 방사성의약품, 항우울제, 정신병치료제, 자극인자, 천식의약, 베타작용제, 흡입성스테로이드, 에피네프린또는이의유사체, 사이토킨, 및사이토킨길항제로이루어진그룹으로부터선택되는, 약제학적조성물. 청구항 98 제75항에기재된 IL-1β 결합단백질접합체및약제학적으로허용되는담체를포함하는약제학적조성물. 청구항 99 제98항에있어서, IL-1β 결합단백질접합체가방사선표지, 효소, 형광성표지, 발광성표지, 생물발광성표지, 자기표지, 및바이오틴으로이루어진그룹으로부터선택되는영상화제를포함하는, 약제학적조성물. 청구항 100 제 99 항에있어서, 상기영상화제가 3 H, 14 C, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I, 177 Lu, 166 Ho, 및 153 Sm 으로이루어진 그룹으로부터선택되는방사선표지인, 약제학적조성물. 청구항

46 제98항에있어서, 상기 IL-1β 결합단백질접합제가항-대사물질, 알킬화제, 항생제, 성장인자, 사이토킨, 항 -혈관형성제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소및세포자멸사제로이루어진그룹으로부터선택되는치료제또는세포독성제를포함하는, 약제학적조성물. 청구항 102 제52항에기재된 IL-1β 결합단백질의아미노산서열을암호화하는분리된핵산. 청구항 103 제102항에따른분리된핵산을포함하는벡터. 청구항 104 제103항에있어서, 상기벡터가 pcdna, ptt, ptt3, pefbos, pbv, pjv, 및 pbj로이루어진그룹으로부터선택되는, 벡터. 청구항 105 제103항에따른벡터를포함하는숙주세포. 청구항 106 제105항에있어서, 상기숙주세포가원핵세포인, 숙주세포. 청구항 107 제106항에있어서, 상기원핵숙주세포가에스케리키아콜라이인, 숙주세포. 청구항 108 제105항에있어서, 상기숙주세포가진핵세포인, 숙주세포. 청구항 109 제108항에있어서, 상기진핵세포가원생생물세포, 동물세포, 식물세포및진균세포로이루어진그룹으로부터선택되는, 숙주세포. 청구항 110 제109항에있어서, 상기진균세포가효모세포인, 숙주세포. 청구항 111 제110항에있어서, 상기효모세포가사카로마이세스세레지아에인, 숙주세포. 청구항 112 제109항에있어서, 상기동물세포가포유동물세포, 조류세포, 및곤충세포로이루어진그룹으로부터선택되는, 숙주세포. 청구항 113 제112항에있어서, 상기포유동물세포가 CHO 세포또는 COS 세포인, 숙주세포. 청구항 114 제112항에있어서, 상기곤충숙주세포가곤충 Sf9 세포인, 숙주세포. 청구항 115 제105항에기재된숙주세포를, IL-1β 결합단백질을생산하기에충분한조건하에서배양배지속에서배양함을포함하는, IL-1β 결합단백질을생산하는방법

47 청구항 116 제115항의방법에따라생산된 IL-1β 결합단백질. 청구항 117 사람 IL-1 단백질을제52항에기재된결합단백질과접촉시켜, 사람 IL-1 단백질활성이감소되도록함을포함하는, 사람 IL-1 활성을감소시키는방법. 청구항 118 IL-1 활성이유해한장애로고생하는사람대상체에서사람 IL-1 활성을감소시키는방법으로서, 상기사람대상체에게제52항에기재된결합단백질을투여함으로써상기사람대상체에서사람 IL-1 활성이감소되도록함을포함하는, IL-1 활성이유해한장애로고생하는사람대상체에서사람 IL-1 활성을감소시키는방법. 청구항 119 IL-1 활성이유해한장애에대해대상체를치료하는방법으로서, 상기대상체에게제52항에기재된결합단백질또는이의결정을투여함으로써치료가달성되도록함을포함하는, IL-1 활성이유해한장애에대해대상체를치료하는방법. 청구항 120 제119항에있어서, 상기장애가당뇨병 ; 포도막염 ; 신경병증성통증 ; 골관절염성통증 ; 염증성통증 ; 류마티스관절염 ; 골관절염 ; 소아만성관절염 ; 패혈성관절염 ; 라임관절염 (Lyme arthritis); 건선관절염 ; 반응성관절염 ; 척추관절병 (spondyloarthropathy); 전신홍반루푸스 (SLE); 크론병 (Crohn's disease); 궤양성대장염 ; 염증성장질환 ; 자가면역당뇨병 ; 인슐린의존성진성당뇨병 ; 갑상샘염 ; 천식 ; 알레르기질환 ; 건선 ; 피부염 ; 피부경화증 ; 이식대숙주질환 (graft versus host disease); 장기이식거부 ; 장기이식과관련된급성면역질환 ; 장기이식과관련된만성면역질환, 사르코이드증 (sarcoidosis) ; 죽상경화증 ; 파종성혈관내응고 (DIC); 가와사키병 (Kawasaki's disease); 그레이브병 (Grave's disease); 콩팥증후군 ; 만성피로증후군 ; 베게너육아종증 (Wegener's granulomatosis); 헤노흐-쉔라인자반증 (Henoch-Schoenlein purpurea); 신장의미세혈관염 ; 만성활성간염 ; 자가면역포도막염 ; 패혈쇼크 ; 독성쇼크증후군 ; 패혈증증후군 ; 악액질 ; 전염병 ; 기생충질환 ; 급성횡단성척수염 ; 헌팅턴무도병 ; 파킨슨병 ; 알츠하이머병 ; 뇌졸중 ; 원발성담즙성간경변 ; 용혈성빈혈 ; 악성종양 (malignancy); 심부전 ; 심근경색 ; 애디슨병 (Addison's disease); 산발성다분비선결핍유형 I; 다분비선결핍유형 II ( 슈미트증후군 ); 급성호흡곤란증후군 (ARDS); 탈모증 ; 원형탈모증 ; 혈청반응음성인관절병증 ; 관절병증 ; 라이터질환 (Reiter's disease); 건선관절병증 ; 궤양성대장염관절병증 ; 장병원성윤활막염 ; 클라미디아 ; 예르시니아 (Yersinia) 및살모넬라관련관절병증 ; 척추관절병증 ; 아테롬성질환 / 동맥경화 ; 아토피성알레르기 ; 자가면역수포성질환 ; 보통천포창 ; 낙엽상천포창 ; 유사천포창 ; 선형 IgA 질환 ; 자가면역성용혈성빈혈 ; 쿰즈 (Coombs) 양성용혈성빈혈 ; 후천성악성빈혈 ; 소아악성빈혈 ; 근육통성뇌염 / 로얄프리질환 (Royal Free disease); 만성피부점막칸디다증 ; 거대세포동맥염 (GCA); 원발성경화간염 ; 잠복성자가면역간염 ; 후천성면역결핍증 (AIDS); 후천성면역결핍관련질환 ; B형간염 ; C형간염 ; 일반적인다양한면역결핍증 ( 보통의가변성저감마글로불린혈증 ); 확장성심근병증 ; 여성불임증 ; 난소기능상실 ; 조기폐경 ; 섬유성폐질환 ; 잠복성섬유화폐포염 ; 사후염증성간질성폐질환 ; 간질성폐렴 ; 결합조직질환관련간질성폐질환 ; 혼합된결합조직질환관련폐질환 ; 전신경화증관련된간질성폐질환 ; 류마티스관절염관련간질성폐질환 ; 전신홍반루푸스관련폐질환 ; 피부근육염 / 다발근육염관련폐질환 ; 쇼그렌질환 (Sjoegren's disease) 관련폐질환 ; 강직성척추염관련폐질환 ; 혈관염성확산폐질환 ; 헤모시덴린증관련폐질환 ; 약물유발간질성폐질환 ; 섬유증 ; 방사선섬유증 ; 폐쇄세기관지염 ; 만성호산구성폐렴 ; 림프구침윤성폐질환 ; 감염후간질성폐질환 ; 통풍성관절염 ; 자가면역간염 ; 제1형자가면역간염 ( 전형적자가면역또는루포이드간염 ); 제2형자가면역간염 ( 항-LKM 항체간염 ); 자가면역매개된저혈당증 ; 흑색극세포증을동반한타입 B의인슐린내성 ; 부갑상샘저하증 ; 골관절염 ; 원발성경화담관염 ; 건선 1형 ; 건선 2형 ; 특발성백혈구감소증 ; 자가면역중성구감소증 ; 신장질환 NOS; 사구체신장염 ; 신장의미세혈관염 ; 라임질환 ; 원반모양홍반루푸스 ; 특발성남성불임 ; 질소산화물-관련남성불임 ; 정자자가면역 ; 다발성경화증 (1차진행성 ; 2차진행성 ; 재발완화성을포함한모든하위유형 ); 교감안염 ; 결합조직질환에부수적인폐고혈압 ; 굿패스춰 (Goodpasture) 증후군 ; 결절성다발의폐발현 ; 급성류마티스열 ; 류마티스척추염 ; 스틸병

48 (Still's disease); 전신경화증 ; 쇼그렌증후군 ; 타카야스 (Takayasu) 병 / 동맥염 ; 자가면역저혈소판증 (AITP); 특발성저혈소판증 ; 자가면역갑상선질환 ; 갑상선기능항진증 ; 갑상선종의자가면역갑상선기능저하증 ( 하시모토병 ); 위축성자가면역갑상선기능저하증 ; 원발성점액수종 ; 수정체성포도막염 ; 원발성혈관염 ; 백반증 ; 급성간질환 ; 만성간질환 ; 알코올성간경변 ; 알코올유발간손상 ; 쓸개즙정체 ; 특이한간질환 ; 약물유발간염 ; 비알콜성지방간염 ; 알레르기 ; 그룹 B 스트렙토코커스 (Streptococci) (GBS) 감염 ; 정신장애 ( 예를들어 ; 우울증및정신분열증 ); Th2 유형및 Th1 유형매개질환 ; 급성및만성통증 ( 통증의상이한형태들 ); 암 ( 예를들어, 폐, 유방, 위, 방광, 결장, 췌장, 난소, 전립선, 및직장암 ); 조혈성악성종양 ; 백혈병 ; 림프종 ; 무베타지방단백혈증 ; 말단청색증 ; 급성및만성기생성또는감염성과정 ; 급성백혈병 ; 급성림프모구백혈병 (ALL); T-세포 ALL; FAB ALL; 급성골수성백혈병 (AML); 급성또는만성세균감염 ; 급성췌장염 ; 급성신부전 ; 아데노암종 (adenocarcinomas); 심방이소성박동 ; AIDS 치매병변군 ; 알코올유도간염 ; 알레르기성결막염 ; 알레르기성접촉피부염 ; 알레르기성비염 ; 동종이식거부 ; 알파-l-안티트립신결핍증 ; 근육위축가쪽경화증 ; 빈혈 ; 협심증 ; 전각세포변성 ; 항-CD3 치료요법 ; 항인지질증후군 ; 항-수용체과민성반응 ; 대동맥및말초동맥류 ; 대동맥박리 ; 동맥고혈압 ; 동맥경화 ; 동정맥루 ; 운동실조증 ; 심방세동 ( 지속성또는발작성 ); 심방조동 (atrial flutter); 심방심실블록 ; B 세포림프종 ; 뼈이식거부 ; 골수이식 (BMT) 거부 ; 번들브랜치블록 (bundle branch block); 버킷림프종 (Burkitt's lymphoma); 화상 ; 심장성부정맥 ; 심장마비증후군 ; 심장종양 ; 심근병증 ; 심폐바이패스염증반응 ; 연골이식거부 ; 소뇌피질변성 ; 소뇌장애 ; 혼란성또는다초점성심방빈맥 ; 화학치료요법관련장애 ; 만성골수구성백혈병 (CML); 만성알코올중독 ; 만성염증성병리 ; 만성림프성백혈병 (CLL); 만성폐쇄성폐질환 (COPD); 만성살리실산의중독 ; 결장직장암종 ; 울혈성심부전 ; 결막염 ; 접촉성피부염 ; 폐심장증 ; 관상동맥질환 ; 크로이츠펠트-야콥병 (Creutzfeldt-Jakob disease); 배양물음성패혈증 ; 낭성섬유증 ; 사이토킨치료요법관련장애 ; 권투선수치매 ; 탈수초병 ; 뎅기열출혈성발열 ; 피부염 ; 피부과병태 ; 진성당뇨병 ; 당뇨병성동맥경화질환 ; 광범위레비소체병 (diffuse Lewy body disease); 확대울혈성심근병증 ; 기저신경절의장애 ; 중년의다운증후군 ; CNS 도파민수용체를차단하는약물에의해유도된약물-유발운동장애 ; 약물민감도 ; 습진 ; 뇌척수염 ; 심내막염 ; 내분비병증 ; 후두개염 ; 엡슈타인-바바이러스감염 (Epstein-Barr virus infection); 지단홍통증 ; 추체외로및소뇌장애 ; 가족성적혈구포식성림프조직구증 ; 태아가슴샘임플란트제거 ; 프리드리히 (Friedreich) 운동실조증 ; 기능성말초동맥장애 ; 진균성패혈증 ; 가스괴저 (gas gangrene); 위궤양 ; 사구체신염 ; 모든장기또는조직의이식거부 ; 그람음성패혈증 ; 그람양성패혈증 ; 세포내유기체로인한육아종 ; 모발세포백혈병 ; 할레르보르덴-스파츠병 (Hallervorden-Spatz disease); 하시모토의갑상샘염 ; 건초열 ; 심장이식거부 ; 혈색소침착증 ; 혈액투석 ; 용혈성요독성증후군 / 혈전용해성혈소판감소성자반증 ; 뇌출혈 ; A형간염 ; His 번들부정맥 ; HIV 감염 /HIV 신경병증 ; 호지킨병 ; 운동과다장애 ; 과민성반응 ; 과민성폐렴 ; 고혈압 ; 운동과다장애 ; 시상하부-뇌하수체-부신축평가 ; 특발성애디슨병 (Addison's disease); 특발성폐의섬유증 (IPF); 항체매개된세포독성 ; 무력증 ; 유아척추근육위축 ; 대동맥의염증 ; 인플루엔자 a; 이온화방사선노출 ; 홍채섬모체염 / 포도막염 / 시각신경염 ; 허혈-재관류손상 ; 허혈성뇌졸중 ; 소아류마티스관절염 ; 소아척추근육위축 ; 카포시육종 ; 신장이식거부 ; 레지오넬라 ; 리슈만편모충증 ; 나병 ; 피질척수계의병변 ; 지방부종 ; 간이식거부 ; 림프부종 ; 말라리아 ; 악성림프종 ; 악성조직구증 ; 악성흑색종 ; 수막염 ; 수막구균혈증 ; 대사증후군편두통두통 ; 특발성편두통두통 ; 미토콘드리아성멀티시스템장애 ; 혼합된결합조직질환 ; 단클론성감마글로불린병증 ; 다중골수종 ; 다중시스템변성 (Menzel; Dejerine-Thomas; Shy-Drager; and Machado-Joseph); 중증근육무력증 ; 마이코박테리움아비움인트라셀룰라에 ; 마이코박테리움결핵 ; 골수형성이상증후군 ; 심근경색 ; 심근허혈성장애 ; 코인두암종 ; 신생아만성폐질환 ; 신염 ; 콩팥증 ; 신경변성질환 ; 신경성 I 근육위축 ; 호중구감소증발열 ; 비- 호지킨림프종 ; 복부대동맥및이의분지의폐색 ; 폐색성동맥장애 ; OKT3 치료요법 ; 고환염 / 부고환염 ; 고환염 / 정관절제술반전시술 ; 병원처방 ; 골다공증 ; 췌장이식거부 ; 췌장암종 ; 악성종양의신생물딸림증후군 / 고칼슘혈증 ; 부갑상샘이식거부 ; 골반염증성질환 ; 다년생비염 ; 심낭질환 ; 말초죽상경화성질환 ; 말초혈관장애 ; 복막염 ; 악성빈혈 ; 주폐포자충폐렴 ; 폐렴 ; POEMS 증후군 ( 다발신경병, 오가노메갈리, 내분비병증, 단클론감마글로불린증, 및피부변화증후군 ); 후재관류증후군 ; 후펌프증후군 ; 후-MI 심장절개증후군 ; 자간전증 ; 진행성핵상마비 ; 원발성폐고혈압 ; 방사선치료요법 ; 레이노드 (Raynaud) 현상 ; 레이노드질환 ; 레프섬 (Refsum) 질환 ; 일반적인협소한 QRS 빈맥 ; 신장혈관고혈압 ; 재관류손상 ; 제한심근병증 ; 육종 ; 노인무도병 ; 레비소체의노인치매 ; 혈청반응음성관절병증 ; 쇼크 (shock); 낫세포빈혈 ; 피부동종이식거부 ; 피부변화증후군 ; 작은창자이식거부 ; 고형종양 ; 특정부정맥 ; 척추운동장애 ; 척수소뇌변성 ; 연쇄구군근육염 ; 소뇌의구조병변 ; 아급성경화성번뇌염 ; 실신 ; 심혈관계매독 ; 전신아나필락시스 ; 전신염증성반응증후군 ; 전신발병소아류마티스관절염 ; 모세혈관확장증 ; 폐쇄혈전혈관염 ; 혈소판감소 ; 독성 ; 이식 ; 외상 / 출혈 ; 유형

49 III 과민성반응 ; 유형 IV 과민증 ; 불안정협심증 ; 요독증 ; 요로성패혈증 ; 두드러기 ; 판막심장질환 ; 정맥류 ; 혈관염 ; 정맥질환 ; 정맥혈전증 ; 심실세동 ; 바이러스및진균감염 ; 바이러스성뇌염 / 무균수막염 ; 바이러스- 관련식혈세포성증후군 ; 베르닉케-코르사코프 (Wernicke-Korsakoff) 증후군 ; 윌슨병 (Wilson's disease); 모든장기또는조직의이종이식거부 ; 급성관상동맥증후군 ; 급성특발성의다발신경염 ; 급성염증탈수초다발성신경병증 ; 급성허혈 ; 성인스틸병 ; 원형탈모증 ; 아나필락시스 ; 항인지질항체증후군 ; 재생불량성빈혈 ; 동맥경화 ; 아토피성습진 ; 아토피성피부염 ; 자가면역피부염 ; 스트렙토코커스감염과관련된자가면역장애 ; 자가면역창자병증 ; 자가면역청력손실 ; 자가면역림프구증식증후군 (ALPS); 자가면역심근염 ; 자가면역조기폐경 ; 눈꺼풀염 ; 기관지확장증 ; 수포성유사천포창 ; 심혈관질환 ; 파국적항인지질증후군 ; 복강질환 ; 자궁경부척추증 ; 만성허혈 ; 반흔성유사천포창 ; 다발성경화증에대한위험을갖는임상적으로분리된증후군 (CIS); 결막염 ; 어린시절발병정신장애 ; 누낭염 ; 피부근육염 ; 당뇨병성망막증 ; 디스크이탈증 ; 디스크탈출증 ; 약물유발면역용혈성빈혈 ; 심내막염 ; 자궁내막증 ; 안구내염 ; 상공막염 ; 다형홍반 ; 주요다형홍반 ; 임신성유사천포창 ; 귈라인-바레 (Guillain-Barre) 증후군 (GBS); 건초열 ; 휴즈증후군 ; 특발성파킨슨병 ; 특발성간질성폐렴 ; IgE로인한알레르기 ; 면역용혈성빈혈 ; 봉입체근염 ; 감염성눈염증성질환 ; 염증성탈수초질환 ; 염증성심장질환 ; 염증성신장질환 ; 홍채염 ; 각막염 ; 건조각막결막염 ; 쿠쓰마울 (Kussmaul) 질환또는쿠쓰마울-마이어질환 ; 랜드리마비 ; 랑게르한스세포조직구증 ; 그물울혈반 ; 황반변성 ; 현미경적다발성혈관염 ; 모부스베흐테레프 (Morbus Bechterev); 운동신경세포장애 ; 점막유사천포창 ; 다발성장기부전 ; 중증근육무력증 ; 골수혈성이상증후군 ; 심근염 ; 신경근장애 ; 신경병증 ; 비-A 비-B 형간염 ; 시각신경염 ; 골용해 ; 소수관절 JRA; 말초동맥폐색성질환 (PAOD); 말초혈관장애 (PVD); 말초동맥 ; 질환 (PAD); 정맥염 ; 결절다발동맥염 ( 또는결절동맥주위염 ); 다발연골열 ; 류마티스성다발성근육통 ; 백모증 ; 다관절 JRA; 다내분비선결핍증후근 ; 다발근육염 ; 류마티스성다발성근육통 (PMR); 후-펌프증후군 ; 원발성파킨슨증 ; 2차파킨슨증 ; 전립샘염 ; 순수적혈구세포무형성 ; 원발성부신기능부전 ; 재발성시각신경척수염 ; 재협착 ; 류마티스심장질환 ; SAPHO ( 윤활막염, 여드름, 농포증, 뼈과다증및골염 ); 2차아밀로이드증 ; 쇼크폐 ; 골막염 ; 좌골신경통 ; 2차부신기능부전 ; 실리콘관련된결합조직질환 ; 스네돈-윌킨슨 (Sneddon-Wilkinson) 피부병 ; 강직척추염 ; 스티븐스-존슨 (Stevens-Johnson) 증후군 (SJS); 전신염증성반응증후군 ; 측두동맥염 ; 톡소플라스믹망막염 ; 독성표피괴사용해 ; 횡척수염 ; TRAPS ( 종양괴사인자수용체타입 1 (TNFR) 관련정기증후군 ); 흑색가시세포증을동반한타입 B의인슐린저항성 ; 제1형알레르기반응 ; 제II형당뇨병 ; 두드러기 ; 보통간질성폐렴 (UIP); 봄철결막염 ; 바이러스성망막염 ; 보그트-코야나기-하라다 (Vogt-Koyanagi-Harada) 증후군 (VKH 증후군 ); 습윤황반변성 ; 상처치유 ; 예르시니아및살모넬라관련관절병증으로이루어진그룹으로부터선택되는, 방법. 청구항 121 제119항에있어서, 상기대상체에대한투여가비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 기관지내, 복부내, 관절낭내, 연골내, 강내, 복강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장횡경막내, 복강내, 흉강내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼러스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내및경피로부터선택되는적어도하나의방식에의해수행되는, 방법. 청구항 122 제52항에기재된결합단백질또는이의결정을제2 제제의투여전에, 제2 제제의투여와동시에또는제2 제제의투여후에투여하는단계를포함하는, IL-1이유해한장애로고통받는환자를치료하는방법으로서, 상기제2 제제는사람 IL-1β에결합할수있는항체, 또는이의단편 ; 사람 IL-1α에결합할수있는항체, 또는이의단편 ; 메토트렉세이트 ; 코르티코스테로이드 ; 베타-작용제 ; 류코트리엔의길항제 ; 류코트리엔수용체의길항제 ; ADVAIR; IgE 억제제 ; 항-IgE 항체 ; XOLAIR; 포스포디에스테라제억제제 ; PDE4 억제제 ; 크산틴 ; 항콜린성약물 ; 비만세포-안정화제 ; 크로몰린 ; IL-4 억제제 ; IL-5 억제제 ; 에오탁신 /CCR3 억제제 ; 히스타민의길항제 ; 히스타민수용체의길항제 ; 프로스타글란딘 D의길항제 ; 수용체 DP1의억제제 ; CRTH2의억제제 ; TNF 길항제 ; TNF 수용체의가용성단편 ; ENBREL; TNF 효소길항제 ; TNF 전환효소 (TACE) 억제제 ; 무스카린성수용체길항제 ; TGF-베타길항제 ; 인터페론감마 ; 페르페니돈 ; 화학요법제, 레플루노미드 ; 시롤리무스 ( 라파마이신 ) 또는이의유사체, CCI-779; COX2 또는 cpla2 억제제 ; 항-스테로이드소염약물 (NSAID); 면역조절제 ; p38 억제제 ; TPL-2 억제제, MK-2 억제제 ; NFκB 억제제 ; 부데노시드 ; 상피성장인자 ; 사이클로스포린 ; 설파살라진 ; 아미노살리실레이트 ; 6-머캅토푸린 ; 아자티오프린 ; 메트로니다졸 ; 리폭시게나제억제제 ; 메살라민 ; 올살라진 ; 발살라지드 ; 항산화제 ; 트롬복산억제제 ; IL-1 수용체길항제 ; 성장인자 ; 엘라스타제억제제 ; 피리디닐-이미다졸화합물 ; TNF, LT, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, IL-16, IL

50 17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, EMAP-II, GM-CSF, FGF, 또는 PDGF의항체또는작용제 ; CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90에대한항체 ; FK506; 마이코페놀레이트모페틸 ; 이부프로펜 ; 프레드니솔론 ; 아데노신작용제 ; 항혈전제 ; 상보체억제제 ; 아드레날린제 ; 키나제억제제 ; IL-1β 전환효소억제제 ; T-세포시그날링억제제 ; 메탈로프로테이나제억제제 ; 안지오텐신전환효소억제제 ; 가용성사이토킨수용체 ; 가용성 p55 TNF 수용체 ; 가용성 p75 TNF 수용체 ; 가용성 IL-1RI; 가용성 IL-1RII; 가용성 IL-6R; 소염성사이토킨 ; IL-4; IL-10; IL-11; 및 TGF-β로이루어진그룹으로부터선택되는, 방법. 명세서 [0001] [0002] [0003] [0004] 기술분야관련출원의전후참조본원은 2010년 5월 14일자로출원된미국가특허원제61/334,917호, 및 2010년 12월 21일자로출원된미국가특허원제61/425,701호의우선권의이익을청구하며, 이들의내용은이들의전문이본원에참조로인용된다. 발명의분야본발명은 IL-1 결합단백질, 및특히류마티스관절염, 골관절염, 건선, 다발경화증, 및다른자가면역질환과같은급성및만성면역학적질환의예방및 / 또는치료시 IL-1 결합단백질의용도에관한것이다. [0005] [0006] [0007] [0008] 배경기술발명의배경인터루킨-1 (IL-1) 및종양괴사인자 (TNF) 와같은사이토킨은염증과정의매개인자인, 단핵세포및대식세포와같은다양한세포들에의해생산된분자이다. 인터루킨-1은열, 프로스타글란딘합성 ( 예를들면, 섬유모세포, 근육세포및내피세포 ), T-림프구활성화, 및인터루킨-2 생산을포함하는, 광범위한생물학적및생리학적효과를지닌사이토킨이다. IL-1 상과 (superfamily) 의원래의구성원들은 IL-1α, IL-1β 및 IL-1 수용체길항제 (IL-1Ra, IL-1RA, IL-1ra, IL-1Rα) 이다. IL-1α 및 IL-1β는감염에대해면역방어에관여하는전-염증성 (pro-inflammatory) 사이토킨이다. IL-1Rα는 IL-1α 및 IL-1β와경쟁적으로수용체에결합하여, 면역활성화시이들의역할을차단하는분자이다. 최근몇해동안 IL-18[ 참조 : Dinarello et al., FASEB J., 8(15): (1994); Huising et al., Dev. Comp. Immunol., 28(5): (2004)] 및 IL-1α, IL-1β 또는 IL-1RA에대해구조적상동성을가진 6개이상의유전자를포함하는 IL-1 상과에다른분자를첨가하는것이알려져왔다. 상기후자의 6개의구성원은 IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, 및 IL1F10으로명명된다. 따라서, IL-1α IL-1β 및 IL-1RA는 IL-1F1, IL-1F2, 및 IL-1F3으로각각재명명되어왔다 [ 참조 : Sims et al., Trends Immunol., 22(10): (2001); Dunn et al., Trends Immunol., 22(10): (2001)]. IL-1 계열의추가의추정되는구성원은, 비록당해명칭이 HGNC 유전자계열명명법데이타베이스에서공식적으로허용되지않지만, IL-33 또는 IL-1F11 로명명되어기술되어왔다. IL-1α 및 IL-1β 둘다는대식세포, 단핵세포및수지상세포에의해생산된다. 이들은감염에대해신체의면역반응의중요한부분을형성한다. 이들사이토킨은내피세포에서부착인자의발현을증가시켜병원체와싸우는세포인, 백혈구의감염부위로의이행 (transmigration) 을가능하도록하고시상하부열조절중심을재설정하여, 열과같이자체발현하는상승된체온을초래한다. 따라서, IL-1은내인성발열원으로명명된다. 상승된체온은신체의면역계가감염과싸우는것을돕는다. IL-1은또한조혈의조절시중요하다. 말초조직에서 IL-1β 생산은또한열과관련된통각과민 ( 통증에대한증가된민감성 ) 과관련되어왔다 [ 참조 : Morgan et al., Brain Res., 1022(1-2): (2004)]. 대부분의경우, IL-1의이들 2개형태들은동일한세포수용체에결합한다. 당해수용체는 2개의관련되어있지만동일하지않은, 대부분특정의다른수용체와공유된경로를통해세포내시그날을전달하는소단위들로구성된다. 이들은선천적인면역수용체및 IL-18에대한수용체의톨계열 (Toll family) 을포함한다. IL-1α 및 IL-1β는또한열의유도, 서파수면 (slow wave sleep), 및중성구증가증, T- 및 B-림프구활성화, 섬유모세포증식, 특정세포에대한세포독성, 콜라게나제의유도, 간급성상단백질의합성, 및콜로니자극인자및콜라겐의증가된생산을포함하는, 유사한생물학적특성들을소유한다

51 [0009] [0010] [0011] IL-1의 2개의명백한형태를암호화하는 cdna는분리되어발현되어왔으며 ; 이들 cdna는 IL-1β[ 참조 : Auron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: (1984)] 및 IL-1α[ 참조 : Lomedico et al., Nature, 312: (1984)] 로명명된, 2개의상이한유전자생성물들을나타낸다. IL-1β는 mrna 및단백질수준둘다에서사람단핵세포에의해생산된우세한형태이다. 사람 IL-1의 2개형태는단지 26% 의아미노산상동성을공유한다. 이들의명백한폴리펩타이드서열에도불구하고, IL-1의 2개형태는, 아미노산상동성이 IL-1 분자의별개의영역으로국한된다는점에서, 구조적유사성을갖는다 [ 참조 : Auron et al., J. Mol. Cell Immunol., 2: (1985)]. IL-1α 및 IL-1β는전구체펩타이드로서생산된다. 다시말해서, 이들은긴단백질로제조된후, 성숙한단백질로명명되는, 보다짧은, 활성분자를방출하기위해프로세싱 (processing) 된다. 예를들어, 성숙한 IL-1β 는, 카스파제-1 또는인터루킨-1 전환효소 (ICE) 로명명되는, 단백질들의카스파제계열의특정구성원에의한절단후 Pro-IL-1β로부터방출된다. 사람 IL-1 상과의각각의구성원의성숙한형태의 3-차원구조는장벽-형단백질 (barrel-shaped protein) 을생산하는 12-14β-가닥으로구성된다. 이러한중요한전염증성사이토킨의발견이래로거의 20년의연구에서 IL-1에대한다양한항체가기술되어왔지만, 염증반응및자가면역장애에있어서 IL-1의활성을효과적으로매개하거나중화시킬수있는개선된항체에대한요구및시료및조직에서 IL-1β를검출하는데있어서의용도의요구가여전히있다. [0012] [0013] 발명의내용 발명의요약 본발명은사람 IL-1α 및 IL-1β 에결합하는단백질에관한것이다. 본발명의결합단백질은사람 IL-1α 및 IL-1β에결합할수있는항체, 이의항원결합부분, 및 DVD-Ig TM 결합단백질과같은다가의, 다중특이적인결합단백질을포함하나, 이에한정되지않는다. 본발명은또한본원에기술된 IL-1α 및 IL-1β결합단백질을제조하고사용하는방법뿐만아니라, 시료에서또는, IL-1 활성과관련되거나관련된것으로추측되는개인에서장애를치료또는예방하는방법에서 IL-1α 및 IL-1β를검출하는방법에사용할수있는각종조성물도제공한다. [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] 하나의양태에서, 본발명은제1의 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n( 여기서 : VD1은제1의중쇄가변도메인이고 ; VD2는제2의중쇄가변도메인이며 ; C는중쇄불변도메인이고 ; X1은링커 (linker) 이며단, CH1이아니며 ; X2는 Fc 영역이고 ; n은독립적으로 0 또는 1이다 ) 를포함하는제1 폴리펩타이드쇄 ; 및제2의 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n( 여기서 : VD1은제1의경쇄가변도메인이고 ; VD2는제2의경쇄가변도메인이며 ; C는경쇄불변도메인이고 ; X1은링커이며단, CH1이아니며 ; X2는 Fc 영역을포함하지않고 ; n은독립적으로 0 또는 1이다 ) 를포함하는제2의폴리펩타이드쇄를포함하는, 결합단백질을제공하며, 여기서, 상기제1의폴리펩타이드쇄에서, VD1은서열번호 60 내지 148, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 및 210으로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하고 ; VD2는서열번호 213 및 227로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하며 ; 여기서, 상기제2의폴리펩타이드쇄에서, VD1은서열번호 149 내지 189, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209 및 211로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하고 ; VD2는서열번호 216 및 229로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하며 ;

52 [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] 여기서, 결합단백질은사람 IL-1β 및사람 IL-1α에결합한다. 하나의양태에서, 위에서기술한결합단백질은서열번호 212, 217, 226, 230, 232, 234, 및 236으로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는제1의폴리펩타이드쇄를포함한다. 다른양태에서, 위에서기술한결합단백질은서열번호 215, 218, 228, 231, 233, 235, 및 237로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는제2의폴리펩타이드쇄를포함한다. 본발명의다른국면에서, 결합단백질은제1의 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n( 여기서 : VD1은제1의중쇄가변도메인이고 ; VD2는제2의중쇄가변도메인이며 ; C는중쇄불변도메인이고 ; X1은링커이며단, CH1이아니고 ; X2는 Fc 영역이며 ; n은독립적으로 0 또는 1이다 ) 를포함하는제1의폴리펩타이드쇄 ; 및제2의 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n( 여기서 : VD1은제1의경쇄가변도메인이고 ; VD2는제2의경쇄가변도메인이며 ; C는경쇄불변도메인이고 ; X1은링커이며단, CH1이아니며 ; X2는 Fc 영역을포함하지않고 ; n은독립적으로 0 또는 1이다 ) 를포함하는제2의폴리펩타이드쇄를포함하며 ; 여기서, 상기제1의폴리펩타이드쇄에서, VD1은서열번호 213 및 227로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하고 ; VD2는서열번호 60 내지 148, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 및 210으로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하며 ; 여기서, 상기제2의폴리펩타이드쇄에서, VD1은서열번호 216 및 229로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하고 ; VD2는서열번호 149 내지 189, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209 및 211로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하며 ; 여기서, 결합단백질은사람 IL-1β 및사람 IL-α에결합한다. 다른양태에서, 위에서기술한결합단백질은서열번호 219 및 221로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는제1의폴리펩타이드쇄를포함한다. 다른양태에서, 위에서기술한결합단백질은서열번호 220 및 222로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는제2의폴리펩타이드쇄를포함한다. 다른국면에서, 본발명은위에서기술된결합단백질을제공하며, 여기서 : 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 212의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 215, 228, 231, 233 및 235로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하고 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 217의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 218 및 237로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하며 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 219의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 220의아미노산서열을포함하고 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 221의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 222를포함하고 ;

53 [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 226의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 228, 215, 231, 233, 및 235로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하며 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 230의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 231, 215, 228, 233, 및 235로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하고 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 232의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 233, 215, 228, 231, 및 235로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하며 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 234의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 235, 215, 228, 231, 및 233으로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하고 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄가서열번호 236의아미노산서열을포함하는경우, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 237의아미노산서열을포함한다. 다른국면에서, 본발명은위에서기술한단백질을제공하며, 여기서 : 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 212를포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 215를포함하거나 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 217을포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 218을포함하거나 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 219를포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 220을포함하거나 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 221를포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 222를포함하거나 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 226을포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 228을포함하거나 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 230을포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 231을포함하거나 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 232를포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 233을포함하거나 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 234를포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 235를포함하거나 ; 상기제1의폴리펩타이드쇄는서열번호 236을포함하고, 상기제2의폴리펩타이드쇄는서열번호 237을포함한다. 하나의양태에서, 위에서기술한본발명의결합단백질은 2개의제1의폴리펩타이드쇄및 2개의제2의폴리펩타이드쇄를포함한다. 다른국면에서, 위에서기술한결합단백질에서 X1 또는 X2는서열번호 26 내지 57, 233, 224, 및 225로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열이다. 다른양태에서, 본발명은위에서기술한결합단백질을제공하며, 여기서 Fc 영역은천연의서열 Fc 영역및가변서열 Fc 영역으로이루어진그룹으로부터선택된다. 다른양태에서, Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 및 IgD로부터의 Fc 영역으로이루어진그룹으로부터선택된다. 다른양태에서, 본발명은위에서기술된결합단백질을포함하고제제를추가로포함하는결합단백질접합체를제공한다. 이러한제제는면역부착분자, 영상화제 (imaging agent), 치료제및세포독성제를포함하나, 이에한정되지않는다. 바람직한영상화제는방사선표지, 효소, 형광성표지, 발광성표지, 생물발광성표지, 자 기표지, 및바이오틴을포함하나, 이에한정되지않는다. 바람직한방사선표지는 3 H, 14 C, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I, 177 Lu, 166 Ho, 및 153 Sm 을포함하나, 이에한정되지않는다. 바람직한치료제또는세포독성제는 항 - 대사물질, 알킬화제, 항생제, 성장인자, 사이토킨, 항 - 혈관형성제, 항 - 유사분열제, 안트라사이클린, 독소

54 및세포자멸사제를포함하나, 이에한정되지않는다. [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] [0098] [0099] [0100] [0101] 본발명은또한항원결합도메인을포함하는결합단백질을제공하며, 여기서결합단백질은사람 IL-1β에결합할수있고항원-결합도메인은 6개의 CDR, 즉, 하기에정의된바와같은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을포함한다 : CDR-H1: X 1 -Y-D-M-S ( 서열번호 190)( 여기서, X 1 은 S, K 또는 R이다 ); CDR-H2: Y-X 2 -S-X 4 -G-G-X 7 -G-T-Y-Y-P-D-X 14 -X 15 -K-G( 서열번호 191)( 여기서, X 2 는 I 또는 V이고 ; X 4 는 S 또는 H이며 ; X 7 은 G 또는 A이고 ; X 14 는 T 또는 S이며 ; X 15 는 V 또는 A이다 ); CDR-H3: G-G-V-X 4 -K-G-X 7 -F-D-X 10 ( 서열번호 192)( 여기서, X 4 는 T 또는 Y이고 ; X 7 은 Y 또는 C이며 ; X 10 은 V, E, L, M, Q, 또는 Y이다 ); CDR-L1: R-A-S-G-N-I-X 7 -X 8 -X 9 -L-X 11 ( 서열번호 193)( 여기서, X 7 은 H, Y, 또는 W이고 ; X 8 은 N, G, T, Q, E, H, D, 또는 K이며 ; X 9 는 Y 또는 W이고 ; X 11 은 T, A, 또는 N이다 ); CDR-L2: X 1 -A-K-X 4 -L-X 6 -X 7 ( 서열번호 194)( 여기서, X 1 은 N, Q, 또는 D이고 ; X 4 는 T, N, I, E, 또는 S이며 ; X 6 은 A, M, 또는 E이고 ; X 7 은 D, E, S, 또는 A이다 ); 및 CDR-L3: Q-X 2 -F-W-X 5 -X 6 -P-X 8 -X 9 ( 서열번호 195)( 여기서, X 2 는 H 또는 Q이고 ; X 5 는 S, N, T, K, R, 또는 M이며 ; X 6 은 I 또는 L이고 ; X 8 은 Y 또는 A이며 ; X 9 는 T, I, 및 N이고 ;

55 [0102] [0103] [0104] [0105] [0106] [0107] 단, CDR-H1이 S-Y-D-M-S ( 서열번호 17) 인경우, CDR-H2는 Y-I-S-S-G-G-G-G-T-Y-Y-P-D-T-V-K-G ( 서열번호 1 8) 일수없으며 ; CDR-H3는 G-G-V-T-K-G-Y-F-D-V ( 서열번호 19) 일수없고 ; CDR-L1은 R-A-S-G-N-I-H-N-Y-L-T ( 서열번호 20) 일수없으며 ; CDR-L2는 N-A-K-T-L-A-D ( 서열번호 21) 일수없고 ; 및 CDR-L3는 Q-H-F-W-S-I-P-Y-T ( 서열번호 22) 일수없다. 하나의양태에서, 위에서기술된분리된결합단백질은하기로이루어진 CDR 서열의그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는적어도하나의 CDR을포함한다 : [0108]

56 [0109]

57 [0110]

58 [0111]

59 [0112]

60 [0113]

61 [0114]

62 [0115]

63 [0116]

64 [0117]

65 [0118]

66 [0119]

67 [0120] [0121] 다른양태에서, 위에서기술한결합단백질은적어도 3 개의 CDR 을포함하며, 여기서 3 개의 CDR 은하기로이루어 진 CDR 세트의그룹으로부터선택되는 CDR 로부터온것이다 :

68 [0122] [0123]

69 [0124]

70 [0125]

71 [0126]

72 [0127]

73 [0128]

74 [0129]

75 [0130]

76 [0131]

77 [0132]

78 [0133]

79 [0134] [0135] [0136] 하나의양태에서, 상기기술된결합단백질은 CDR 세트의상기그룹으로부터선택되는 2개의 CDR 세트로부터의 CDR을포함한다. 다른양태에서, 본발명은상기그룹으로부터의 2개의 CDR 세트로부터의 CDR을포함하는결합단백질을제공하여, 여기서 2개의 CDR 세트는하기로이루어진그룹으로부터선택된다 :

80 [0137]

81 [0138] [0139] [0140] [0141] [0142] [0143] [0144] [0145] 다른양태에서, 위에서기술된결합단백질은사람수용체골격 (framework) 을추가로포함한다. 바람직하게는사람골격은서열번호 7 내지 10, 13 내지 16, 25, 240 내지 316, 및 317 내지 381로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, 본발명의결합단백질은서열번호 7 내지 10 및 13 내지 16으로이루어진그룹으로부터선택되는사람골격서열을포함한다. 본발명의결합단백질은적어도하나의골격영역아미노산치환을포함하는사람수용체골격을포함하는것들을포함하며, 여기서골격의아미노산서열은상기사람수용체골격의서열에대해적어도 65% 동일하며상기사람수용체골격에대해동일한적어도 70개아미노산잔기를포함한다. 다른양태에서, 본발명의결합단백질은사람수용체골격을포함하며, 여기서상기수용체골격은키이 (key) 잔기에서적어도하나의골격영역아미노산치환을포함하며, 상기키이잔기는, CDR에인접한잔기 ; 글리코실화부위잔기 ; 드문잔기 (rare residue); 사람 IL-1β와상호작용할수있는잔기 ; CDR과상호작용할수있는잔기 ; 정규잔기 (canonical residue); 중쇄가변영역과경쇄가변영역사이의접촉잔기 ; 베르니에영역 (Vernier zone) 내잔기 ; 및쵸티아 (Chothia)-정의된가변중쇄 CDR1과카밧 (Kabat)-정의된제1의중쇄골격사이에서오버랩된영역내잔기로이루어진그룹으로부터선택된다. 예시적인양태에서, 본발명의결합단백질은키이잔기를포함하고, 여기서상기키이잔기는 2H, 4H, 24H, 26H, 27H, 29H, 34H, 35H, 37H, 39H, 44H, 45H, 47H, 48H, 49H, 50H, 51H, 58H, 59H, 60H, 63H, 67H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H, 91H, 93H, 94H, 2L, 4L, 25L, 29L, 27bL, 33L, 34L, 36L, 38L, 43L, 44L, 46L, 47L, 48L, 49L, 55L, 58L, 62L, 64L, 71L, 87L, 89L, 90L, 91L, 94L, 95L( 모두카밧번호매김 ) 으로이루어진그룹으로부터선택된다. 본발명의결합단백질의사람화를위한이들잔기의예시적인서브세트는 27H, 48H, 67H, 69H, 93H, 36L, 43L, 46L, 47L, 49L, 58L, 71L, 및 87L로이루어진다. 다른양태에서, 본발명의결합단백질은컨센서스 (consensus) 사람가변도메인을포함한다. 하나의양태에서, 본발명의 IL-1β 결합단백질은서열번호 60 내지 189로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는적어도하나의가변도메인을포함한다. 다른양태에서, 본발명의결합단백질은서열번호 60 내지 148, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 및 210 으로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는적어도하나의가변중쇄 (VH) 영역 ( 또는도메인 ) 을포함한다. 다른양태에서, 본발명에따른결합단백질은서열번호 149 내지 189로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는적어도하나의가변경쇄 (VL) 영역 ( 또는도메인 ) 을포함한다

82 [0146] [0147] 여전히다른양태에서, 본발명에따른결합단백질은서열번호 60 내지 148, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 및 210으로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는적어도하나의 VH 영역, 및서열번호 149 내지 189, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 및 211로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는적어도하나의 VL 영역을포함한다. 하나의양태에서, 본발명에따른결합단백질은 2개의가변도메인들을포함하며, 여기서 2개의가변도메인은하기로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함한다 : [0148]

83 [0149] [0150] 다른양태에서, 본원에기술된 IL-1β 결합단백질은면역글로불린분자, scfv, 단클론항체, 사람화된항체, 키메라항체, 사람화된항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab') 2, Fv, 및이황화물연결된 Fv 로이루어진그룹으로 부터선택된다. [0151] [0152] 본발명의하나의국면에서, 본원에기술된결합단백질은 IL-1 의생물학적기능을조절할수있다. 다른국면 에서, 본원에기술된결합단백질은 IL-1 을중화시킬수있다. 하나의양태에서, 본원에기술된결합단백질은표면플라스몬공명에의해측정된것으로서, 적어도약 10 2 M -1 s - 1 ; 적어도약 10 3 M -1 s -1 ; 적어도약 10 4 M -1 s -1 ; 적어도약 10 5 M -1 s -1 ; 및적어도약 10 6 M -1 s -1 으로이루어진그룹으로 부터선택되는 IL-1β 에대한결합속도상수 (on rate constant; K on ) 를갖는다. [0153] 다른양태에서, 본원에기술된결합단백질은표면플라스몬공명에의해측정된것으로서, 약 10-3 s -1 이하 ; 약 10-4 s -1 이하 ; 약 10-5 s -1 이하 ; 및약 10-6 s -1 이하로이루어진그룹으로부터선택되는 IL-1β 에대한해리속도 상수 (K off ) 를갖는다. [0154] 다른양태에서, 본원에기술된결합단백질은약 10-7 M 이하 ; 약 10-8 M 이하 ; 약 10-9 M 이하 ; 약 M 이하 ; 약 M 이하 ; 약 M 이하 ; 및 M 이하로이루어진그룹으로부터선택되는 IL-1β 에대한해리상수 (K D ) 를갖는다. [0155] 하나의국면에서, 본발명은본원에기술된결합단백질을포함하고링커또는면역글로불린불변도메인을추가로포함하는결합단백질작제물을제공한다. 하나의양태에서, 결합단백질작제물은결합단백질을포함하며, 여기서결합단백질은면역글로불린분자, 이황화물연결된 Fv, 단클론항체, scfv, 키메라항체, CDR-이식된항체, 디아바디 (diabody), 사람화된항체, 다중특이적항체, Fab, 이중특이적항체, Fab', 이특이적항체, 및 F(ab') 2, DVD-Ig TM 및 Fv 로이루어진그룹으로부터선택된다. [0156] [0157] 하나의양태에서, 결합단백질작제물은사람 IgM 불변도메인, 사람 IgG4 불변도메인, 사람 IgG1 불변도메인, 사람 IgE 불변도메인, 사람 IgG2 불변도메인, 및사람 IgG3 불변도메인, 및사람 IgA 불변도메인으로이루어진그룹으로부터선택되는중쇄면역글로불린불변도메인을포함한다. 다른양태에서, 결합단백질작제물은서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 및서열번호 6으로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을갖는면역글로불린불변도메인을포함한다

84 [0158] 본발명은또한본원에기술된결합단백질작제물을포함하고면역부착분자, 영상화제, 치료제및세포독성제로이루어진그룹으로부터선택되는제제를추가로포함하는결합단백질접합체를제공한다. 본원에기술된단백질접합체를결합시키는데있어서제제모이어티 (moiety) 로유용한영상화제는방사선표지, 효소, 형광성표지, 발광성표지, 생물발광성표지, 자기표지, 및바이오틴을포함하나, 이에한정되지않는다. 하나의양 태에서, 방사선표지는 3 H, 14 C, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I, 177 Lu, 166 Ho, 및 153 Sm 으로이루어진그룹으로부터 선택된다. [0159] [0160] [0161] [0162] [0163] [0164] [0165] [0166] [0167] [0168] [0169] 다른양태에서, 결합단백질접합체는항-대사물질, 알킬화제, 항생제, 성장인자, 사이토킨, 항-혈관형성제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소및세포자멸사제로이루어진그룹으로부터선택되는치료제또는세포독성제인제제를포함한다. 하나의양태에서, 본원에기술된결합단백질, 결합단백질작제물, 또는결합단백질접합체는사람글리코실화패턴을보유한다. 본원에기술된결합단백질, 결합단백질작제물, 및결합단백질접합체는가용성단백질또는결정으로서존재할수있다. 하나의양태에서, 이러한결정은담체-유리된약제학적제어방출형결정이다. 다른양태에서, 본원에기술된결합단백질, 결합단백질작제물, 또는결합단백질접합체의결정성형태는이의가용성대응물보다생체내반감기가더크다. 다른양태에서, 본원에기술된결합단백질, 결합단백질작제물, 또는결합단백질접합체의결정은이의가용성대응물의생물학적활성을유지한다. 본발명의조성물은 : (a) 본원에기술된결정화된결합단백질, 결합단백질작제물, 또는결합단백질접합체, 및성분을포함하는제형 ; 및 (b) 적어도하나의중합체담체를포함하는, 본원에기술된결정화된결합단백질, 결합단백질작제물, 또는결합단백질접합체의방출을위한조성물을포함한다. 본발명의조성물에유용한중합체담체는폴리 ( 아크릴산 ), 폴리 ( 시아노아크릴레이트 ), 폴리 ( 아미노산 ), 폴리 ( 무수물 ), 폴리 ( 뎁시펩타이드 ), 폴리 ( 에스테르 ), 폴리 ( 락트산 ), 폴리 ( 락틱-co-글리콜산 ) 또는 PLGA, 폴리 (b-하이드록시부티레이트 ), 폴리 ( 카프로락톤 ), 폴리 ( 디옥사논 ); 폴리 ( 에틸렌글리콜 ), 폴리 (( 하이드록시프로필 ) 메타크릴아미드, 폴리 [( 오가노 ) 포스파젠 ], 폴리 ( 오르토에스테르 ), 폴리 ( 비닐알코올 ), 폴리 ( 비닐피롤리돈 ), 말레산무수물-알킬비닐에테르공중합체, 플루로닉폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로즈및셀룰로즈유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 하이알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산화다당류, 이들의블렌드및공중합체로이루어진그룹중하나이상을포함하나, 이에한정되지않는다. 다른국면에서, 본발명의조성물의성분은알부민, 수크로즈, 트레할로즈, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필- β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌글리콜및폴리에틸렌글리콜로이루어진그룹으로부터선택된다. 본발명은또한본원에기술된결합단백질, 결합단백질작제물, 또는결합단백질접합체, 및약제학적으로허용되는담체를포함하는약제학적조성물을제공한다. 본발명의약제학적조성물은적어도하나의추가의제제를추가로포함할수있다. 하나의양태에서, 이러한추가의제제는치료제, 영상화제, 세포독성제, 혈관형성억제제 ; 키나제억제제 ; 동시-자극분자차단제 ; 부착분자차단제 ; 항-사이토킨항체또는이의기능성단편 ; 메토트렉세이트 ; 사이클로스포린 ; 라파마이신 ; FK506; 검출가능한표지또는리포터 ; TNF 길항제 ; 항류마티스제 ; 근육이완제, 마약, 비-스테로이드성소염약물 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소마취제, 신경근차단제, 항미생물제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 단백동화스테로이드, 적혈구형성인자, 면역제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장호르몬, 호르몬대체약물, 방사성의약품, 항우울제, 정신병치료제, 자극인자, 천식의약, 베타작용제, 흡입성스테로이드, 에피네프린또는이의유사체, 사이토킨, 및사이토킨길항제를포함하나, 이에한정되지않는다. 하나의양태에서, 본발명의약제학적조성물을약제학적으로허용되는담체를포함하며, 여기서담체는또한조성물속에서결합단백질, 결합단백질작제물, 또는결합단백질접합체의흡수또는분산을증가시기기위한보조제로서제공된다. 예시적인보조제는하이알루로니다제이다. 다른양태에서, 약제학적조성물은, IL-1β 활성이유해한장애를치료하기위한적어도하나의추가의치료제를추가로포함한다

85 [0170] [0171] [0172] [0173] [0174] [0175] [0176] 하나의양태에서, 본발명은본원에기술된결합단백질의하나이상의아미노산서열을암호화하는분리된핵산을제공한다. 이러한핵산은각종유전적분석을수행하기위해또는본원에기술된결합단백질의하나이상의특성을발현시키거나, 특성화하거나개선시키기위해벡터내로삽입시킬수있다. 벡터는본원에기술된결합단백질의하나이상의아미노산서열을암호화하는하나이상의핵산분자를포함할수있으며, 여기서하나이상의핵산분자는벡터를수반하는특정숙주세포내에서결합단백질의발현을허용하는적절한전사및 / 또는해독서열에작동적으로연결된다. 본원에기술된결합단백질의아미노산서열을암호화하는핵산을클로닝하거나발현시키기위한벡터의예는 pcdna, ptt, ptt3, pefbos, pbv, pjv, 및 pbj를포함하나, 이에한정되지않는다. 본발명은또한본원에기술된결합단백질의하나이상의아미노산서열을암호화하는핵산을포함하는벡터를포함하는숙주세포를제공한다. 본발명에유용한숙주세포는원핵또는진핵세포일수있다. 예시적인원핵숙주세포는에스케리키아콜라이 (Escherichia coli) 이다. 본발명에서숙주세포로유용한진핵세포는원생생물세포, 동물세포, 식물세포및진균세포를포함한다. 예시적인진균세포는사카로마이세스세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 를포함하는효모세포이다. 본발명에따른숙주세포로서유용한예시적인동물세포는포유동물세포, 조류세포, 및곤충세포를포함하지만, 이에한정되지않는다. 바람직한포유동물세포는 CHO 및 COS 세포를포함한다. 본발명에따른숙주세포로서유용한곤충세포는곤충 Sf9 세포이다. 다른국면에서, 본발명은 IL-1α 및 / 또는 IL-1β에결합할수있는결합단백질을생산하기에충분한조건하에서배양배지속에서결합단백질을암호화하는벡터를포함하는숙주세포를배양함을포함하여, 본원에기술된결합단백질을생산하는방법을제공한다. 이렇게생산된단백질은분리하여본원에기술된각종조성물및방법에사용될수있다. 다른양태에서, 본발명은사람 IL-1을본원에기술된결합단백질과접촉시켜, 사람 IL-1 활성이감소되도록함을포함하여, 사람 IL-1 활성을감소시키는방법을제공한다. 본발명의다른양태는대상체에게본원에기술된결합단백질을투여함으로써치료가달성되도록하는, 장애에대해대상체를치료하는방법을제공한다. 다른양태에서, 본원기술된결합단백질은하기로이루어진그룹으로부터선택되는장애를치료하는데유용하다 : 당뇨병, 포도막염, 신경병증성통증, 골관절염성통증, 염증성통증, 류마티스관절염, 골관절염, 소아만성관절염, 패혈성관절염, 라임관절염 (Lyme arthritis), 건선관절염, 반응성관절염, 척추관절병 (spondyloarthropathy), 전신홍반루푸스 (SLE), 크론병 (Crohn's disease), 궤양성대장염, 염증성장질환, 자가면역당뇨병, 인슐린의존성진성당뇨병, 갑상샘염, 천식, 알레르기질환, 건선, 피부염, 피부경화증, 이식대숙주질환 (graft versus host disease), 장기이식거부, 장기이식과관련된급성면역질환 ; 장기이식과관련된만성면역질환, 사르코이드증 (sarcoidosis), 죽상경화증, 파종성혈관내응고 (DIC), 가와사키병 (Kawasaki's disease), 그레이브병 (Grave's disease), 콩팥증후군, 만성피로증후군, 베게너육아종증 (Wegener's granulomatosis), 헤노흐-쉔라인자반증 (Henoch-Schoenlein purpurea), 신장의미세혈관염, 만성활성간염, 자가면역포도막염, 패혈쇼크, 독성쇼크증후군, 패혈증증후군, 악액질, 전염병, 기생충질환, 급성횡단성척수염, 헌팅턴무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 원발성담즙성간경변, 용혈성빈혈, 악성종양 (malignancy), 심부전, 심근경색, 애디슨병 (Addison's disease), 산발성다분비선결핍유형 I, 다분비선결핍유형 II ( 슈미트증후군 ), 급성호흡곤란증후군 (ARDS), 탈모증, 원형탈모증, 혈청반응음성인관절병증, 관절병증, 라이터질환 (Reiter's disease), 건선관절병증, 궤양성대장염관절병증, 장병원성윤활막염, 클라미디아, 예르시니아 (Yersinia) 및살모넬라관련관절병증, 척추관절병증, 아테롬성질환 / 동맥경화, 아토피성알레르기, 자가면역수포성질환, 보통천포창, 낙엽상천포창, 유사천포창, 선형 IgA 질환, 자가면역성용혈성빈혈, 쿰즈 (Coombs) 양성용혈성빈혈, 후천성악성빈혈, 소아악성빈혈, 근육통성뇌염 / 로얄프리질환 (Royal Free disease), 만성피부점막칸디다증, 거대세포동맥염 (GCA), 원발성경화간염, 잠복성자가면역간염, 후천성면역결핍증 (AIDS), 후천성면역결핍관련질환, B형간염, C형간염, 일반적인다양한면역결핍증 ( 보통의가변성저감마글로불린혈증 ), 확장성심근병증, 여성불임증, 난소기능상실, 조기폐경, 섬유성폐질환, 잠복성섬유화폐포염, 사후염증성간질성폐질환, 간질성폐렴, 결합조직질환관련간질성폐질환, 혼합된결합조직질환관련폐질환, 전신경화증관련된간질성폐질환, 류마티스관절염관련간질성폐질환, 전신홍반루푸스관련폐질환, 피부근육염 / 다발근육염관련폐질환, 쇼그렌질환 (Sjoegren's

86 disease) 관련폐질환, 강직성척추염관련폐질환, 혈관염성확산폐질환, 헤모시덴린증관련폐질환, 약물유발간질성폐질환, 섬유증, 방사선섬유증, 폐쇄세기관지염, 만성호산구성폐렴, 림프구침윤성폐질환, 감염후간질성폐질환, 통풍성관절염, 자가면역간염, 제1형자가면역간염 ( 전형적자가면역또는루포이드간염 ), 제2형자가면역간염 ( 항-LKM 항체간염 ), 자가면역매개된저혈당증, 흑색극세포증을동반한타입 B 의인슐린내성, 부갑상샘저하증, 골관절염, 원발성경화담관염, 건선 1형, 건선 2형, 특발성백혈구감소증, 자가면역중성구감소증, 신장질환 NOS, 사구체신장염, 신장의미세혈관염, 라임질환, 원반모양홍반루푸스, 특발성남성불임, 질소산화물-관련남성불임, 정자자가면역, 다발성경화증 (1차진행성, 2차진행성, 재발완화성을포함한모든하위유형 ), 교감안염, 결합조직질환에부수적인폐고혈압, 굿패스춰 (Goodpasture) 증후군, 결절성다발의폐발현, 급성류마티스열, 류마티스척추염, 스틸병 (Still's disease), 전신경화증, 쇼그렌증후군, 타카야스 (Takayasu) 병 / 동맥염, 자가면역저혈소판증 (AITP), 특발성저혈소판증, 자가면역갑상선질환, 갑상선기능항진증, 갑상선종의자가면역갑상선기능저하증 ( 하시모토병 ), 위축성자가면역갑상선기능저하증, 원발성점액수종, 수정체성포도막염, 원발성혈관염, 백반증, 급성간질환, 만성간질환, 알코올성간경변, 알코올유발간손상, 쓸개즙정체, 특이한간질환, 약물유발간염, 비알콜성지방간염, 알레르기, 그룹 B 스트렙토코커스 (Streptococci) (GBS) 감염, 정신장애 ( 예를들어, 우울증및정신분열증 ), Th2 유형및 Th1 유형매개질환, 급성및만성통증 ( 통증의상이한형태들 ), 암 ( 예를들어, 폐, 유방, 위, 방광, 결장, 췌장, 난소, 전립선, 및직장암 ), 조혈성악성종양, 백혈병, 림프종, 무베타지방단백혈증, 말단청색증, 급성및만성기생성또는감염성과정, 급성백혈병, 급성림프모구백혈병 (ALL), T- 세포 ALL, FAB ALL, 급성골수성백혈병 (AML), 급성또는만성세균감염, 급성췌장염, 급성신부전, 아데노암종 (adenocarcinomas), 심방이소성박동, AIDS 치매병변군, 알코올유도간염, 알레르기성결막염, 알레르기성접촉피부염, 알레르기성비염, 동종이식거부, 알파-l-안티트립신결핍증, 근육위축가쪽경화증, 빈혈, 협심증, 전각세포변성, 항-CD3 치료요법, 항인지질증후군, 항-수용체과민성반응, 대동맥및말초동맥류, 대동맥박리, 동맥고혈압, 동맥경화, 동정맥루, 운동실조증, 심방세동 ( 지속성또는발작성 ), 심방조동 (atrial flutter), 심방심실블록, B 세포림프종, 뼈이식거부, 골수이식 (BMT) 거부, 번들브랜치블록 (bundle branch block), 버킷림프종 (Burkitt's lymphoma), 화상, 심장성부정맥, 심장마비증후군, 심장종양, 심근병증, 심폐바이패스염증반응, 연골이식거부, 소뇌피질변성, 소뇌장애, 혼란성또는다초점성심방빈맥, 화학치료요법관련장애, 만성골수구성백혈병 (CML), 만성알코올중독, 만성염증성병리, 만성림프성백혈병 (CLL), 만성폐쇄성폐질환 (COPD), 만성살리실산의중독, 결장직장암종, 울혈성심부전, 결막염, 접촉성피부염, 폐심장증, 관상동맥질환, 크로이츠펠트-야콥병 (Creutzfeldt-Jakob disease), 배양물음성패혈증, 낭성섬유증, 사이토킨치료요법관련장애, 권투선수치매, 탈수초병, 뎅기열출혈성발열, 피부염, 피부과병태, 진성당뇨병, 당뇨병성동맥경화질환, 광범위레비소체병 (diffuse Lewy body disease), 확대울혈성심근병증, 기저신경절의장애, 중년의다운증후군, CNS 도파민수용체를차단하는약물에의해유도된약물-유발운동장애, 약물민감도, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비병증, 후두개염, 엡슈타인-바바이러스감염 (Epstein-Barr virus infection), 지단홍통증, 추체외로및소뇌장애, 가족성적혈구포식성림프조직구증, 태아가슴샘임플란트제거, 프리드리히 (Friedreich) 운동실조증, 기능성말초동맥장애, 진균성패혈증, 가스괴저 (gas gangrene), 위궤양, 사구체신염, 모든장기또는조직의이식거부, 그람음성패혈증, 그람양성패혈증, 세포내유기체로인한육아종, 모발세포백혈병, 할레르보르덴-스파츠병 (Hallervorden- Spatz disease), 하시모토의갑상샘염, 건초열, 심장이식거부, 혈색소침착증, 혈액투석, 용혈성요독성증후군 / 혈전용해성혈소판감소성자반증, 뇌출혈, A형간염, His 번들부정맥, HIV 감염 /HIV 신경병증, 호지킨병, 운동과다장애, 과민성반응, 과민성폐렴, 고혈압, 운동과다장애, 시상하부-뇌하수체-부신축평가, 특발성애디슨병 (Addison's disease), 특발성폐의섬유증 (IPF), 항체매개된세포독성, 무력증, 유아척추근육위축, 대동맥의염증, 인플루엔자 a, 이온화방사선노출, 홍채섬모체염 / 포도막염 / 시각신경염, 허혈-재관류손상, 허혈성뇌졸중, 소아류마티스관절염, 소아척추근육위축, 카포시육종, 신장이식거부, 레지오넬라, 리슈만편모충증, 나병, 피질척수계의병변, 지방부종, 간이식거부, 림프부종, 말라리아, 악성림프종, 악성조직구증, 악성흑색종, 수막염, 수막구균혈증, 대사증후군편두통두통, 특발성편두통두통, 미토콘드리아성멀티시스템장애, 혼합된결합조직질환, 단클론성감마글로불린병증, 다중골수종, 다중시스템변성 (Menzel, Dejerine-Thomas, Shy-Drager, and Machado-Joseph), 중증근육무력증, 마이코박테리움아비움인트라셀룰라에, 마이코박테리움결핵 ; 골수형성이상증후군, 심근경색, 심근허혈성장애, 코인두암종, 신생아만성폐질환, 신염, 콩팥증, 신경변성질환, 신경성 I 근육위축, 호중구감소증발열, 비-호지킨림프종, 복부대동맥및이의분지의폐색, 폐색성동맥장애, OKT3 치료요법, 고환염 / 부고환염, 고환염 / 정관절제술반전시술, 병원처방, 골다공증, 췌장이식거부, 췌장암종, 악성종양의신생물딸림증후군 / 고칼슘혈증, 부갑상샘이식

87 거부, 골반염증성질환, 다년생비염, 심낭질환, 말초죽상경화성질환, 말초혈관장애, 복막염, 악성빈혈, 주폐포자충폐렴, 폐렴, POEMS 증후군 ( 다발신경병, 오가노메갈리, 내분비병증, 단클론감마글로불린증, 및피부변화증후군 ), 후재관류증후군, 후펌프증후군, 후-MI 심장절개증후군, 자간전증, 진행성핵상마비, 원발성폐고혈압, 방사선치료요법, 레이노드 (Raynaud) 현상, 레이노드질환, 레프섬 (Refsum) 질환, 일반적인협소한 QRS 빈맥, 신장혈관고혈압, 재관류손상, 제한심근병증, 육종, 노인무도병, 레비소체의노인치매, 혈청반응음성관절병증, 쇼크 (shock), 낫세포빈혈, 피부동종이식거부, 피부변화증후군, 작은창자이식거부, 고형종양, 특정부정맥, 척추운동장애, 척수소뇌변성, 연쇄구군근육염, 소뇌의구조병변, 아급성경화성번뇌염, 실신, 심혈관계매독, 전신아나필락시스, 전신염증성반응증후군, 전신발병소아류마티스관절염, 모세혈관확장증, 폐쇄혈전혈관염, 혈소판감소, 독성, 이식, 외상 / 출혈, 유형 III 과민성반응, 유형 IV 과민증, 불안정협심증, 요독증, 요로성패혈증, 두드러기, 판막심장질환, 정맥류, 혈관염, 정맥질환, 정맥혈전증, 심실세동, 바이러스및진균감염, 바이러스성뇌염 / 무균수막염, 바이러스-관련식혈세포성증후군, 베르닉케-코르사코프 (Wernicke-Korsakoff) 증후군, 윌슨병 (Wilson's disease), 모든장기또는조직의이종이식거부, 급성관상동맥증후군, 급성특발성의다발신경염, 급성염증탈수초다발성신경병증, 급성허혈, 성인스틸병, 원형탈모증, 아나필락시스, 항인지질항체증후군, 재생불량성빈혈, 동맥경화, 아토피성습진, 아토피성피부염, 자가면역피부염, 스트렙토코커스감염과관련된자가면역장애, 자가면역창자병증, 자가면역청력손실, 자가면역림프구증식증후군 (ALPS), 자가면역심근염, 자가면역조기폐경, 눈꺼풀염, 기관지확장증, 수포성유사천포창, 심혈관질환, 파국적항인지질증후군, 복강질환, 자궁경부척추증, 만성허혈, 반흔성유사천포창, 다발성경화증에대한위험을갖는임상적으로분리된증후군 (CIS), 결막염, 어린시절발병정신장애, 누낭염, 피부근육염, 당뇨병성망막증, 디스크이탈증, 디스크탈출증, 약물유발면역용혈성빈혈, 심내막염, 자궁내막증, 안구내염, 상공막염, 다형홍반, 주요다형홍반, 임신성유사천포창, 귈라인-바레 (Guillain-Barre) 증후군 (GBS), 건초열, 휴즈증후군, 특발성파킨슨병, 특발성간질성폐렴, IgE로인한알레르기, 면역용혈성빈혈, 봉입체근염, 감염성눈염증성질환, 염증성탈수초질환, 염증성심장질환, 염증성신장질환, 홍채염, 각막염, 건조각막결막염, 쿠쓰마울 (Kussmaul) 질환또는쿠쓰마울-마이어질환, 랜드리마비, 랑게르한스세포조직구증, 그물울혈반, 황반변성, 현미경적다발성혈관염, 모부스베흐테레프 (Morbus Bechterev), 운동신경세포장애, 점막유사천포창, 다발성장기부전, 중증근육무력증, 골수혈성이상증후군, 심근염, 신경근장애, 신경병증, 비-A 비-B 형간염, 시각신경염, 골용해, 소수관절 JRA, 말초동맥폐색성질환 (PAOD), 말초혈관장애 (PVD), 말초동맥, 질환 (PAD), 정맥염, 결절다발동맥염 ( 또는결절동맥주위염 ), 다발연골열, 류마티스성다발성근육통, 백모증, 다관절 JRA, 다내분비선결핍증후근, 다발근육염, 류마티스성다발성근육통 (PMR), 후-펌프증후군, 원발성파킨슨증, 2차파킨슨증, 전립샘염, 순수적혈구세포무형성, 원발성부신기능부전, 재발성시각신경척수염, 재협착, 류마티스심장질환, SAPHO ( 윤활막염, 여드름, 농포증, 뼈과다증및골염 ), 2차아밀로이드증, 쇼크폐, 골막염, 좌골신경통, 2차부신기능부전, 실리콘관련된결합조직질환, 스네돈-윌킨슨 (Sneddon-Wilkinson) 피부병, 강직척추염, 스티븐스-존슨 (Stevens-Johnson) 증후군 (SJS), 전신염증성반응증후군, 측두동맥염, 톡소플라스믹망막염, 독성표피괴사용해, 횡척수염, TRAPS ( 종양괴사인자수용체타입 1 (TNFR) 관련정기증후군 ), 흑색가시세포증을동반한타입 B의인슐린저항성, 제1형알레르기반응, 제II형당뇨병, 두드러기, 보통간질성폐렴 (UIP), 봄철결막염, 바이러스성망막염, 보그트-코야나기-하라다 (Vogt-Koyanagi-Harada) 증후군 (VKH 증후군 ), 습윤황반변성, 상처치유, 예르시니아및살모넬라관련관절병증. [0177] [0178] 본원에기술된치료방법의추가의양태에서, 대상체에게본원에기술된결합단백질또는결합단백질작제물또는결합단백질접합체를투여하는단계는비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 기관지내, 복부내 (intraabdominal), 관절낭내, 연골내, 강내 (intracavitary), 복강내 (intracelial), 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내 (intracervical), 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장횡경막내, 복강내, 흉강내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼러스 (bolus), 질, 직장, 볼, 설하, 비강내및경피로부터선택된적어도하나의방식에의해서수행된다. 본발명의다른국면은본원에기술된결합단백질, 결합단백질작제물, 또는결합단백질접합체를제2 제제의투여전에, 동시에또는후에투여하는단계를포함하여, IL-1이유해한장애로고생하는환자를치료하는방법이며, 여기서제2 제제는흡입된스테로이드 ; 베타-작용제 ; 단기-작용성또는장기-작용성베타-작용제 ; 류코트리엔또는류코트리엔수용체의길항제 ; ADVAIR; IgE 억제제 ; 항-IgE 항체 ; XOLAIR; 포스포디에스테라제억제제 ; PDE4 억제제 ; 크산틴 ; 항콜린성약물 ; 비만세포-안정화제 ; 크로몰린 ; IL-4 억제제 ; IL-5 억제제 ; 에오탁신 /CCR3 억제제 ; 히스타민또는 H1, H2, H3, 및 H4를포함하는이의수용체의길항제 ; 프로스타글란딘 D 또는 이의수용체 DP1 및 CRTH2 의길항제 ; TNF 길항제 ; TNF 수용체의가용성단편 ; ENBREL ; TNF 효소길항제 ; TNF

88 전환효소 (TACE) 억제제 ; 무스카린성수용체길항제 ; TGF-베타길항제 ; 인터페론감마 ; 페르페니돈 ; 화학요법제, 메토트렉세이트 ; 레플루노미드 ; 시롤리무스 ( 라파마이신 ) 또는이의유사체, CCI-779; COX2 또는 cpla2 억제제 ; NSAID; 면역조절제 ; p38 억제제 ; TPL-2, MK-2 및 NFkB 억제제 ; 부데노시드 ; 상피성장인자 ; 코르티코스테로이드 ; 사이클로스포린 ; 설파살라진 ; 아미노살리실레이트 ; 6-머캅토푸린 ; 아자티오프린 ; 메트로니다졸 ; 리폭시게나제억제제 ; 메살라민 ; 올살라진 ; 발살라지드 ; 항산화제 ; 트롬복산억제제 ; IL-1 수용체길항제 ; 항-IL-1β 항체 ; 항-IL-6 항체 ; 성장인자 ; 엘라스타제억제제 ; 피리디닐-이미다졸화합물 ; TNF, LT, IL-1, IL- 2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL- 33, EMAP-II, GM-CSF, FGF, 또는 PDGF의항체또는작용제 ; CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 또는이들의리간드의항체 ; FK506; 라파마이신 ; 마이코페놀레이트모페틸 ; 이부프로펜 ; 프레드니솔론 ; 포스포디에스테라제억제제 ; 아데노신작용제 ; 항혈전제 ; 상보체억제제 ; 아드레날린제 ; IRAK, NIK, IKK, p38, 또는 MAP 키나제억제제 ; IL-1β 전환효소억제제 ; TNF-α 전환효소억제제 ; T-세포시그날링억제제 ; 메탈로프로테이나제억제제 ; 6-머캅토푸린 ; 안지오텐신전환효소억제제 ; 가용성사이토킨수용체 ; 가용성 p55 TNF 수용체 ; 가용성 p75 TNF 수용체 ; sil-1ri; sil-1rii; sil-6r; 소염성사이토킨 ; IL-4; IL-10; IL-11; 및 TGF-β로이루어진그룹으로부터선택된다. [0179] 본발명의다른국면은본원에기술된적어도하나의 IL-1 결합단백질에대한적어도하나의 IL-1 항-유전형항체를제공한다. 항-유전형항체는본발명의결합단백질내로혼입될수있는, 중쇄또는경쇄의적어도하나의 CDR 또는이의리간드결합부분, 중쇄또는경쇄가변영역, 중쇄또는경쇄불변영역, 골격영역, 또는이의특정부분과같은, 그러나이에한정되지않는면역글로불린분자의적어도일부를포함하는분자를함유하는모든단백질또는펩타이드를포함한다. [0180] [0181] 발명을실시하기위한구체적인내용 발명의상세한설명 본발명은 IL-1β 에결합하는항 -IL-1β 항체, 또는이의항원 - 결합부분, IL-1β 및다른표적에결합하는 DVD-Ig TM 과같은다가의다특이적인결합단백질을포함하지만이에한정되지않는, IL-1β 결합단백질에관한것이다. 본발명의각종국면은항체및항체단편, DVD-Ig 결합단백질, 및이의약제학적조성물및항체, DVD-Ig 결합단백질, 및이의단편을포함하는, 이러한 IL-1β 결합단백질을제조하기위한핵산, 재조합체발현벡터및숙주세포에관한것이다. 사람 IL-1β를검출하고 ; 사람 IL-1β를시험관내또는생체내에서억제하고 ; 유전자발현을조절하기위해본발명의 IL-1β 결합단백질을사용하는방법이또한본발명에포함된다. [0182] [0183] [0184] 본발명은또한본원에기술된 IL-1β 결합단백질과경쟁할수있는모든결합단백질또는항체를포함한다. 본원에달리정의하지않는한, 본발명과관련하여사용된과학적및기술적용어들은당해분야의통상의기술자에의해일반적으로이해되는의미를갖는다. 그러나, 용어들의의미및범위는어떠한사전적또는고유한정의를앞서는본원에제공된어떠한잠재적인애매한정의의경우에도명백해야한다. 또한, 내용에서달리요구하지않는한, 단수용어들은복수를포함하며복수용어들은단수를포함한다. 본원에서, " 또는 " 의사용은달리기술하지않는한 " 및 / 또는 " 을의미한다. 또한, 용어 " 포함하는 ", 및 " 포함하다 " 및 " 포함된 " 과같은다른형태의사용은제한되지않는다. 또한, " 요소 " 또는 " 성분 " 과같은용어들은, 구체적으로달리기술하지않는한, 하나의단위를포함하는요소및성분과하나이상의소단위를포함하는요소및성분들둘다를포함한다. 일반적으로, 본원에기술된세포및조직배양, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전학및단백질및핵산화학및하이브리드화와연관되어사용된명명법및이들기술은당해분야에잘공지되어있고일반적으로사용된다. 본발명의방법및기술은일반적으로당해분야에잘공지된통상의방법에따라수행되며달리나타내지않는한본명세서전체에서인용되고논의된각종의일반적이고보다특이적인참조문헌에기술된바와같이수행된다. 효소적반응및정제기술은당해분야에서일반적으로달성되거나본원에기술된것으로서, 제조업자의설명서에따라수행된다. 본원에기술된분석화학, 합성유기화학, 및의학및약제학적화학과연관되어사용된명명법, 및이의실험실과정및기술은당해분야에잘공지되어있고일반적으로사용되는것들이다. 표준기술은화학합성, 화학분석, 약제학적제제, 제형, 및전달, 및환자의치료에사용된다

89 [0185] [0186] [0187] [0188] [0189] [0190] [0191] 본발명을보다용이하게이해하기위해, 선택된용어들을하기정의한다. 용어 " 폴리펩타이드 " 는아미노산의모든중합체쇄를말한다. 용어 " 펩타이드 " 및 " 단백질 " 은용어폴리펩타이드와상호교환적으로사용되며또한아미노산의중합체쇄를말한다. 용어 " 폴리펩타이드 " 는천연또는인공단백질, 단백질단편및단백질서열의폴리펩타이드유사체를포함한다. 폴리펩타이드는단량체또는중합체일수있다. 용어 " 폴리펩타이드 " 는, 내용에서부인하지않는한, 단편및이의변이체 ( 변이체의단편포함 ) 를포함한다. 항원성폴리펩타이드에관하여, 폴리펩타이드의단편은폴리펩타이드의적어도하나의연속되거나비선형인에피토프를임의로함유한다. 적어도하나의에피토프단편의정확한경계는당해분야의통상의기술을사용하여확인할수있다. 단편은적어도약 5개의연속된아미노산, 예를들면, 적어도약 10개의연속된아미노산, 적어도약 15개의연속된아미노산, 또는적어도약 20개의연속된아미노산을포함한다. 폴리펩타이드의변이체는본원에기술된바와같다. 용어 " 분리된단백질 " 또는 " 분리된폴리펩타이드 " 는이의기원또는유도체의공급원에의해이의천연상태에서이를동반하는천연적으로관련된성분과관련되지않거나 ; 동일한종으로부터다른단백질을실질적으로함유하지않거나 ; 상이한종으로부터의세포에의해발현되거나 ; 천연적으로존재하지않는단백질또는폴리펩타이드이다. 따라서, 천연적으로기원하는세포와는상이한세포계내에서합성되거나화학적으로합성된폴리펩타이드는이의천연적으로관련된성분들로부터 " 분리 " 될것이다. 단백질은또한당해분야에잘공지된단백질정제기술을사용하여, 분리에의해천연적으로관련된성분들을실질적으로함유하지않도록할수있다. 용어 " 회수하는 " 은예를들면, 당해분야에잘공지된단백질정제기술을사용하여분리에의해천연적으로관련된성분들을실질적으로함유하지않는폴리펩타이드와같은화학종이되도록하는과정을말한다. 용어 " 사람 IL-1α"( 본원에서 hil-1α, 또는 IL-1α로약술함 ) 는각종면역반응, 염증과정및조혈에관여된다형질성사이토킨을포함한다. 예를들면, IL-1α는활성화된대식세포에의해생산된사람사이토킨을포함하며 ; 이는 IL-2 방출, B-세포성숙및증식, 및섬유모세포성장인자활성을유도함으로써흉선세포증식을자극한다. 용어사람 IL-1α는표준재조합체발현방법에의해제조될수있는재조합체사람 IL-1α(rh IL-1 α) 를포함하는것으로의도된다. 용어 " 사람 IL-1β"( 본원에서 hil-1β, 또는 IL-1β로약술함 ) 는각종면역반응, 염증과정및조혈에관여된다형질성사이토킨을포함한다. 용어사람 IL-1β는표준재조합체발현방법에의해제조될수있는재조합체사람 IL-1β(rh IL-1β) 를포함한다. 사람 IL-1α 및 IL-1β의아미노산서열은표 1에나타낸다. 표 1 [0192] [0193] [0194] 용어 " 생물학적활성 " 은 IL-1 사이토킨, 예를들면, IL-1α 및 / 또는 IL-1β의모든고유의생물학적특성을말한다. IL-1α 및 IL-1β의생물학적특성은 IL-1 수용체에대한결합을포함하나, 이에한정되지않는다. 항체, 단백질또는펩타이드와제2 화학종 (chemical species) 의상호작용과관련하여용어 " 특이적인결합 " 또는 " 특이적으로결합하는 " 은, 상호작용이화학종에서특수구조 ( 예를들면, 항원결정인자또는에피토프 ) 의존재에의존하며 ; 예를들면, 항체가일반적으로단백질이외에특이적단백질구조를인식하여이에결합함을

90 의미한다. 항체가에피토프 "A" 에대해특이적인경우, 표지된 "A" 및항체를함유하는반응에서에피토프 A ( 또는유리되고, 표지되지않은 A) 를함유하는분자의존재는항체에결합된, 표지된 A 의양을감소시킬 것이다. [0195] [0196] [0197] [0198] 용어 " 항체 " 는넓게는 4개의폴리펩타이드쇄, 2개의중 (H) 쇄및 2개의경 (L) 쇄로구성된어떠한면역글로불린 (Ig) 분자, 또는 Ig 분자의필수적인에피토프결합특징을보유한, 이의모든기능적단편, 돌연변이체, 변이체, 또는유도체를말한다. 이러한돌연변이체, 변이체, 또는유도적항체양식은당해분야에공지되어있다. 이의비제한적인양태는하기에논의된다. 완전한길이의항체에서, 각각의중쇄는중쇄가변영역 ( 본원에서 HCVR 또는 VH로약술함 ) 및중쇄불변영역으로구성된다. 중쇄불변영역은 3개의도메인 : CH1, CH2, 및 CH3으로구성된다. 각각의경쇄는경쇄가변영역 ( 본원에서 LCVR 또는 VL로약술함 ) 및경쇄불변영역으로구성된다. 경쇄불변영역은하나의도메인, CL로구성된다. VH 및 VL 영역은또한골격영역 (FR) 으로명명된, 보다보존된영역들사이에배치된상보성결정영역 (CDR) 으로명명된초가변성의영역으로추가로아분될수있다. 각각의 VH 및 VL은다음순서로아미노-말단으로부터카복시-말단까지배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로구성된다 : FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 면역글로불린분자는어떠한유형 ( 예를들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 ( 예를들면, IgG 1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는소부류일수있다. 용어 "Fc 영역 " 은완전한항체의파파인분해에의해생성될수있는면역글로불린중쇄의 C-말단영역을정의하는데사용된다. Fc 영역은천연서열 Fc 영역또는변이체 Fc 영역일수있다. 면역글로불린의 Fc 영역은일반적으로 2개의불변도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을포함하며, 임의로 CH4 도메인을포함한다. 항체효과기기능을변경시키기위한 Fc 부분에서아미노산잔기의교체는당해분야에공지되어있다 ( 참조 : Winter et al., 미국특허공보제5,648,260호및제5,624,821호 ). 항체의 Fc 부분은수개의중요한효과기기능, 예를들면, 사이토킨유도, ADCC, 포식작용, 상보체의존성세포독성 (CDC), 및항체및항원-항체복합체의반감기 / 클리어런스비율 (clearance rate) 을매개한다. 일부경우에, 이들효과기기능은치료용항체에바람직하지만기타경우에는치료학적목적에좌우되어, 불필요할수있거나유해할수도있다. 특정의사람 IgG 동형, 특히 IgG1 및 IgG3은 FcγR 및상보체 C1q 각각에대한결합을통해 ADCC 및 CDC를매개한다. 신생 Fc 수용체 (FcRn) 는항체의순환하는반감기를측정하는중요한성분이다. 여전히다른양태에서적어도하나의아미노산잔기는항체의불변영역, 예를들면, 항체의 Fc 영역에서교체됨으로써, 항체의효과기기능이변경된다. 면역글로불린의 2개의동일한중쇄의이합체화는 CH3 도메인의이합체화에의해매개되며힌지영역내에서이황화물결합에의해안정화된다 [ 참조 : Huber et al., Nature, 264: (1976); Thies et al., J. Mol. Biol., 293: (1999)]. 중쇄-중쇄이황화물결합을방지하기위한힌지 (hinge) 영역내시스테인잔기의돌연변이는 CH3 도메인의이합체화를탈안정화시킬것이다. CH3 이합체화에관여하는잔기는확인되어있다 [ 참조 : Dall'Acqua et al., Biochemistry, 37: (1998)]. 따라서, 1가의반-Ig를생성하는것이가능하다. 흥미롭게도, 이들 1가의반 Ig 분자는 IgG 및 IgA 소부류둘다의경우천연적으로발견되어왔다 [ 참조 : Seligmann et al., Ann. Immunol., 129 C: (1978); Biewenga et al., Clin. Exp. Immunol., 51: (1983)]. FcRn:Ig Fc 영역의화학량론은 2:1인것으로측정되었으며 [ 참조 : West et al., Biochemistry, 39: (2000)], 반 Fc는 FcRn 결합을매개하는데충분하다 [ 참조 : Kim et al., Eur. J. Immunol., 24: (1994)]. CH3 도메인의이합체화를파괴하기위한돌연변이는, CH3 이합체화에중요한잔기가 CH3 β 쉬트 (sheet) 구조의내부계면에위치한반면, FcRn 결합에관여하는영역은 CH2-CH3 도메인의외부계면에위치하므로, 이의 FcRn 결합에있어보다큰부작용을가지지않을수있다. 그러나, 반 Ig 분자는정규의항체보다자체의보다작은크기로인하여조직침투에있어특정의장점을가질수있다. 하나의양태에서, 적어도하나의아미노산잔기는본발명의결합단백질의불변영역, 예를들면, Fc 영역에서대체됨으로써, 중쇄의이합체화가파괴되어, 반 DVD Ig 분자가생성된다. IgG 의소염활성은 IgG Fc 단편의 N-연결된글리칸의시알릴화에완전히의존적이다. 소염활성의상세한글리칸요건은측정되었으므로, 적절한 IgG1 Fc 단편을생성함으로써효능이크게향상된완전한재조합체, 시알릴화된 IgG1 Fc를생성시킬수있다 [ 참조 : Anthony et al., Science, 320: (2008)]. 용어항체의 " 항원-결합부분 " 은항원 ( 예를들면, hil-1β) 에특이적으로결합하는능력을보유하는항체의하나이상의단편을말한다. 항체의항원-결합기능은완전한길이의항체의단편으로수행할수있음이밝혀졌다. 이러한항체양태는또한이특이적, 이중특이적, 또는다특이적양식일수있으며 ; 2개이상의상이한항원 ( 예를들면, hil-1β 및상이한항원분자, 예를들면, hil-1β 및 hil-1α) 에특이적으로결합할수있다. 용어항체의 " 항원-결합부분 " 내에포함된결합단편의예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로이

91 루어진 1가단편 ; (ii) F(ab') 2 단편, 힌지영역에서이황화물브릿지에의해연결된 2개의 Fab 단편을포함하는 2가단편 ; (iii) VH 및 CH1 도메인으로이루어진 Fd 단편 ; (iv) 항체의단일아암 (arm) 의 VL 및 VH 도메인으로이루어진 Fv 단편 ; (v) 단일의가변도메인을포함하는 dab 단편 [ 참조 : Ward et al., Nature, 341: (1989); PCT 공보제WO 90/05144호 ]; 및 (vi) 분리된상보성결정영역 (CDR) 을포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의도메인, VL 및 VH가별개의유전자에의해암호화되어있다고해도, 이들은재조합체방법을사용하여, 이들을 VL 및 VH 영역이쌍을이루어 1가분자 [ 단일쇄 Fv(scFv) 로공지됨 ; 참조 : 예를들면, Bird et al., Science, 242: (1988); 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: (198 8)] 를형성하는단일단백질쇄로제조될수있도록하는합성링커에의해결합될수있다. 이러한단일쇄항체는또한용어항체의 " 항원-결합부분 " 내에포함되는것으로의도된다. 디아바디와같은단일쇄항체의다른형태또한포함된다. 디아바디는, VH 및 VL 도메인이단일폴리펩타이드쇄에서발현되지만동일한쇄에서 2개의도메인사이에쌍을이루도록하기에는너무짧은링커를사용함으로써, 도메인이다른쇄의상보성도메인과쌍을이루어 2개의항원결합부위를생성하도록하는 2가의, 이특이적인항체이다 [ 참조 : 예를들면, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: (1993); Poljak, R.J., Structure, 2: (1994)]. 이러한항체결합부분은당해분야에공지되어있다 [ 참조 : Kontermann and Duebel eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag, New York, 2001), p. 790 (ISBN )]. 추가로, 단일쇄항체는또한상보성경쇄폴리펩타이드와함께, 항원결합영역의쌍을형성하는탄뎀 (tandem) Fv 분절의쌍 (VH-CH1-VH-CH1) 을포함하는 " 선형항체 " 를포함한다 [ 참조 : Zapata et al., Protein Eng., 8(10): (1995); 및미국특허공보제 5,641,870호 )]. [0199] [0200] 면역글로불린불변 (C) 도메인은중쇄 (CH) 또는경쇄 (CL) 불변도메인을말한다. 뮤린 (murine) 및사람 IgG 중쇄및경쇄불변도메인아미노산서열은당해분야에공지되어있다. 용어 "IL-1β 결합단백질작제물 "( 또는 " 결합단백질작제물 ") 은링커또는면역글로불린불변도메인에연결된본발명의항원결합부분중하나이상을포함하는폴리펩타이드를말한다. " 링커폴리펩타이드 " 는펩타이드결합에의해결합된 2개이상의아미노산잔기를포함하며하나이상의항원결합부분을연결하는데사용된다. 이러한링커폴리펩타이드는당해분야에잘공지되어있다 [ 참조 : 예를들면, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: (1993); Poljak, R.J., Structure, 2: (1994)]. 면역글로불린불변도메인은중쇄또는경쇄불변도메인을말한다. 사람 IgG 중쇄및경쇄불변도메인아미노산서열은당해분야에공지되어있으며표 2에나타낸다

92 표 2 [0201] [0202] 여전히추가로, 항체또는이의항원-결합부분과같은, IL-1β 결합단백질은항체또는항원-결합부분과하나이상의다른단백질또는펩타이드의공유또는비공유결합적연합에의해형성된보다큰면역부착분자의일부일수있다. 이러한면역부착분자의예는사합체 scfv 분자를제조하기위한스트렙타비딘코어영역의사용 [ 참조 : Kipriyanov et al., Human Antibod. Hybridomas, 6: (1995)] 및 2가및바이오티닐화된 scfv 분자를제조하기위한시스테인잔기, 마커펩타이드및 C-말단폴리히스티딘태그의사용을포함한다 [ 참조 : Kipriyanov et al., Mol. Immunol., 31: (1994)]. Fab 및 F(ab') 2 단편과같은항체부분은전 체항체로부터전체항체의파파인또는펩신분해각각과같은통상의기술을사용하여제조할수있다. 또한, 항체, 이의항원 - 결합부분, 및면역부착분자들은표준재조합체 DNA 기술을사용하여수득할수있다. [0203] [0204] [0205] " 분리된항체 " 는상이한항원특이성을갖는다른항체를실질적으로함유하지않는항체를말하는것으로의도된다 ( 예를들면, hil-1β에특이적으로결합하는분리된항체는 hil-1β 이외의항원에특이적으로결합한항체를실질적으로함유하지않는다 ). 그러나, hil-1β에특이적으로결합하는분리된항체는다른종으로부터의 IL-1β 분자와같은다른항원과교차-반응성을가질수있다. 또한, 분리된항체는다른세포물질및 / 또는화합물질을실질적으로함유하지않을수있다. 용어 " 단클론항체 " 또는 "mab" 는실질적으로동종항체의집단으로부터수득된항체, 즉, 소량으로존재할수있는가능한한천연적으로존재하는돌연변이를제외하고는동일한집단을포함하는개개항체를말한다. 단클론항체는단일항원에대해직접적으로고도로특이적이다. 또한, 상이한결정인자들 ( 에피토프 ) 에대해직접적인상이한항체들을전형적으로포함하는다클론항체제제와는대조적으로, 각각의 mab는항원에서단일의결정인자에대해직접적이다. 개질인자 " 단클론 " 은어떠한특수방법에의해항체의생산에요구되는것으로고려되지않아야한다. 용어 " 사람항체 " 는사람배선면역글로불린서열로부터기원한가변및불변영역을갖는항체를포함한다. 본발명의사람항체는예를들면, CDR 및특히 CDR3에서사람배선면역글로불린서열에의해암호화되지않은아미노산잔기 ( 예를들면, 시험관내에서무작위적또는부위-특이적돌연변이유발에의해또는생체내에서체세

93 포돌연변이에의해도입된돌연변이 ) 를포함할수있다. 그러나, 용어 " 사람항체 " 는마우스와같은다른포 유동물종의배선으로부터기원한 CDR 서열이사람골격서열상으로이식된항체를포함하지않는다. [0206] [0207] [0208] [0209] [0210] 용어 " 재조합체사람항체 " 는재조합체수단에의해제조되거나, 발현되거나, 생성되거나분리된모든사람항체, 예를들면, 숙주세포내로형질감염된재조합체발현벡터를사용하여발현된항체 ( 하기단락 IIC에서추가로기술 ), 재조합체, 조합사람항체라이브러리로부터분리된항체 [ 참조 : Hoogenboom, H.R., Trends Biotechnol., 15: (1997); Azzazy and Highsmith, Clin. Biochem., 35: (2002); Gavilondo and Larrick, BioTechniques, 29: (2000); Hoogenboom and Chames, Immunol. Today, 21: (2000)], 사람면역글로불린유전자에대해유전자삽입성인동물 ( 예를들면, 마우스 ) 로부터분리된항체 [ 참조 : 예를들면, Taylor et al., Nucl. Acids Res., 20: (1992); Kellermann and Green, Curr. Opin. Biotechnol., 13: (2002); Little et al., Immunol. Today, 21: (2000)]; 또는다른 DNA 서열에대해사람면역글로불린유선자서열의스플라이싱 (splicing) 을포함하는어떠한다른수단에의해제조되거나, 발현되거나, 생성되거나분리된항체를포함한다. 이러한재조합체사람항체는사람배선면역글로불린서열로부터기원한가변및불변영역을갖는다. 그러나, 특정양태에서, 이러한재조합체사람항체는시험관내돌연변이유발 ( 또는, 사람 Ig 서열에대해유전자삽입성인동물을사용하는경우, 생체내체세포돌연변이유발 ) 에적용되므로재조합체항체의 VH 및 VL 영역의아미노산서열은사람배선 VH 및 VL 서열로부터기원하고이와관련되지만생체내에서사람항체배선레퍼토리내에천연적으로존재하지않는서열일수있다. 용어 " 키메라항체 " 는하나의종으로부터의중쇄및경쇄가변영역서열및다른종으로부터의불변영역서열을포함하는항체, 예를들면, 사람불변영역에연결된뮤린중쇄및경쇄가변영역을갖는항체를말한다. 용어 "CDR-이식된항체 " 는하나의종으로부터의중쇄및경쇄가변영역서열을포함하지만여기서 VH 및 / 또는 VL의 CDR 영역중하나이상의서열이다른종의 CDR 서열로교체된항체, 예를들면, 뮤린중쇄및경쇄가변영역을갖고, 여기서뮤린 CDR( 예를들면, CDR3) 중하나이상이사람 CDR 서열로교체된항체를말한다. 용어 "CDR" 은항체가변서열내상보성결정영역을말한다. 가변영역각각에대해, CDR1, CDR2 및 CDR3으로지정된, 중쇄및경쇄의가변영역각각에서 3개의 CDR이존재한다. 본원에사용된것으로서용어 "CDR 세트 " 는항원을결합시킬수있는단일의가변영역에존재하는 3개의 CDR의그룹을말한다. 이들 CDR의정확한경계는상이한시스템에따라상이하게정의되어왔다. 카밧이기술한시스템 [ 참조 : Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1987) and (1991)] 은항체의어떠한가변영역에도적용가능한명확한잔기번호매김시스템을제공할뿐아니라, 3개의 CDR을정의하는정밀한잔기경계도제공한다. 이들 CDR은카밧 CDR로언급될수있다. 쵸티아및공동연구자들 [ 참조 : Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: (1987); 및 Chothia et al., Nature, 342: (1989)] 은, 카밧 CDR내특정의소-부분이아미노산서열의수준에있어서큰다양성을가짐에도불구하고, 거의동일한펩타이드백본 (backbone) 형태를채택함을발견하였다. 이들소-부분은 L1, L2, 및 L3 또는 H1, H2, 및 H3로지정되었으며, 여기서 "L" 및 "H" 는경쇄및중쇄영역을각각나타낸다. 이들영역은쵸티아 CDR 로언급될수있으며, 이는카밧 CDR과오버랩되는경계를갖는다. 카밧 CDR과오버랩되는 CDR을정의하는다른경계는파들란 (Padlan) 등의문헌 [ 참조 : FASEB J., 9: (1995)) 및 MacCallum et al. (J. Mol. Biol., 262(5): (1996)] 에기술되어있다. 여전히다른 CDR 경계부정의는상기시스템들중하나를엄격하게따르지않을수있지만, 이러한특수잔기들또는잔기들의그룹또는심지어전체 CDR이항원결합에유의적으로영향을미치지않는다는예측또는실험적발견의관점에서단축될수있거나길어질수있다해도, 카밧 CDR과오버랩되지않을것이다. 본원에사용된방법은, 예시적인양태가카밧또는쵸티아정의된 CDR을사용한다고해도, 이들시스템중어느것에따라정의된 CDR을이용할수있다. 용어 " 카밧번호매김 ", " 카밧정의 ", 및 " 카밧표지화 " 는본원에서상호교환적으로사용된다. 당해분야에서인식되는이들용어들은항체, 또는이의항원결합부분의중쇄및경쇄가변영역내다른아미노산잔기보다더가변성 ( 즉, 초가변성 ) 인아미노산잔기의번호매김시스템을말한다 [ 참조 : Kabat et al., Ann. NY Acad. Sci., 190: (1971); 및 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공보제 (1991)]. 중쇄가변영역의경우, 초가변영역은 CDR1의경우 31 내지 35번아미노산위치, CDR2의경우 50 내지 65번아미노산위치, 및 CDR3의경우 95 내지 102번아미노산위치의범위이다. 경쇄가변영역의경우, 초가변영역은 CDR1의경우 24 내지 34번아미노산위치, CDR2의경우 50 내지 56번아미노산위치, 및 CDR3의경우 89 내지 97번아미노산위치의범위이다

94 [0211] [0212] [0213] [0214] [0215] [0216] [0217] [0218] [0219] [0220] [0221] [0222] [0223] [0224] [0225] [0226] [0227] [0228] [0229] [0230] [0231] [0232] [0233] [0234] [0235] [0236] [0237] 과거 20년에걸쳐가변중쇄및경쇄영역의아미노산서열의집중적인공공의데이타베이스의성장및분석은가변영역서열내골격영역 (FR) 과 CDR 서열사이의전형적인경계의이해를가져왔으며당해분야의숙련가가카밧번호매김, 초티아번호매김, 또는다른시스템에따라 CDR을정밀하게측정할수있도록하였다 [ 참조 : 예를들면, Martin, "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," Chapter 31, In Antibody Engineering, (Kontermann and Duebel, eds.) (Springer-Verlag, Berlin, 2001), 특히 pages ]. 가변중쇄 (VH) 및가변경쇄 (VL) 영역의아미노산서열내에서카밧 CDR의아미노산서열을측정하는유용한방법은하기제공된다 : CDR-L1 아미노산서열을확인하기위하여 : VL 영역의아미노말단으로부터대략 23개아미노산잔기로부터출발하고 ; CDR-L1 서열앞의잔기는항상시스테인 (C) 이며 ; CDR-L1 서열이후의잔기는항상트립토판 (W) 잔기, 전형적으로 Trp-Tyr-Gln (W-Y-Q) 이지만, 또한 Trp-Leu-Gln (W-L-Q), Trp-Phe-Gln (W-F-Q), 및 Trp-Tyr-Leu (W-Y-L) 이고 ; 길이는전형적으로 10 내지 17개아미노산잔기이다. CDR-L2 아미노산서열을확인하기위하여 : CDR-L1의말단후 16개잔기로항상출발하고 ; CDR-L2 서열앞의잔기는일반적으로 Ile-Tyr (I-Y) 이지만, 또한 Val-Tyr (V-Y), Ile-Lys (I-K), 및 Ile-Phe (I-F) 이고 ; 길이는항상 7개아미노산잔기이다. CDR-L3 아미노산서열을확인하기위하여 : CDR-L2의말단후 33개아미노산으로항상출발하고 ; CDR-L3 아미노산서열앞의잔기는항상시스테인 (C) 이며 ; CDR-L3 서열이후의잔기는항상 Phe-Gly-X-Gly (F-G-X-G) ( 서열번호 11) 이고, 여기서 X는어떠한아미노산이며 ; 길이는전형적으로 7 내지 11개아미노산잔기이다. CDR-H1 아미노산서열을확인하기위하여 : VH 영역의아미노말단으로부터대략 31개아미노산잔기및시스테인 (C) 이후항상 9개잔기로부터출발하고 ; CDR-H1 서열앞의잔기는항상 Cys-X-X-X-X-X-X-X-X ( 서열번호 12) 이고, 여기서 X는어떠한아미노산이며 ; CDR-H1 서열이후의잔기는항상 Trp (W), 전형적으로 Trp-Val (W-V) 이지만, 또한 Trp-Ile (W-I), 및 Trp-Ala (W-A) 이고 ; 길이는전형적으로 5 내지 7개아미노산잔기이다. CDR-H2 아미노산서열을확인하기위하여 : CDR-H1의말단이후항상 15개아미노산잔기로출발하고 ; CDR-H2 서열앞의잔기들은전형적으로 Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (L-E-W-I-G) ( 서열번호 23) 이지만다른변이들이또한존재하고 ; CDR-H2 서열이후의잔기는 Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala (K/R-L/I/V/F/T/A-T/S/I/A) 이며 ; 길이는전형적으로 16 내지 19개아미노산잔기이다. CDR-H3 아미노산서열을확인하기위하여 : CDR-H2의말단이후에항상 33개아미노산잔기및시스테인 (C)' 이후에항상 3개아미노산잔기로출발하고 ;

95 [0238] [0239] [0240] [0241] [0242] [0243] [0244] [0245] CDR-H3 서열앞의잔기는항상 Cys-X-X (C-X-X)( 여기서 X는어떠한아미노산이다 ), 전형적으로 Cys-Ala-Arg (C-A-R) 이며 ; CDR-H3 서열이후의잔기는항상 Trp-Gly-X-Gly (W-G-X-G) ( 서열번호 24)( 여기서, X는어떠한아미노산이다 ) 이고 ; 길이는전형적으로 3 내지 25개아미노산잔기이다. 본원에사용된것으로서, 용어 " 정규 (canonical)" 잔기는둘다본원에참조로인용된쵸티아등의문헌 [ 참조 : J. Mol. Biol., 196: (1987)); 및쵸티아등의문헌 [ 참조 : J. Mol. Biol., 227: (1992)] 에의해정의된바와같은특수정규 CDR 구조를정의하는골격또는 CDR내잔기를말한다. 쵸티아등에따라서, 많은항체들의 CDR의중요부분은아미노산서열의수준에있어서큰다양성에도불구하고거의동일한펩타이드백본형태를갖는다. 각각의정규구조는루프를형성하는아미노산잔기의연속적인분절에대한펩타이드백본비틀림각의세트를주로명시한다. " 친화성성숙된 " 항체는변경 ( 들 ) 을소유하지않는모항체와비교하여, 표적항원에대해항체의친화성에있어서개선을초래하는이의하나이상의 CDR에있어서의하나이상의변형을갖는항체이다. 예시적인친화성성숙된항체는표적항원에대해나노몰 (nanomolar) 또는심지어피코몰 (picomolar) 친화성을가질것이다. 친화성성숙된항체를생산하기위한각종과정들이당해분야에공지되어있다. 예를들면, 문헌 [ 참조 : Marks et al., BioTechnology, 10: (1992)] 에서는 VH 및 VL 도메인셔플링 (shuffling) 에의한친화성성숙을기술한다. CDR 및 / 또는골격잔기의무작위돌연변이유발은문헌 [ 참조 : Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: (1994); Schier et al., Gene, 169: (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): (1995); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: (1992)] 에기술되어있다. 선택적인돌연변이유발위치및활성향상아미노산잔기와의접촉또는초돌연변이위치에서선택적인돌연변이는미국특허공보제6,914,128 B1호에기술되어있다. 용어 " 다가결합단백질 " 은 2개이상의항원결합부위를포함하는결합단백질을나타낸다. 다가결합단백질은바람직하게는가공되어 3개이상의항원결합부위를가지며, 일반적으로천연적으로존재하는항체가아니다. 용어 " 다특이적결합단백질 " 은 2개이상의관련되거나관련되지않은표적을결합시킬수있는결합단백질을말한다. 본발명의 " 이중가변도메인 "("DVD") 결합단백질은 2개이상의항원결합부위를포함하며 4가또는다가결합단백질이다. DVD는일특이적일수있으며, 즉, 하나의항원에결합할수있거나, 다특이적, 즉 2개이상의항원에결합할수있다. 2개의중쇄 DVD 폴리펩타이드및 2개의경쇄 DVD 폴리펩타이드를포함하는 DVD 결합단백질은 "DVD 면역글로불린 " 또는 "DVD-Ig" 로언급된다. DVD-Ig의각각의반은중쇄 DVD 폴리펩타이드및경쇄 DVD 폴리펩타이드, 및 2개이상의항원결합부위를포함한다. 각각의결합부위는항원결합부위당항원결합에관여된총 6개의 CDR을갖는중쇄가변도메인및경쇄가변도메인을포함한다. DVD-Ig 분자의설계, 발현, 및특성화의기술은 PCT 공보제WO 2007/024715호 ; 미국특허공보제7,612,181호 ; 및문헌 [ 참조 : Wu et al., Nature Biotechnol., 25: (2007)] 에서제공된다. 이러한 DVD-Ig 분자의바람직한예는구조식 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n( 여기서, VD1은제1의중쇄가변도메인이고, VD2 는제2의중쇄가변도메인이며, C는중쇄불변도메인이고, X1은링커이며단, 이것은 CH1이아니고, X2는 Fc 영역이고, n은 0 또는 1이지만, 바람직하게는 1이다 ) 를포함하는중쇄 ; 및구조식 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n( 여기서, VD1은제1의경쇄가변도메인이고, VD2는제2의경쇄가변도메인이며, C는경쇄불변도메인이고, X1은링커이며단, 이것은 CH1이아니고, X2는 Fc 영역을포함하지않으며 ; n은 0 또는 1이지만, 바람직하게는 1이다 ) 를포함하는경쇄를포함한다. 이러한 DVD-Ig는 2개의이러한중쇄및 2개의이러한경쇄를포함할수있으며, 여기서각각의쇄는가변영역들사이에중간불변영역 (intervening constant region) 이없이탄뎀으로연결된가변도메인을포함하며, 여기서중쇄및경쇄는연합하여탄뎀기능성항원결합부위를형성하고, 중쇄및경쇄의쌍은중쇄및경쇄의다른쌍과연합하여 4개의기능성항원결합부위를갖는사합체성결합단백질을형성한다. 다른예에서, DVD-Ig 분자는가변도메인들사이에중간불변영역없이탄뎀으로연결된 3 개의가변도메인 (VD1, VD2, VD3) 을각각포함하는중쇄및경쇄를포함할수있으며, 여기서중쇄및경쇄의쌍은연합하여 3개의항원결합부위를형성할수있고, 여기서중쇄및경쇄의쌍은중쇄및경쇄의다른쌍과연합하여 6개의항원결합부위를갖는사합체성결합단백질을형성할수있다. DVD-Ig 결합단백질은 IL-1β의하나이상의에피토프에결합할수있다. DVD-Ig 결합단백질은또한 IL-1β의에피토프및 IL-1β 폴리펩타이드이외의제2의표적항원의에피토프에또한결합할수있다

96 [0246] [0247] [0248] [0249] [0250] [0251] [0252] 본원에사용된것으로서, 용어 " 이특이적항체 " 는이의단지하나가기능성의이특이적항체인다수의상이한면역글로불린종을생성하는, 콰드로마기술 (quadroma technology)[ 참조 : Milstein and Cuello, Nature, 305: (1983)] 에의해, 2개의상이한단클론항체의화학적접합에의해 [ 참조 : Staerz et al., Nature, 314: (1985)], 또는놉-인투-홀 (knob-into-hole) 또는 Fc 영역내에돌연변이를도입하는유사한시도 [ 참조 : Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(14): (1993)] 에의해생성되는완전한길이의항체를말한다. 분자기능에의해, 이특이적항체는이의 2개의결합아암중하나 (HC/LC의하나의쌍 ) 에서하나의항원 ( 또는에피토프 ) 에결합하고, 이의제2의아암 (HC/LC의상이한쌍 ) 의상이한항원 ( 또는에피토프 ) 에결합한다. 당해정의에의해, 이특이적항체는 2개의명백한항원결합아암 ( 특이성및 CDR 서열둘다 ) 을가지며, 이것이결합하는각각의항원에대해 1가이다. 본원에사용된것으로서, 용어 " 이중-특이적인항체 " 는이의 2개의결합아암 (HC/LC의쌍 ) 의각각에서 2개의상이한항원 ( 또는에피토프 ) 에결합할수있는완전한길이의항체를말한다 ( 참조 : PCT 공보제WO 02/02773호 ). 따라서, 이중-특이적인결합단백질은동일한특이성및동일한 CDR 서열을갖는 2개의동일한항원결합아암을가지며이것이결합하는각각의항원에대해 2가이다. 결합단백질의 " 기능적항원결합부위 " 는표적항원에결합할수있는것이다. 항원결합부위의항원결합친화성은, 항원결합부위가기원하는모항체와같이필수적으로강력하지않지만, 항원에결합하는능력은항원에대한항체결합을평가하기위해공지된각종방법중어느하나를사용하여측정할수있어야한다. 또한, 본원의다가항체의항원결합부위각각의항원결합친화성은정량적으로동일할필요는없다. 용어 " 사이토킨 " 은하나의세포집단에의해방출되고세포내매개인자로서다른세포집단에서작용하는단백질에대한일반적인용어이다. 이러한사이토킨의예는림포킨, 모노킨, 및전통적인폴리펩타이드호르몬이다. 사이토킨중에는사람성장호르몬, N-메티오닐사람성장호르몬, 및소성장호르몬과같은성장호르몬 ; 부갑상샘호르몬 ; 티록신 ; 인슐린 ; 프로인슐린 ; 렐락신 ; 프로렐락신 ; 난포자극호르몬 (FSH), 갑상샘자극호르몬 (TSH), 및황체화호르몬 (LH) 과같은당단백질호르몬 ; 간성장인자 ; 섬유모세포성장인자 ; 프롤락틴 ; 태반락토겐 ; 종양괴사인자-알파 (TNF-α) 및종양괴사인자-베타 (TNF-β) 와같은종양괴사인자 ; 뮬러리안 (mullerian)-억제물질 ; 마우스고나도트로핀-결합된펩타이드 ; 인히빈 ; 악티빈 ; 혈관내피성장인자 ; 인테그린 ; 트롬보포이에틴 (TPO); NGF-알파 (NGF-α) 와같은신경성장인자 ; 혈소판-성장인자 ; 태반성장인자 ; TGF-알파 (TGF-α) 및 TGF-베타 (TGF-β) 와같은형질전환성장인자 (TGF); 인슐린-유사성장인자-1 및 -11; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도인자 ; 인터페론-알파 (IFN-α), 인터페론-베타 (IFN-β), 및인터페론-감마 (IFNγ) 와같은인터페론 ; 대식세포-CSF (M-CSF) 와같은콜로니자극인자 (CSF); 과립구대식세포-CSF (GM-CSF); 및과립구-CSF (G-CSF); IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-33과같은인터루킨 (IL); 및 LIF를포함하는다른폴리펩타이드인자및키트리간드 (KL) 가포함된다. 본원에사용된것으로서, 용어사이토킨은천연공급원으로부터또는재조합체세포배양물로부터의단백질및천연서열사이토킨의생물학적으로활성인등량체를포함한다. 본원에사용된것으로서, 용어 " 공여체 " 및 " 공여체항체 " 는하나이상의 CDR을제공하는항체를말한다. 예시적인양태에서, 공여체항체는, 골격영역이수득되거나기원된항체와상이한종으로부터의항체이다. 사람화된항체와관련하여, 용어 " 공여체항체 " 는하나이상의 CDR을제공하는비-사람항체를말한다. 본원에사용된것으로서, 용어 " 골격 " 또는 " 골격서열 " 은각종영역에서 CDR을뺀나머지서열을말한다. CDR 서열의정확한정의는상이한시스템에의해측정될수있으므로, 골격서열의의미는상응하게상이한해석에적용된다. 6개의 CDR( 경쇄의 CDR-L1, -L2, 및 -L3 및중쇄의 CDR-H1, -H2, 및 -H3) 은또한경쇄및중쇄위의골격영역을각각의쇄위의 4개의소-영역 (FR1, FR2, FR3 및 FR4) 으로나누며, 여기서 CDR1은 FR1과 FR2 사이에위치하고, CDR2는 FR2와 FR3 사이에위치하며, CDR3은 FR3와 FR4 사이에위치한다. FR1, FR2, FR3 또는 FR4와같은특수한소-영역을명시하지않고, 다른것들에의해언급된바와같은, 골격영역은단일의천연적으로존재하는면역글로불린쇄의가변영역내조합된 FR을나타낸다. 본원에사용된것으로서, FR은 4개의소 -영역중하나를나타내고, FR은골격영역을구성하는 4개의소-영역중 2개이상을나타낸다. 본원에사용된것으로서, 용어 " 수용체 " 및 " 수용체항체 " 는골격영역중하나이상의아미노산서열의적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100% 를제공하는항체또는이를암호화하는핵산서열을말한다. 일부양태에서, 용어 " 수용체 " 는불변영역 ( 들 ) 을제공하는항체아미노산또는이를암호화하는핵산서열을말한다. 여전히다른양태에서, 용어 " 수용체 " 는골격영역및불변영역 ( 들 ) 중하나이상을제공하는항체아미노산또는암호화하는핵산서열을말한다. 특수양태에서, 용어 " 수용체 " 는골격영역중

97 하나이상의아미노산서열의적어도 80%, 바람직하게는, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100% 를제공하거나이를암호화하는사람항체아미노산또는핵산서열을말한다. 본양태에따라서, 수용체는사람항체의하나이상의특이적인위치에서발생하지않는적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는적어도 10개의아미노산잔기를함유할수있다. 수용체골격영역및 / 또는수용체불변영역 ( 들 ) 은예를들면, 배선항체유전자, 성숙한항체유전자, 기능적항체 ( 예를들면, 당해분야에잘공지된항체, 개발중인항체, 또는시판중인항체 ) 로부터기원하거나수득될수있다. [0253] 사람중쇄및경쇄수용체서열은당해분야에공지되어있다. 본발명의하나의양태에서, 사람중쇄및경쇄 수용체서열은 V- 염기 ( 또는 IMGT the international ImMunoGeneTics information system ( 으로부터나열된서열로부터 선택된다. 본발명의다른양태에서사람중쇄및경쇄수용체서열은표 3 및표 4 에기술된서열로부터선택 된다. 표 3 [0254]

98 [0255] [0256]

99 표 4 [0257]

100 [0258] [0259] [0260] [0261] 본원에사용된것으로서, 용어 " 배선항체유전자 " 또는 " 유전자단편 " 은특수면역글로불린의발현을위한유전적재배열및돌연변이를초래하는성숙과정을겪지않는비-림프구세포에의해암호화된면역글로불린서열을말한다 [ 참조 : 예를들면, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol., 22(3): (2002); Marchalonis et al., Adv. Exp. Med. Biol., 484: (2001)]. 본발명의각종양태에의해제공된장점들중하나는, 배아항체유전자가성숙한항체유전자보다종에서개인의필수적인아미노산서열구조특징을보존하는경향이있어서, 이러한종에서치료학적으로사용되는경우외부공급원으로부터와같이인식되는경향이거의없다는인식에기인한다. 본원에사용된것으로서, 용어 " 키이 " 잔기는항체, 특히사람화된항체의결합특이성및 / 또는친화성에보다큰영향을갖는가변영역내특정잔기를말한다. 키이잔기는다음중하나이상을포함하나, 이에한정되지않는다 : CDR에인접한잔기, 강력한글리코실화잔기 (N- 또는 O-글리코실화부위일수있다 ), 드믄잔기, 항원과상호작용할수있는잔기, CDR과상호작용할수있는잔기, 정규잔기, 중쇄가변영역과경쇄가변영역사이의접촉잔기, 베르니에영역내잔기, 및가변중쇄 CDR1의쵸티아정의와제1의중쇄골격의카밧정의사이에서오버랩되는영역내잔기. 용어 " 사람화된항체 " 는비-사람종 ( 예를들면, 마우스 ) 으로부터의중쇄및경쇄가변영역서열을포함하지만여기서 VH 및 / 또는 VL 서열의적어도일부가보다 " 사람-유사 " 하게되도록, 즉사람배선가변서열과보다유

101 사하도록변경된항체를말한다. 사람화된항체의하나의유형은 CDR-이식된항체이며, 여기서사람 CDR 서열은비-사람 VH 및 VL 서열내로도입되어상응하는비사람 CDR 서열을교체한다. 또한, " 사람화된항체 " 는목적한항원에면역특이적으로결합하며실질적으로사람항체의아미노산서열을갖는골격 (FR) 영역및실질적으로비-사람항체의아미노산서열을갖는상보성결정영역 (CDR) 을포함하는항체또는변이체, 이의유도체, 유사체또는단편이다. 본원에사용된것으로서, CDR과관련하여용어 " 실질적으로 " 는비-사람항체 CDR의아미노산서열과적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는적어도 99% 동일한아미노산서열을갖는 CDR을말한다. 사람화된항체는실질적으로적어도 1개, 및전형적으로 2개의가변도메인 (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv) 을모두포함하며, 여기서 CDR 영역중모두또는실질적으로모두는비-사람면역글로불린 ( 즉, 공여체항체 ) 의것에상응하며, 골격영역의모두또는실질적으로모두는사람면역글로불린컨센서스서열의것이다. 하나의양태에서, 사람화된항체는또한면역글로불린불변영역 (Fc) 의적어도일부, 전형적으로사람면역글로불린의것을포함한다. 일부양태에서, 사람화된항체는경쇄뿐만아니라적어도중쇄의가변도메인둘다를함유한다. 항체는또한중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을포함할수있다. 일부양태에서, 사람화된항체는단지사람화된경쇄를함유한다. 일부양태에서, 사람화된항체는단지사람화된중쇄를함유한다. 특이적인양태에서, 사람화된항체는단지경쇄및 / 또는사람화된중쇄의사람화된가변도메인을함유한다. [0262] [0263] [0264] [0265] 사람화된항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를포함하는, 면역글로불린의모든부류, 및 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를포함하나이에한정되지않는모든동형으로부터선택될수있다. 사람화된항체는하나이상의부류또는동형으로부터의서열을포함할수있으며, 특수한불변도메인은당해분야에잘공지된기술을사용하여바람직한 (desired) 효과기기능을최적화하기위해선택될수있다. 사람화된항체의골격및 CDR 영역은모서열에대해정밀하게상응할필요는없는데, 예를들면, 공여체항체 CDR 또는컨센서스골격은적어도하나의아미노산잔기의치환, 삽입및 / 또는결실에의해돌연변이유발됨으로써이러한부위에서 CDR 또는골격잔기가공여체항체또는컨센서스골격에상응하지않도록할수있다. 그러나예시적인양태에서, 이러한돌연변이는대규모가아닐것이다. 일반적으로, 사람화된항체잔기의적어도 80%, 바람직하게는적어도 85%, 보다바람직하게는적어도 90%, 및가장바람직하게는적어도 95% 는모 FR 및 CDR 서열의것에상응할것이다. 본원에사용된바와같이, 용어 " 컨센서스골격 " 은컨센서스면역글로불린서열에서골격영역을말한다. 본원에사용된것으로서, 용어 " 컨센서스면역글로불린서열 " 은관련된면역글로불린서열의계열에서가장흔히존재하는아미노산 ( 또는뉴클레오타이드 ) 로부터형성된서열을말한다 [ 참조 : 예를들면, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)]. 면역글로불린의계열에서, 컨센서스서열내각각의위치는계열에서이러한위치에가장흔히발생하는아미노산에의해점유되어있다. 2개의아미노산이동등하게흔히발생하는경우, 하나는컨센서스서열내에포함될수있다. 작제되는 DVD-Ig 또는다른결합단백질분자와관련하여, " 링커 " 는펩타이드결합에의해연결되고하나이상의항원결합부분을연결하는데사용된 2개이상의아미노산잔기를포함하는단일아미노산또는폴리펩타이드 (" 링커폴리펩타이드 ") 를나타내는데사용된다. 이러한링커폴리펩타이드는당해분야에잘공지되어있다 [ 참조 : 예를들면, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: (1993); Poljak, R.J., Structure, 2: (1994)]. 예시적인링커는 GGGGSG ( 서열번호 26), GGSGG ( 서열번호 27), GGGGSGGGGS ( 서열번호 28), GGSGGGGSG ( 서열번호 223), GGSGGGGSGS ( 서열번호 29), GGSGGGGSGGGGS ( 서열번호 30), GGGGSGGGGSGGGG ( 서열번호 31), GGGGSGGGGSGGGGS ( 서열번호 32), ASTKGP ( 서열번호 33), ASTKGPSVFPLAP ( 서열번호 34), TVAAP ( 서열번호 35), RTVAAP ( 서열번호 224),TVAAPSVFIFPP ( 서열번호 36), RTVAAPSVFIFPP ( 서열번호 225), AKTTPKLEEGEFSEAR ( 서열번호 37), AKTTPKLEEGEFSEARV ( 서열번호 38), AKTTPKLGG ( 서열번호 39), SAKTTPKLGG ( 서열번호 40), SAKTTP ( 서열번호 41), RADAAP ( 서열번호 42), RADAAPTVS ( 서열번호 43), RADAAAAGGPGS ( 서열번호 44), RADAAAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ( 서열번호 45), SAKTTPKLEEGEFSEARV ( 서열번호 46), ADAAP ( 서열번호 47), ADAAPTVSIFPP ( 서열번호 48), QPKAAP ( 서열번호 49), QPKAAPSVTLFPP ( 서열번호 50), AKTTPP ( 서열번호 51), AKTTPPSVTPLAP ( 서열번호 52), akttap ( 서열번호 53), AKTTAPSVYPLAP ( 서열번호 54), GENKVEYAPALMALS ( 서열번호 55), GPAKELTPLKEAKVS ( 서열번호 56), 및 GHEAAAVMQVQYPAS ( 서열번호 57) 를포함하나, 이에한정되지않는다. 본원에사용된것으로서, " 베르니에 " 영역은본원에참조로인용된문헌 [ 참조 : Foote and Winter, J. Mol. Biol., 224: (1992)] 에기술된바와같이 CDR 구조를조절할수있고항원에대한적합도를미세하게-조율할수있는골격잔기의서브세트를말한다. 베르니에영역잔기는 CDR이근본이되는층을형성하며 CDR의구조및항체의친화성에영향을미칠수있다

102 [0266] 본원에사용된것으로서, 용어 " 중화 " 는, 결합단백질이항원에특이적으로결합하는경우항원 ( 예를들면, 사이토킨 IL-1β) 의생물학적활성의중화를말한다. 바람직하게는본원에기술된중화결합단백질은 hil-1β의생물학적활성의억제시생성되는 hil-1β에결합한다. 바람직하게는, 중화결합단백질은 hil-1β에결합하여 hil-1β의생물학적활성을적어도약 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 그이상감소시킨다. 중화결합단백질에의한 hil-1β의생물학적활성의억제는당해분야에잘공지된 hil-1β 생물학적활성의하나이상의지시인자를측정함으로써평가할수있다. 예를들면, HS27 세포내에서 IL-1β 유도에의한사람 IL-6의분비억제이다. [0267] [0268] [0269] [0270] 용어 " 활성 " 은항원에대한항체, 예를들면, IL-1β 항원에결합하는항-hIL-1β 항체의결합특이성 / 친화성및 / 또는, 항체, 예를들면 hil-1β에대한이의결합이 hil-1β의생물학적활성을억제하는, 항-IL-1β 항체의중화효능, 예를들면, HS27 세포에서 IL-1β 유도에의한사람 IL-6 분비의억제와같은활성을포함한다. 용어 " 에피토프 " 는면역글로불린또는 T-세포수용체에대해특이적결합할수있는어떠한펩타이드결정인자를포함한다. 특정양태에서, 에피토프결정인자는아미노산, 당측쇄, 포스포릴, 또는설포닐과같은분자의화학적으로활성인표면그룹화를포함하며, 특정양태에서, 특이적인 3차원구조적특성및 / 또는특이적인전하특성을가질수있다. 에피토프는항체에의해결합되는항원의영역이다. 특정양태에서, 항체는단백질및 / 또는거대분자의복합체혼합물속에서이의표적항원을우선적으로인식하는경우항원에특이적으로결합하는것으로일컬어진다. 항체는, 항체가교차-경쟁하는경우 ( 하나가다른것의결합또는조절효과를방지하는경우 ) " 동일한에피포트에결합한다 " 로일컬어진다. 또한, 에피토프의구조적정의 ( 오버랩핑, 유사한, 동일한 ) 은유익하지만, 기능적정의는, 이들이구조적 ( 결합 ) 및기능적 ( 조절, 경쟁 ) 매개변수를포함하므로, 흔히더관련이있다. 본원에사용된것으로서, 용어 " 표면플라스몬공명 " 은예를들어, BIAcore 시스템 [ 제조원 : 파마시아바이오센서아베 (Pharmacia Biosensor AB), 스웨덴웁살라및뉴저지주피츠카타웨이소재 ] 을사용하여바이오센서매트릭스내에서단백질농도에있어서의변경을검출함으로써실시간생물특이적인상호작용의분석을허용하는광학현상을말한다. 추가의설명에대해서는문헌 [ 참조 : Joensson et al., Ann. Biol. Clin., 51: (1993); Joensson et al., BioTechniques, 11: (1991); Johnsson et al., J. Mol. Recognit., 8: (1995); 및 Johnsson et al., Anal. Biochem., 198: (1991)] 을참조한다. 본원에사용된것으로서, 용어 "K on "( 또한 "Kon", "kon") 은결합단백질 ( 예를들면, 항체 ) 이항원에연합하여연 합복합체, 예를들면, 당해분야에공지된바와같은, 항체 / 항원복합체를형성하는연합의결합속도상수 (on rate constant) 를나타내는것을의도한다. "K on " 은또한본원에상호교환적으로사용되는것으로서, 용어 " 연합속도상수 " 또는 "ka" 로서공지되어있다. 당해값은하기방정식으로나타내는바와같이이의표적항원에대한항체의결합속도또는항체와항원사이의복합체형성의속도를나타낸다 : [0271] [0272] 항체 ("Ab") + 항원 ("Ag") Ab-Ag. 본원에사용된것으로서, 용어 "K off "( 또한 "Koff", "koff") 는당해분야에공지된것으로서연합복합체 ( 예를 들면, 항체 / 항원복합체 ) 로부터의결합단백질 ( 예를들면, 항체 ) 의해리를위한해리속도상수 (off rate constant), 또는 " 해리속도상수 " 를말한다. 당해값은이의표적항원으로부터항체의해리속도또는시간 에걸친 Ab-Ag 복합체의유리항체 (free antibody) 및항원으로의분리를나타낸다 : [0273] [0274] Ab + Ag Ab-Ag. 본원에사용된것으로서, 용어 "K D "( 또한 "K d ") 는 " 평형해리상수 " 를말하며, 평형에서적정측정시 수득되거나, 해리속도상수 (Koff) 를연합속도상수 (Kon) 로나누어수득된값을말한다. 연합속도상수 (Kon), 해리속도상수 (Koff), 및평형해리상수 (K) 는항원에대한항체의결합친화성을나타낸다. 연합및해리속도상수를측정하는방법은당해분야에잘공지되어있다. 형광성-계기술을사용하여평형시생리학적완충액속에서시료를시험하기위한고민감성및능력을제공한다. 다른실험적시도및 BIAcore ( 생물분자상호작용분석 ) 검사와같은장치를사용할수있다 [ 예를들면, 스웨덴웁살라에소재하는비아코어인터네셔널아베 (BIAcore International AB), 지이핼쓰케어캄파니 (GE Healthcare company) 로부터입수가능한장치 ]. 또한, 사피다인인스트루먼츠 (Sapidyne Instruments, 아이다호보이제소재 ) 로부터입수가능한 KinExA ( 역학적배출검사 ) 검사를사용할수있다

103 [0275] 용어 " 표지 " 및 " 검출가능한표지 " 는예를들면, 검출가능한항체및분석물과같은특이적인결합쌍의구성원들사이에서반응하도록하기위한항원또는분석물과같은특이적인결합파트너에부착된모이어티를의미한다. 이렇게표지된특이적인결합파트너, 예를들면, 항체또는분석물은 " 검출가능하게표지된 " 것으로언급된다. 따라서, 본원에사용된것으로서용어 " 표지된결합단백질 " 은결합단백질의확인을위해제공되는혼입된표지를지닌단백질을말한다. 하나의양태에서, 표지는가시적인또는장치적수단, 예를들면, 표시된아비딘또는스트렙타비딘 ( 예를들면, 광학적또는비색방법으로검출할수있는형광성마커또는효소활성을함유하는스트렙타비딘 ) 에의해검출할수있는바이오티닐모이어티의폴리펩타이드에대한부착또는방사선표지된아미노산의혼입에의해검출가능한시그날을생산할수있는검출가능한마커이다. 폴리펩타이드에 대한표지의예는다음을포함하나, 이에한정되지않는다 : 방사성동위원소또는방사성핵종 ( 예를들면, 3 H 14, C, S, Y, Tc, In, I, I, Lu, Ho, 또는 Sm), 색소원, 형광성표지 ( 예를들면, FITC, 로다민, 란타나이드포스포르 ), 효소표지 ( 예를들면, 서양고추냉이퍼옥시다제, 루시퍼라제, 알칼린포스파타제 ), 화학발광성마커, 바이오티닐그룹, 제2 리포터에의해인식된예정된폴리펩타이드에피토프 ( 예를들면, 류신지퍼쌍서열, 제2 항체에대한결합부위, 금속결합도메인, 에피토프태그 ), 및자기제제 ( 예를들면, 가돌리늄킬레이트 ). 면역검사에일반적으로사용된표지의대표적인예는광을생산하는모이어티, 예를들면, 아크리디늄화합물, 및형광성을생산하는모이어티, 예를들면플루오레세인을포함한다. 다른표지들은본원에기술되어있다. 이와관련하여, 모이어티자체는검출가능하게표지되지않을수있지만여전히다른모이어티와반응시검출가능하게될수있다. 용어 " 검출가능하게표지된 " 의사용은검출가능한표지화의후자의유형을포함하는것으로의도된다. [0276] [0277] [0278] [0279] [0280] 용어 "IL-1β 결합단백질접합체 " 는치료제또는세포독성제와같은, 제2 화학모이어티에화학적으로연결된본원에기술된 IL-1β 결합단백질을말한다. 용어 " 제제 " 는본원에서화학적화합물, 화학적화합물들의혼합물, 생물학적거대분자, 또는생물학적물질로부터제조된추출물을나타내기위해사용된다. 바람직하게는치료제또는세포독성제는백일해독소, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시안트라신디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및푸로마이신, 및이의유사체또는동족체를포함하나, 이에한정되지않는다. 면역검사와관련하여사용된경우, IL-1β 결합단백질접합체는검출항체로사용되는, 검출가능하게표지된항체일수있다. 본원에사용된바와같은용어 " 결정 " 및 " 결정화된 " 은결정의형태로존재하는결합단백질 ( 예를들면, 항체 ), 또는이의항원결합부분을말한다. 결정은무정형고체상태또는액체결정성상태와같이다른형태와구별되는물질의고체상태중하나의형태이다. 결정은원자, 이온, 분자 ( 예를들면, 항체와같은단백질 ), 또는분자조립체 ( 예를들면, 항원 / 항체복합체 ) 의규칙적이고, 반복되는, 3차원배열로구성된다. 이들 3-차원배열은당해분야에서잘이해되는특수한수학적관계에따라배열된다. 결정에서반복되는기본단위, 또는빌딩블록 (building block) 은비대칭단위로일컬어진다. 제공되고잘정의된결정학적대칭을따르는배열내비대칭단위의반복은결정의 " 단위셀 (unit cell)" 을제공한다. 모든 3차원에서규칙적인해독에의한단위셀의반복은결정을제공한다 [ 참조 : Giege et al., Chapter 1, In Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ed., (Ducruix and Giege, eds.) (Oxford University Press, New York, 1999) pp. 1-16]. 용어 " 폴리뉴클레오타이드 " 는리보뉴클레오타이드또는데옥시뉴클레오타이드의 2개이상의뉴클레오타이드의중합체형태또는뉴클레오타이드유형의변형된형태를의미한다. 이용어는 DNA의단일가닥및이중가닥형태를포함한다. 용어 " 분리된폴리뉴클레오타이드 " 는이의기원측면에서, " 분리된폴리뉴클레오타이드 " 가, 이것이천연적으로발견되는폴리뉴클레오타이드의모두또는일부와연합되지않거나 ; 천연적으로연결되어있지않은폴리뉴클레오타이드에작동적으로연결되어있거나 ; 보다큰서열의부분으로서천연적으로발생하지않는폴리뉴클레오타이드 ( 예를들면, 게놈성, cdna, 또는합성기원, 또는이의일부조합 ) 을의미할수있다. 본원에사용된것으로서, 용어 " 벡터 " 는, 이것이연결된다른핵산을수송할수있는핵산분자를말하는것으로의도된다. 벡터의하나의유형은 " 플라스미드 " 이며, 이는, 추가의 DNA 분절 (segment) 이연결될수있는원형의이중가닥 DNA 루프를말하는 " 플라스미드 " 이다. 벡터의다른유형은바이러스벡터이며, 여기서추가의 DNA 분절은바이러스게놈내로연결될수있다. 특정의벡터는, 이들이도입된숙주세포내에서자가복제할

104 수있다 ( 예를들면, 세균복제오리진 (origin) 을갖는세균벡터및에피소옴포유동물벡터 ). 다른벡터 ( 예를들면, 비-에피소옴포유동물벡터 ) 는숙주세포내로도입시숙주세포의게놈내로통합됨으로써숙주게놈과함께복제될수있다. 또한, 특정의벡터는, 이들이작동적으로연결되는유전자의발현을지시할수있다. 이러한벡터는본원에서 " 재조합체발현벡터 "( 또는단순히, " 발현벡터 ") 로언급된다. 일반적으로, 재조합체 DNA 기술에서이용되는발현벡터는흔히플라스미드의형태이다. 본명세서에서, " 플라스미드 " 및 " 벡터 " 는, 플라스미드가벡터의형태로가장일반적으로사용되므로상호교환적으로사용될수있다. 그러나, 본발명은동일한기능을제공하는, 바이러스벡터 ( 예를들면, 복제결핍성레트로바이러스, 아데노바이러스및아데노-관련바이러스 ) 와같은이러한발현벡터의다른형태를포함하는것으로의도된다. [0281] [0282] [0283] [0284] [0285] 용어 " 작동적으로연결된 " 은, 기술된성분들이이들의의도된방식으로기능하도록하는관계에있는병렬을말한다. 암호화서열에 " 작동적으로연결된 " 대조군서열은, 암호화서열의발현이대조군서열과혼화성인조건하에서달성되는방식으로연결된다. " 작동적으로연결된 " 서열은, 목적한유전자와인접한발현조절서열및트랜스 (in trans) 로작용하거나목적한유전자를조절하는거리에있는발현조절서열둘다를포함한다. 본원에사용된바와같은용어 " 발현조절서열 " 은, 이들이연결되는암호화서열의발현및프로세싱을수행하는데필수적인폴리뉴클레오타이드서열을말한다. 발현조절서열은적절한전사개시, 종결, 프로모터및인핸서서열 (enhancer sequence); 스플라이싱및폴리아데닐화시그날과같은효율적인 RNA 프로세싱시그날 ; 세포질성 mrna를안정화시키는서열 ; 해독효율을향상시키는서열 ( 예를들면, 코작컨센서스서열 ); 단백질안정성을향상시키는서열 ; 및목적하는경우, 단백질분비를향상시키는서열을포함한다. 이러한조절서열의특성은숙주유기체에따라상이하며 ; 원핵세포에서, 이러한조절서열은일반적으로프로모터, 리보소옴결합부위, 및전사종결서열을포함하며 ; 진핵세포에서, 일반적으로, 이러한조절서열은프로모터및전사종결서열을포함한다. 용어 " 대조군서열 " 은, 이의존재가발현및프로세싱에필수적인성분을포함하는것으로의도되며, 또한이의존재가유리한추가의성분, 예를들면, 리더 (leader) 서열및융합파트너서열을포함할수있다. 본원에정의된바와같은, " 형질전환 " 은, 외인성 DNA가숙주세포내로도입되는모든과정을말한다. 형질전환은당해분야에잘공지된각종방법을사용하는천연또는인공조건하에서발생할수있다. 형질전환은외부핵산서열을원핵또는진핵숙주세포내로삽입하기위한모든공지된방법에의존할수있다. 당해방법은형질전환되는숙주세포를기반으로선택되며, 바이러스감염, 전기천공, 지질감염, 및입자충격 (particle bombardment) 을포함할수있으나, 이에한정되지않는다. 이러한 " 형질전환된 " 세포는안정하게형질전환된세포를포함하며, 여기서삽입된 DNA는자동적으로복제하는플라스미드또는숙주염색체의일부로서복제할수있다. 이들은또한제한된기간동안삽입된 DNA 또는 RNA를일시적으로발현하는세포를포함한다. 용어 " 재조합체숙주세포 "( 또는단순히 " 숙주세포 ") 는, 외인성 DNA가도입된세포를말하는것으로의도된다. 하나의양태에서, 숙주세포는예를들면, 미국특허공보제7,262,028호에기술된숙주세포와같이, 항체를암호화하는 2개이상 ( 예를들면, 다수 ) 의핵산을포함한다. 이러한용어는특수한대상체세포뿐만아니라, 이러한세포의후대세포도언급하는것으로의도된다. 특정의변형이돌연변이또는환경적영향으로인하여후속되는세대에서발생할수있으므로, 이러한후대세포는실제로모세포와동일하지않을수있지만, 여전히본원에사용된것으로서, 용어 " 숙주세포 " 의범위내에포함된다. 하나의양태에서, 숙주세포는모든생물계로부터선택된원핵및진핵세포를포함한다. 다른양태에서, 진핵세포는원생생물, 진균, 식물및동물세포를포함한다. 다른양태에서, 숙주세포는원핵세포주에스케리키아콜라이 ; 포유동물세포주 CHO, HEK 293, COS, NS0, SP2 및 PER.C6; 곤충세포주 Sf9; 및진균세포사카로마이세스세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 를포함하나, 이에한정되지않는다. 표준기술을재조합체 DNA, 올리고뉴클레오타이드합성, 및조직배양및형질전환 ( 예를들면, 전기천공, 지질감염 ) 에사용할수있다. 효소반응및정제기술은제조업자의설명서에따라또는당해분야에서일반적으로달성된바와같이또는본원에기술된바와같이수행될수있다. 앞서의기술및과정은일반적으로당해분야에잘공지된통상의방법에따라서및본명세서전체에서인용되고논의된각종의일반적이고보다특수한참조문헌에기술된바와같이수행될수있다 [ 참조 : 예를들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]. 당해분야에공지된것으로서 " 유전자삽입유기체 " 는삽입유전자를함유하는세포를갖는유기체를말하며, 여기서유기체 ( 또는유기체의조상 ) 내로도입된삽입유전자는유기체내에서천연적으로발현되지않는폴리펩타이드를발현한다. " 삽입유전자 " 는 DNA 작제물이며, 이는, 유전자삽입유기체가발달하는세포의게놈내로안정하게및작동적으로통합되어, 유전자삽입유기체의하나이상의세포유형또는조직에서암호화된유전자생성

105 물의발현을지시하는 DNA 작제물이다. [0286] [0287] [0288] [0289] [0290] [0291] [0292] [0293] [0294] 용어 " 조절하다 (regulate 및 modulate)" 는상호교환적으로사용되며, 본원에사용된것으로서, 목적한분자의활성 ( 예를들면, hil-1β의생물학적활성 ) 에있어서의변화또는변경을말한다. 조절은목적한분자의특정활성또는기능의크기에있어서의증가또는감소일수있다. 분자의예시적인활성및기능은결합특성, 효소활성, 세포수용체활성화, 및시그날형질도입을포함하나, 이에한정되지않는다. 상응하게, 본원에사용된것으로서, 용어 " 조절인자 " 는목적한분자의활성또는기능 ( 예를들면, hil-1β의생물학적활성 ) 을변화시키거나변경시킬수있는화합물이다. 예를들면, 조절인자는조절인자의부재하에서관찰된활성또는기능의크기와비교하여분자의특정활성또는기능의크기에있어증가또는감소를유발할수있다. 특정양태에서, 조절인자는억제제이며, 이는분자의적어도하나의활성또는기능의크기를감소시키는억제제이다. 예시적인억제제는단백질, 펩타이드, 항체, 펩티바디 (peptibody), 탄수화물또는소유기분자를포함하나, 이에한정되지않는다. 펩티바디는예를들면, PCT 공보제WO 01/83525호에기술되어있다. 본원에사용된것으로서, 용어 " 작용제 " 는, 목적한분자와접촉시, 작용제의부재하에서관찰된활성또는기능의크기와비교하여분자의특정활성또는기능의크기에있어서증가를유발하는조절인자를말한다. 목적한특수작용제는 IL-1β 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 또는 hil-1β에결합하는모든다른분자를포함할수있으나, 이에한정되지않는다. 본원에사용된것으로서, 용어 " 길항제 " 및 " 억제제 " 는목적한분자와접촉시, 길항제의부재하에서관찰된활성또는기능의크기와비교하여분자의특정활성또는기능의크기에있어서감소를유발하는조절인자를말한다. 특수한목적길항제는사람 IL-1β의생물학적또는면역학적활성을차단하거나조절하는것들을포함한다. 사람 IL-1β의길항제및억제제는사람 IL-1β에결합하는단백질, 핵산, 탄수화물, 또는모든다른분자를포함할수있지만, 이에한정되지않는다. 본원에사용된것으로서, 용어 " 유효량 " 은장애또는이의하나이상의증상의중증도및 / 또는지속을감소시키거나완화시키거나 ; 장애의진전을방지하거나 ; 장애의회귀를유발하거나 ; 장애와관련된하나이상의증상의재발, 발달, 발병, 또는진행을방지하거나, 장애를검출하거나 ; 또는다른치료요법 ( 예를들면, 예방제또는치료제 ) 의예방학적또는치료학적효과 ( 들 ) 을향상시키거나개선시키기에충분한치료요법제의양을말한다. " 환자 " 및 " 대상체 " 는본원에서상호교환적으로사용되어영장류 ( 예를들면, 사람, 원숭이, 및침팬지 ), 비-영장류 ( 예를들면, 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니어피그 (guinea pig), 고양이, 개, 랫트, 마우스, 고래 ), 조류 ( 예를들면, 오리또는거위 ), 및상어를포함하는동물, 예를들면포유동물을말한다. 바람직하게는, 환자또는대상체는, 질환, 장애또는병태를치료하거나평가하는사람, 질환, 장애또는병태에걸릴위험이있는사람, 질환, 장애또는병태를갖는사람및 / 또는, 질환, 장애또는병태에대해치료중인사람과같은, 사람이다. 본원에사용된것으로서, 용어 " 시료 " 는가장넓은의미로사용된다. 본원에사용된것으로서 " 생물학적시료 " 는살아있는것또는앞서살아있던것들로부터의물질의어떠한양도포함하나, 이에한정되지않는다. 이러한살아있는것들은사람, 비-사람영장류, 마우스, 랫트, 원숭이, 개, 토끼및다른동물을포함하나, 이에한정되지않는다. 이러한물질은혈액 ( 예를들면, 전혈 ), 혈장, 혈청, 뇨, 양수, 활액, 내피세포, 백혈구, 단핵세포, 다른세포, 기관, 조직, 골수, 림프절및비장을포함하나, 이에한정되지않는다. " 성분 ", " 성분들 ", 및 " 적어도하나의성분 " 은일반적으로, 본원에기술된방법및당해분야에공지된다른방법에따라환자뇨, 혈청또는혈장시료와같은시험시료의검사를위한키트 (kit) 에포함될수있는, 포획항체, 검출또는접합체항체, 대조군, 캘리브레이터 (calibrator), 일련의캘리브레이터, 민감성패널, 용기, 완충액, 희석제, 염, 효소, 효소용보조-인자, 검출시약, 예비처리시약 / 용액, 기질 ( 예를들면, 용액으로서 ), 정지용액등을말한다. 따라서, 본교시내용과관련하여, " 적어도하나의성분 ", " 성분 " 및 " 성분들 " 은항-분석물 ( 예를들면, 항-폴리펩타이드 ) 항체에대한결합에의해서와같이, 고체지지체상에임의로고정된, 폴리펩타이드와같은분석물을포함하는조성물과같이, 상기와같은폴리펩타이드또는다른분석물을포함할수있다. 일부성분은검사에서사용하기위해재구성용으로동결건조될수있거나용액일수있다. " 대조군 " 은분석대상이아니거나 (" 음성대조군 ") 분석물을함유하는 (" 양성대조군 ") 것으로공지된조성물을말한다. 양성대조군은분석물의공지된농도를포함할수있다. " 대조군 ", " 양성대조군 " 및 " 캘리브레이터 (calibrator)" 는본원에서공지된농도의분석물을포함하는조성물을언급하기위해상호교환적으로사용될수있다. " 양성대조군 " 은검사수행특성을달성하기위해사용될수있으며시약 ( 예를들면, 분석물 ) 의완전성

106 (integrity) 의유용한지시인자이다. [0295] [0296] [0297] [0298] [0299] [0300] [0301] " 예정된컷오프 " 및 " 예정된수준 " 은일반적으로예정된컷오프 / 수준에대한검사결과를비교함으로써얻은진단 / 예후 / 치료효능을평가하기위해사용된검사컷오프값을말하며, 여기서예정된컷오프 / 수준은이미각종임상매개변수 ( 예를들면, 질환의중증도, 진행 / 비진행 / 개선등 ) 과연결되거나관련된다. 본교시내용이예시적인예정된수준을제공할수있다고해도, 컷오프값은면역검사의특성 ( 예를들면, 사용된항체등 ) 의특성에따라변할수있음은잘공지되어있다. 또한본교시내용을기반으로한다른면역검사를위한면역검사- 특이적인컷오프값을수득하기위한다른면역검사를위해본원의교시내용을채택하는것은또한본발명의통상의기술내에있다. 예정된컷오프 / 수준의정밀한값은검사들사이에서변할수있지만, 본원 ( 존재하는경우 ) 에기술된관련성은일반적으로적용되어야한다. 본원에기술된진단검사에사용된것으로서, " 예비처리시약 ", 예를들면, 분해, 침전및 / 또는가용화시약은시험시료속에존재하는어떠한분해물도가용화시키고 / 시키거나어떠한세포도용해시키는것이다. 예비처리는본원에추가로기술된바와같이, 모든시료에필수적이지는않다. 다른것들중에서, 분석물 ( 예를들면, 목적한폴리펩타이드 ) 의가용화는시료속에존재하는어떠한내인성결합단백질로부터의분석물의방출을포함할수있다. 예비처리시약은동종 ( 분리단계가요구되지않음 ) 또는이종 ( 분리단계가요구됨 ) 일수있다. 이종예비처리시약을사용하여검사의다음단계로진행시키기전에시험시료로부터모든침전된분석물결합단백질을제거한다. 본원에기술된면역검사및키트와관련하여 " 품질대조군시약 " 은캘리브레이터, 대조군, 및민감성패널을포함하나, 이에한정되지않는다. " 캘리브레이터 " 또는 " 표준물 " 은전형적으로항체또는분석물과같은, 분석물의농도의보간 (interpolation) 을위한교정 ( 표준 ) 곡선을확립하기위해사용된다 ( 예를들면, 다수와같이, 하나이상 ). 대안적으로, 예정된양성 / 음성컷오프근처인단일캘리브레이터를사용할수있다. 다수의캘리브레이터 ( 즉, 하나이상의캘리브레이터또는다양한양의캘리브레이터 ( 들 )) 를함께사용하여 " 민감성패널 " 을포함하도록할수있다. " 위험 " 은현재또는미래의어느시점에서존재하는특수현상의가능성또는개연성을말한다. " 위험계층화 " 는, 주치의가환자를특수질환, 장애또는병태로발전할낮은, 중간의, 높은또는최대위험으로분류하도록하는공지된임상위험인자들의배열을말한다. 특이적결합쌍 [ 예를들면, 항원 ( 또는이의단편 ) 및항체 ( 또는항원적으로반응성인이의단편 )] 의구성원들사이의상호작용과관련하여 " 특이적인 " 및 " 특이성 " 은상호작용의선택적인반응성을말한다. 어구 " 에특이적으로결합하는 " 및유사한어구는분석물 ( 또는이의단편 ) 에특이적으로결합하고다른실체에특이적으로결합하지않는항체 ( 또는이의항원적으로반응성인단편 ) 의능력을말한다. " 특이적인결합파트너 " 는특이적인결합쌍의구성원이다. 특이적인결합쌍은 2개의상이한분자들을포함하며, 이는화학적또는물리적수단을통해서로특이적으로결합한다. 따라서, 일반적인면역검사의항원및항체특이적인결합쌍외에도, 다른특이적인결합쌍은바이오틴및아비딘 ( 또는스트렙타비딘 ), 탄수화물및렉틴, 상보성뉴클레오타이드서열, 효과기및수용체분자, 보조인자및효소, 효소억제제및효소들등을포함할수있다. 또한, 특이적인결합쌍은원래의특이적인결합쌍구성원의유사체, 예를들면, 분석물-유사체인구성원을포함할수있다. 면역반응성특이적인결합구성원은, 분리되거나재조합적으로생산되는것에상관없이, 항원, 항원단편, 및단클론및다클론항체를포함하는항체및이의복합체, 단편, 및변이체 ( 변이체의단편포함 ) 를포함한다. 본원에사용된것으로서 " 변이체 " 는아미노산의첨가 ( 예를들면, 삽입 ), 결실또는보존적치환에의해아미노산서열내제공된폴리펩타이드 ( 예를들면, IL-1β, BNP, NGAL, 또는 HIV 폴리펩타이드, 또는항-폴리펩타이드항체 ) 와는상이하지만, 제공된폴리펩타이드의생물학적활성을유지하는폴리펩타이드를의미한다 ( 예를들면, 변이체 IL-1β는 IL-1β에대한결합에대해항-IL-1β 항체와경쟁할수있다 ). 아미노산을보존적치환, 즉, 아미노산을유사한특성 ( 예를들면, 친수성및, 하전된영역의정도및분포 ) 의상이한아미노산으로교체하는것은당해분야에서일반적으로약간의변화를포함하는것으로인식된다. 이들약간의변화는당해분야에서이해되는바와같이 [ 참조 : 예를들면, Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: (1982)], 아미노산의수치지수 (hydropathic index) 를고려함으로써, 부분적으로확인될수있다. 아미노산의수치지수는이의소수성및전하의고려를기반으로한다. 유사한수치지수의아미노산은치환될수있고여전히단백질기능을보유하는것으로당해분야에공지되어있다. 하나의국면에서, ±2의수치지표를갖는아미노산이치환된다. 아미노산의친수성은또한생물학적기능을보유하는단백질을생성할수있는치환을나타내는데사용될수

107 있다. 펩타이드와관련하여아미노산의친수성의고려는항원성및면역원성과매우관련된것으로보고된 ( 참조 : 예를들면, 미국특허공보제4,554,101호 ) 유용한척도인, 이러한펩타이드의최대국소평균친수성의계산을허용한다. 유사한친수성값을가진아미노산의치환은당해분야에서이해되는바와같은, 생물학적활성, 예를들면, 면역원성을보유하는펩타이드를생성할수있다. 하나의국면에서, 치환은서로에대해 ±2내의친수성값을갖는아미노산으로수행된다. 아미노산의소수성지수및친수성값둘다는이러한아미노산의특수측쇄에의해영향받는다. 이러한관찰과일치하여, 생물학적기능과양립성인아미노산치환은소수성, 친수성, 전하, 크기, 및다른특성들에의해나타나는바와같이, 아미노산의상대적인유사성, 및특히이들아미노산의측쇄의상대적인유사성에의존하는것으로이해된다. " 변이체 " 는또한예를들어, 단백질분해, 포스포릴화, 또는다른해독후변형에의해, 차등적으로프로세싱되지만, 여전히이의생물학적활성또는항원반응성, 예를들면, IL-1β에결합하는능력을보유하는폴리펩타이드또는이의단편을기술하는데사용될수있다. 본원에서 " 변이체 " 의사용은달리내용을부정하지않는한, 하나의변이체의단편들을포함하는것으로의도된다. [0302] [0303] I. 사람 IL-1β에결합하는항체본발명의하나의국면은 IL-1β에고친화성, 느린오프속도및고중화능으로결합하는분리된뮤린단클론항체, 또는이의항원-결합부분을제공한다. 본발명의제2 국면은 IL-1β에결합하는키메라항체를제공한다. 본발명의제3 국면은 IL-1β에결합하는 CDR 이식된항체, 또는이의항원-결합부분을제공한다. 본발명의제4 국면은 IL-1β에결합하는사람화된항체, 또는이의항원-결합부분을제공한다. 본발명의제5 국 면은 IL-1β 및하나의다른표적에결합하는이중가변도메인면역글로불린 (DVD-Ig TM ) 분자를제공한다. 바람 직하게는, 항체또는이의부위는분리된항체이다. 바람직하게는, 본발명의항체는중화사람항 -IL-1β 항 체이다. [0304] [0305] [0306] [0307] [0308] A. 항-IL-1β 항체의제조방법본발명의항-IL-1β 항체는당해분야에공지된모든다수의기술들에의해제조할수있다. 1. 하이브리도마기술을사용한항 IL-1β 단클론항체단클론항체는하이브리도마, 재조합체, 및파아지디스플레이기술, 또는이의조합의사용을포함하는당해분야에공지된광범위한기술을사용하여제조할수있다. 예를들어, 단클론항체는당해분야에공지되고, 예를들면, 문헌 [ 참조 : Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Hammerling et al., eds., "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas," In Research Monographs in Immunology, vol. 3 (J.L. Turk, General Editor) (Elsevier, New York, 1981) pp ( 상기참조문헌들은이들의전문이참조로인용된다 )] 에교시된것들을포함하는하이브리도마기술을사용하여생산할수있다. 본원에사용된것으로서용어 " 단클론항체 " 는하이브리도마기술을통해생산된항체에한정되지않는다. 용어 " 단클론항체 " 는어떠한진핵, 원핵또는파아지클론을포함하는단일클론으로부터기원한항체를말하며이것이생산되는방법을말하지않는다. 하이브리도마기술을사용하여특이적인항-IL-1β 항체를생산하고스크리닝하는방법은통상적이며당해분야에잘공지되어있다. 하나의양태에서, 본발명은단클론항체를생성하는방법및본발명의항체를분비하는하이브리도마세포를배양함을포함하는방법에의해생산된항체를제공하며, 여기서바람직하게는, 하이브리도마는, 본발명의항원으로면역화된마우스로부터분리된비장세포를흑색종세포와융합시킨후본발명의폴리펩타이드와결합할수있는항체를분비하는하이브리도마클론에대한융합체로부터생성된하이브리도마를스크리닝함으로써생성된다. 요약하면, 마우스는 IL-1β 항원으로면역화시킬수있다. 예시적인양태에서, IL-1β 항원은부형제와함께투여하여면역반응을자극한다. 이러한보조제는완전또는불완전프루언드보조제 (Freund's adjuvant), RIBI ( 무라밀디펩타이드 ) 또는 ISCOM( 면역자극복합체 ) 를포함한다. 이러한보조제는이를국소저장소 (local deposit) 속에봉쇄함으로써신속한분산으로부터폴리펩타이드를보호하거나, 숙주를자극하여면역계의대식구및다른성분들에대해화학주성인인자들을분비하는물질을함유할수있다. 바람직하게는, 폴리펩타이드가투여되는경우, 면역화스케쥴은폴리펩타이드의 2회이상의투여, 수주에걸친확산을포함할것이다

108 [0309] [0310] [0311] [0312] [0313] [0314] 동물을 IL-1β 항원으로면역화한후, 항체및 / 또는항체-생산세포를동물로부터수득할수있다. 항-IL-1β 항체-함유혈청은동물을방혈시키거나희생시킴으로써동물로부터수득된다. 혈청은동물로부터수득된채로사용할수있거나, 면역글로불린분획은혈청으로부터수득할수있거나, 또는항-IL-1β 항체는혈청으로부터정제할수있다. 이러한방식으로수득된혈청또는면역글로불린은다클론이므로, 특성의이종배열을갖는다. 면역반응이검출되면, 예를들어, 항원 IL-1β에대해특이적인항체가마우스혈청속에서검출되면, 마우스비장을수거하고비장세포를분리한다. 이후에, 비장세포를잘공지된기술에의해어떠한적합한흑색종세포, 예를들면, 아메리칸타입컬쳐컬렉션 (American Type Culture Collection: ATCC, 버지니아주마나사스소재 ) 로부터입수가능한세포주 SP20으로부터의세포에융합시킨다. 하이브리도마는제한희석으로선택하고클로닝한다. 이후에, 하이브리도마클론을당해분야에공지된방법에의해 IL-1β에결합할수있는항체를분비하는세포에대해검사한다. 일반적으로고수준의항체를함유하는복수액은마우스를양성하이브리도마클론으로면역화시켜생성할수있다. 다른양태에서, 항체-생산무한증식하이브리도마는면역화된동물로부터제조할수있다. 면역화한후, 동물을희생시키고비장 B 세포를무한증식된흑색종세포로당해분야에잘공지된바와같이융합시킨다 ( 참조 : 예를들면, Harlow et al., supra). 예시적인양태에서, 흑색종세포는면역글로불린폴리펩타이드 ( 비-분비성세포주 ) 를분비하지않는다. 융합및항생제선택후, 하이브리도마는 IL-1β, 또는이의부분, 또는 IL-1β를발현하는세포를사용하여스크리닝한다. 예시적인양태에서, 초기스크리닝은효소-연결된면역흡착검사 (ELISA) 또는방사면역검사 (RIA), 바람직하게는 ELISA를사용하여수행한다. ELISA 스크리닝의예는본원에참조로인용된 PCT 공보제WO 00/37504호에서제공된다. 항-IL-1β 항체-생산하이브리도마는하기에추가로논의된바와같이, 왕성한하이브리도마성장, 고항체생산및바람직한항체특성을포함하는바람직한특성에대해선택하고, 클로닝하며추가로스크리닝한다. 하이브리도마는동계동물, 면역계를상실한동물, 예를들면, 누드마우스 (nude mouse) 에서생체내, 또는시험관내세포배양물속에서배양하고확장시킬수있다. 하이브리도마를선택하고, 클로닝하며확장시키는방법은당해분야의통상의기술자에게잘공지되어있다. 예시적인양태에서, 하이브리도마는상기기술된바와같은, 마우스하이브리도마이다. 다른바람직한양태에서, 하이브리도마는비-사람, 비-마우스종, 예를들면, 랫트, 양, 돼지, 염소, 소또는말에서생산된다. 다른양태에서, 하이브리도마는사람하이브리도마이며, 여기서사람비-분비성흑색종은항-IL-1β 항체를발현하는사람세포와융합시킨다. 특이적인에피토프를인식하는항체단편은공지된기술로생성시킬수있다. 예를들어, 본발명의 Fab 및 F(ab') 2 단편은파파인 (Fab 단편을생산하기위한것 ) 또는펩신 [F(ab') 2 단편을생산하기위한것 ] 과같은효소 를사용하여면역글로불린분자의단백질분해적절단에의해생산될수있다. F(ab') 2 단편은가변영역, 경쇄 불변영역, 및중쇄의 CHI 도메인을함유한다. [0315] [0316] 2. SLAM을사용한항-IL-1β 단클론항체본발명의다른국면에서, 재조합체항체는미국특허공보제5,627,052호 ; PCT 공보제WO 92/02551호 ; 및문헌 [ 참조 : Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: (1996)] 에기술된바와같이, 선택된림프구항체방법 (SLAM) 으로서당해분야에언급된과정을사용하여단일의분리된림프구로부터생성된다. 당해방법에서, 목적한항체를분비하는단일세포, 예를들어, 단락 1에기술된면역화된동물들중어느하나로부터기원한림프구는항원-특이적인용혈플라크검사를사용하여스크리닝하며, 여기서항원 IL-1β, IL-1β 의소단위, 또는이의단편은양적혈구세포에바이오틴과같은링커를사용하여커플링시켜 IL-1β에대해특이성을갖는항체를분비하는단일세포를확인하는데사용한다. 목적한항체-분비세포의확인에이어서, 중쇄및경쇄가변영역 (VH 및 VL) cdna는세포로부터리버스트랜스크립타제-pcr에의해구하고, 이들가변영역은이후에적절한면역글로불린불변영역 ( 예를들면, 사람불변영역 ) 과관련하여, COS 또는 CHO 세포와같은포유동물숙주세포내에서발현될수있다. 생체내에서선택된림프구로부터기원한증폭된면역글로불린서열로형질감염된숙주세포는, 이후에예를들면, IL-1β에대한항체를발현하는세포를분리하기위한형질감염된세포를패닝 (panning) 함으로써시험관내에서추가의분석및선택에적용시킬수있다. 증폭된면역글로불린서열은또한 PCT 공보제WO 97/29131호및 PCT 공보제WO 00/56772호에기술된것들과같은시험관내친화

109 성성숙방법에의해시험관내에서추가로조작할수있다. [0317] [0318] 3. 유전자삽입동물을사용한항-IL-1β 단클론항체본발명의다른양태에서, 항체는사람면역글로불린유전자자리중일부또는모두를포함하는비-사람동물을 IL-1β 항원으로면역화시켜생산한다. 예시적인양태에서, 비-사람동물은 XENOMOUSE 유전자삽입마우스, 사람면역글로불린유전자자리의거대단편을포함하고마우스항체생산이결손된가공된마우스균주이다 [ 참조 : 예를들면, Green et al., Nature Genetics, 7: (1994) 및미국특허공보제5,916,771호 ; 제5,939,598 호 ; 제5,985,615호 ; 제5,998,209호 ; 제6,075,181호 ; 제6,091,001호 ; 제6,114,598호및제6,130,364호 ]. 또한, 1991년 7월 25일자로공개된 PCT 공보제WO 91/10741호 ; 1994년 2월 3일자로공개된제WO 94/02602호 ; 둘다 1996년 10월 31일자로공개된제WO 96/34096호및제WO 96/33735호 ; 1998년 4월 23일자로공개된제WO 98/16654호, ; 1998년 6월 11일자로공개된제WO 98/24893호 ; 1998년 11월 12일자로공개된제WO 98/50433호, ; 1999년 9월 10일자로공개된제WO 99/45031호 ; 1999년 10월 21일자로공개된제WO 99/53049호 ; 2000년 2월 24일자로공개된제WO 00/09560호 ; 및 2000년 6월 29일자로공개된제WO 00/ 호 ]. XENOMOUSE 유전자삽입마우스는완전한사람항체의성인-유사사람레퍼토리를생산하며, 항원-특이적인사람 Mab를생성한다. XENOMOUSE 유전자삽입마우스는사람중쇄유전자자리및 x경쇄유전자자리의메가염기크기의, 배선구조 YAC 단편의도입을통해사람항체레퍼토리의대략 80% 를함유한다 [ 참조 : Mendez et al., Nature Genetics, 15: (1997); 및 Green and Jakobovits, J. Exp. Med., 188: (1998), 이의교시내용은본원에참조로인용된다 ]. [0319] [0320] [0321] 4. 재조합체항체라이브러리를사용한항-IL-1β 단클론항체시험관내방법을또한사용하여본발명의항체를제조할수있으며, 여기서항체라이브러리를스크리닝하여바람직한결합특이성을가진항체를확인한다. 재조합체항체라이브러리를이와같이스크리닝하는방법은당해분야에잘공지되어있으며예를들면, 문헌 [ 참조 : Ladner et al., 미국특허공보제5,223,409호 ; Kang et al., PCT 공보제WO 92/18619호 ; Dower et al., PCT 공보제WO 91/17271; Winter et al., PCT 공보제WO 92/20791; Markland et al., PCT 공보제WO 92/15679호 ; Breitling et al., PCT 공보제WO 93/01288호 ; McCafferty et al., PCT 공보제WO 92/01047호 ; Garrard et al., PCT 공보제WO 92/09690호 ; Fuchs et al., Bio/Technology, 9: (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3: (1992); Huse et al., Science, 246: (1989); McCafferty et al., Nature, 348: (1990); Griffiths et al., EMBO J., 12: (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: (1992); Clackson et al., Nature, 352: (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: (1992); Garrard et al., Bio/Technology, 9: (1991); Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: (1991); 및 Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: (1991); US 공보제2003/ ; 및 PCT 공보제WO 97/29131호, 이들각각의내용은본원에참조로인용된다 ] 에기술된방법을포함한다. 재조합체항체라이브러리는 IL-1β 또는, IL-1β의부분으로면역화된대상체로부터일수있다. 대안적으로, 재조합체항체라이브러리는나이브대상체 (naive subject), 즉, 사람 IL-1β로면역화되지않은사람대상체로부터의사람항체라이브러리와같은, IL-1β로면역화되지않은대상체로부터일수있다. 본발명의항체는재조합체항체라이브러리를, 사람 IL-1β를포함하는펩타이드를사용하여스크리닝함으로써 IL-1β을인식하는항체를선택하여선택한다. 이러한스크리닝및선택을수행하는방법은앞서의단락에서참조문헌들에기술된바와같이, 당해분야에잘공지되어있다. 특수한 K off 속도상수를가진사람 IL-1β로부터해리되는것 들과같은, 사람 IL-1β에대한특수한결합친화성을갖는본발명의항체를선택하기위해, 표면플라스몬공명의당해분야에공지된방법을사용하여바람직한 K off 속도상수를가진항체를선택할수있다. 특수한 IC 50 을갖는것들과같은, 사람 IL-1β에대한특수한중화활성을갖는본발명의항체를선택하기위해, 사람 IL- 1β 항체의억제를평가하기위한당해분야에공지된표준방법을사용할수있다. [0322] [0323] 하나의국면에서, 본발명은사람 IL-1β 에결합하는, 분리된항체, 또는이의항원 - 결합부분에관한것이다. 바람직하게는, 항체는중화항체이다. 각종양태에서, 항체는재조합체항체또는단클론항체이다. 예를들면, 본발명의항체는당해분야에공지된각종의파아지디스플레이방법을사용하여생성시킬수

110 있다. 파아지디스플레이방법에서, 기능성항체도메인은이들을암호화하는폴리뉴클레오타이드서열을수반하는파아지입자의표면에디스플레이된다. 특히, 이러한파아지를이용하여레퍼토리또는조합항체라이브러리 ( 예를들면, 사람또는뮤린 ) 로부터발현된항원-결합도메인을디스플레이할수있다. 목적한항원에결합하는항원결합도메인을발현하는파아지는항원, 예를들면, 표지된항원또는고체표면또는비드 (bead) 에결합되거나포획된항원으로선택되거나확인될수있다. 이러한방법에서사용된파아지는전형적으로파아지유전자 III 또는유전자 VIII 단백질에재조합적으로융합된 Fab, Fv, 또는이황화물안정화된 Fv 항체도메인을지닌파아지로부터발현된 fd 및 M13 결합도메인을포함하는전형적으로필라멘트성파아지이다. 본발명의항체를제조하는데사용할수있는파아지디스플레이방법의예는문헌 [ 참조 : Brinkmann et al., J. Immunol. Methods, 182: (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods, 184: (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 24: (1994); Persic et al., Gene, 187: 9-18 (1997); Burton et al., Adv. Immunol., 57: (1994); PCT 공보제WO 90/02809호 ; 제WO 91/10737호 ; 제WO 92/01047호 (PCT/GB91/01134); 제WO 92/18619호 ; 제WO 93/11236호 ; 제WO 95/15982호 ; 제WO 95/20401호 ; 및미국특허공보제5,698,426호 ; 제5,223,409호 ; 제5,403,484호 ; 제5,580,717호 ; 제5,427,908호 ; 제5,821,047호 ; 제5,571,698호 ; 제5,427,908호 ; 제5,516,637호 ; 제5,780,225호 ; 제5,658,727호 ; 제5,733,743호및제5,969,108호 ; 이들각각은, 전문이본원에참조로인용되어있다 ] 에기재된것들을포함한다. [0324] 상기참조문헌에기술된바와같이, 파아지선택후, 파아지로부터항원암호화영역을분리하여사람항체또는어떠한다른바람직한항원결합단편을포함하는전체항체를생성하는데사용할수있으며, 예를들면, 하기상세히기술된바와같이, 포유동물세포, 곤충세포, 식물세포, 효모, 및세균을포함하는어떠한바람직한숙주내에서발현시킬수있다. 예를들면, Fab, Fab' 및 F(ab') 2 단편을재조합적으로생산하기위한기술 은또한 PCT 공보제WO 92/22324호 ; Mullinax et al., BioTechniques, 12(6): (1992); 및 Sawai et al., Am. J. Reprod. Immunol., 34: (1995); 및 Better et al., Science, 240: (1988), ( 상기참조문헌들은, 이들의전문이참조로인용된다 ) 에기재된것들과같은당해분야에공지된방법을사용하여이용할수있다. 단일쇄 Fv 및항체를생산하는데사용될수있는기술의예는미국특허공보제4,946,778호및제5,258,498호 ; Huston et al., Methods Enzymol., 203: (1991); Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: (1993); 및 Skerra et al., Science, 240: (1988) 에기술된것들을포함한다. [0325] [0326] [0327] [0328] 파아지디스플레이에의해재조합체항체라이브러리를스크리닝하는대안으로, 대형조합라이브러리를스크리닝하기위해당해분야에공지된다른방법을본발명의이중특이성항체의확인에적용시킬수있다. 대안적인발현시스템의하나의유형은, 재조합체항체라이브러리가 PCT 공보제WO 98/31700호 (Szostak 및 Roberts 가출원함 ); 및문헌 [ 참조 : Roberts and Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: (1997)] 에기술된바와같은 RNA-단백질융합체로서발현되는것이다. 당해시스템에서, 공유결합융합체는, mrna와, 이의 3' 말단에서, 푸로마이신, 펩티딜수용체항생제를수반하는합성 mrna의시험관내해독에의해이것이암호화하는펩타이드또는단백질사이에서생성된다. 따라서, 특이적인 mrna는이중특이성항원에대한항체, 또는이의부분의결합과같은암호화된펩타이드또는단백질, 예를들면, 항체, 또는이의부분의특성을기반으로한 mrna의복합체혼합물 ( 예를들면, 조합라이브러리 ) 로부터농축될수있다. 이러한라이브러리의스크리닝으로부터회수된, 항체, 또는이의부분을암호화하는핵산서열은위에서기술된바와같이 ( 예를들면, 포유동물숙주세포내에서 ) 재조합체수단으로발현시킬수있으며, 또한위에서기술된바와같이, 돌연변이가원래의선택된서열 ( 들 ) 내로도입된 mrna-펩타이드융합체의스크리닝의추가라운드에의해, 또는재조합체항체의시험관내친화성성숙에대한다른방법에의해추가의친화성성숙에적용시킬수있다. 다른시도에서, 본발명의항체는또한당해분야에공지된효모디스플레이방법을사용하여생성시킬수있다. 효모디스플레이방법에서, 유전방법을사용하여효모세포벽에대해항체도메인을묶고이들을효모표면위에디스플레이한다. 특히, 이러한효모는레퍼토리또는조합항체라이브러리 ( 예를들면, 사람또는뮤린 ) 로부터발현된항원-결합도메인을디스플레이하기위해사용될수있다. 본발명의항체를제조하기위해사용될수있는효모디스플레이방법의예는본원에참조로인용된문헌 ( 참조 : Wittrup et al. 의미국특허공보제6,699,658호 ) 에개재된것들을포함한다. B. 재조합체 IL-1β 항체의생산본발명의항체는당해분야에공지된다수의기술들중어느것에의해생산될수있다. 예를들면, 숙주세포로부터의발현에의해생산될수있으며, 여기서중쇄및경쇄를암호화하는발현벡터 ( 들 ) 는표준기술에의해

111 숙주세포내로형질감염된다. 용어 " 형질감염 " 의각종형태는외인성 DNA를원핵세포또는진핵숙주세포내로예를들면, 전기천공, 인산칼슘침전, DEAE-덱스트란형질감염등에의한도입에일반적으로사용된광범위한기술을포함하는것으로의도된다. 비록본발명의항체를원핵또는진핵숙주세포내에서발현하는것이가능하다고해도, 진핵세포내에서항체를발현하는것이바람직하며, 포유동물숙주세포내에서가가장바람직한데, 이는, 이러한진핵세포 ( 및특히포유동물세포 ) 가원핵세포보다보다더적절하게폴딩되고면역학적으로활성인항체를조립하고분비하는경향이있기때문이다. [0329] [0330] [0331] 본발명의재조합체항체를발현하기에바람직한포유동물숙주세포는예를들면, 문헌 [ 참조 : Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: (1982)] 에기술된바와같이, DHFR 선택성마커와함께사용된, 차이니즈햄스터난소 (Chinese Hamster Ovary: CHO 세포 )[dhfr - CHO 세포포함, 문헌 : Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: (1980) 에기술됨 ], NS0 흑색종세포, COS 세포및 SP2 세포를포함한다. 항체유전자를암호화하는재조합체발현벡터를포유동물숙주세포내로도입하는경우, 항체는숙주세포내에서항체의발현또는, 보다바람직하게는숙주세포가성장하는배양배지내로항체의분비를허용하기에충분한기간동안숙주세포를배양함으로써생산된다. 항체는표준단백질정제방법을사용하여배양배지로부터회수할수있다. 숙주세포는또한 Fab 단편또는 scfv 분자와같은, 기능성항체단편을생산하는데사용될수있다. 상기과정에서변형은본발명의영역내에있음이이해될것이다. 예를들면, 숙주세포를본발명의항체의경쇄및 / 또는중쇄의기능성단편을암호화하는 DNA로형질감염시키는것이바람직할수있다. 재조합체 DNA 기술을또한사용하여목적한항원에대한결합에필수적이지않은경쇄및중쇄중의하나또는이들둘다를암호화하는 DNA 중일부, 또는모두를제거할수있다. 이러한트렁케이트된 (truncated) DNA 분자로부터발현된분자는또한본발명의항체에포함된다. 또한, 하나의중쇄및하나의경쇄가본발명의항체이고다른중쇄및경쇄가본발명의항체를표준화학적가교결합방법에의해제2 항체에교차연결시킴으로써목적한항원이외의항원에대해특이적인이기능성항체를생산할수있다. 본발명의항체, 또는이의항원-결합부분의재조합체발현을위한예시적인시스템에서, 항체중쇄및항체 경쇄둘다를암호화하는재조합체발현벡터는 dhfr - CHO 세포내로인산칼슘-매개된형질감염에의해도입된다. 재조합체발현벡터내에서, 항체중쇄및경쇄유전자각각은 CMV 인핸서 /AdMLP 프로모터조절성분에작동적으로연결되어유전자의고수준전사를구동시킨다. 재조합체발현벡터는또한메토트렉세이트선택 / 증폭을사용하여벡터로형질감염시킨 CHO 세포의선택을허용하는, DHFR 유전자를또한수반한다. 선택된형질전환체숙주세포를배양하여항체중쇄및경쇄의발현을허용하며완전한항체는배양배지로부터회수된다. 표준분자생물학기술을사용하여재조합체발현벡터를제조하고, 숙주세포를형질감염시키며, 형질전환체에대해선택하고, 숙주세포를배양하고항체를배양배지로부터회수한다. 또한여전히본발명은본발명의숙주세포를적합한배양배지속에서본발명의재조합체항체가합성될때까지배양함으로써본발명의재조합체항체를합성하는방법을제공한다. 당해방법은배양배지로부터재조합체항체를분리함을추가로포함할수있다. [0332] [0333] [0334] [0335] 1. 항-사람 IL-1β 키메라항체키메라항체는, 항체의상이한부분들이상이한동물종 (species) 으로부터기원한분자, 예를들면, 뮤린단클론항체로부터기원한가변영역및사람면역글로불린불변영역을갖는항체이다. 키메라항체를생산하는방법은당해분야에공지되어있고, 실시예단락에상세히논의되어있다. 이의전문이본원에참조로인용된문헌 [ 참조 : 예를들면, Morrison, S.L., Science, 229: (1985); Oi et al., BioTechniques, 4: (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods, 125: (1989); 미국특허공보제5,807,715 호 ; 제4,816,567호 ; 및제4,816,397호 ] 을참조. 또한, 적절한항원특이성의마우스항체분자로부터의유전자를적절한생물학적활성의사람항체분자로부터의유전자와함께스플라이싱 (splicing) 시킴에의한 " 키메라항체 " 의생산을위해개발된기술 [ 참조 : Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: (1984); Neuberger et al., Nature, 312: (1984); Takeda et al., Nature, 314: (1985), 이는, 이의전문이본원에참조로인용되어있다 ] 을사용할수있다. 하나의양태에서, 본발명의키메라항체는 1 단락에기술된뮤린단클론항-사람 IL-1β 항체의중쇄불변영역을사람 IgG1 불변영역으로교체함으로써생산된다. 2. 항-IL-1β CDR-이식된항체

112 [0336] 본발명의 CDR- 이식된항체는사람항체로부터의중쇄및경쇄가변영역서열을포함하며, 여기서 V H 및 / 또는 V L 의 CDR 영역중의하나이상은본발명의뮤린항체의 CDR 서열로교체된다. 어떠한사람항체로부터의골격서열도 CDR 이식용주형 (template) 으로서공급될수있다. 그러나, 이러한골격상의직쇄교체는흔히항원의결합친화성의일부손실을초래한다. 사람항체가원래의뮤린항체에대해보다동종일수록, 뮤린 CDR과사람골격의조합은친화성을감소시킬수있는 CDR내뒤틀림을유도할가능성이더적어진다. 따라서, CDR로부터떨어진뮤린가변골격을교체하기위해선택되는사람가변골격은뮤린항체가변영역골격과적어도 65% 서열동질성을갖는것이바람직하다. CDR로부터떨어진사람및뮤린가변영역이적어도 70% 서열동질성을갖는것이보다더바람직하다. CDR로부터떨어진사람및뮤린가변영역은적어도 75% 서열동질성을갖는것이훨씬더바람직하다. CDR로부터떨어진사람및뮤린가변영역이적어도 80% 서열동질성을갖는것이가장바람직하다. 키메라항체를생산하는방법은당해분야에공지되어있다 [ 참조 : 예를들면, 유럽특허공보제EP 호 ; PCT 공보제WO 91/09967호 ; 미국특허공보제5,225,539호 ; 제5,530,101호 ; 및제 5,585,089호 ]. 항체의베니어링 (veneering) 또는재표면화 (resurfacing) 에대해서는, 예를들면, 문헌 [ 참조 : 유럽특허공보제EP 호및제EP 호 ; Padlan, Mol. Immunol., 28(4/5): (1991); Studnicka et al., Protein Eng., 7(6): (1994); 및 Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: (1994)] 을참조한다. 항체쇄셔플링 (chain shuffling) 에관해서는, 예를들면, 미국특허공보제5,565,352호를참조한다. [0337] [0338] [0339] 3. 항-사람 IL-1β 사람화된항체 사람화된항체는비-사람종항체로부터의하나이상의상보성결정영역 (CDR) 및사람면역글로불린분자로부 터의골격영역을갖는바람직한항원에결합하는비-사람종항체로부터기원한항체분자이다. 공지된사람 Ig 서열은예를들면, 전세계적인웹사이트 (worldwide web sites): /query.fcgi; ikeimages.html; mcb.harvard.edu/biolinks/immuno- logy.html. pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/aep-start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; imgt.cnusc.fr:8104/; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; roducts.htm; et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983) 에기재되어있으며, 이들각각 은본원에참조로전체적으로인용된다. 이러한불러온서열 (imported sequence) 을사용하여당해분야에공지 된바와같이, 면역원성을감소시키거나결합, 친화성, 온-속도, 오프-속도, 항원항체결합력, 특이성, 반감기, 또는어떠한다른적합한특성을감소시키거나, 향상시키거나변형시킬수있다. 사람골격영역내골격 (FR) 잔기는 CDR 공여체항체로부터의상응하는잔기로치환됨으로써항원결합을변경, 바람직하게는개선시킬수있다. 이들골격치환은당해분야에잘공지된방법, 예를들면, CDR 및골격잔기 의상호작용을모델화하여특수위치에서특수한골격잔기를확인하기위한항원결합및서열비교를위해중 요한골격잔기를확인한다.[ 참조 : 예를들면, Queen et al., 미국특허공보제5,585,089호 ; Riechmann et

113 al., Nature, 332: (1988), 이들은, 이들의전문이본원에참조로인용된다 ]. 3차원면역글로불린모델은일반적으로이용가능하며당해분야의숙련가에게친숙하다. 선택된후보물면역글로불린서열의가능한 3차원구조적구조물을설명하고디스플레이하는컴퓨터프로그램이이용가능하다. 이들디스플레이의점검은후보물면역글로불린서열의기능화에있어서잔기의가능한역할의분석, 즉, 이의항원을결합시키기위한후보물면역글로불린의능력에영향을미치는잔기의분석을허용한다. 이러한방식으로, FR 잔기를선택하여컨센서스및불러온서열로부터조합하여, 표적항원 ( 들 ) 에대한증가된친화성과같은바람직한항체특성을달성하도록할수있다. 일반적으로, CDR 잔기는항원결합에영향을미치는데직접적으로및가장실질적으로관여된다. 항체는하기에기술된것들과같지만이에한정되지않는당해분야에공지된각종기술을사용하여사람화시킬수있다 : Jones et al., Nature, 321: (1986); Verhoeyen et al., Science, 239: (1988); Sims et al., J. Immunol., 151: (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: (1993); Padlan, Mol. Immunol., 28(4/5): (1991); Studnicka et al., Protein Eng., 7(6): (1994); Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: (1994); PCT 공보제WO 91/09967호 ; 제WO 90/14443호 ; 제WO 90/14424호 ; 제WO 90/14430호 ; 제WO 99/06834호 (PCT/US98/16280); 제WO 97/20032호 (PCT/US96/18978); 제WO 92/11272호 (PCT/US91/09630); 제WO 92/03461호 (PCT/US91/05939); 제WO 94/18219호 (PCT/US94/01234); 제WO 92/01047호 (PCT/GB91/01134); 및제WO 93/06213호 (PCT/GB92/01755); 유럽특허공보제EP 호 ; 제EP 호및제EP 호 ; 미국특허공보제5,565,332호 ; 제5,723,323호 ; 제5,976,862호 ; 제5,824,514호 ; 제5,817,483호 ; 제 5,814,476호 ; 제5,763,192호 ; 제5,723,323호 ; 제5,766,886호 ; 제5,714,352호 ; 제6,204,023호 ; 제6,180,370호 ; 제5,693,762호 ; 제5,530,101호 ; 제5,585,089호 ; 제5,225,539호및제4,816,567호 ( 이들문헌에인용된문헌을포함하여, 각각은참조로본원에전체적으로인용된다 ). [0340] [0341] [0342] 5. 항 IL-1β DVD-Ig TM 결합단백질또한 IL-1β의하나이상의에피토프에결합하는이중가변도메인면역글로불린결합단백질 (DVD-Ig) 이제공된다. DVD-Ig 결합단백질은또한 IL-1β의에피토프및 IL-1β 폴리펩타이드이외의제2 표적항원의에피토프에결합할수있다. 이러한 DVD-Ig 분자의예시적인양태는구조식 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n( 여기서, VD1은제1의중쇄가변도메인이고, VD2는제2의중쇄가변도메인이며, C는중쇄불변도메인이고, X1은링커이며단, 이는 CH1이아니고, X2는 Fc 영역이며, n은 0 또는 1이고, 바람직하게는 1이다 ) 을포함하는중쇄 ; 및구조식 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n( 여기서, VD1은제1의경쇄가변도메인이고, VD2는제2의경쇄가변도메인이며, C 는경쇄불변도메인이고, X1은링커이며단, 이는 CH1이아니고, X2는 Fc 영역을포함하지않으며 ; n은 0 또는 1이고, 바람직하게는 1이다 ) 을포함하는경쇄를포함한다. 이러한 DVD-Ig는 2개의이러한중쇄및 2개의이러한경쇄를포함할수있으며, 여기서각각의쇄는가변영역들사이에개입된불변영역의부재하에탄뎀으로연결된가변영역을포함하며, 여기서중쇄및경쇄는연합하여 2개의탄뎀항원결합부위를형성하고, 중쇄및경쇄의쌍은중쇄및경쇄의다른쌍과연합하여 4개의항원결합부위를갖는사합체성결합단백질을형성할수있다. 다른양태에서, DVD-Ig 분자는가변도메인들사이의개입불변영역의부재하에서탄뎀으로연결된, 3개의가변도메인, 예를들면, VD1, VD2, VD3을각각을포함하는중쇄및경쇄를포함할수있으며, 중쇄및경쇄의쌍은연합하여 3개의항원결합부위를형성하고, 여기서중쇄및경쇄의쌍은중쇄및경쇄의다른쌍과연합하여 6개의항원결합부위를갖는사합체성결합단백질을형성할수있다. DVD-Ig에서각각의가변도메인 (VD) 은 IL-1β 및 / 또는 IL-1α 항원또는에피토프와같은하나이상의바람직한항원또는에피토프에결합하는하나이상의 " 모 (parent)" 단클론항체로부터수득될수있다. [0343] [0344] A. 모단클론항체의생성 DVD-Ig 결합단백질의가변도메인은목적한항원과결합할수있는단클론항체 (mab) 를포함하는, 모항체로부터수득될수있다. 이들항체는천연적으로존재하거나재조합체기술에의해생성될수있다. 바람직한표적항원또는에피토프에결합하는항체가다클론인경우이는 DVD-Ig를생성하는데사용하기위해, 다클론집단으로부터단일항체, 즉, 다클론집단의단일단클론구성원의항원결합부위의가변도메인을수득하기위해여전히필수적이다. 단클론항체는본원에기술된것들 ( 참조 : 상기단락 A.1. 내지 A.4.) 을포함하는, 당해

114 분야에공지된어떠한각종방법에의해생성될수있다. [0345] [0346] B. 모단클론항체를선택하기위한기준본발명의양태는 DVD-Ig 분자내에서바람직한적어도하나이상의특성을갖는모항체를선택하는것에관한것이다. 하나의양태에서, 바람직한특성은하나이상의항체매개변수로부터선택된다. 다른양태에서, 항체매개변수는항원특이성, 항원에대한친화성, 효능, 생물학적기능, 에피토프인지, 안정성, 가용성, 생산효율, 면역원성, 약력학, 생물이용성, 조직교차반응성, 및이종상동성 (orthologous) 항원결합으로이루어진그룹으로부터선택된다. [0347] [0348] [0349] [0350] B1. 항원에대한친화성치료용 mab의바람직한친화성은항원의특성, 및바람직한치료학적종점에의존할수있다. 하나의양태에서, 단클론항체는, 사이토킨-사이토킨수용체상호작용을차단하는경우보다높은친화성 (Kd = 0.01 내지 0.50 pm) 을가지는데, 이러한친화성은일반적으로고친화성상호작용 ( 예를들면, <pm 내지 <nm 범위 ) 이기때문이다. 이러한예에서, 이의표적에대한 mab 친화성은이의수용체에대한사이토킨 ( 리간드 ) 의친화성과동일하거나더우수하여야한다. 반면, 보다적은친화성 (> nm 범위 ) 을갖는 mab는예를들면순환하는잠재적으로병원성인단백질, 예를들면, A-β 아밀로이드와같은표적항원의순환하는종에결합하고, 봉쇄하며제거하는단클론항체를제거하는데있어치료학적으로효과적일수있다. 다른예에서, 부위-지시된돌연변이유발에의한또는이의표적에대한친화성이낮은 mab를사용함에의한존재하는고친화성의친화성을감소시키는것을사용하여잠재적인부작용을피할수있는데, 예를들면, 고친화성 mab는이의의도된표적모두를봉쇄하거나중화시킴으로써표적화된단백질의기능 ( 들 ) 을완전히고갈시키고 / 제거할수있다. 이러한시나리오에서, 저친화성 mab는질환증상들 ( 병리학적또는과-생산된수준 ) 에관여할수있는표적의분획을봉쇄하고 / 중화시킴으로써표적의분획이이의정상적인생리학적기능 ( 들 ) 을수행하는것을지속하도록할수있다. 따라서, Kd를감소시켜용량을조절하고 / 하거나부작용을감소시키는것이가능할수있다. 모 mab의친화성은세포표면분자를적절히표적화하여바람직한치료학적결과를달성하는데있어서중요한역할을할수있다. 예를들면, 표적이고밀도의암세포및저밀도의정상세포에서발현되는경우, 보다낮은친화성 mab는정상세포보다종양세포상의거대한수의표적과결합함으로써, ADCC 또는 CDC를통해종양세포제거를일으켜치료학적으로바람직한효과를가질수있다. 따라서, 바람직한친화성을가진 mab를선택하는것은가용성및표면표적둘다에관련될수있다. 이의리간드와의상호작용시수용체를통한시그날링은수용체-리간드상호작용의친화성에의존할수있다. 유사하게, 표면수용체에대한 mab의친화성은세포내시그날링의특성을측정할수있으며, mab가작용제또는길항제시그날을전달할수있는지여부를고려할수있다. mab-매개된시그날링의친화성-계특성은이의부작용프로파일의영향을가질수있다. 따라서, 치료용단클론항체의바람직한친화성및바람직한기능은시험관내및생체내실험에의해조심스럽게측정될필요가있다. 결합단백질 ( 예를들면, 항체 ) 의바람직한 Kd는바람직한치료학적결과에따라실험적으로측정할수있다. 하나의양태에서, 동일한항원에대해 DVD-Ig의바람직한친화성과동일하거나더우수한특수항원에대한친화성 (Kd) 을갖는모항체를선택한다. 항원결합친화성및역학은비아코어 (Biacore) 또는다른유사한기술 에의해평가한다. 하나의양태에서, 각각의모항체는약 10-7 M 이하 ; 약 10-8 M 이하 ; 약 10-9 M 이하 ; 약 M 이하 ; 약 M 이하 ; 약 M 이하 ; 및 M 이하로이루어진그룹으로부터선택되는이의항원에대한해리상수 (Kd) 를갖는다. VD1이수득되는제1의모항체및 VD2가수득되는제2의모항체는각각의항원에대해유사하거나상이한친화성 (K D ) 을가질수있다. 각각의모항체는표면플라스몬공명에의해측정된것으로서, 적어도약 10 2 M -1 s -1 ; 적어도약 10 3 M -1 s -1 ; 적어도약 10 4 M -1 s -1 ; 적어도약 10 5 M -1 s -1 ; 및적어도약 10 6 M -1 s -1 로이루어진그룹으로부터선택되는항원에대한결합속도상수 (Kon) 를가진다. 예를들면, VD1이수득되는제1의모항체및 VD2가수득된제2의모항체는각각의항원에대해유사하거나상이한결합속도상수 (Kon) 를가질수있다. 하나의양태에서, 각각의모항체는표면플라스몬공명에의해측정된것으로서, 약 10-3 s -1 이하 ; 약 10-4 s -1 이하 ; 약 10-5 s -1 이하 ; 및약 10-6 s -1 로이루어진그룹으로부터선택되는항원에대한

115 해리속도상수 (Koff) 를가진다. VD1 이수득되는제 1 의모항체및 VD2 가수득되는제 2 의모항체는각각의항 원에대해유사하거나상이한해리속도상수 (Koff) 를가질수있다. [0351] [0352] [0353] [0354] B2. 효능모단클론항체의바람직한친화성 / 효능은바람직한치료학적결과에의존할것이다. 예를들면, 수용체-리간드 (R-L) 상호작용의경우, 친화성 (kd) 은 R-L kd (pm 범위 ) 와동등하거나이보다우수하다. 병리학적순환단백질의단순한클리어런스, 예를들면순환하는 A-β 펩타이드의각종종의클리어런스를위해서, Kd는낮은 nm 범위내에존재할수있다. 또한, Kd는표적이, 동일한에피토프, 예를들면, Aβ 올리고머에서 mab 표적화구조적에피토프의다수의카피를발현하는지여부에도의존할것이다. VDI 및 VD2가동일한항원에결합하지만구별되는에피토프에결합하는경우, DVD-Ig는동일한항원에대한결합부위를함유함으로써항원항체결합력을증가시킴으로써 DVD-Ig의명백한 Kd를증가시킬것이다. 하나의양태에서, DVD-Ig에서바람직한 Kd와동등하거나더낮은모항체가선택된다. 모 mab의친화성고려는또한, DVD-Ig가 4개이상의동일한항원결합부위 ( 예를들면, 단일 mab로부터의 DVD-Ig) 를함유하는지에의존할수있다. 이경우, 명백한 Kd는항원항체결합력으로인하여 mab보다더클수있다. 이러한 DVD-Ig는교차-결합표면수용체, 증가된중화효능, 병리학적단백질의향상된클리어런스등을위해사용될수있다. 다른양태에서, 동일한항원에대한 DVD-Ig의바람직한중화효능과동등하거나이보다더우수한특이적인항원에대한중화효능을갖는모항체를선택한다. 중화효능은표적-의존성생검사에의해평가할수있으며, 여기서적절한유형의세포는표적자극에대한반응시측정가능한시그날 ( 즉, 증식또는사이토킨생산 ) 을생산하며, mab에의한표적중화는투여량-의존적방식으로시그날을감소시킬수있다. [0355] [0356] B3. 생물학적기능단클론항체는잠재적으로수개의기능으로수행할수있다. 이들기능중일부는표 5에나열되어있다. 이들기능은시험관내검사 ( 예를들면, 세포-계및생화학적검사 ) 및생체내동물모델둘다에의해평가될수있다. 표 5 [0357] [0358] 본원의실시예및표 5에기술된명백한기능을갖는 MAb를선택하여바람직한치료학적결과를달성할수있다. 2개이상의선택된모단클론항체를이후에 DVD-Ig 양식에사용하여단일 DVD-Ig 분자에서 2개의명백한기능을달성할수있다. 예를들면, DVD-Ig는 IL-1β와같은특이적인사이토킨의기능을중화시키는모 mab를선택하고, 병리학적단백질의클리어런스를향상시키는모 mab를선택함으로써생성시킬수있다. 유사하게, 2개의상이한세포표면수용체를인지하는 2개의모 mab를선택할수있으며, 하나의 mab는하나의수용체에서작용제기능을가지고다른 mab는상이한수용체에서길항제기능을갖는다. 각각명백한기능을갖는, 이들 2개의선택된 mab를사용하여단일분자내에서선택된단클론항체의 2개의명백한기능 ( 작용제및길항제 ) 을소유할단일의 DVD-Ig 분자를작제할수있다. 유사하게, 각각의수용체리간드 ( 예를들면, EGF 및

116 IGF) 의결합을각각차단하는, 세포표면수용체에대한 2 개의길항제 mab 를 DVD-Ig 양식에사용할수있다. 역으로, 길항성항 - 수용체 mab( 예를들면, 항 -EGFR) 및중화항 - 가용성매개인자 ( 예를들면, 항 -IGF1/2) mab 를 선택하여 DVD-Ig 를제조할수있다. [0359] [0360] [0361] [0362] B4. 에피토프인지 : 단백질의상이한영역은상이한기능을수행할수있다. 예를들면, IL-1β와같은사이토킨의특이적인영역은사이토킨수용체와상호작용하여수용체활성화를유발하는반면, 단백질의다른영역은사이토킨을안정화하는데요구될수있다. 당해예에서, 하나는사이토킨에서수용체상호작용영역 ( 들 ) 에특이적으로결합하는 mab를선택함으로써사이토킨-수용체상호작용을차단할수있다. 일부경우에, 예를들면, 다수의리간드와결합하는특정의케모킨수용체의경우, 단지하나의리간드와상호작용하는에피토프 ( 케모킨수용체상의영역 ) 에결합하는 mab를선택할수있다. 다른예에서, 단클론항체는단백질의생리학적기능에직접적으로관여하지않는표적상의에피토프에결합할수있지만, 이들영역에대한 mab의결합은생리학적기능 ( 입체장애 ) 으로방해하거나단백질의구조를변경시킴으로써단백질이기능하지않을수있다 ( 다수의리간드를가진수용체에대한 mab는수용체구조를변경시킴으로써리간드중어느것도결합할수없다 ). 이의수용체에대한사이토킨의결합을차단하지않지만, 시그날형질도입을차단하는항-사이토킨단클론항체가또한확인되었다 ( 예를들면, 125-2H, 항-IL-18 mab). 에피토프및 mab 기능의예는수용체-리간드 (R-L) 상호작용의차단 (R-상호작용부위에결합하는중화 mab); R- 결합을소멸시키거나생성하지않는입체장애를포함하나, 이에한정되지않는다. 항체는수용체결합부위이외의부위에서표적에결합할수있지만, 구조적변화를유도시켜 R에결합하지만시그날링 (125-2H mab) 을차단하여기능을제거함으로써 [ 예를들면, XOLAIR 오말리주마브, 진테크 (Genetech)/ 노바티스 (Novartis)] 수용체결합및표적의기능을여전히방해할수있다. 하나의양태에서, 모 mab는최대효능에대해적절한에피토프를표적화하는데요구된다. 이러한에피토프는 DVD-Ig에서보존되어야한다. mab의결합에피토프는동시-결정학, mab-항원복합체의제한된단백질분해와질량분석법펩타이드맵핑 [ 참조 : Legros et al., Protein Sci., 9: (2000)], 파아지디스플레이된펩타이드라이브러리 [ 참조 : O'Connor et al., J. Immunol. Methods., 299: (2005)], 및돌연변이유발 [ 참조 : Wu C. et al., J. Immunol., 170: (2003)] 을포함하는, 수개의시도들로측정할수있다. [0363] [0364] B5. 물리화학적및약제학적특성항체를사용한치료학적치료는흔히수 mg/kg( 전형적으로큰분자량의결과로서질량기준으로낮은효능으로인함 ) 인, 고용량의투여를필요로한다. 환자순응도를제공하고만성질환치료요법및외래환자치료에적절히촛점을맞추기위하여, 치료용 mab의피하 (s.c.) 또는근육내 (i.m.) 투여가바람직하다. 예를들면, s.c. 투여용의최대바람직한용적은 ~1.0 ml이므로, >100 mg/ml의농도가투여량당주사수를제한하는데바람직하다. 하나의양태에서, 치료용항체는하나의용량으로투여된다. 그러나, 이러한제형의개발은단백질-단백질상호작용 ( 예를들면, 면역원성위험도를잠재적으로증가시키는응집 ) 에의해및가공및전달동안제한 ( 예를들면, 점도 ) 에의해구속된다. 결과적으로, 임상효능및관련된개발구속에요구되는다량은항체제형의효능및고-용량요법에서 s.c. 투여의효능의제한된완전한이용을제한한다. 단백질분자및단백질용액의물리화학적및약제학적특성, 예를들어, 안정성, 가용성및점도특성은가장중요하다는것이명백하다. [0365] [0366] B5.1. 안정성 " 안정한 " 항체제형은, 항체가, 저장시이의물리적안정성및 / 또는화학적안정성및 / 또는생물학적활성을필수적으로보유하는것이다. 안정성은선택된온도에서선택된기간동안측정할수있다. 하나의양태에서, 제형중항체는실온 ( 약 30 ) 또는 40 에서적어도 1개월동안안정하고 / 하거나약 2 내지 8 에서적어도 1년동안, 예를들면, 적어도 2년동안안정하다. 또한, 하나의양태에서, 제형은제형의동결 ( 예를들면, -70 까지 ) 및해동후안정하며, 이후, " 동결 / 해동주기 " 로언급된다. 다른예에서, " 안정한 " 제형은, 단백질의약 10% 미만및약 5% 미만이제형속에응집체로서존재하는것일수있다

117 [0367] [0368] [0369] [0370] 연장된기간동안다양한온도에서시험관내에서안정한 DVD-Ig가바람직하다. 이는시험관내에서안정한모 mab를상승된온도, 예를들면, 40 에서 2 내지 4주동안신속하게스크리닝한후안정성을평가하여달성할수있다. 2 내지 8 에서저장동안, 단백질은적어도 12 개월, 예를들면, 적어도 24 개월동안안정성을나타낸다. 안정성 ( 단량체성의, 완전한분자의 %) 은양이온교환크로마토그래피, 크기배제크로마토크래피, SDS-PAGE, 및생물활성시험과같은다양한기술을사용하여평가할수있다. 공유결합적및구조적변형을분석하기위해사용될수있는분석기술들의보다총괄적인목록에대해서는, 문헌 [ 참조 : Jones, A.J.S., "Analytical methods for the assessment of protein formulations and delivery systems," Chapter 2, In Formulation and delivery of peptides and proteins, 1st ed., (Cleland and Langer, eds.) (American Chemical Society, Washington, D.C., 1994) pp ; 및 Pearlman and Nguyen, "Analysis of protein drugs," Chapter 6, In Peptide and protein drug delivery, 1st ed. [In Advances in Parenteral Sciences, vol. 4] (Lee, V.H., ed.) (Marcel Dekker, Inc., New York, 1991) pp ] 을참조한다. 이질성및응집체제형 : 항체의안정성은, 제형이, 응집체로서존재하는 GMP 항체물질속에약 10% 미만을나타내도록, 및하나의양태에서, 약 5% 미만, 다른양태에서, 약 2%, 또는, 하나의양태에서, 0.5% 내지 1.5% 이하의범위를나타내도록존재할수있다. 크기배제크로마토그래피는단백질응집체의검출시민감하고, 재생성이며매우강력한방법이다. 낮은응집체수준외에, 항체는하나의양태에서, 화학적으로안정하여야한다. 화학적안정성은이온교환크로마토그래피 ( 예를들면, 양이온또는음이온교환크로마토그래피 ), 소수성상호작용크로마토그래피, 또는등전포커싱또는모세관전기영동과같은다른방법으로측정할수있다. 예를들어, 항체의화학적안정성은, 2 내지 8 에서적어도 12개월의저장후양이온교환크로마토그래피내에서변형되지않는항체를나타내는피크가저장시험전항체용액과비교하여 20% 이하, 하나의양태에서, 10% 이하, 또는, 다른양태에서, 5% 이하로증가될수있다. 하나의양태에서, 모항체는구조적통합성 ; 정확한이황화물결합형성, 및정확한폴딩 : 항체활성에영향을미칠수있는항체의 2차또는 3차구조에있어서의변화로인한화학적불안정성을나타낸다. 예를들어, 항체의활성에의해나타내는바와같은안정성은 2 내지 8 에서적어도 12개월저장한후, 항체의활성이저장시험전항체용액과비교하여 50% 이하, 하나의양태에서 30% 이하, 또는심지어 10% 이하, 또는하나의양태에서 5% 이하또는 1% 로감소될수있다. 적합한항원-결합검사를사용하여항체활성을측정할수있다. [0371] [0372] B5.2. 가용성 (solubility) mab의 " 가용성 " 은정확하게폴딩된, 단량체성 IgG의생산과관련된다. 따라서, IgG의가용성은 HPLC로평가할수있다. 예를들면, 가용성 ( 단량체성 ) IgG는 HPLC 크로마토그래피상에서단일피크를생성할것인반면, 불용성 ( 예를들면, 다합체성및응집된 ) 은다수의피크를생성할것이다. 따라서, 당해분야의숙련가들은통상의 HPLC 기술을사용하여 IgG의가용성에있어증가또는감소를검출할수있을것이다. 가용성을분석하기위해사용될수있는분석기술의보다총괄적인목록은문헌 [ 참조 : Jones, A.G., Dep. Chem. Biochem. Eng., Univ. Coll. London, "Particle formation and separation in suspension crystallization processes," Chapter 4, In Process. Solid-Liquid Suspensions, (P. Ayazi Shamlou, ed.) (Butterworth-Heinemann, Oxford, UK, 1993) pp ; and Pearlman and Nguyen, "Analysis of protein drugs," Chapter 6, In Peptide and protein drug delivery, 1st ed. [In Advances in Parenteral Sciences, vol. 4] (Lee, V.H., ed.) (Marcel Dekker, Inc., New York, 1991) pp ] 을참조한다. 치료용 mab의가용성은적절한용량에서흔히요구되는고농도로제형화하는데있어중요하다. 본원에요약한바와같이, >100 mg/ml의가용성이효율적인항체용량을제공하는데요구될수있다. 예를들면, 항체가용성은조기조사단계에서약 5 mg/ml 이상, 하나의양태에서, 개선된과정과학단계에서약 25 mg/ml 이상, 또는하나의양태에서약 100 mg/ml 이상, 또는하나의양태에서약 150 mg/ml 이상일수있다. 단백질분자의고유한특성은단백질용액의물리-화학적특성, 예를들면, 안정성, 가용성, 점도에중요하다. 그러나, 당해분야의숙련가는, 최종단백질제형의특징에유리하게영향을미치기위해첨가제로서사용될수있는광범위한부형제가존재함을인식할것이다. 이들부형제는 (i) 액체용매, 보조용매 ( 예를들면, 에탄올과같은알코올 ); (ii) 완충제 ( 예를들면, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 아미노산완충액 ); (iii) 당또는당알코올 ( 예를들면, 수크로즈, 트레할로즈, 프럭토즈, 라피노즈, 만니톨, 소르비톨, 덱스트란 ); (iv) 표면활성제 ( 예를들면, 폴리소르베이트 20, 40, 60, 80, 폴록사머 ); (v) 등장성개질제 ( 예를들면, NaCl와같은염, 당, 당알코올 ); 및 (vi) 기타 ( 예를들면,

118 방부제, 킬레이트제, 항산화제, 킬레이팅물질 ( 예를들면, EDTA), 생분해가능한중합체, 담체분자 ( 예를들면, HSA, PEG)] 를포함할수있다. [0373] 점도는항체제조및항체프로세싱 ( 예를들면, 정용여과 / 한외여과 ), 충전-마무리공정 (fill-finish)( 펌핑국면 (pumping aspect), 여과국면 ) 및전달국면 ( 주사가능성, 복잡한장치전달 ) 과관련하여매우중요한매개변수이다. 저점도는, 농도가보다높은항체의액체용액이가능하도록한다. 이는, 동일한용량을보다적은용적으로투여할수있다. 소주사용적은주사동안보다낮은통증의장점을제공하며, 용액은환자에게주사시통증을감소시키도록필수적으로등장성일필요는없다. 항체용액의점도는, 100 (1/s) 의전단속도에서항체용액점도가 200 mpa s 미만, 하나의양태에서 125 mpa s 미만, 다른양태에서 70 mpa s 미만, 및여전히다른양태에서 25 mpa s 미만또는심지어 10 mpa s 미만이도록할수있다. [0374] [0375] [0376] B5.3. 생산효율한양태에서포유동물, 예를들면차이니즈햄스터난소세포 (CHO) 에서효율적으로발현되는 DVD-Ig의생성은포유동물세포내에서효율적으로발현되는 2개의모단클론항체를필요로할것이다. 안정한포유동물주 ( 즉, CHO) 로부터의생산수율은약 0.5 g/l 초과, 하나의양태에서약 1g/L 초과, 및다른양태에서약 2 내지약 5 g/l 이상의범위이어야한다 [ 참조 : Kipriyanov et al., Mol. Biotechnol., 12: (1999); Carroll et al., Expert Opin Biol Ther., 4: (2004)]. 포유동물세포에서항체및 Ig 융합단백질의생산은수개의인자에의해영향받는다. 강력한프로모터, 인핸서의도입및선택마커를통한발현벡터의가공은통합된벡터카피로부터목적유전자의전사를최대화시킬수있다. 고수준의유전자전사를위해허용되는벡터통합부위의확인은벡터로부터단백질발현을증강시킬수있다 [ 참조 : Wurm, F.M., Nature Biotechnol., 22(11): (2004)]. 또한, 생산수준은단백질조립및분비의과정에서각종단계및항체중쇄와경쇄의비에의해영향받는다 [ 참조 : Jiang et al., Biotechnol. Prog., 22(1): (2006)]. [0377] [0378] [0379] B6. 면역원성치료용 mab의투여는면역반응 ( 즉, 치료용 mab에대해지시된내인성항체의형성 ) 의특정발생을초래할수있다. 면역원성을유도할수있는잠재적인성분은모단클론항체의선택동안분석되어야하며, 이러한위험을감소시키기위한단계는 DVD-Ig 작제이전에모단클론항체를최적화하기위해취할수있다. 마우스-기원한항체는환자에서고도로면역원성인것으로밝혀졌다. 마우스가변및사람불변영역으로구성된키메라항체의생성은치료용항체의면역원성을감소시키기위한논리적다음단계를나타낸다 [ 참조 : Morrison and Schlom, "Recombinant Chimeric Monoclonal Antibodies," Chapter 1, In Important Advances in Oncology 1990 (J.B. Lippincott Company, Philadelphia, 1990) pp. 3-18)]. 대안적으로, 면역원성은문헌 [ 참조 : Riechmann et al., Nature, 332: (1988)] 에서치료용항체에대해기술된바와같이, 뮤린 CDR 서열을사람항체골격내로형질감염 [ 재성형 (reshaping)/cdr 이식 / 사람화 ] 시킴으로써감소시킬수있다. 다른방법은설치류가변경쇄및중쇄도메인으로출발하는 " 재표면화 (resurfacing)" 또는 " 베니어링 (veneering)" 으로언급되며, 표면-접근가능성골격아미노산만이사람것으로변경되는반면, CDR 및묻혀진아미노산은모설치류항체로부터잔류한다 [ 참조 : Roguska et al., Protein Eng., 9(10): (1996)]. 사람화의다른유형에서, 전체 CDR을이식하는대신, 하나의기술은이의표적으로항체의결합에관여하는 CDR 잔기의서브세트로정의된 [ 참조 : Kashmiri et al., Methods, 36(1): (2005)], " 특이성-결정영역 (SDR)" 만을이식시킨다. 이는항체-표적복합체의이용가능한 3차원구조의분석또는표적과상호작용하는것을측정하기위한항체 CDR 잔기의돌연변이적분석을통해 SDR의확인을필요하도록한다. 대안적으로, 완전한사람항체는뮤린, 키메라또는사람화된항체와비교하여면역원성을감소시킬수있다. 치료용항체의면역원성을감소시키기위한다른시도는면역원성인것으로예측되는특정의특이적인서열의제거이다. 하나의시도에서, 제1 세대생물제를사람에서시험하여허용되지않는면역원성임이밝혀진후, B- 세포에피토프를맵핑한후변경시켜면역검출을피한다. 다른시도는잠재적인 T-세포에피토프를예측하여제거하는방법을사용한다. 컴퓨터처리된방법은 MHC 단백질에결합시키기위한잠재능을가진생물학적치료제의펩타이드서열을스캐닝하여확인하기위해개발되어왔다 [ 참조 : Desmet et al., Proteins, 58: (2005)]. 대안적으로, 사람수지세포 - 계방법을사용하여잠재적인단백질알레르기항원에서 CD4 + T- 세포에

119 피토프를확인할수있다 [ 참조 : Stickler et al., J. Immunother., 23: (2000); Morrison and Schlom, Important Adv. Oncol. (1990) pp. 3-18; Riechmann et al. "Reshaping human antibodies for therapy," Nature. 332: (1988); Roguska et al., "A comparison of two murine mabs humanized by CDR-grafting and variable domain resurfacing, "Protein Eng., 9: (1996); Kashmiri et al., "SDR grafting--a new approach to antibody humanization," Methods, 36(1): (2005); Desmet et al., "Anchor profiles of HLA-specific peptides: analysis by novel affinity scoring method and experimental validation," Proteins, 58: (2005); Stickler et al., "CD4 + T-cell epitope determination using unexposed human donor peripheral blood mononuclear cells," J. Immunother., 23: (2000)]. [0380] [0381] B7. 생체내효능바람직한생체내효능을갖는 DVD-Ig 분자를생성하기위해서는, 함께제공되는경우유사하게바람직한생체내효능을갖는 mab를생성하고선택하는것이중요하다. 그러나, 일부예에서, DVD-Ig는 2개의별개의 mab의조합으로달성될수없는생체내효능을나타낼수있다. 예를들면, DVD-Ig는 2개의표적을근접성이되도록하여 2개의별개의 mab의조합으로달성될수없는활성을초래할수있다. 추가의바람직한생물학적기능은본원에서단락 B3에기술되어있다. DVD-Ig 분자에서바람직한특성을갖는모항체는, 약력학적반감기 (t½); 조직분포 ; 가용성대세포표면표적 ; 및표적농도-가용성 / 밀도-표면과같은인자들을기본으로선택될수있다. [0382] [0383] B8. 생체내조직분포바람직한생체내조직분포를갖는 DVD-Ig 분자를생성하기위해, 하나의양태에서, 유사한바람직한생체내조직분포프로파일을갖는모 mab를선택하여야만한다. 대안적으로, 이중-특이적인표적화전략의메커니즘을기본으로하여, 함께제공되는경우이는다른때에유사하게바람직한생체내조직분포를갖는모 mab를선택하는데요구되지않을수있다. 예를들면, 하나의결합성분이 DVD-Ig를특이적인부위에표적화함으로써동일한표적부위에제2 결합성분을가져오는 DVD-Ig의경우이다. 예를들면, DVD-Ig의하나의결합특이성은췌장 ( 섬세포 ) 을표적화할수있으며다른특이성은, GLP1이췌장에대해인슐린을유도하도록할수있다. [0384] [0385] [0386] [0387] B9. 동형동형, 효과기기능, 및순환하는반감기를포함하나, 이에한정되지않는바람직한특성을가진 DVD-Ig 분자를생성하기위해, 치료학적유용성및바람직한치료학적종점에따라적절한 Fc-효과기기능을보유하는모 mab 를선택한다. 5개의주요중쇄부류또는동형이존재하며, 이들중일부는몇개의소-유형을가지며이들은항체분자의효과기기능을결정한다. 이들효과기기능은항체분자의힌지영역, CH2 및 CH3 도메인에있다. 그러나, 항체분자의다른부분에서잔기는또한효과기기능에있어서효과를가질수있다. 힌지영역 Fc-효과기기능은 (i) 항체-의존성세포세포독성 (ADCC), (ii) 상보체 (C1q) 결합, 활성화, 및상보체-의존성세포독성 (CDC), (iii) 항원-항체복합체의포식작용 / 클리어런스, 및 (iv) 일부예에서사이토킨방출을포함한다. 항체분자의이들 Fc-효과기기능은 Fc-영역과부류-특이적인세포표면수용체의세트의상호작용을통해매개된다. IgG1 동형의항체는가장활성인반면 IgG2 및 IgG4는최소의효과기기능을가지거나기능이없다. IgG 항체의효과기기능은 3개의구조적으로상동성인세포 Fc 수용체유형 ( 및소-유형 )(FcgR1, FcgRII, 및 FcgRIII) 과의상호작용을통해매개된다. 이러한 IgG1의효과기기능은 FcgR 및 C1q 결합에요구되는보다낮은힌지영역 ( 예를들면, L234A, L235A) 에서특이적인아미노산잔기를돌연변이시킴에의해제거될수있다. Fc 영역, 특히 CH2-CH3 도메인에서아미노산잔기는또한항체분자의순환하는반감기를결정한다. 이러한 Fc 기능은산성리소좀으로부터의항체분자의일반적인순환으로의역재순환에관여하는신생 Fc 수용체 (FcRn) 에대한 Fc-영역의결합을통해매개된다. mab가활성또는비활성동형을가질수있는지의여부는항체에대한바람직한치료학적종점에의존할것이다. 동형및바람직한치료학적결과의용도의일부예는하기에나열되어있다 : 1. 바람직한종점이가용성사이토킨의기능적중화인경우, 이후에비활성동형이사용될수있다 ;

120 [0388] [0389] [0390] [0391] [0392] [0393] [0394] [0395] [0396] [0397] [0398] 2. 바람직한결과가병리학적단백질의클리어런스인경우, 활성동형이사용될수있다 ; 3. 바람직한결과가단백질응집체의클리어런스인경우, 활성동형이사용될수있다 ; 4. 바람직한결과가표면수용체를길항시키기위한것인경우, 비활성동형이사용된다 ( 티사브리 (Tysabri), IgG4; OKT3 돌연변이된 IgG1); 5. 바람직한결과가표적세포를제거하기위한것인경우, 활성동형이사용된다 ( 헤르셉틴, IgG1( 및향상된효과기기능 ); 및 6. 바람직한결과가 CNS내로도입하지않고순환으로부터단백질을제거하기위한경우, IgM 동형이사용될수있다 ( 예를들면, 순환하는 Ab 펩타이드종의제거 ). 모 mab의 Fc 효과기기능은당해분야에잘공지된각종시험관내방법으로측정할수있다. 논의된바와같이, 동형의선택, 및이에의한효과기기능은바람직한치료학적종점에의존할것이다. 순환하는표적의단순한중화, 예를들면수용체-리간드상호작용의차단이요구되는경우, 효과기기능은요구되지않을수있다. 이러한예에서, 효과기기능을제거하는항체의 Fc-영역내동형또는돌연변이가바람직하다. 다른예에서, 표적세포의제거가치료학적종점인경우, 예를들면, 효과기기능을향상시키는 Fc-영역내종양세포, 동형또는돌연변이또는탈-푸코실화의제거가바람직하다 [ 참조 : Presta, L.G., Adv. Drug Del. Rev., 58: (2006); Satoh et al., Expert Opin. Biol. Ther., 6: (2006)]. 유사하게, 치료학적유용성에따라서, 항체분자의순환하는반감기는 Fc 영역내특이적인돌연변이를유도시킴으로써항체-FcRn 상호작용을조절함에의해감소 / 연장될수있다 [ 참조 : Dall's Acqua et al., J. Biol. Chem., 281: (2006); Petkova et al., Int. Immunol., 18: (2006); Vaccaro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: (2006)]. 정상의치료용 mab의상이한효과기기능에영향을미치는각종잔기에서공개된정보는 DVD-Ig에대해확인될필요가있을수있다. DVD-Ig 양식에서단클론항체효과기기능의조절을위해확인된것들외에, 추가의 ( 상이한 ) Fc-영역잔기가중요할수있다. 전체적으로, 어떠한 Fc-효과기기능 ( 동형 ) 이최종 DVD-Ig 양식에중요할지에대한결정은질환징조, 치료학적표적, 바람직한치료학적종점, 및안정성고려에의존할것이다. 하기나열된것은 IgG1-동종이형 : G1mz; IgG1 돌연변이체-A234, A235; IgG2-동종이형 : G2m(n-); Kappa-Km3; 및람다를포함하나, 이에한정되지않는예시적인적절한중쇄및경쇄불변영역이다. Fc 수용체및 C1q 연구 : 세포막에서어떠한과발현된표적에대한항체복합체화에의한원치않는항체-의존성세포-매개된세포독성 (ADCC) 및상보체-의존성세포독성 (CDC) 의가능성은 ( 예를들면, L234A, L235A) 힌지- 영역돌연변이에의해제거될수있다. mab의 IgG1 힌지영역에존재하는이러한치환된아미노산은, FcgR 결합이 IgG1 힌지영역에서오버랩핑부위내존재하는것으로고려되므로, 사람 Fc 수용체 (FcRn은아니다 ) 에대한 mab의약화된결합을생성하는것으로예측된다. mab의이러한특징은야생형 IgG를함유하는항체에비해개선된안정성프로파일을생성할수있다. 사람 Fc 수용체에대한 mab의결합은유동세포분석실험에의해세포주 ( 예를들면, THP-1, K562) 및 FcgRIIb( 또는다른 FcgR) 를발현하는가공된 CHO 세포주를사용하여측정할수있다. IgG1 대조군단클론항체와비교하여, mab는 FcgRI 및 FcgRIIa에대한감소된결합을나타내는반면, FcgRIIb에대한결합은영향받지않는다. 항원 /IgG 면역복합체에의한 C1q의결합및활성화는후속적인염증및 / 또는면역조절반응을사용한전통적인상보체캐스케이드 (cascade) 를개시한다. IgG 위의 C1q 결합부위는 IgG 힌지영역내에서잔기에국재화된다. 증가하는농도의 mab에결합하는 C1q는 C1q ELISA로평가하였다. 당해결과는, mab가야생형대조군 IgG1의결합과비교하는경우예측되는바와같이, C1q에결합할수없다. 전체적으로, L234A, L235A 힌지영역돌연변이는 FcgRI, FcgRIIa, 및 C1q에대한 mab의결합을제거하지만, mab 와 FcgRIIb의상호작용에영향을미치지않는다. 이들데이타는, 돌연변이체 Fc를가진생체내 mab가일반적으로억제성 FcgRIIb와상호작용하겠지만활성화 FcgRI 및 FcgRIIa 수용체또는 C1q와상호작용하지않을것임을제시한다. 사람 FcRn 결합 : 신생수용체 (FcRn) 는태반을거치는 IgG의수송및 IgG 분자의이화작용적반감기를조절하는데관여한다. 효능을개선하거나, 용량또는투여의횟수를감소시키거나, 표적에대한국재화를개선시키기위해항체의말기반감기를증가시키는것이바람직할수있다. 대안적으로, 전체항체노출을감소시키기위해항체의말기반감기를감소시키거나, 표적-대-비-표적결합비를개선시키는, 역을수행하는것이유리할수

121 있다. IgG와이의구조적수용체, FcRn 사이의상호작용의맞춤은 IgG의말기반감기를증가시키거나감소시키는방법을제공한다. IgG를포함하는순환에서단백질은유체상으로미세포음작용을통해혈관내피의세포와같은특정세포에의해취한다. IgG는약산성조건 ((ph 6.0 내지 6.5) 하에서엔도솜내에서 FcRn에결합하여세포표면을재생시킬수있으며, 여기서이는거의중성조건 (ph 7.0 내지 7.4) 하에서방출된다. FcRn80, 16, 17에서 Fc-영역-결합부위의맵핑은, 종을가로질러보존된 2개의히스티딘잔기, His310 및 His435가이러한상호작용의 ph 의존성에관여함을나타내었다. 파아지-디스플레이기술을사용하여, FcRn에대한결합을증가시키고마우스 IgG의반감기를연장시키는마우스 Fc-영역돌연변이를확인하였다 [ 참조 : Ghetie et al., Nature Biotechnol., 15(7): (1997)]. ph 6.0에서 FcRn에대한사람 IgG의결합친화성을증가시키지만, ph 7.4에서는증가시키지않는 Fc-영역돌연변이가또한확인되어왔다 [ 참조 : Dall'Acqua et al., J. Immunol., 169(9): (2002)]. 또한, 하나의경우에, 결합에있어서유사한 ph-의존성증가 (27배이하 ) 가또한레서스 (rhesus) FcRn에서관찰되었으며, 이는모 IgG와비교하여레서스원숭이에서혈청반감기의 2배증가를생성하였다 [ 참조 : Hinton et al., J. Biol. Chem., 279(8): (2004)]. 이러한발견은, 이것이 FcRn 을가진 Fc 영역의상호작용을맞춤으로써항체치료요법의혈장반감기를연장시키기용이함을나타낸다. 역으로, FcRn과의상호작용을약화시키는 Fc-영역돌연변이는항체반감기를감소시킬수있다. [0399] [0400] [0401] [0402] [0403] [0404] B.10. 약력학 (PK) 바람직한약력학적프로파일을지닌 DVD-Ig 분자를생성하기위하여, 하나의양태에서, 유사한바람직한약력학적프로파일을가진모 mab를선택한다. 하나의고려사항은, 단클론항체 ( 즉, "HAHA", 사람항-사람항체반응 ; "HACA", 사람항-키메라항체반응 ) 는또한이들치료제의약력학을추가로복잡하게한다는것이다. 하나의양태에서, 면역원성이최소이거나없는단클론항체는 DVD-Ig 분자를작제하는데사용됨으로써수득되는 DVD-Ig는또한, 면역원성이최소이거나없게될것이다. mab의 PK를측정하는인자들중일부는 mab의고유특성 (VH 아미노산서열 ); 면역원성 ; FcRn 결합및 Fc 기능을포함하지만, 이에한정되지않는다. 선택된모단클론항체의 PK 프로파일은, 설치류에서 PK 프로파일이사이노몰구스원숭이및사람에서단클론항체의 PK 프로파일과잘관련되거나 ( 이를밀접하게예측되는 ) 바와같이설치류에서용이하게측정될수있다. 바람직한 PK 특성 ( 및본원에논의된것으로서다른바람직한기능적특성 ) 을가진모단클론항체를선택한후에, DVD-Ig를작제한다. DVD-Ig 분자는 2개의모단클론항체로부터의 2개의항원-결합도메인을함유하므로, DVD-Ig의 PK 특성이또한평가된다. 따라서, DVD-Ig의 PK 특성을측정하는동안, 2개의모단클론항체로부터기원한항원-결합도메인둘다의기능성을기반으로 PK 프로파일을측정하는 PK 검사를사용할수있다. DVD- Ig의 PK 프로파일을측정할수있다. DVD-Ig의 PK 프로파일에영향을미치는추가의인자는항원-결합도메인 (CDR) 배향, 링커크기, 및 Fc/FcRn 상호작용을포함한다. 모항체의 PK 특성은다음매개변수 : 흡수, 분포, 대사및배출을평가함으로써평가할수있다. 흡수 : 지금까지, 치료학적단클론항체의투여는비경구투여 ( 예를들면, 정맥내 [IV], 피하 [SC], 또는근육내 [IM]) 를통한다. 사이질공간 (interstitial space) 으로부터 SC 또는 IM 투여후전신계순환내로 mab를흡수시키는것은주로림프구경로를통한다. 포화가능한, 전전신계적 (presystemic), 단백질분해적분해는혈관외투여후가변성의절대생물이용성을생성할수있다. 일반적으로, 단클론항체의증가하는용량을사용한절대적인생물이용성에있어서의증가는보다높은용량에서포화된단백질분해능으로인해관찰될수있다. mab 에대한흡수과정은일반적으로림프액이혈관계내로서서히유출되기때문에매우느리며, 흡수기간은수시간내지수일에걸쳐발생할수있다. SC 투여후단클론항체의절대적인생물이용성은일반적으로 50% 내지 100% 의범위이다. DVD-Ig 작제물에의해표적화된혈액-뇌장벽 (BBB) 에서수송-매개된구조의경우에, 혈장내순환횟수는혈액뇌장벽 (BBB) 에서 CNS 구획내로향상된경-세포수송 (trans-cellular transport) 으로인해감소될수있으며, 여기서 DVD-Ig는이의제2 항원인식부위를통해상호작용이가능하도록유리된다. 분포 : IV 투여후, 단클론항체는일반적으로신속한분포상으로개시한후느린제거상이이어지는, 2상 (biphasic) 혈청 ( 또는혈장 ) 농도-시간프로파일을따른다. 일반적으로, 이중지수약력학적모델 (biexponential pharmacokinetic model) 은이러한종류의약력학적프로파일을가장잘기술한다. mab에대한중심구획 (Vc) 에서분포용적은일반적으로혈장용적 (2 내지 3 리터 ) 과동등하거나이보다약간더크다. 혈청 ( 혈장 ) 농도대시간프로파일에서명백한 2상패턴은, 혈청 ( 혈장 ) 농도-시간곡선의분포상이긴흡수부분에의해차폐되므로, IM 또는 SC와같은다른비경구투여경로로명백하지않을수있다. 물리화학적특성,

122 부위 - 특이적인및표적 - 기원한수용체매개된흡수, 조직의결합력, 및 mab 용량을포함하는많은인자들은 mab 의생분포에영향을미칠수있다. 이들인자들중일부는 mab 에대한생분포에서비선형성에기여할수있다. [0405] 대사및배출 : 분자크기로인하여, 완전한단클론항체는신장을통해뇨내로배출되지않는다. 이들은주로대사 ( 예를들면, 이화작용 ) 에의해불활성화된다. IgG-계치료용단클론항체의경우, 반감기는전형적으로수시간또는 1 내지 2일내지 20일초과의범위이다. mab의제거는 FcRn 수용체에대한친화성, mab의면역원성, mab의글리코실화정도, 단백질분해에대한 mab에대한민감성, 및수용체-매개된제거를포함하나, 이에한정되지않는많은인자들에의해영향받을수있다. [0406] [0407] [0408] [0409] [0410] [0411] [0412] [0413] [0414] B.11. 사람및독종 (tox species) 에있어서조직교차-반응성패턴동일한염색패턴은, 잠재적인사람독성이독종에서평가될수있음을제안한다. 독종은, 관련되지않은독성이연구된동물이다. 개개항체를선택하여다음과같은 2개의기준을충족하도록한다 : (1) 항체표적의공지된발현에적절한조직염색및 (2) 동일한기관으로부터사람및독종조직들사이의유사한염색패턴. 기준 1: 면역화및 / 또는항체선택은전형적으로재조합체또는합성된항원 ( 단백질, 탄수화물또는다른분자 ) 를사용한다. 관련되지않은항원에대한천연의대응물및카운터스크린 (counterscreen) 은흔히치료용항체에대한스크리닝깔대기의부분이다. 그러나, 다수의항원에대한스크리닝은흔히실제적이지않다. 따라서, 모든주요기관으로부터의사람조직을사용한조직교차-반응성연구는어떠한관련되지않은항원에대한항체의원치않은결합도제외시키기위해제공된다. 기준 2: 사람및독종조직 ( 사이노몰구스원숭이, 개, 가능하게는설치류, 및기타, 사람연구에서와같이시험중인동일한 36개또는 37개조직들 ) 을사용한비교조직교차반응성연구는독종의선택을유효하도록돕는다. 동결된조직단면에서의전형적인조직교차-반응성연구에서, 치료용항체는공지된항원에대한예측된결합및 / 또는저수준의상호작용 ( 비특이적인결합, 유사한항원에대한저수준결합, 저수준전하계상호작용등 ) 을기반으로하는조직에대한보다적은정도의결합을입증할수있다. 어떠한경우에서도, 대부분의관련된독성동물종은사람및동물조직에대한결합의가장큰정도의일치를갖는것이다. 조직교차-반응성연구는문헌 [EC CPMP Guideline III/5271/94 "Production and quality control of mabs" and the 1997 US FDA/CBER "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use"] 을포함하는적절한조절안내서를따른다. 부검또는생검으로수득된사람조직의동결단면 (cryosection)(5μm) 을고정시키고대물렌즈위에서건조시켰다. 조직단면의퍼옥시다제염색은아비딘-바이오틴시스템을사용하여수행한다 ( 참조 : FDA의안내서 "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use"). 관련된참조문헌은문헌 [Clarke, J. (2004), Boon, L. (2002a), Boon, L. (2002b), Ryan, A. (1999)] 을포함한다. 조직-교차반응성연구는흔히 2개단계로수행하며, 제1 단계는하나의사람공여체로부터의 32개조직의동결단면 ( 전형적으로, 부신, 위장관, 전립샘, 방광, 심장, 골격근, 혈액세포, 신장, 피부, 골수, 간, 척수, 유방, 페, 비장, 소뇌, 림프절, 고환, 대뇌피질, 난소, 가슴샘, 결장, 췌장, 갑상샘, 내피, 부갑상샘, 요관, 눈, 난관, 자궁, 난관및태반 ) 을포함한다. 제2 상에서, 완전한교차반응성연구는 3명의관련되지않은성인으로부터의 38개까지의조직 ( 부신, 혈액, 혈관, 골수, 소뇌, 대뇌, 경부, 식도, 눈, 심장, 신장, 대장, 간, 폐, 림프절, 유방유선, 난소, 난관, 췌장, 부갑상샘, 말초신경, 뇌하수체, 태반, 전립샘, 타액선, 피부, 소장, 척수, 비장, 위, 횡문근, 고환, 가슴샘, 갑상샘, 편도, 요관, 방광, 및자궁을포함 ) 을사용하여수행한다. 연구는최소 2회용량수준에서전형적으로수행된다. 치료용항체 ( 즉, 시험제품 ) 및동형매치된대조군항체는아비딘-바이오틴복합체 (ABC) 검출을위해바이오티닐화될수있으며 ; 다른검출방법은 FITC( 또는기타의경우 ) 표지된시험제품에대한 3차항체검출, 또는표지되지않은시험제품에대한표지된항-사람 IgG와의예비복합체화를포함할수있다. 요약하면, 부검또는생검에서수득된사람조직의동결단면 ( 약 5μm) 을고정시키고대물렌즈위에서건조시킨다. 조직단면의퍼옥시다제염색은아비딘-바이오틴시스템을사용하여수행한다. 첫째로 ( 예비복합체화검출시스템의경우 ), 시험제품을제2의바이오티닐화된항-사람 IgG와함께항온처리하고면역복합체로발달시켰다. 시험제품의 2 및 10 μg /ml의최종농도에서면역복합체를대물렌즈위의조직단면위에가한후조직

123 단면을 30 분동안아비딘 - 바이오틴 - 퍼옥시다제키트로반응시켰다. 후속적으로, 퍼옥시다제반응에대한기질 인, DAB(3,3'- 디아미노벤지딘 ) 을 4 분동안조직염색에적용시켰다. 항원 - 세파로즈비드 (bead) 를양성대조군 조직단면으로사용한다. [0415] [0416] [0417] [0418] 모든특이적인염색은문제의표적항원의공지된발현을기반으로예측된 ( 예를들면, 항원발현과일치하는 ) 또는예측되지않은반응성인것으로판단된다. 특이적인것으로판단된모든염색은강도및횟수에대해점수매긴다. 항원또는혈청경쟁또는차단연구는관찰된염색이특이적인지또는비특이적인지를측정하는데있어추가로보조할수있다. 2개의선택된항체가선택기준 - 적절한조직염색, 사람과독성학동물특이적인조직사이에매칭염색을충족하는것으로밝혀진경우 - 이들은 DVD-Ig 생성을위해선택될수있다. 조직교차-반응성연구는최종의 DVD-Ig 작제물을사용하여반복되어야하지만, 이들연구는본원에요약된바와동일한프로토콜을따르는반면, 어떠한결합도 2개의모항체중어느것으로부터올수있기때문에, 이들은평가하기에보다복잡하며, 어떠한설명되지않은결합도복합체항원경쟁연구를사용하여수행할필요가있다. DVD-Ig와같은다특이적분자를사용한조직교차-반응성을착수하는복합체는, 2개의모항체가 (1) 예측되지않는조직교차-반응성발견의결여및 (2) 상응하는사람과독성학동물종조직사이의조직교차-반응성발견의적절한유사성에대해선택됨이용이하게드러난다. [0419] [0420] [0421] [0422] [0423] [0424] B.12. 특이성및선택성바람직한특이성및선택성을갖는 DVD-Ig 분자를생성하기위해, 유사하게바람직한특이성및선택성프로파일을갖는모 mab 생성하고선택할필요가있다. DVD-Ig를사용한특이성및선택성에대한결합연구는, 각각의항원에대해각각 2개인, 4개이상의결합부위로인하여복잡할수있다. 요약하면, DVD-Ig를사용한 ELISA, BIAcore, KinExA, 또는다른상호작용연구를이용하는결합연구는 DVD-Ig 분자에대한 1 또는 2개이상의항원의결합을모니터링할필요가있다. BIAcore 기술은다수의항원의순차적인, 독립적인결합을해결할수있는반면, ELISA를포함하는보다전통적인방법또는 KinExA와같은보다현대적인기술은해결할수없다. 따라서, 각각의모항체의조심스러운특성화가중요하다. 각각의개별적인항체가특이성에대해특성화된후, DVD-Ig 분자에서개개결합부위의특이성보유의구조는크게단순화된다. DVD-Ig의특이성의측정을수행하는복합체는, 2개의모항체를 DVD-Ig내로조합하기전에특이성에대해선택할경우크게단순화됨이용이하게드러난다. 항원-항체상호작용연구는 ELISA( 효소연결된면역흡착성검사 ), 질량분광법, 화학교차연결, 광산란을사용한 SEC, 평형투석, 겔침투, 한외여과, 겔크로마토그래피, 거대-부위분석 SEC, 미세제조한외여과 ( 침강평형 ), 분광법, 적정미세열량측정법, 침강평형 ( 분석적한외원심분리 ), 침강속도 ( 분석적원심분리 ), 표면플라스몬공명 (BIAcore 포함 ) 을포함하는많은전통적인형태를취할수있다. 관련된참조문헌은 Current Protocols in Protein Science, Volume 3, chapters 19 and 20, (Coligan et al., eds.) (John Wiley & Sons Inc.) and references included therein; and Current Protocols in Immunology, (Coligan et al., eds.) (John Wiley & Sons Inc.) 및이에포함된관련참조문헌을포함한다. 전혈에서사이토킨방출 : mab와사람혈액세포의상호작용은사이토킨방출검사 [ 참조 : Wing et al., Therapeutic Immunol., 2(4): (1995); Current Protocols in Pharmacology, (Enna et al., eds.) (John Wiley & Sons Inc.); Madhusudan et al., Clin. Cancer Res., 10(19): (2004); Cox et. al., Methods, 38(4): (2006); Choi et al., Eur. J. Immunol., 31(1): (2001)] 으로시험할수있다. 요약하면, 다양한농도의 mab를사람전혈과 24시간동안항온처리한다. 시험한농도는환자에서전형적인혈액수준을모사하는최종농도 (100 ng/ml 내지 100 μg /ml을포함하나이에한정되지않음 ) 를포함하는광범위한범위를포함하여야한다. 항온처리후, 상층액및세포분해물을 IL-1Rα, TNF-α, IL-1b, IL-6 및 IL- 8의존재에대해분석한다. mab에대해생성된사이토킨농도프로파일을음성사람 IgG 대조군및양성 LPS 또는 PHA 대조군에의해생성된프로파일과비교한다. 세포상층액및세포분해물둘다로부터의 mab에의해디스플레이된사이토킨프로파일을대조군사람 IgG를사용한것과비교한다. 하나의양태에서, 단클론항체는

124 사람혈액세포와상호작용하여염증성사이토킨을자발적으로방출하지않는다. [0425] DVD-Ig에대한사이토킨방출연구는각각의항원에대해각각 2개인, 4개이상의결합부위로인해복잡하다. 요약하면, 본원에기술된바와같은사이토킨방출연구는전혈또는다른세포시스템에서전체 DVD-Ig 분자의효과를측정하지만분자의어느부위가사이토킨방출을유발하는지를해결할수없다. 사이토킨방출이검출되면, 일부동시-정제하는세포성분들이이들자체에서사이토킨방출을유발할수있으므로, DVD-Ig 제제의순도를확인하여야한다. 순도가쟁점이아닌경우, DVD-Ig의단편화 (Fc 부위의제거, 결합부위의분리등을포함하나, 이에한정되지않는다 ), 결합부위돌연변이유발또는다른방법들이어떠한관찰도해결하는데사용할필요가있을수있다. 이러한복합체수행은, 2개의모항체가 DVD-Ig내로조합되기전에사이토킨방출의결여를위해선택되는경우크게단순화됨이용이하게드러난다. [0426] [0427] [0428] [0429] B.13. 독성학적연구에대한다른종에대한교차-반응성하나의양태에서, 개개항체를적절한독종, 예를들면, 사이노몰구스원숭이에대한충분한교차-반응성을사용하여선택하였다. 모항체는이종상동성종표적 ( 즉, 사이노몰구스원숭이 ) 에결합하여적절한반응 ( 조절, 중화, 활성화 ) 을유발할필요가있다. 하나의양태에서, 이종상동성종에대한교차-반응성 ( 친화성 / 효능 ) 은사람표적의 10배이내이어야한다. 실시시, 모항체는마우스, 랫트, 개, 원숭이 ( 및다른비-사람영장류 ), 및질환모델종 ( 즉, 천식모델용양 ) 을포함하는다수종에대해평가된다. 모단클론항체로부터의독종에대한허용되는교차-반응성은동일한종에서 DVD-Ig의미래의독성학연구를허용한다. 이러한이유로, 2개의모단클론항체는일반적인독종에대해허용되는교차-반응성을가져야하므로동일한종에서 DVD-Ig의독성학연구를허용한다. 모 mab는특이적인표적에결합할수있고당해분야에잘공지된각종 mab로부터선택될수있다. 이는 IL- 1β, 항-TNF 항체 ( 미국특허공보제6,258,562호 ), 항-IL-12 및 / 또는항-IL-12p40 항체 ( 미국특허공보제 6,914,128호 ); 항-IL-18 항체 (US 공보제2005/ A1호 ), 항-C5, 항-CBL, 항-CD147, 항-gp120, 항-VLA-4, 항-CD11a, 항-CD18, 항-VEGF, 항-CD40L, 항-CD-40 ( 예를들면, PCT 공보제WO 2007/124299호참조 ) 항-Id, 항 -ICAM-1, 항-CXCL13, 항-CD2, 항-EGFR, 항-TGF-베타 2, 항-HGF, 항-cMet, 항-DLL-4, 항-NPR1, 항-PLGF, 항- ErbB3, 항-E-셀렉틴, 항-Fact VII, 항-Her2/neu, 항-F gp, 항-CD11/18, 항-CD14, 항-ICAM-3, 항-RON, 항-CD- 19, 항-CD80 ( 예를들면, PCT 공보제WO 2003/039486호참조 ), 항-CD4, 항-CD3, 항-CD23, 항-베타2-인테그린, 항-알파4베타7, 항-CD52, 항-HLA DR, 항-CD22( 참조 : 예를들면, 미국특허공보제5,789,554호 ), 항-CD20, 항- MIF, 항-CD64 (FcR), 항-TCR 알파베타, 항-CD2, 항-Hep B, 항-CA 125, 항-EpCAM, 항-gp120, 항-CMV, 항- gpiibiiia, 항-IgE, 항-CD25, 항-CD33, 항-HLA, 항-IGF1,2, 항-IGFR, 항-VNR인테그린, 항-IL-1알파, 항-IL-1베타, 항-IL-1 수용체, 항-IL-2 수용체, 항-IL-4, 항-IL-4 수용체, 항-IL5, 항-IL-5 수용체, 항-IL-6, 항-IL-6R, RANKL, NGF, DKK, 알파V베타3, 항-IL-8, 항-IL-9, 항-IL-13, 항-IL-13 수용체, 및항-IL-23; IL-23p19[ 참조 : Presta, L.G., "Selection, design, and engineering of therapeutic antibodies," J. Allergy Clin. Immunol., 116: (2005) 및 worldwide website 을포함하나, 이에한정되지않는다. 모 mab는또한임상시험, 또는임상용도에대한개발시사용을위해승인된각종치료용항체로부터선택될수있다. 이러한치료용항체는리툭시마브 [Rituxan IDEC/ 제조원 : 진테크 (Genentech)/ 로슈 (Roche)]( 참조 : 예를들면, 미국특허공보제5,736,137호 ), 비-호지킨림프종 (Non-Hodgkin's lymphoma) 을치료하기위해승인된키메라항-CD20 항체 ; HuMax-CD20, 젠마브 (Genmab) 에의해현재개발중인항-CD20, 미국특허공보제 5,500,362호에기술된항-CD20 항체, AME-133[ 제조원 : 어플라이드몰레큘러에볼류션 (Applied Molecular Evolution)], ha20[ 제조원 : 임뮤노메딕스, 인코포레이션 (Immunomedics, Inc.)], HumaLYM[ 제조원 : 인트라셀 (Intracel)], 및 PRO70769 [" 면역글로불린변이체및이의용도 " 라는명칭의 PCT 공보제WO 2004/056312호 (PCT/US2003/040426)], 트라스투주마브 [Herceptin 제조원 : 진테크 (Genentech)]( 참조 : 예를들면, 미국특허공보제5,677,171호 ), 유방암치료를위해승인된사람화된항-Her2/neu 항체 ; 현재진테크에의해개발중인페 르투주마브 (rhumab-2c4, Omnitarg ); 미국특허공보제4,753,894호에기술된항-Her2 항체 ; 세툭시마브 [Erbitux, 제조원 : 임클론 (ImClone)]( 미국특허공보제 4,943,533호 ; PCT 공보제WO 96/40210호 ), 각종암에대한임상시험중인키메라항-EGFR 항체 ; 현재아브게닉스-임뉴넥스- 암젠 (Abgenix-Immunex-Amgen) 에의해개발중인 ABX-EGF ( 미국특허공보제6,235,883호 ); 현재젠마브 (Genmab) 에의해개발중인 HuMax-EGFr(US 제

125 2003/ 호로발표되어, 현재미국특허공보제 7,247,301호인, 미국일련번호제10/172,317호 ); 425, EMD55900, EMD62000, 및 EMD72000[ 제조원 : 머크케이지에이에이 (Merck KGaA)][ 미국특허공보제5,558,864호 ; Murthy et al., Arch. Biochem. Biophys., 252(2): (1991)]; ICR62[ 제조원 ; 인스티튜트오브캔서리서치 (Institute of Cancer Research), PCT 공보제WO 95/20045호 ; (1987); Rodeck et al., J. Cell Biochem., 35(4): (1987); Kettleborough et al., Protein Eng., 4(7): Modjtahedi et al., J. Cell Biophys., 22(1-3): (1993); Modjtahedi et al., Br. J. Cancer, 67(2): (1993); Modjtahedi et al., Br. J. Cancer, 73(2): (1996); Modjtahedi et al., Int. J. Cancer, 105(2): (2003)); TheraCIM hr3 (YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba ( 미국특허공보제 5,891,996호 ; 미국특허공보제6,506,883호 ; Mateo et al., Immunotechnology, 3(1):71-81(1997)]; mab-806[ 제조원 : 루드빅인스티튜트포캔서리서치 (Ludwig Institute for Cancer Research), 메로리얼스롤안 -케터링소재 ][ 참조 : Jungbluth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100(2): (2003)]; KSB-102[ 제조원 : 케이에스바이오메딕스 (KS Biomedix)]; MR1-1[(IVAX), 제조원 ; 내셔널캔서인스티튜트 (National Cancer Institute)(PCT 공보제WO 01/62931호 ); 및 SC100[ 제조원 : 스캔셀 (Scancell)](PCT 공보제WO 01/88138호 ); B-세포만성림프구백혈병치료용으로현재승인된사람화된 mab인, 알렘투부마브 [Campath 제조원 : 밀레니움 (Millennium)]; 무로모나브 (muromonab)-cd3[orthoclone OKT3, 오르토바이오테크 (Ortho Biotech)/ 존슨앤드존슨 (Johnson & Johnson) 에의해개발된항-CD3 항체, 이브리투모마브티욱세탄 (Zevalin ), IDEC/ 쉐링아게 (Schering AG) 에의해개발된항-CD20 항체, 겜투주마브오조가미신 (Mylotarg ), 셀테크 (Celltech)/ 와이어쓰 (Wyeth) 에의해개발된항-CD33(p67 단백질 ) 항체, 알레파셉트 (Amevive ), 바이오젠 (Biogen) 에의해개발된항 -LFA-3 Fc 융합체 ], 센토코르 (Centocor)/ 릴리 (Lilly) 에의해개발된아브킥시마브 (ReoPro ), 노바티스 (Novartis) 에의해개발된바실릭시마브 (Simulect ), 메디뮨 (Medimmune) 에의해개발된팔리비주마브 (Synagis ), 센토코르 (Centocor) 에의해개발된항-TNF알파항체인인플릭시마브 (Remicade ), 애보트래보러토리즈 (Abbott Laboratories) 에의해개발된항-TNF알파항체인아달리무마브 (Humira ), 셀테크에의해개발된항-TNF알파항체인 Humicade, 센토코르에의해개발된완전한사람 TNF 항체인골리무마브 (CNTO- 148), 에타네르셉트 (Enbrel ), 임뮤넥스 / 암젠에의해개발된 p75 TNF 수용체 Fc 융합체, 레네르셉트, 로슈 (Roche) 에의해이미개발된 p55tnf 수용체 Fc 융합체, ABX-CBL, 아브게닉스 (Abgenix) 에의해개발중인항- CD147 항체, ABX-IL8, 아브게닉스에의해개발중인항-IL8 항체, ABX-MA1, 아브게닉스에의해개발중인항- MUC18 항체, 펜투모마브 (R1549, 90Y-muHMFG1), 안티소마 (Antisoma) 에의해개발중인항-MUC1, 테렉스 (R1550), 안티소마에의해개발중인항-MUC1 항체, 안티소마에의해개발중인안지오맵 (AS1405), 안티소마에의해개발중인 HuBC-1, 안티소마에의해개발중인티오플라틴 (AS1407), Antegren ( 나탈리주마브 ), 바이오젠에의해개발중인항-알파-4-베타-1 (VLA-4) 및알파-4-베타-7 항체, VLA-1 mab, 바이오젠에의해개발중인항-VLA-1 인테그린항체, LTBR mab, 바이오젠에의해개발중인항-림프독소베타수용체 (LTBR) 항체, CAT-152, 캠브릿지안티바디테크놀로지 (Cambridge Antibody Technology) 에의해개발중인항-TGF-β2 항체, ABT 874 (J695), 애보트래보러토리즈에의해개발중인항-IL-12 p40 항체, CAT-192, 캠브릿지안티바디테크놀로지및젠자임 (Genzym e) 에의해개발중인항-TGFβ1 항체, CAT-213, 캠브릿지안티바디테크놀로지에의해개발중인항-에오탁신1 항체, 캠브릿지안티바디테크놀로지및휴먼게놈사이언시즈인코포레이티드 (Human Genome Sciences Inc.) 에의해개발중인 LymphoStat-B 항-Blys 항체, TRAIL-R1mAb, 캠브릿지안티바디테크놀로지및휴먼게놈사이언시즈인코포레이티드에의해개발중인항-TRAIL-R1 항체, Avastin 베바키주마브, rhumab-vegf), 진테크에의해개발중인항-VEGF 항체, 진테크에의해개발중인항-HER 수용체계열항체, 항-조직인자 (ATF), 진테크에의해개발중인항-조직인자항체, Xolair ( 오말리주마브 ), 진테크에의해개발중인항-IgE 항체, Raptiva ( 에팔리부마브 ), 진테크및크소마 (Xoma) 에의해개발중인항-CD11a 항체, 진테크및밀레니엄파마슈티칼즈에의해개발중인 MLN-02 항체 ( 앞서 LDP-02), HuMax CD4, 젠마브에의해개발중인항-CD4 항체, HuMax-IL15, 젠마브및암젠에의해개발중인항-IL15 항체, 젠마브및메다렉스 (Medarex) 에의해개발중인 HuMax-Inflam, HuMax-암, 젠마브및메다렉스및옥스포드지코사이언시즈 (Oxford GcoSciences) 에의해개발중인항-헤파라나제 I 항체, 젠마브및암젠에의해개발중인 HuMax-림프종, 젠마브에의해개발중인 HuMax-TAC, 아이디이씨파마슈티칼즈 (IDEC Pharmaceuticals) 에의해개발중인 IDEC-131, 및항-CD40L 항체, IDEC-151( 클레놀릭시마브 ), 아이디이씨

126 파마슈티칼즈에의해개발중인항-CD4 항체, IDEC-114, 아이디이씨파마슈티칼즈에의해개발중인항-CD80 항체, IDEC-152, 아이디이씨파마슈티칼즈에의해개발중인항-CD23, 아이디이씨파마슈티칼즈에의해개발중인항-대식세포이주인자 (MIF) 항체, BEC2, 임클론 (imclone) 에의해개발중인항-개별특이형항체, IMC-1C11, 임클론에의해개발중인항-KDR 항체, DC101, 임클론에의해개발중인항-flk-1 항체, 임클론에의해개발중인항 -VE 카드헤린항체, CEA-Cide ( 라베투주마브 ), 임뮤노메딕스 (Immunomedics) 에의해개발중인항-암배아항원 (CEA) 항체, LymphoCide ( 에프라투주마브 ), 임뮤노메딕스에의해개발중인항-CD22 항체, 임뮤노메딕스에의해개발중인 AFP-시드, 임뮤노메딕스에의해개발중인마이엘로마시드, 임뮤노메딕스에의해개발중인 LkoCide, 임뮤노메딕스에의해개발중인프로스타시드 (ProstaCide), MDX-010, 메다렉스 (Medarex) 에의해개발중인항-CTLA4 항체, MDX-060, 메다렉스에의해개발중인항-CD30 항체, 메다렉스에의해개발중인 MDX-070, 메다렉스에의해개발중인 MDX-018, Osidem (IDM-1), 및메다렉스에의해개발중인항-Her2 항체및면역-설계된분자, HuMax - CD4, 메다렉스및젠마브에의해개발중인항-CD4 항체, HuMax-IL15, 메다렉스및젠마브에의해개발중인항- IL15 항체, CNTO 148, 메다렉스및센토코르 / 존슨앤드존슨에의해개발중인항-TNFα 항체, CNTO 1275, 센토코르 / 존슨앤드존슨에의해개발중인항-사이토킨항체, MOR101 및 MOR102, 모르포시스 (MorphoSys) 에의해개발중인항-세포내부착분자-1 (ICAM-1)(CD54) 항체, MOR201, 모르포시스에의해개발중인항-섬유모세포성장인자수용체 3 (FGFR-3) 항체, Nuvion ( 비실리주마브 ), 프로테인디자인랩스 (Protein Design Labs) 에의해개발중인항-CD3 항체, HuZAF, 프로테인디자인랩스에의해개발중인항-감마인터페론항체, 프로테인디자인랩스에의해개발중인항-α5β1 인테그린, 프로테인디자인랩스에의해개발중인항-IL-12, ING-1, 크소마 (Xoma) 에의해개발중인항-Ep-CAM 항체, 진테크및노바티스에의해개발된 Xolair ( 오말리주마브 ) 사람화된항-IgE 항체, 및 MLN01, 크소마에의해개발중인항-베타2 인테그린항체를포함하나, 이에한정되지않는다. 다른양태에서, 치료제는 KRN330 (Kirin); hua33 항체 (A33, 제조원 : 루드빅인스티튜트포캔서리서치 ); CNTO 95 ( 알파 V 인테그린, 제조원 : 센토코르 ); MEDI-522 ( 알파 Vβ3 인테그린, 제조원 : 메드임뮨 ); 볼록식시마브 ( 알파 Vβ1 인테그린, 제조원 : 바이오젠 /PDL); 사람 mab 216(B 세포글리코졸화된에피토프, NCI); BiTE MT103( 이특이적인 CD19 x CD3, 제조원 : 메드임뮨 ); 4G7xH22( 이특이적인 BcellxFcgammaR1, 제조원 ; 메다렉스 / 머크케이지에이 ); rm28( 이특이적인 CD28 x MAPG, 유럽특허공보제 호 ); MDX447(EMD 82633)( 이특이적인 CD64 x EGFR, 메다렉스 ); 카투막소마브 ( 레모바브 )( 이특이적인 EpCAM x 항-CD3, 제조원 ; 트리온 (Trion)/ 프레스 (Fres)); 에르투막소마브 [ 이특이적인 HER2/CD3, 제조원 ; 프레세니우스바이오테크 (Fresenius Biotech)]; 오레고보마브 [ 제조원 : 오바렉스 (OvaRex)] (CA-125, ViRexx); Rencarex (WX G250)[ 카보닉안하이드라제 IX, 제조원 : 윌렉스 (Wilex)]; CNTO 888(CCL2, 제조원 : 센토코르 ); TRC105[CD105( 엔도글린 ), 제조원 ; 트라콘 (Tracon)]; BMS [CD137 작용제, 제조원 : 브리스톨마이어스스퀴브 (Brystol Myers Squibb)]; MDX-1342[(CD19, 제조원 : 메다렉스 (Medarex)]; 시프릴주마브 (MEDI-507)(CD2, 제조원 : 메드임뮨 ); 오파투무마브 ( 휴막스-CD20) (CD20, 제조원 : 젠마브 ); 리툭시마브 ( 리툭산 ) (CD20, 제조원 : 진테크 ); 벨투주마브 (ha20)(cd20, 제조원 : 임뮤노메딕스 ); 에프라투주마브 (CD22, 제조원 : 암젠 ); 루밀릭시마브 (IDEC 152)(CD23, 제조원 : 바이오젠 ); 무로모나브-CD3 (CD3, 제조원 : 오르토 ); HuM291[CD3 fc 수용체, 제조원 : 피디엘바이오파마 (PDL Biopharma)]; HeFi-1(CD30, 제조원 : 엔씨아이 ); MDX-060(CD30, 제조원 : 메다렉스 ); MDX-1401(CD30, 제조원 : 메다렉스 ); SGN-30[CD30, 제조원 : 시애틀제네틱스 (Seattle Genentics)]; SGN-33( 린투주마브 ) (CD33, 제조원 : 시애틀제네틱스 ); 자롤리무마브 (HuMax-CD4)(CD4, 제조원 : 젠마브 ); HCD122 (CD40, 제조원 ; 노바티스 ); SGN-40 (CD40, 제조원 : 시애틀제네틱스 ); 캄파쓰1h( 알렘투주마브 ) (CD52, 제조원 : 젠자임 ); MDX-1411(CD70, 제조원 : 메다렉스 ); hll1 (EPB-1) (CD74.38, 제조원 : 임뮤노메딕스 ); Galiximab(IDEC-144) (CD80, 제조원 : 바이오젠 ); MT293 (TRC093/D93) [ 콜라겐에의해절단됨, 제조원 : 트라콘 (Tracon)]; HuLuc63 (CS1, 제조원 : 피디엘파마 ); 이필리무마브 (MDX- 010)[CTLA4, 제조원 : 브리스톨마이어스스퀴브 (Brystol Myers Squibb)]; 트레멜리무마브 ( 티킬리무마브, CP- 675,2)[CTLA4, 제조원 : 화이자 (Pfizer)]; HGS-ETR1( 마파투무마브 )(DR4 TRAIL-R1 작용제, 제조원 : 휴먼게놈사이언스 (Human Genome Science)/ 글락소스미쓰클라인 (Glaxo Smith Kline)]; AMG-655 (DR5, 제조원 : 암젠 ); Apomab (DR5, 제조원 : 진테크 ); CS-1008[DR5, 제조원 : 다이이치산쿄 (Daiichi Sankyo)]; HGS-ETR2( 렉사투무마브 )[DR5 TRAIL-R2 작용제, 제조원 : 에이치지에스 (HGS)]; 세툭시마브 ( 에르비툭스 )[EGFR, 제조원 : 임클론 (ImClone)]; IMC-11F8, (EGFR, 제조원 : 임클론 ); 니모투주마브 [EGFR, 제조원 : 와이엠바이오 (YM Bio)]; 파니투무마브 ( 벡타빅스 ) (EGFR, 제조원 : 암젠 ); 잘루투마브 (HuMaxEGFr)(EGFR, 제조원 : 젠마브 ); CDX-110[EGFRvIII, 제조원 : 아반트임뮤노써라퓨틱스 (AVANT Immunotherapeutics)]; 아데카투무마브 (MT201)( 엡캄, 제조원 : 머크 ); 에드레콜로마브 ( 파노렉스, 17-1A)( 엡캄, 제조원 : 글락소 / 센토코르 ); MORAb-003[ 엽산수용체 a, 제조원 : 모르포

127 테크 (Morphotech)]; KW-2871[ 강글리오사이드 GD3, 제조원 : 교와 (Kyowa)]; MORAb-009 (GP-9, 제조원 : 모르포테크 ); CDX-1307 (MDX-1307) [hcgb, 제조원 : 셀덱스 (Celldex)]; 트라스투주마브 ( 헤르셉틴 ) (HER2, 제조원 : 셀덱스 ); 페르투주마브 (rhumab 2C4) (HER2 (DI), 제조원 : 진테크 ); 아폴리주마브 (HLA-DR 베타쇄, 제조원 : 피디엘파마 ); AMG-479 (IGF-1R, 제조원 : 암젠 ); 항-IGF-1R R1507 [IGF1-R, 제조원 : 로슈 (Roche)]; CP (IGF1- R, 제조원 : 화이자 ); IMC-A12 (IGF1-R, 제조원 : 임클론 ); BIIB022 (IGF-1R, 제조원 : 바이오젠 ); Mik-베타-1 [IL-2Rb (CD122), 제조원 : 호프만라로슈 (Hoffman LaRoche)]; CNTO 328 (IL6, 제조원 : 센토코르 ); 항-KIR (1-7F9)[ 킬러세포 Ig-유사수용체 (KIR), 제조원 : 노보 (Novo)]; Hu3S193( 루이스 (y), 제조원 : 와이어쓰, 루드빅인스티튜트오브캔서리서치 ); hcbe-11 (LTβR, 제조원 : 바이오젠 ); HuHMFG1 (MUC1, 제조원 : 안티소마 / 엔씨아이 ); RAV12[N-연결된탄수화물에피토프, 제조원 : 라벤 (Raven)]; CAL[ 부갑상샘호르몬-관련단백질 (PTH-rP), 제조원 : 유니버시티오브캘리포니아 (University of California)]; CT-011[PD1, 제조원 : 큐어테크 (CureTech)]; MDX-1106(ono-4538) (PD1, 제조원 : 메다렉스 /Ono); MAb CT-011[PD1, 제조원 : 큐어테크 (Curetech)]; IMC-3G3 (PDGFRa, 제조원 : 임클론 ); 바비툭시마브 [ 포스파티딜세린, 제조원 : 페레그린 (Peregrine)]; huj591[psma, 제조원 : 코넬리서치파운데이션 (Cornell Research Foundation)]; muj591 (PSMA, 제조원 : 코넬리서치파운데이션 ); GC1008 (TGFb (pan) 억제제 (IgG4), 제조원 : 젠자임 ); 인플릭시마브 ( 레미카데 ) (TNFa, 제조원 : 센토코르 ); A27.15[ 트랜스페린수용체, 제조원 : 살크인스티튜트 (Salk Institute), INSERM, PCT 공보제WO 2005/111082호 ]; E2.3 ( 트랜스페린수용체, 제조원 : 살크인스티튜트 ); 베바키주마브 ( 아바스틴 ) (VEGF, 제조원 : 진테크 ); HuMV833[VEGF, 쓰쿠바리서치랩 (Tsukuba Research Lab), PCT 공보제WO 2000/034337호, 제조원 : 유니버시티오브텍사스 (University of Texas)]; IMC-18F1 (VEGFR1, 제조원 : 임클론 ); IMC-1121 (VEGFR2, 제조원 : 임클론 ) 을포함한다. [0430] [0431] [0432] [0433] [0434] C. DVD-Ig TM 결합단백질의작제다가의다특이적인이중가변도메인면역글로불린 (DVD-Ig TM ) 결합단백질은, 상이한모단클론항체로부터의 2 개의상이한경쇄가변도메인 (VL) 이재조합 DNA 기술에이은, 경쇄불변도메인에의해직접탄뎀으로또는짧은링커를통해연결되도록설계된다. 유사하게, 중쇄는탄뎀으로연결되고, 이어서불변도메인 CH1 및 Fc 영역에의해연결된 2개의상이한중쇄가변도메인 (VH) 을포함한다. 가변도메인은본원에기술된방법들중어느하나에의해생성된모항체로부터의재조합 DNA 기술을사용하여수득할수있다. 하나의양태에서, 가변도메인은뮤린중쇄또는경쇄가변도메인이다. 다른양태에서, 가변도메인은 CDR-이식되거나사람화된가변중쇄또는경쇄도메인이다. 하나의양태에서, 가변도메인은사람중쇄또는경쇄가변도메인이다. 하나의양태에서, 제1 및제2의가변도메인은재조합 DNA 기술을사용하여서로직접연결된다. 다른양태에서가변도메인은링커서열을통해연결된다. 하나의양태에서, 2개의가변도메인이연결된다. 3개이상의가변도메인이또한적접또는링커서열을통해연결될수있다. 가변도메인은동일한항원에결합하거나상이한항원에결합할수있다. 본발명의 DVD-Ig 분자는하나의면역글로불린가변도메인및하나의비-면역글로불린가변도메인, 예를들면, 수용체의리간드결합도메인, 효소의활성도메인을포함할수있다. DVD-Ig 분자는또한 2개이상의비-Ig 도메인을포함할수있다. 링커서열은펩타이드결합에의해연결된 2개이상의아미노산잔기를포함하는단일의아미노산또는링커폴리펩타이드일수있다. 하나의양태에서, 링커서열은 GGGGSG ( 서열번호 26), GGSGG ( 서열번호 27), GGGGSGGGGS ( 서열번호 28), GGSGGGGSG ( 서열번호 223), GGSGGGGSGS ( 서열번호 29), GGSGGGGSGGGGS ( 서열번호 30), GGGGSGGGGSGGGG ( 서열번호31), GGGGSGGGGSGGGGS ( 서열번호 32), ASTKGP ( 서열번호 33), ASTKGPSVFPLAP ( 서열번호 34), TVAAP ( 서열번호 35), RTVAAP ( 서열번호 224), TVAAPSVFIFPP ( 서열번호 36), RTVAAPSVFIFPP ( 서열번호 225), AKTTPKLEEGEFSEAR ( 서열번호 37), AKTTPKLEEGEFSEARV ( 서열번호 38), AKTTPKLGG ( 서열번호 3번호 4AKTTPKLGG ( 서열번호 40), SAKTTP ( 서열번호 41), RADAAP ( 서열번호 42), RADAAPTVS ( 서열번호 43), RADAAAAGGPGS ( 서열번호 44), RADAAAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ( 서열번호 45), SAKTTPKLEEGEFSEARV ( 서열번호 46), ADAAP ( 서열번호 47), ADAAPTVSIFPP ( 서열번호 48), QPKAAP ( 서열번호 4번호 4PKAAPSVTLFPP ( 서열번호 50), AKTTPP ( 서열번호 51), AKTTPPSVTPLAP ( 서열번호 52), akttap ( 서열번호 53), akttapsvyplap ( 서열번호 54), GENKVEYAPALMALS ( 서열번호 55), GPAKELTPLKEAKVS ( 서열번호 56), 및 GHEAAAVMQVQYPAS ( 서열번호 57) 로이루어진그룹으로부터선택된다. 링커서열의선택은수개의 Fab 분자의결정구조분석을기반으로한다. Fab 또는항체분자구조에서가변도메인과 CH1/CL 불변도메인사이에

128 천연의굴곡성연결이존재한다. 천연의연결은 V 도메인의 C-말단으로부터의 4 내지 6개잔기및 CL/CH1 도메인의 N-말단으로부터의 4 내지 6개의잔기에의해기여된대략 10 내지 12개의아미노산잔기를포함한다. 본원에기술된 DVD-Ig는각각 DVD-Ig의경쇄및중쇄에서링커로서 CL 또는 CH1의 11 내지 12개아미노산잔기, 또는 N-말단 5 내지 6개아미노산잔기를사용하여생성될수있다. CL 또는 CH1 도메인의 N-말단잔기, 특히처음 5 내지 6개아미노산잔기는강력한 2차구조없이루프구조를채택함으로써, 2개의가변도메인들사이의굴곡성링커로서작용할수있다. CL 또는 CH1 도메인의 N-말단잔기는 Ig 서열의부분이므로, 가변도메인의천연연장이며, 따라서링커및연결부로부터잠재적으로발생하는어떠한면역원성도큰정도로최소화한다. [0435] [0436] [0437] [0438] [0439] [0440] [0441] 다른링커서열은 CL/CH1 도메인의어떠한서열 ; 예를들면, CL/CH1 도메인의처음 5 내지 12개아미노산잔기를포함할수있으며 ; 경쇄링커는 Cκ 또는 Cλ로부터기원할수있고 ; 중쇄링커는 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε, 및 Cμ를포함하는어떠한동형의 CH1으로부터기원할수있다. 링커서열은또한 Ig- 유사단백질 ( 예를들면, TCR, FcR, KIR) 과같은다른단백질 ; G/S 계서열 ; 힌지영역-기원한서열 ; 및다른단백질로부터의다른천연서열로부터기원할수있다. 하나의양태에서불변도메인은 2개의연결된가변도메인에재조합 DNA 기술을사용하여연결된다. 하나의양태에서, 탄뎀으로연결된중쇄가변도메인을포함하는서열은중쇄불변도메인에연결되며탄뎀으로연결된경쇄가변도메인을포함하는서열은경쇄불변도메인에연결된다. 하나의양태에서, 불변도메인은각각사람중쇄불변도메인및사람경쇄불변도메인이다, 하나의양태에서, DVD 중쇄는또한 Fc 영역에연결된다. Fc 영역은천연의서열 Fc 영역, 또는변이체 Fc 영역일수있다. 다른양태에서, Fc 영역은사람 Fc 영역이다. 다른양태에서 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD로부터의 Fc 영역을포함한다. 가장바람직한양태에서, 2개의중쇄 DVD 폴리펩타이드및 2개의경쇄 DVD 폴리펩타이드는결합하여 DVD-Ig 분자를형성한다. IL-1β와같은, 특이적인표적항원에결합할수있는특이적인 DVD-Ig 분자의상세한설명, 및이를제조하는방법은하기실시예단락에서제공된다. D. DVD-Ig 결합단백질의생산본발명의 DVD-Ig 결합단백질은예를들면, 숙주세포로부터의발현을포함하는, 당해분야에공지된다수의기술중어느것으로생산될수있으며, 여기서 DVD-Ig 중쇄및 DVD-Ig 경쇄를암호화하는발현벡터 ( 들 ) 은표준기술에의해숙주세포내로형질감염된다. 용어 " 형질감염 " 의각종형태는외인성 DNA를원핵또는진핵숙주세포내로도입시키는데일반적으로사용된광범위한기술, 예를들면, 전기천공, 인산칼슘침전, DEAE-덱스트란형질감염등을포함하는것으로의도된다. 비록본발명의 DVD-Ig 단백질을원핵또는진핵숙주세포내에서발현하는것이가능하다고해도, DVD-Ig 단백질은원핵세포, 예를들면, 포유동물숙주세포내에서발현되는데, 이는, 이러한진핵세포 ( 및특히포유동물세포 ) 가원핵세포보다적절히폴딩되고면역학적으로활성인 DVD-Ig 단백질을조립하여분비하는경향이있기때문이다. 본발명의재조합체항체를발현하는예시적인포유동물숙주세포는차이니즈햄스터난모 (CHO 세포 )( 예를들면, Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: (1982) 에기술된바와같은, DHFR 선택성마커와함께사용된, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: (1980) 에기술된, dhfr - CHO 세포포함 ], NS0 흑색종세포, COS 세포, SP2 및 PER.C6 세포를포함한다. DVD-Ig 단백질을암호화하는재조합체발현벡터가포유동물숙주세포내로도입된경우, DVD-Ig 단백질은숙주세포를숙주세포내에서 DVD-Ig 단백질을발현시키거나 DVD 단백질을숙주세포가성장한배양배지내로분비시키기에충분한기간동안배양함으로써생산된다. DVD-Ig 단백질은표준단백질정제방법을사용하여배양배지로부터회수될수있다. 본발명의 DVD-Ig 단백질의재조합체발현에대한예시적인시스템에서, DVD-Ig 중쇄및 DVD-Ig 경쇄둘다를암 호화하는재조합체발현벡터는인산칼슘-매개된형질감염에의해 dhfr - CHO 세포내로도입된다. 재조합체발현벡터내에서, DVD-Ig 중쇄및경쇄유전자는각각 CMV 인핸서 /AdMLP 프로모터조절성분에작동적으로연결되어유전자의고수준의전사를구동시킨다. 재조합체발현벡터는또한 DHFR 유전자를수반하며, 이는메톡트렉세이트선택 / 증폭을사용하여벡터로형질감염된 CHO 세포의선택을허용한다. 선택된형질전환체숙주세포는배양하여 DVD-Ig 중쇄및경쇄의발현을허용하고완전한 DVD-Ig 단백질을배양배지로부터회수한다. 표준분자생물학기술을사용하여재조합체발현벡터를제조하고, 숙주세포를형질감염시키며, 형질전환체에대해선택하고, 숙주세포를배양하며배양배지로부터 DVD-Ig 단백질을회수한다. 여전히또한본발명은본발명의본발명의숙주세포를적합한배양배지속에서본발명의 DVD-Ig 단백질이합성될때까지배양시킴으로써

129 본발명의 DVD-Ig 단백질을합성하는방법을제공한다. 당해방법은배양배지로부터 DVD-Ig 단백질을분리함 을추가로포함한다. [0442] [0443] [0444] [0445] [0446] [0447] DVD-Ig의중요한특징은통상의항체와유사한방식으로생산되고정제될수있다는것이다. DVD-Ig의생산은바람직한이중-특이적인활성을지닌균질한, 단일의주요생성물을불변영역의어떠한서열변형또는어떠한종류의화학적변형없이생성한다. " 이-특이적 ", " 다-특이적 ", 및 " 다-특이적다가 " 의완전한길이의결합단백질을생성하는다른앞서기술된방법은단일의주요생성물을초래하지않지만대신조립된불활성의, 일-특이적인, 다중-특이적인, 다가의완전한길이의결합단백질, 및상이한결합부위의조합을가진다가의완전한길이의결합단백질의혼합물의세포내또는분비된생산을초래한다. 예를들면, 밀러 (Miller) 및프레스타 (Presta) 에의해기술된설계를기반으로 (PCT 공보제WO 2001/077342호 ), 중쇄및경쇄의 16개의가능한조합이존재한다. 결과적으로, 단백질중단지 6.25% 만이바람직한활성형으로존재하는경향이있으며, 다른 15개의가능한조합과비교하여단일의주요생성물또는단일의일차생성물로존재하는않는다. 통상적으로대규모제조에사용된, 표준크로마토그래피기술을사용한단백질의불활성및부분적으로활성인형태로부터의단백질의완전한활성형은아직입증되지않고있다. 놀랍게도, 본발명의 " 이중-특이적인다가의완전한길이의결합단백질 " 은바람직한 " 이중-특이적인다가의완전한길이의결합단백질 " 에주로조립되는이중가변도메인경쇄및이중가변도메인중쇄를생성한다. 조립되고, 발현된 DVD-Ig 분자의적어도 50%, 적어도 75%, 및적어도 90% 는바람직한이중-특이적인 4가단백질이다. 본발명의당해국면은특히본발명의상업적인유용성을향상시킨다. 따라서, 본발명은 " 이중-특이적인 4가의완전한길이의결합단백질 " 의단일의일차생성물을초래하는단일세포내이중가변도메인경쇄및이중가변도메인중쇄를포함한다. 본발명은 " 이중-특이적인, 4가의, 완전한길이의결합단백질 " 을초래하는단일세포내에서이중가변도메인경쇄및이중가변도메인중쇄를발현시키는방법을제공하며, 여기서 " 일차생성물 " 은이중가변도메인경쇄및이중가변도메인중쇄를포함하는, 모든조립된단백질의 50% 이상이다. 본발명은 " 이중-특이적인, 4가의, 완전한길이의결합단백질 " 의단일의 " 일차생성물 " 을초래하는단일세포내에서이중가변도메인경쇄및이중가변도메인중쇄를발현시키는방법을제공하며, 여기서 " 일차생성물 " 은이중가변도메인경쇄및이중가변도메인중쇄를포함하는, 모든조립된단백질의 75% 이상이다. 본발명은 " 이중-특이적인 4가의완전한길이의결합단백질 " 의단일의 " 일차생성물 " 을초래하는단일세포내에서이중가변도메인경쇄및이중가변도메인중쇄를발현시키는방법을제공하며, 여기서 " 일차생성물 " 은이중가변도메인경쇄및이중가변도메인중쇄를포함하는, 모든조립된단백질의 90% 이상이다. [0448] [0449] [0450] 6. IL-1β 결합단백질및결합단백질-생산세포주의생산바람직하게는, 본발명의항-IL-1β 항체를포함하는, IL-1β 결합단백질은예를들면, 당해분야에공지된수개의시험관내및생체내검사중어느하나에의해평가된것으로서, IL-1β 활성을감소시키거나중화시키는고능력을나타낸다. 바람직하게는, 본발명의 IL-1β 결합단백질은또한 IL-1β 활성을감소시키거나중화시키는고능력을나타낸다. 바람직한양태에서, 결합단백질, 또는이의항원-결합부분은사람 IL-1β에결합하며, 여기서결합단백질, 또는이의항원-결합부분은표면플라스몬공명에의해측정된것으로서, 사람 IL-1β로부터약 0.1s -1 이하의 k off 속도상수를나타내거나, 사람 IL-1β 활성을약 1 x 10-6 M 이하의 IC 50 로억제한다. 대안적으로, 결합단 백질, 또는이의항원 - 결합부분은표면플라스몬공명에의해측정된것으로서, 사람 IL-1β 로부터약 1 x 10-2 s -1 이하의 koff 속도상수를나타내거나, 사람 IL-1β 활성을약 1 x 10-7 M 이하의 IC 50 로억제할수있다. 대 안적으로, 결합단백질, 또는이의항원-결합부분은표면플라스몬공명에의해측정된것으로서, 사람 IL-1β 로부터약 1 x 10-3 s -1 이하의 k off 속도상수를나타내거나, 사람 IL-1β 활성을약 1 x 10-8 M 이하의 IC 50 로억제할수있다. 대안적으로, 결합단백질, 또는이의항원-결합부분은표면플라스몬공명에의해측정된것으로서, 사람 IL-1β로부터약 1 x 10-4 s -1 이하의 k off 속도상수를나타내거나, 사람 IL-1β 활성을약 1 x 10-9 M

130 이하의 IC 50 로억제할수있다. 대안적으로, 결합단백질, 또는이의항원 - 결합부분은표면플라스몬공명에 의해측정된것으로서, 사람 IL-1β 로부터약 1 x 10-5 s -1 이하의 k off 속도상수를나타내거나, 사람 IL IL-1β 활성을약 1 x M 이하의 IC 50 로억제할수있다. 대안적으로, 결합단백질, 또는이의항원 - 결합부분은 표면플라스몬공명에의해측정된것으로서, 사람 IL-1β 로부터약 1 x 10-5 s -1 이하의 k off 속도상수를나타내 거나, 사람 IL-1β 활성을약 1 x M 이하의 IC 50 로억제할수있다. [0451] [0452] [0453] [0454] [0455] [0456] [0457] [0458] 특정양태에서, 결합단백질은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변영역과같은중쇄불변영역을포함한다. 바람직하게는, 중쇄불변영역은 IgG1 중쇄불변영역또는 IgG4 중쇄불변영역이다. 또한, 항체는카파경쇄불변영역또는람다경쇄불변영역으로서, 경쇄불변영역을포함할수있다. 바람직하게는, 항체는카파경쇄불변영역을포함한다. 대안적으로, 항체부위는예를들면, Fab 단편또는일본쇄 Fv 단편일수있다. 항체효과기기능을변경시키기위한 Fc 부위에서아미노산잔기의교체는당해분야에공지되어있다 ( 참조 : Winter et al., 미국특허공보제5,648,260호및제5,624,821호 ). 항체의 Fc 부위는몇가지중요한효과기기능, 예를들면, 사이토킨유도, ADCC, 포식작용, 상보체의존성세포독성 (CDC) 및, 항체및항원-항체복합체의반감기 / 제거속도를매개한다. 일부경우에이들효과기기능은치료용항체에바람직하지만다른경우에치료학적목적에따라, 필수적이지않거나심지어유해할수있다. 특정의사람 IgG 동형, 특히 IgG1 및 IgG3은, FcγR 및상보체 C1q 각각에대한결합을통해 ADCC 및 CDC를매개한다. 신생 Fc 수용체 (FcRn) 는항체의순환하는반감기를측정하는중요성분이다. 여전히다른양태에서, 적어도하나의아미노산잔기가항체의불변영역내에서예를들면, 항체의 Fc 영역으로교체되어, 항체의효과기기능이변경되도록한다. 하나의양태는표지된결합단백질을제공하며, 여기서본발명의항체또는항체부위는다른기능성분자 ( 예를들면, 다른펩타이드또는단백질 ) 로유도체화되거나연결된다. 예를들면, 본발명의표지된결합단백질은본발명의항체또는항체부위를 ( 화학적커플링, 유전적융합, 비공유결합성연합또는기타에의해 ) 다른항체 ( 예를들면, 이특이적인항체또는디아바디 ), 검출가능한제제, 세포독성제, 약제학적제제, 및 / 또는항체또는항체부위와다른분자 ( 예를들면, 스트렙타비딘코어영역또는폴리히스티딘태그의연합을매개할수있는단백질또는펩타이드 ) 에기능적으로연결시켜유도체화할수있다. 본발명의항체또는항체부위와같은, 결합단백질이유도체화될수있는유용한검출가능한제제는형광성화합물을포함한다. 예시적인형광성검출가능한제제는플루오레세인, 플루오레세신이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐클로라이드, 피코에리트린등을포함한다. 항체는또한알칼린포스파타제, 서양고추냉이퍼옥시다제, 글루코즈옥시다제등과같은검출가능한효소로유도체화될수있다. 항체를검출가능한효소로유도체화하는경우, 이는검출가능한반응생성물을생산하는데효소가사용하는추가의제제를가함으로써검출된다. 예를들면, 검출가능한제제인서양고추냉이퍼옥시다제가존재하는경우, 과산화수소및디아미노벤지딘의첨가는착색된반응생성물을생성하며, 이는검출가능하다. 항체는또한바이오틴으로유도체화시킬수있으며, 아비딘또는스트렙타비딘결합의간접적인측정을통해검출된다. 본발명의다른양태는결정화된결합단백질을제공한다. 바람직하게는본발명은본원에기술된바와같은전체항-IL-1β 항체및이의단편의결정, 및이러한결정을포함하는제형및조성물에관한것이다. 하나의양태에서, 결정화된결합단백질은결합단백질의가용성대응물보다생체내반감기가더크다. 다른양태에서, 결합단백질은결정화후생물학적활성을유지한다. 본발명의결정화된결합단백질은본원에참조로인용된, PCT 공보제WO 02/072636호에기재되고당해분야에공지된방법에따라생산될수있다. 본발명의다른양태는, 항체또는이의항원-결합부분이하나이상의탄수화물잔기를포함하는글리코실화된결합단백질을제공한다. 초기의생체내단백질생산은해독후변형으로알려진, 추가의프로세싱을겪을수있다. 특히, 당 ( 글리코실 ) 잔기는글리코실화로공지된공정인, 효소적으로첨가될수있다. 공유결합으로연결된폴리사카라이드측쇄를갖는수득되는단백질은글리코실화된단백질또는당단백질로공지되어있다. 천연적으로존재하는항체는 Fc 도메인, 및또한가변도메인내에하나이상의탄수화물잔기를지닌당단백질이다. Fc 도메인내탄수화물잔기는 Fc 도메인의효과기기능에있어서중요한효과와, 항체의항원결합또는반감기에있어최소의효과를갖는다 [ 참조 : Jefferis, R., Biotechnol. Prog., 21: (2005)]. 대조적으

131 로, 가변도메인의글리코실화는항체의항원결합활성에서효과를가질수있다. 가변도메인에서글리코실화는입체장애로인하여, 항체결합친화성에있어부정적인효과를가질수있거나 [ 참조 : Co et al., Mol. Immunol., 30: (1993), 또는항원에대한증가된친화성을생성할수있다 [ 참조 : Wallick et al., J. Exp. Med., 168: (1988); Wright et al., EMBO J., 10: (1991)]. [0459] [0460] [0461] [0462] [0463] [0464] 본발명의하나의국면은, 결합단백질의 O- 또는 N-연결된글리코실화부위가돌연변이된글리코실화부위돌연변이체를생성하는것에관한것이다. 당해분야의숙련가는표준의잘-공지된기술을사용하여이러한돌연변이체를생성할수있다. 생물학적활성을유지하지만증가되거나감소된결합활성을갖는글리코실화부위돌연변이체는본발명의다른목적이다. 여전히다른양태에서, 본발명의항체또는항원-결합부분의글리코실화는변형된다. 예를들면, 어글리코실화된항체 (aglycoslated antibody) 가제조될수있다 ( 즉, 항체는글리코실화를결여하고있다 ). 글리코실화는예를들면, 항원에대한항체의친화성을증가시키도록변형시킬수있다. 이러한탄수화물변형은예를들면, 항체서열내글리코실화의하나이상의부위를변경시킴으로써달성할수있다. 예를들면, 하나이상의가변영역글리코실화부위를제거하여이러한부위에서글리코실화를제거하는하나이상의아미노산치환을이룰수있다. 이러한어글리코실화는항원에대한항체의친화성을증가시킬수있다. 이러한시도는 PCT 공보제 WO 2003/016466호, 및미국특허공보제5,714,350호및제6,350,861호에추가로상세히기술되어있다. 추가로또는대안으로, 푸코실잔기의양이감소된하이포푸코실화된항체 [ 참조 : Kanda et al., J. Biotechnol., 130(3): (2007)] 또는이등분된 GlcNAc 구조가증가된항체와같은본발명의변형된결합단백질을제조할수있다. 이러한변경된글리코실화양식은항체의 ADCC 능력을증가시키는것으로입증되어왔다. 이러한탄수화물변형은예를들면, 항체를변경된글리코실화기구 (machinery) 를가진숙주세포내에서발현시킴으로써달성할수있다. 변경된글리코실화기구를가진세포는당해분야에기술되어있으며본발명의재조합체항체를발현함으로써변경된글리코실화를갖는항체를생산하는숙주세포로서사용될수있다 [ 참조 : 예를들면, Shields et al., J. Biol. Chem., 277: (2002); Umana et al., "Engineered glycoforms of an antineuroblastoma IgG1 with optimized antibody-dependent cellular cytotoxic activity," Nat. Biotechnol., 17: (1999), 및또한유럽공보제EP 호 ; PCT 공보제WO 03/035835호및제WO 99/54342호 ]. 단백질글리코실화는목적한단백질의아미노산서열, 및또한단백질이발현되는숙주세포에의존한다. 상이한유기체는상이한글리코실화효소 ( 예를들면, 글리코실트랜스퍼라제및글리코시다제 ) 를생산할수있으며이용가능한상이한기질 ( 뉴클레오타이드당 ) 을가진다. 이러한인자로인하여, 단백질글리코실화양식, 및글리코실화잔기의조성은, 특수단백질이발현되는숙주시스템에따라상이할수있다. 본발명에유용한글리코실잔기는글루코즈, 갈락토즈, 만노즈, 푸럭토즈, n-아세틸글루코사민및시알산을포함하나, 이에한정되지않는다. 바람직하게는, 글리코실화된결합단백질은글리코실잔기를포함함으로써글리코실화패턴이사람이되도록한다. 단백질글리코실화의차별화가상이한단백질특성을생성할수있음은당해분야의숙련가에게공지되어있다. 예를들면, 효모와같은미생물숙주내에서생산되고, 효모내인성경로를이용하여글리코실화된치료학적단백질의효능은 CHO 세포주와같은포유동물세포내에서발현된동일한단백질의효능과비교하여감소될수있다. 이러한당단백질은또한사람에서면역원성일수있으며투여후생체내에서감소된반감기를나타낼수있다. 사람및다른동물에서특이적인수용체는특이적인글리코실잔기를인지할수있으며혈류로부터단백질의신속한정화를촉진할수있다. 다른부작용은단백질폴딩, 가용성, 프로테아제에대한민감성, 트래피킹 (trafficking), 수송, 구획화 (compartmentalization), 분비, 다른단백질또는인자에의한인지, 항원성, 또는알레르기항원성에있어서의변화를포함할수있다. 따라서, 전문가는특수조성및글리코실화양식, 예를들면, 글리코실화조성및사람세포, 또는의도된대상체동물의종-특이적인세포에서생산된것과동일하거나적어도유사한양식을지닌치료학적단백질을선호한다. 숙주세포의것과상이한글리코실화된단백질의발현은숙주세포를유전적으로변형시켜이종글리코실화효소를발현시킴으로써달성할수있다. 당해분야에공지된기술을사용하여전문가는사람단백질글리코실화를나타내는항체또는이의항원-결합부분을생성할수있다. 예를들면, 효모균주를유전적으로변형시켜천연적으로발생하지않는글리코실화효소를발현시킴에의해이들효모균주에서생산된글리코실화된단백질 ( 당단백질 ) 이동물세포, 특히사람세포의것과동일한단백질글리코실화를나타내도록한다 ( 참조 : 미국공보제2004/ 호및제2002/ 호 )

132 [0465] [0466] 본발명의결합단백질외에도, 본발명은또한본발명의이러한결합단백질에대해특이적인항-동형 ( 항-Id) 항체에관한것이다. 항-Id 항체는, 다른항체의항원-결합영역과유전적으로연합된유일한결정인자를인지하는항체이다. 항-Id는동물을결합단백질또는이의 CDR 함유영역으로면역화시켜제조할수있다. 면역화된동물은면역화항체의동형결정인자를인지하여반응할것이며항-Id 항체를생산할것이다. DVD-Ig 분자내로혼입된 2개이상의모항체에대한항-동형항체를생산하고 ; 당해분야에잘인지된방법 ( 예를들면, BIAcore, ELISA) 에의해각각의모항체의동형에대해특이적인항-동형항체가또한 DVD-Ig와관련하여동형 ( 예를들면, 항원결합부위 ) 를인지하는지를입증하는것이보다용이해질수있음은용이하게드러난다. DVD-Ig의 2개이상의항원결합부위각각에대해특이적인항-동형항체는환자혈청내사람 DVD-Ig의 DVD-Ig 농도를측정하기위한이상적인시약을제공한다. 예를들면, DVD-Ig 농도검사는고체상 ( 예를들면, BIAcore 칩, ELISA 플레이트등 ) 위에피복되고, 세정완충액으로세정되며, 혈청시료와함께항온처리, 다른세정단계, 및결합반응의정량화를위해효소로자체표지된, 궁극적으로다른항원결합부위에대한다른항-동형항체와항온처리된제1의항원결합영역에대한항체로 " 샌드위치검사 ELISA 양식 " 을사용하여설정할수있다. 하나의양태에서, 2개이상의상이한결합부위를갖는 DVD-Ig의경우, 2개의최외각결합부위 ( 불변영역으로부터가장근접한및가장먼부위 ) 를갖는항-동형항체는사람혈청에서 DVD-Ig 농도를측정하는데도움을줄뿐아니라생체내애서분자의통합성을기록하기도할것이다. 각각의항-Id 항체는또한 " 면역원 " 으로사용되어여전히다른동물에서면역반응을유발하여, 소위항-항-Id 항체를생산할수있다. 또한, 목적한단백질이각종글리코실화효소를발현하도록가공됨으로써라이브러리의구성원숙주세포가변이체글리코실화양식을갖는목적한단백질을생산하도록하는숙주세포의라이브러리를사용하여발현시킬수있음은당해분야의숙련가에게인식될것이다. 숙련가는이후에특수한신규글리코실화양식을갖는목적한단백질을선택하고분리할수있다. 바람직하게는, 특별히선택된신규글리코실화양식을갖는단백질은개선되거나변경된생물학적특성을나타낸다. [0467] [0468] 7. IL-1β 결합단백질의용도사람 IL-1β에결합하기위한이들의능력이주어지면, 본발명의 IL-1β결합단백질, 또는이의항원결합부분을사용하여효소연결된면역흡착검사 (ELISA), 방사선면역검사 (RIA) 또는조직면역조직화학과같은통상의면역검사를사용하여, IL-1β( 예를들면, 혈청또는혈장과같은생물학적시료속에서 ) 를검출할수있다. 본발명은생물학적시료를본발명의결합단백질, 또는항원결합부분과접촉시키고 IL-1β에결합되거나결합되지않은결합단백질 ( 또는항원결합부위 ) 를검출함으로써생물학적시료속에서 IL-1β를검출함을포함하여, 생물학적시료속에서 IL-1β를검출하는방법을제공한다. 결합단백질은검출가능한물질로직접또는간접적으로표지됨으로써결합되거나결합되지않은항체의검출을촉진한다. 적합한검출가능한물질은각종효소, 보조그룹, 형광성물질, 발광성물질및방사활성물질을포함한다. 적합한효소의예는서양고추냉이퍼옥시다제, 알칼린포스파타제, β-갈락토시다제, 또는아세틸콜린에스테라제를포함하며 ; 적합한보조그룹복합체의예는스트렙타비딘 / 바이오틴및아비딘 / 바이오틴을포함하고 ; 적합한형광성물질의예는움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민플루오레세인, 단실클로라 이드또는피코에리트린을포함하며 ; 발광성물질의예는루미놀을포함하고 ; 적합한방사활성물질의예는 3 H, 14 C, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I, 177 Lu, 166 Ho, 또는 153 Sm 을포함한다. [0469] [0470] 결합단백질을표지하는것에대한대안으로, 사람 IL-1β는생물학적유액속에서검출가능한물질및표지되지않은사람 IL-1β 결합단백질로표지된 rh IL-1β 표준물을이용하는경쟁면역검사에의해검사할수있다. 당해검사에서, 생물학적시료, 표지된 rh IL-1β 표준물, 및사람 IL-1β 결합단백질을합하여표지되지않은항체에결합된표지된 rh IL-1β 표준물의양을측정한다. 생물학적시료중의사람 IL-1β의양은 IL- 1β 결합단백질에결합된표지된 IL-1β 표준물의양에역으로비례한다. 유사하게, 사람 IL-1β는또한생물학적유액속에서검출가능한물질로표지된 rh IL-1β 표준물및표지되지않은사람 IL-1β 결합단백질을이용하는경쟁면역검사에서검사할수있다. 본발명의결합단백질및 IL-1β 결합부위는시험관내및생체내둘다에서사람 IL-1β 활성을중화시킬수있다. 따라서, 본발명의이러한결합단백질및이의 IL-1β 결합부위를사용하여, 예를들면, 사람 IL-1β 를함유하는세포배양물, 사람대상체, 또는본발명의항체가교차-반응하는 IL-1β를갖는다른포유동물대상체에서, 사람 IL-1β 활성을억제할수있다. 하나의양태에서, 본발명은사람 IL-1β를본발명의 IL-1β

133 결합단백질또는이의결합부위와접촉시켜사람 IL-1β 활성이억제되도록함을포함하여사람 IL-1β 활성을억제하는방법을제공한다. 예를들면, 사람 IL-1β를함유하거나, 함유하는것으로추측되는세포배양물에서, 본발명의 IL-1β 결합단백질또는이의결합부위를배양배지에가하여배양물에서사람 IL-1β 활성을억제할수있다. [0471] [0472] [0473] [0474] [0475] [0476] [0477] [0478] [0479] [0480] [0481] [0482] [0483] [0484] [0485] [0486] 다른양태에서, 본발명은대상체, 유리하게는, IL-1β 활성이유해한질환또는장애로고생하는대상체로부터사람 IL-1β 활성을감소시키는방법을제공한다. 본발명은이러한질환또는장애로고생하는대상체에서사람 IL-1β 활성을감소시키는방법을제공하며, 당해방법은상기대상체에게본발명의항체또는항체부위를투여함으로써대상체에서 IL-1β 활성이감소되도록함을포함한다. 바람직하게는 IL-1β는사람 IL-1β이고대상체는사람대상체이다. 대안적으로, 대상체는, 본발명의항체가결합할수있는 IL-1β를발현하는포유동물일수있다. 여전히또한, 대상체는, IL-1β가도입된 ( 예를들면, IL-1β의투여또는 IL-1β 삽입유전자의발현에의해 ) 포유동물이다. 본발명의 IL-1β 결합단백질은치료목적으로사람대상체에게투여될수있다. 또한, 본발명의결합단백질은, 항체가수의학적목적을위해또는사람질환의동물모델로서결합할수있는 IL-1β를발현하는비-사람포유동물에투여될수있다. 후자와관련하여, 이러한동물모델은본발명의항체의치료학적효능을평가 ( 예를들면, 용량및투여의기간을시험 ) 하는데유용할수있다. 본원에사용된바와같은, "IL-1β 활성이유해한장애 " 는, 장애로고생하는대상체에서 IL-1β의존재가장애의병태생리학또는장애를악화시키는데기여하는인자에관여하는것으로입증되거나추측되는질환및다른장애를포함하는것으로의도된다. 따라서, IL-1β 활성이유해한장애는, IL-1β활성의감소가장애의증상및 / 또는진행을완화시키는것으로예측되는장애이다. 이러한장애는예를들면, 위에서기술한항-IL-1β 항체를사용하여검출될수있는, 장애로고생하는대상체의생물학적유액에서예를들면, IL-1β의농도에있어서의증가 ( 예를들면, 대상체의혈청, 혈장, 활액등의농도의증가 ) 에의해입증될수있다. 본발명의항체로치료될수있는장애의비-제한적예는본발명의항체의약제학적조성물에대하여하기단락에서논의한장애를포함한다. 본발명의 DVD-Ig는 IL-1β 단독또는다수의항원 ( 예를들면, 사람 IL-1β 및다른비-IL-1β 항원 ) 에결합할수있다. 따라서, DVD-Ig는다른표적항원의활성및 hu IL-1β의활성을차단시키거나감소시킬수있다. 이러한다른표적항원은가용성표적 ( 예를들면, IL-1α) 및세포표면수용체표적 ( 예를들면, VEGFR, EGFR) 을포함할수있다. 이러한다른항원은공공이용가능한데이타베이스에나열된표적을포함하나, 이에한정되지않으며, 이러한데이타베이스는 worldwide web 상에서이용가능하고본원에참조로인용된것들을포함한다. 이들표적데이타베이스는다음을포함한다 : 치료학적표적 ( 사이토킨및사이토킨수용체 ( 및 케모킨 ( Chemokine receptors 및 GPCR ( 후각수용체 ( 수용체 ( 암표적 ( 잠재적인항체표적으로서분비된단백질 ( 단백질키나제 ( 및사람 CD마커 ( 및 (Zola et al., "CD molecules 2005: human cell differentiation molecules," Blood, 106: (2005)]. DVD-Ig는 2개이상의상이한표적, 예를들면, 사람 IL-1β 및하나이상의다른비-IL-1β 표적항원을동시

134 차단함으로써효능 / 안정성을향상시키고 / 시키거나환자차폐율 (patient coverage) 을증가시키는치료제로서유 용한다. 이러한표적은가용성표적 (TNF) 및세포표면수용체표적 (VEGFR 및 EGFR) 을포함할수있다. [0487] 또한, 본발명의 DVD-Ig는세포내전달 ( 내재화수용체및세포내분자의표적화 ), 뇌내부로전달 ( 트랜스페린수용체및, 혈액-뇌장벽을통과하기위한 CNS 질환매개인자를표적화 ) 을포함하는조직-특이적전달 ( 국소 PK 를향상시키기위해조직마커및질환매개인자를표적화하여더높은효능및 / 또는더낮은독성을나타냄 ) 을사용할수있다. DVD-Ig는또한담체단백질로서제공되어이러한항원의비-중화에피토프에대한및또한항원의반감기를증가시키기위한결합을통해특이적위치에항원을전달할수있다. 또한, DVD-Ig는환자내로이식된의학장치에물리적으로연결되거나이들의학장치를표적화하도록설계할수있다 [ 참조 : Burke et al., "Zotarolimus eluting stents," Adv. Drug Deliv. Rev., 58(3): (2006); Hildebrand et al., "Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices," Surface and Coatings Technology, 200(22-23): (2006); Wu et al., "Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis," Biomaterials, 27: (2006); Marques et al., "Mediation of the Cytokine Network in the Implantation of Orthopedic Devices," Chapter 21, In Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, (Reis et al., eds.) (CRC Press LLC, Boca Raton, 2005) pp ]. 요약하면, 적절한유형의세포를의학이식체의부위로향하도록하는것은정상조직기능의치유및회복을촉진할수있다. 대안적으로, 장치에커플링되거나표적화된 DVD-Ig에의한장치이식시방출된매개인자 ( 사이토킨을포함하나이에한정되지않음 ) 의억제가또한제공된다. 예를들면, 스텐트 (stent) 를중재심장학 (interventional cardiology) 에서수년동안사용하여차단된동맥을청소하고심근으로혈류를개선시켜왔다. 그러나, 전통적인드러난금속스텐트는일부환자에서재협착 ( 치료된부위에서동맥의재-협소화 ) 를유발하여혈액응괴를초래할수있는것으로알려져왔다. 최근에, 재협착을감소시키고혈액전체를순환하는내피후대세포 (EPC) 를포획함에의한발생으로부터혈액응괴를방지하는항-CD34 항체피복된스텐트가기술되어왔다. 내피세포는혈관을라이닝 (lining) 하여, 혈액이부드럽게흐르도록하는세포이다. EPC는치유를촉진할뿐아니라스텐트의사용과앞서관련된합병증 [ 참조 : Aoki et al., J. Am. Coll. Cardiol., 45(10): (2005)] 인협착및혈액응괴를방지하는부드러운층을형성하는스텐트의경질표면에부착한다. 스텐트가요구되는환자의대한결과를개선시키는것외에도, 심혈관우회로수술 (cardiovascular bypass surgery) 를필요로하는환자에대한합병증이또한존재한다. 예를들면, 항-EPC 항체로피복된보철혈관도관 ( 인공동맥 ) 은우회로수술이식을위해환자다리또는팔로부터의동맥을사용할필요성을제거할수있다. 이는수술및마취횟수를감소시킬수있으며, 결국관상수술사망을감소시킬것이다. DVD-Ig는, 이것이이식된장치상에피복되어세포공급을촉진시키는세포표면마커 ( 예를들면, CD34) 및또한단백질 ( 또는단백질, 지질및다당류를포함하나이에한정되지않는, 어떠한종류의에피토프 ) 에결합하는방식으로설계된다. 이러한시도는또한일반적으로다른의학적이식체에도적용될수있다. 대안적으로, DVD-Ig는의학장치상에피복되어이식시및장치로부터모든 DVD의방출 ( 또는이미로딩된 DVD-Ig의노화및변성을포함하는, 추가의새로운 DVD-Ig를요구할수있는다른어떠한필요성 ) 시, 장치를새로운 DVD-Ig를환자에게전신계투여하여재로딩 (reloading) 할수있으며, 여기서, DVD-Ig는결합부위의하나의세트를지닌목적한표적 ( 사이토킨, 세포표면마커 ( 예를들면, CD34) 등 ) 및다른것을지닌장치상에피복된표적 ( 지질, 다당류및중합체를포함하나, 이에한정되지않는단백질, 어떠한유형의에피토프포함 ) 에결합하도록설계된다. 이러한기술은피복된이식체의유용성을확장시키는이점을갖는다. [0488] [0489] [0490] [0491] A. 각종질환에서 DVD-Ig의용도본발명의 DVD-Ig 분자는각종질환을치료하기위한치료학적분자로서유용하다. 이러한 DVD 분자는특수질환에관여된하나이상의표적에결합할수있다. 각종질환에서이러한표적의예는하기기술되어있다. 사람자가면역및염증성반응하나의국면에서, 본발명의 DVD-Ig 결합단백질은일반적인자가면역및염증반응에관여하는결합사람 IL-1 β 및하나이상의항원에결합할수있으며, 다음을포함한다 : C5, CCL1 (I-309), CCL11( 에오탁신 ), CCL13 (mcp-4), CCL15 (MIP-1d), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19, CCL2 (mcp-1), CCL20 (MIP- 3a), CCL21 (MIP-2), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2/ 에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26, CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (mcp-3), CCL8 (mcp-2), CXCL1, CXCL10 (IP-10), CXCL11 (I-TAC / IP- 9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL2, CXCL3, CXCL5 (ENA-78 / LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9, IL13,

135 IL8, CCL13 (mcp-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, IL8RA, XCR1 (CCXCR1), IFNA2, IL10, IL13, IL17C, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL22, IL5, IL8, IL9, LTA, LTB, MIF, SCYE1 ( 내피단핵세포-활성화사이토킨 ), SPP1, TNF, TNFSF5, IFNA2, IL10RA, IL10RB, IL13, IL13RA1, IL5RA, IL9, IL9R, ABCF1, BCL6, C3, C4A, CEBPB, CRP, ICEBERG, IL1R1, IL1RN, IL8RB, LTB4R, TOLLIP, FADD, IRAK1, IRAK2, MYD88, NCK2, TNFAIP3, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, CD28, CD3E, CD3G, CD3Z, CD69, CD80, CD86, CNR1, CTLA4, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, FCGR3A, GPR44, HAVCR2, OPRD1, P2RX7, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, BLR1, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCR4, GPR2, SCYE1, SDF2, XCL1, XCL2, XCR1, AMH, AMHR2, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, C19orf10 (IL27w), CER1, CSF1, CSF2, CSF3, DKFZp451J0118, FGF2, GFI1, IFNA1, IFNB1, IFNG, IGF1, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL9, IL9R, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17R, IL18, IL18R1, IL19, IL20, KITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB4R2, LTBR, MIF, NPPB, PDGFB, TBX21, TDGF1, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, TNF, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF11A, TNFRSF21, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF11, VEGF, ZFPM2, 및 RNF110 (ZNF144). [0492] [0493] [0494] [0495] 천식알레르기성천식은호산구증가증, 술잔세포화생, 내피세포변경, 기도과반응성 (AHR), 및 Th2 및 Th1 사이토킨발현, 및또한상승된혈청 IgE 수준의존재에의해특성화된다. 기도염증은 T 세포, B 세포, 호중구, 비만세포및대식세포의, 및사이토킨및케모킨을포함하는이들의분비된매개인자의복잡한상호작용을포함하는, 천식의발병의근원적인주요인자라는것이현재광범위하게수용된다. 코르티코스테로이드는현재천식에대한가장중요한소염치료제이나, 이들의작용메커니즘은비-특이적이고특히청소년환자집단에서안정성문제가존재한다. 따라서보다특이적이고표적화된치료요법을개발하는것을타당하게만든다. 염증및 AHR 둘다를평가할수있는 OVA-유도된천식마우스모델과같은동물모델은당해분야에공지되어있으며천식을치료하기위한다양한 DVD-Ig 분자의능력을측정하는데사용될수있다. 천식을연구하기위한동물모델은문헌 [ 참조 : Coffman et al., J. Exp. Med., 201(12): (2005); Lloyd et al., Adv. Immunol., 77: (2001); Boyce et al., J. Exp. Med., 201(12): (2005); 및 Snibson et al., Clin. Exp. Allergy, 35(2): (2005)] 에기재되어있다. 이들표적쌍의통상적인안정성평가외에도, 면역억제의정도에대한구체적인시험이가장우수한표적쌍을선택하는데보장되고도움이될수있다 [ 참조 : Luster et al., Toxicology, 92(1-3): (1994); Descotes, J., Develop. Biol. Standard., 77: (1992); Hart et al., J. Allergy Clin. Immunol., 108(2): (2001)]. 본발명의하나의국면은 IL-1β 및 IL-4, IL-5, IL-8, IL-9, IL-13, IL-18, IL-5R(α), TNFSF4, IL-4R(α), 인터페론 α, 에오탁신, TSLP, PAR-2, PGD2, 및 IgE로이루어진그룹으로부터선택되는하나이상, 예를들면, 2개의표적에결합할수있는 DVD-Ig 분자에관한것이다. 하나의양태는천식의치료에유리한치료제로서이중-특이적인항-IL-1β/IL-1α DVD-Ig를포함한다. [0496] [0497] 류마티스관절염 (RA) 전신계질환인, 류마티스관절염 (RA) 은관절의윤활막내만성염증반응으로특징화되며, 연골의변성및관절곁골의미란 (erosion) 과관련되어있다. TNF, 케모킨, 및성장인자를포함하는많은전-염증성사이토킨이장애가있는관절에서발현된다. RA가있는마우스모델에대한항-TNF 항체또는 stnfr 융합단백질의전신투여는소염성이고관절보호성임이밝혀졌다. IL-1β를포함한각종사이토킨이 RA에관련되어있다. RA 환자에서 TNF의활성이정맥내투여된인플릭시마브 [ 참조 : Harriman et al., "Summary of clinical trials in rheumatoid arthritis using infliximab, an anti-tnfalpha treatment," Ann. Rheum. Dis., 58 (Suppl 1): I61-I64 (1999)], 키메라항-TNF mab로차단되는임상연구는, TNF가 IL-6, IL-8, MCP-1, 및 VEGF 생산, 면역

136 및염증세포세포의관절내로의보충, 및매트릭스메탈로프로테이나제-1 및 -3의혈액수준의감소를조절한다는증거를제공하여왔다. 류마티스관절염에서염증경로에대한우수한이해는류마티스관절염에관여하는다른치료학적표적의확인을이끌어왔다. 인터루킨-6 길항제 [IL-6 수용체항체 MRA, 추가이 (Chugai) 에의해개발된, 로슈 (Roche)( 참조 : Nishimoto et al., Arthritis Rheum., 50(6): (2004)], CTLA4Ig[ 아바타셉트, 참조 : Genovese et al., "Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alpha inhibition," N. Engl. J. Med., 353: (2005)], 및항-B 세포치료요법 [ 리툭시마브, 참조 : Okamoto et al., "Rituximab for rheumatoid arthritis," N. Engl. J. Med., 351: 1909 (2004)] 과같은촉망되는치료는과거수년에걸쳐무작위처리되고조절된시험들에서이미시험되어왔다. IL-1β 및, IL-15 및 IL-18와같은다른사이토킨은 RA 동물모델 [ 치료용항체 HuMax-IL_15, AMG 714; 참조 : Baslund et al., Arthritis Rheum., 52(9): (2005)] 를사용하여역할을담당하는것으로확인되었다. 항-TNF 및다른매개인자, 예를들면, IL-1β를조합하는이중-특이적인항체치료요법은임상효능및 / 또는환자범위를향상시키는데있어매우강력하다. 예를들면, TNF 및 VEGF 둘다의차단은염증및혈관형성을잠재적으로근절시킬수있으며, 이들둘다는 RA의병리생리학에관여한다. IL-1α 및 IL-1β를차단할수있는 DVD-Ig 결합단백질이고려된다. 이들표적쌍의통상의안정성평가외에, 면역억제의정도에대한구체적인시험이보장될수있고가장우수한표적쌍을선택하는데도움이될수있다 [ 참조 : Luster et al., Toxicology, 92(1-3): (1994); Descotes et al., Develop. Biol. Standard., 77: (1992); Hart et al., J. Allergy Clin. Immunol., 108(2): (2001)]. DVD-Ig 분자가류마티스관절염의치료에유용할것인지는콜라겐 -유도된관절염마우스모델과같은전-임상동물 RA 모델을사용하여평가할수있다. 다른유용한모델은또한당해분야에잘공지되어있다 [ 참조 : Brand, D.D., Comp. Med., 55: (2005)]. 사람및마우스이종상동성에대한모항체의교차-반응성 ( 예를들면, 사람및마우스 TNF, 사람및마우스 IL-15에대한반응성등 ) 을기반으로하여, 마우스 CIA 모델에서확인연구를 " 매치된대체항체 " 기원한 DVD-Ig 분자로수행할수있다. 요약하면, 2개 ( 또는그이상 ) 의마우스표적특이적인항체를기반으로하는 DVD-Ig는사람 DVD-Ig 작제에사용된모사람또는사람화된항체의특성 ( 유사한친화성, 유사한중화효능, 유사한반감기등 ) 의특성에대해가능한정도로매치될수있다. [0498] [0499] 하나의양태에서, 사람 IL-1β 및다른비-IL-1β 표적에결합하는본발명의 DVD-Ig는또한, IL-1β가작용하는다른질환을치료하는데사용될수있다. 이러한질환은 SLE, 다발경화증 (MS), 패혈증, 각종신경학적질환및암 ( 경부, 유방, 위장포함 ) 을포함하나, 이에한정되지않는다. IL-1β가역할을하는질환및장애의더폭넓은목록이또한하기제공된다. 본발명의양태는사람 IL-1β 및, IL-1α, TNFα, IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNFβ, CD45RB, CD200, IFN-γ, GM-CSF, FGF, C5, CD52, 스클레로스틴, 및 CCR2로이루어진그룹으로부터선택되는하나이상의표적에결합할수있는 DVD-Ig 분자에관한것이다. [0500] [0501] [0502] 전신홍반루푸스 (SLE) SLE의면역병원성특징은고글로불린혈증, 자가항체생산및면역복합체형성을초래하는다클론 B 세포활성화이다. 근본적인기형은일반화된 T 세포조절곤란으로인하여 T 세포가금지된 B 세포클론을억제하는데실패하는것으로여겨진다. 또한, B 및 T-세포상호작용은 IL-10과같은수개의사이토킨뿐만아니라제2의시그날을개시하는 CD40 및 CD40L, B7 및 CD28 및 CTLA-4와같은동시-자극분자에의해서도촉진된다. 면역복합체및세포자멸사물질의손상된포식작용청소와함께이들상호작용은수득되는조직손상과함께면역반응을영구화한다. 하나의국면에서, 본발명의 DVD-Ig 결합단백질은사람 IL-1β 및 SLE에관여된다음항원중하나이상에결합할수있다 : B 세포표적화된치료요법 : CD-20, CD-22, CD-19, CD28, CD4, CD80, HLA-DRA, IL10, IL2, IL4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, BLR1, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, ICOSL, IGBP1, MS4A1, RGS1, SLA2, CD81, IFNB1, IL10, TNFRSF5, TNFRSF7, TNFSF5, AICDA, BLNK, GALNAC4S-6ST, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, IL10, IL11, IL4, INHA, INHBA, KLF6, TNFRSF7, CD28, CD38, CD69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, TNFSF7, CD24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CR2, IL1R2, ITGA2, ITGA3, MS4A1, ST6GAL1, CD1C, CHST10, HLA-A, HLA-DRA, 및 NT5E.; 공-자극시그날 : CTLA4 또는 B7.1/B7.2; B 세포생존의억제 : BlyS, BAFF; 상보체불활성화 : C5; 사이토킨조절 : 주요원리는, 어떠한조직에서도총 (net) 생물학적반응이전염증성또는소염사이토킨의국소수준사이의균형의결과라는것이다 [ 참조 : Sfikakis et al., Curr. Opin

137 Rheumatol., 17: (2005)]. SLE는혈청 IL-4, IL-6, IL-10에서문서화된상승을갖는 Th-2 기원한질환인것으로고려된다. IL-4, IL-6, IL-10, IFN-α 및 TNF-α로이루어진그룹으로부터선택되는하나이상의표적에결합할수있는 DVD-Ig가또한고려된다. 본원에논의된표적의조합은다수의루푸스 (lupus) 전임상모델에서시험될수있는 SLE에대한치료학적효능을향상시킬것이다 [ 참조 : Peng S.L., Methods Mol. Med., 102: (2004)]. 사람및마우스이종상동성에대한모항체의교차-반응성 ( 예를들면, 사람및마우스 CD20, 사람및마우스인테페론알파에대한반응성등 ) 을기반으로하여, 마우스루푸스모델에서확인연구를 " 매치된대용항체 " 기원한 DVD-Ig 분자를사용하여수행할수있으며 ; 요약하면, DVD-Ig 계 2개 ( 또는이상 ) 의마우스표적특이적인항체를사람 DVD-Ig 작제에사용된모사람또는사람화된항체의특성 ( 유사한친화성, 유사한중화효능, 유사한반감기등 ) 에대해가능한정도로매치시킬수있다. [0503] [0504] [0505] [0506] [0507] [0508] 다발경화증 (MS) 다발경화증 (MS) 은대부분공지되지않은원인론을가진복잡한사람자가면역-유형질환이다. 신경계를통한미엘린염기성단백질 (MBP) 의면역원성파괴는다발경화증의주요병리학이다. MS는중추신경계내의반응의및, CD4+ 및 CD8+ T 세포에의한침윤에관여하는, 복합체병리학의질환이다. CNS내에서사이토킨, 반응성질소종및고자극인자분자의발현은모두 MS에기술되어왔다. 주요고려대상은자가면역성의발달에기여하는면역학적메커니즘이다. 특히, 항원발현, 사이토킨및백혈구상호작용, 및 Th1 및 Th2 세포와같은다른 T-세포를조화시키고 / 조절하는것을돕는조절성 T-세포는치료학적표적확인을위해중요한영역이다. IL-12는 APC에의해생산되고 Th1 효과기세포의분화를촉진하는전염증성사이토킨이다. IL-12는 MS 환자의진행중인병변에서및또한 EAE-영향받은동물에서생산된다. 앞서, IL-12 경로에서의방해는설치류에서 EAE 를효과적으로방지하며, 항-IL-12 mab를사용한 IL-12p40의생체내중화는일반적인마모셋 (marmoset) 에서미엘린-유도된 EAE 모델에서유리한효과를가짐이밝혀졌다. TWEAK는세포유형에의존하여전-염증성, 증식성또는세포자멸사효과를갖는, 중추신경계 (CNS) 내에서구성적으로발현된 TNF 계열의구성원이다. 이의수용체, Fn14은 CNS내에서내피세포, 반응성별아교세포및뉴우런에의해발현된다. TWEAK 및 Fn14 mrna 발현은실험적인자가면역뇌염 (EAE) 동안척수에서증가되었다. C57BL/6 마우스에서올리고가지세포당단백질 (MOG) 유도된 EAE에서항-TWEAK 항체치료는마우스를프라이밍상 (priming phase) 후에치료하는경우질환중증도및백혈구침윤의감소를생성하였다. 본발명의하나의국면은 IL-1β 및, IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, IFN감마, GM-CSF, FGF, C5, CD52, 오스테오폰틴, 및 CCR2로이루어진그룹으로부터선택되는하나이상, 예를들면, 2개의표적에결합할수있는 DVD-Ig 분자에관한것이다. 하나의양태는 MS의치료에유리한치료제로서이중-특이적인항-IL-1β/TWEAK DVD-Ig를포함한다. MS를치료하기위한 DVD-Ig 분자의유용성을평가하기위한몇가지동물모델은당해분야에공지되어있다 [ 참조 : Steinman et al., Trends Immunol., 26(11): (2005); Lublin et al., Springer Semin Immunopathol., 8(3): (1985); Genain et al., J. Mol. Med., 75(3): (1997); Tuohy et al., J. Exp. Med., 189(7): (1999); Owens et al., Neurol. Clin., 13(1): (1995); and 't Hart et al., J. Immunol., 175(7): (2005)]. 사람및동물종이종상동성에대한모항체의교차-반응성 ( 예를들면, 사람과마우스 IL-1β, 사람및마우스 TWEAK 등에대한반응성 ) 을기반으로하여, 마우스 EAE 모델에서확인연구를 " 매치된대리항체 " 기원한 DVD-Ig 분자를사용하여수행할수있으며 ; 요약하면, 2개 ( 또는그이상 ) 의마우스표적특이적인항체를기반으로한 DVD-Ig는사람 DVD-Ig 작제를위해사용된모사람또는사람화된항체의특성 ( 유사한친화성, 유사한중화효능, 유사한반감기등 ) 에대해가능한정도로매치될수있다. 동일한개념이다른비-설치류종에서동물모델에적용되며, 여기서 " 매치된대리항체 " 기원한 DVD-Ig는예측된약력학및가능한안정성연구를위해선택될수있다. 이들표적쌍의통상의안정성평가외에, 면역억제의정도에대한특이적인시험은가장우수한쌍을선택하는데있어보장되고도움이될수있다 [ 참조 : Luster et al., Toxicology, 92(1-3): (1994); Descotes et al., Develop. Biol. Standard., 77: (1992); Jones, R., "Rovelizumab -ICOS Corp," IDrugs, 3(4): (2000)]. [0509] [0510] 패혈증 패혈증의병태생리학은그람 - 음성유기체 ( 지다당류 [LPS], 지질 A, 엔도톡신 ) 및그람 - 양성유기체 ( 리포테이초익

138 산, 펩티도글리칸 ) 의외막성분에의해개시된다. 이들외막성분은단핵세포의표면에서 CD14 수용체에결합할수있다. 최근기술된톨-유사수용체 (toll-like receptor) 에의해, 시그날은이후세포로전파되어, 전염증성사이토킨종양괴사인자-알파 (TNF-알파) 및인터루킨-1 (IL-1) 의궁극적인생산을초래한다. 압도적인염증및면역반응은패혈증쇼크의필수적인특징이며조직손상의발병, 다발성기관부전, 및패혈증에의해유발된사망에서중심적인역할을한다. 사이토킨, 특히종양괴사인자 (TNF) 및인터루킨 (IL-1) 은패혈성쇼크의중요한매개인자임이밝혀졌다. 이들사이토킨은조직에서직접적인독성효과를가지며 ; 이들은또한포스포리파제 A2를활성화시킨다. 이들및다른효과는혈소판-활성화인자의증가된농도, 산화질소신타제활성의촉진, 호중구에의한조직침윤의촉진, 및호중구활성의촉진을초래한다. [0511] 패혈증및패혈성쇼크의치료는임상적난제로남아있으며, 염증성반응에목표를둔생물학적반응개질인자 ( 예를들면, 항-TNF, 항-MIF) 를사용한최근의예측된시험은단지보통의임상적이점을나타내었다. 최근에, 흥미는면역억제의동반된기간을역전시키는데목표를둔치료요법으로이전되었다. 실험동물및위독한환자에있어서의연구는림프구기관및일부실질조직의증가된세포자멸사가면역억제, 무반응 (anergy), 및기관계기능부전에기여함을입증하여왔다. 패혈증증후군동안, 림프구세포자멸사가 IL-2의부재에의해또는글루코코르티코이드, 그란자임, 또는소위 ' 사멸 ' 사이토킨 : 종양괴사인자알파또는 Fas 리간드의방출에의해개시될수있다. 세포자멸사는 Bcl-2 계열의전- 및항-세포자멸사적구성원에의해영향받을수있는, 세포질성및 / 또는미토콘드리아성카스파제의자가-활성화를통해진행된다. 실험동물에서, 세포자멸사의억제제를사용한치료는림프구세포세포자멸사를방지할수있을뿐아니라 ; 이는또한결과를개선시킬수있다. 항-세포자멸사제를사용한임상시험이대부분이들의투여및조직표적화와관련된기술적난점으로인하여명백하게남아있다고해도, 림프구세포자멸사의억제는패혈증환자에대한매력적인치료학적표적이다. 유사하게, 염증성매개인자및세포자멸사성매개인자둘다를표적화하는이중-특이적인제제는추가된이점을가질수있다. 본발명의하나의국면은 IL-1β 및, TNF, IL-1, MIF, IL-6, IL-8, IL-18, IL-12, IL-23, FasL, LPS, 톨-유사수용체, TLR-4, 조직인자, MIP-2, ADORA2A, CASP1, CASP4, IL-10, IL-1B, NFKB1, PROC, TNFRSF1A, CSF3, CCR3, IL1RN, MIF, NFKB1, PTAFR, TLR2, TLR4, GPR44, HMOX1, HMG-B1, 미드킨, IRAK1, NFKB2, SERPINA1, SERPINE1, 및 TREM1로이루어진그룹으로부터선택되는패혈증에관여하는하나이상의표적에결합할수있는 DVD-Ig에관한것이다. 패혈증에대한이러한 DVD-Ig의효능은당해분야에공지된전임상동물모델에서평가할수있다 [ 참조 : Buras et al., Nat. Rev. Drug Discov., 4(10): (2005); 및 Calandra et al., Nature Med., 6(2): (2000)]. [0512] [0513] 신경학적장애및신경변성질환신경변성질환은, 이들이일반적으로연령-의존성인만성또는급성 ( 예를들면, 뇌졸중, 외상성뇌손상, 척수손상등 ) 이다. 이들은뉴우런기능 ( 뉴우런세포사멸, 탈수초화 ) 의점진적인상실, 운동성의상실및기억상실을특징으로한다. 만성신경변성질환 ( 예를들면, 알츠하이머병, AD) 의근본적인메커니즘의드러나는지식은, 복잡한병인 (etiology) 및다양한인자, 예를들면, 연령, 혈당상태, 아밀로이드생산및다합체화, 이들의수용체 (AGE에대한수용체 ) 에결합하는진전된당화-최종생성물 (AGE) 의축적, 증가된뇌산화성스트레스, 감소된대뇌혈류, 염증성사이토킨및케모킨의방출을포함하는신경염증, 신경기능장애및미세아교세포활성화가이들의발달및진행에기여하는것으로인식되어왔음을나타낸다. 따라서, 이들만성신경변성질환은다수의세포유형과매개인자사이의복잡한상호작용을나타낸다. 이러한질환의치료전략은제한되며비- 특이적인소염제 ( 예를들면, 코르티코스테로이드, COX 억제제 ) 또는뉴우런상실및 / 또는시냅스기능을방지하는제제를주로구성한다. 이러한치료는질환진행을정지시키는데실패한다. 최근연구는, 가용성 Aβ 펩타이드 (Aβ 올리고머형포함 ) 에대한항체와같은보다표적화된치료요법이질병진행을중지하는데도움을줄수있을뿐아니라또한기억을유지하는데도움을줄수있음을제안한다. 이러한예비관측은, 하나이상의질환매개인자 ( 예를들면, Aβ 및전-염증성사이토킨, 예를들면, TNF) 를표적화하는특이적인치료요법이단일질환메커니즘 ( 예를들면, 가용성 Aβ 단독 ) 을표적화하여관찰된것보다만성신경변성질환에대해훨씬더우수한치료학적효능을제공할수있음을제안한다 [ 참조 : Shepherd et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol., 31: (2005); Nelson, R.B., Curr. Pharm. Des., 11: (2005); Klein, W.L., Neurochem. Int., 41: (2002); Janelsins et al., "Early correlation of microglial activation with enhanced tumor necrosis factor-alpha and monocyte chemoattractant protein-i expression specifically within the entorhinal cortex of triple transgenic Alzheimer's disease mice," J. Neuroinflammation, 2(23): 1-12 (2005); Soloman, B., Curr. Alzheimer. Res., 1: (2004); Klyubin

139 et al., Nature Med., 11: (2005); Arancio et al., EMBO J., 23: (2004); Bornemann et al., Am. J. Pathol., 158: (2001); Deane et al., Nature Med., 9: (2003); 및 Masliah et al., Neuron, 46: (2005)]. [0514] 본발명의 DVD-Ig 분자는 IL-1β 및알츠하이머병과같은만성신경변성질환에관여된하나이상의표적에결합할수있다. 이러한표적은 AD 발병기전에관여된, 어떠한매개인자, 가용성또는세포표면, 예를들면, AGE (S100 A, 암포테리신 ), 전-염증성사이토킨 ( 예를들면, IL-1), 케모킨 ( 예를들면, MCP 1), 신경재생을억제하는분자 ( 예를들면, Nogo, RGM A), 신경돌기성장을향상시키는분자 ( 뉴로트로핀 ) 및혈액뇌장벽에서수송을매개할수있는분자 ( 예를들면, 트랜스페린수용체, 인슐린수용체또는 RAGE) 도포함하나, 이에한정되지않는다. DVD-Ig 분자의효능은아밀로이드전구체단백질또는 RAGE를과-발현하고알츠하이머병-유사증후군으로발전하는유전자삽입마우스와같은전-임상동물모델에서입증될수있다. 또한, DVD-Ig 분자는동물모델에서작제되어효능에대해시험될수있으며가장우수한치료학적 DVD-Ig를사람환자에서시험하기위해선택할수있다. DVD-Ig 분자는또한다른신경변성질환, 예를들면, 파킨슨병의치료를위해사용될수있다. 알파-시누클레인은파킨슨병리학에관여한다. IL-1β 및 LINGO-1을표적화할수있는 DVD-Ig, 알파-시누클레인, 및 / 또는 TNF, IL-17, MCP-1과같은염증성매개인자는파킨슨병에대한효과적인치료요법을입증할수있으며본발명에서고려된다. [0515] [0516] [0517] 신경재생및척수손상병리학적메커니즘의지식에있어서증가에도불구하고, 척수손상 (SCI) 은여전히충격적인상태이며높은의학적요구도를특징으로하는의학적징후를나타낸다. 대부분의척수손상은타박상또는압착손상이며, 1차손상은일반적으로초기손상을악화시켜병병부위의유의적인확장, 때때로 10배이상의확장을생성하는 2차손상메커니즘 ( 염증매개인자, 예를들면, 사이토킨및케모킨 ) 을수반한다. SCI에서이들 1차및 2차메커니즘은다른수단예를들면, 뇌졸중에의해유발된뇌손상에서의것들과매우유사하다. 만족된치료는존재하지않으며메틸프레드니솔론 (MP) 의고투여량거환주사 (bolus injection) 가손상후 8시간의협소한시간윈도우 (time window) 내에서유일하게사용된치료요법이다. 그러나, 당해치료는어떠한유의적인기능적회복을유발하지않으면서 2차손상을예방하기위해단지의도된다. 이는분명한효능의결여및후속적인감염및심각한조직병리학적근육변경을갖는면역억제와같은심각한부작용으로매우비난받고있다. 내인성의재생성인가능성을자극하는다른약물, 생물제또는소분자는입증되지않았지만, 촉망되는치료원리및약물후보물은최근몇년동안 SCI의동물모델에서효능이입증되어왔다. 사람 SCI에서기능적회복의큰정도의결여는수초내에서뿐만아니라, 손상-관련세포에서도, 반흔조직내병변부위에서신경돌기성장을억제하는인자에의해유발된다. 이러한인자는수초-관련단백질, NogoA, OMgp 및 MAG, RGM A, 반흔-관련 CSPG( 콘드로이틴설페이트프로테오글리칸 ) 및, 반응성별아교세포상의억제인자 ( 일부세마포린및에프린 ) 이다. 그러나, 병변부위에서성장억제분자뿐아니라뉴로트로핀, 라미닌, L1 및기타의것들과같은신경돌기성장자극인자도밝혀져있다. 신경돌기성장억제및성장촉진분자의이러한조합은, NogoA 또는 RGM A와같은단일인자를차단하는것이설치류 SCI 모델에서유의적인기능적회복을초래하는데, 그이유는억제성영향의감소가성장억제로부터성장촉진까지균형을이동시킬수있기때문이다. 그러나, 단일의신경돌기증식 (outgrowth) 억제분자를차단하여관찰된회복은완전하지않았다. 보다신속하고보다확연한회복을달성하기위해, 2개의신경돌기증식억제분자, 예를들면, Nogo 및 RGM A를차단하거나, 신경돌기증식향상분자, 예를들면, Nogo 및뉴로트로핀의기능을향상시키거나, 신경돌기성장억제분자, 예를들면, Nogo 및전-염증성분자, 예를들면, TNF를차단하는것이바람직할수있다 [ 참조 : McGee et al., Trends Neurosci., 26: (2003); Domeniconi et al., J. Neurol. Sci., 233: (2005); Makwana et al., FEBS J., 272: (2005); Dickson, B.J., Science, 298: (2002); Teng et al., J. Neurosci. Res., 79: (2005); Karnezis et al., Nature Neurosci., 7: 736 (2004); Xu et al., J. Neurochem., 91: (2004)]. 하나의국면에서, 사람 IL-1β에결합하는 DVD-Ig는 NgR 및 RGM A; NogoA 및 RGM A; MAG 및 RGM A; OMgp 및 RGM A; RGM 및 RGM B; CSPGs 및 RGM A; 아그레칸, 미드킨, 뉴로칸, 베르시칸, 포스파칸, Te38 및 TNF-α; 수지및액손발아 (axon sprouting) 를촉진하는항체와조합된 Aβ 글로불로머-특이적인항체가제공된다. 수지병리학은 AD의매우조기의신호이며 NOGO A는가지돌기성장을제한하는것으로공지되어있다. 이러한유형의 ab를어떠한 SCI-후보물 ( 메엘린-단백질 ) Ab와합할수있다. 다른 DVD-Ig 표적은 NgR-p75, NgR-Troy, NgR- Nogo66(Nogo), NgR-Lingo, Lingo-Troy, Lingo-p75, MAG 또는 OMgp의어떠한조합도포함할수있다. 또한, 표

140 적은또한신경돌기의억제에연관된어떠한매개인자, 가용성또는세포표면, 예를들면, Nogo, OMgp, MAG, RGM A, 세마포린, 에프린, 가용성 Aβ, 전-염증성사이토킨 ( 예를들면, IL-1), 케모킨 ( 예를들면, MIP 1a), 신경재생을억제하는분자를포함할수있다. 항-nogo/ 항-RGM 또는유사한 DVD-Ig 분자의효능은척수손상의전-임상동물모델에서입증될수있다. 또한, 이들 DVD-Ig 분자는작제되어동물모델에서효능에대해시험될수있으며, 가장우수한치료학적 DVD-Ig를사람환자에서시험을위해선택할수있다. 또한, 단일의수용체, 예를들면, 3개의리간드 Nogo, OMgp, 및 MAG에결합하는 Nogo 수용체및 Aβ 및, S100 A에결합하는 RAGE 상에서 2개의명백한리간드결합부위를표적하는 DVD-Ig 분자가작제될수있다. 또한, 신경돌기증식억제인자, 예를들면, nogo 및 nogo 수용체는또한다발경화증과같은면역학적질환에서신경재생을예방하는데역할을담당한다. nogo-nogo 수용체상호작용의억제는다발경화증의동물모델에서회복을향상시키는것으로밝혀졌다. 따라서, 하나의면역매개인자의기능을차단할수있는 DVD-Ig 분자, 예를들면, IL-12와같은사이토킨, 및신경돌기증식억제제분자, 예를들면, Nogo 또는 RGM은면역또는신경돌기성장억제제분자단독을차단하는것보다더신속하고보다높은효능을제공할수있다. [0518] 일반적으로, 항체는효율적이고관련된방식으로혈액뇌장벽 (BBB) 을통과하지않는다. 그러나, 특정의신경질환, 예를들면, 뇌졸증, 외상뇌손상, 다발경화증등에서, BBB는뇌내로의 DVD-Ig 및항체의증가된침투를타협하고허용할수있다. BBB 유출이발생하지않는다른신경학적상태에서, 글루코즈및아미노산담체와같은담체-매개된수송인자및수용체-매개된통과세포외배출-매개된세포구조 / 수용체를포함하는내인성수송시스템의표적화를 BBB의혈관내피에서사용함으로써 DVD-Ig의트랜스-BBB 수송을가능하도록할수있다. 이러한수송을가능하도록하는 BBB에서구조물은인슐린수용체, 트랜스페린수용체, LRP 및 RACE를포함하나이에한정되지않는다. 또한, 전략들은강력한약물을저분자량약물, 나노입자및핵산을포함하는 CNS내로수송하기위한셔틀 (shuttle) 로서또한 DVD-Ig의사용이가능하도록한다 [ 참조 : Coloma et al., Pharm. Res., 17(3): (2000); Boado et al., Bioconjug. Chem., 18(2): (2007)]. [0519] [0520] [0521] [0522] 종양학적장애단클론항체치료요법은암에대한중요한치료학적양식으로서출현되었다 [ 참조 : von Mehren et al., Ann. Rev. Med., 54: (2003)]. 항체는세포자멸사, 재지시된세포독성을유도하거나, 리간드-수용체상호작용을방해하거나, 신생물표현형에중요한단백질의발현을방지함에의해항종양효과를발휘할수있다. 또한, 항체는종양미세환경의성분을표적화하여, 종양-관련혈관화의형성과같은필수적인구조물을교란시킬수있다. 항체는또한, 이의리간드가내피성장인자수용체와같은성장인자인수용체를표적화할수있다. 따라서, 항체는표적화된종양세포에대한결합으로부터세포성장을자극하는천연리간드를억제한다. 대안적으로, 항체는항-동형네트워크, 상보체-매개된세포독성, 또는항체-의존성세포세포독성 (ADCC) 을유도할수있다. 2개의별개의종양매개인자를표적화하는이중-특이적인항체의사용은일-특이적인치료요법과비교하여추가의이점을제공할것이다. 다른양태에서, 본발명의사람 IL-1β에결합하는 DVD-Ig는또한다음을포함하나, 이에한정되지않는종양학적질환에관여된다른표적에결합시킬수있다 : IGFR, IGF, VGFR1, PDGFRb, PDGFRa, IGF1,2, ERB3, CDCP, 1BSG2, ErbB3, CD52, CD20, CD19, CD3, CD4, CD8, BMP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, INHA, TNF, TNFSF10, BMP6, EGF, FGF1, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GRP, IGF1, IGF2, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, INHA, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, VEGF, CDK2, FGF10, FGF18, FGF2, FGF4, FGF7, IGF1R, IL2, BCL2, CD164, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, GNRH1, IGFBP6, IL1A, IL1B, ODZ1, PAWR, PLG, TGFB1I1, AR, BRCA1, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, E2F1, EGFR, ENO1, ERBB2, ESR1, ESR2, IGFBP3, IGFBP6, IL2, INSL4, MYC, NOX5, NR6A1, PAP, PCNA, PRKCQ, PRKD1, PRL, TP53, FGF22, FGF23, FGF9, IGFBP3, IL2, INHA, KLK6, TP53, CHGB, GNRH1, IGF1, IGF2, INHA, INSL3, INSL4, PRL, KLK6, SHBG, NR1D1, NR1H3, NR1I3, NR2F6, NR4A3, ESR1, ESR2, NR0B1, NR0B2, NR1D2, NR1H2, NR1H4, NR1I2, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR5A1, NR5A2, NR6A1, PGR, RARB, FGF1, FGF2, FGF6, KLK3, KRT1, APOC1, BRCA1, CHGA, CHGB, CLU, COL1A1, COL6A1, EGF, ERBB2, ERK8, FGF1, FGF10, FGF11, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GNRH1, IGF1, IGF2, IGFBP3, IGFBP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, INHA, INSL3, INSL4, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, MMP2, MMP9, MSMB, NTN4, ODZ1, PAP, PLAU, PRL, PSAP, SERPINA3, SHBG, TGFA, TIMP3, CD44, CDH1, CDH10, CDH19, CDH20, CDH7, CDH9, CDH1, CDH10,

141 CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH7, CDH8, CDH9, ROBO2, CD44, ILK, ITGA1, APC, CD164, COL6A1, MTSS1, PAP, TGFB1I1, AGR2, AIG1, AKAP1, AKAP2, CANT1, CAV1, CDH12, CLDN3, CLN3, CYB5, CYC1, DAB2IP, DES, DNCL1, ELAC2, ENO2, ENO3, FASN, FLJ12584, FLJ25530, GAGEB1, GAGEC1, GGT1, GSTP1, HIP1, HUMCYT2A, IL29, K6HF, KAI1, KRT2A, MIB1, PART1, PATE, PCA3, PIAS2, PIK3CG, PPID, PR1, PSCA, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, STEAP, STEAP2, TPM1, TPM2, TRPC6, ANGPT1, ANGPT2, ANPEP, ECGF1, EREG, FGF1, FGF2, FIGF, FLT1, JAG1, KDR, LAMA5, NRP1, NRP2, PGF, PLXDC1, STAB1, VEGF, VEGFC, ANGPTL3, BAI1, COL4A3, IL8, LAMA5, NRP1, NRP2, STAB1, ANGPTL4, PECAM1, PF4, PROK2, SERPINF1, TNFAIP2, CCL11, CCL2, CXCL1, CXCL10, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, IFNA1, IFNB1, IFNG, IL1B, IL6, MDK, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EPHB4, FGFR3, HGF, IGF1, ITGB3, PDGFA, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBR1, CCL2, CDH5, COL18A1, EDG1, ENG, ITGAV, ITGB3, THBS1, THBS2, BAD, BAG1, BCL2, CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CDH1 (E-카드헤린), CDKN1B (p27kip1), CDKN2A (p16ink4a), COL6A1, CTNNB1 (b-카테닌), CTSB ( 카텝신 B), ERBB2 (Her-2), ESR1, ESR2, F3 (TF), FOSL1 (FRA-1), GATA3, GSN ( 젤솔린 ), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL6R, IL6ST ( 당단백질 130), ITGA6 (a6 인테그린 ), JUN, KLK5, KRT19, MAP2K7 (c-jun), MKI67 (Ki-67), NGFB (NGF), NGFR, NME1 (NM23A), PGR, PLAU (upa), PTEN, SERPINB5 ( 마스핀 ), SERPINE1 (PAI-1), TGFA, THBS1 ( 트롬보스폰딘-1), TIE (Tie-1), TNFRSF6 (Fas), TNFSF6 (FasL), TOP2A ( 토포이소머라제 Iia), TP53, AZGP1 ( 아연-a-당단백질 ), BPAG1 ( 플렉틴 ), CDKN1A (p21wap1/cip1), CLDN7 ( 클라우딘-7), CLU ( 클러스테린 ), ERBB2 (Her-2), FGF1, FLRT1 ( 피브로넥틴 ), GABRP (GABAa), GNAS1, ID2, ITGA6 (a6 인테그린 ), ITGB4 (b 4 인테그린 ), KLF5 (GC Box BP), KRT19 ( 케라틴 19), KRTHB6 ( 모발-특이적인제II형케라틴 ), MACMARCKS, MT3 ( 메탈로티오넥틴-III), MUC1 ( 무친 ), PTGS2 (COX-2), RAC2 (p21rac2), S100A2, SCGB1D2 ( 리포필린 B), SCGB2A1 ( 맘마글로빈 2), SCGB2A2 ( 맘마글로빈 1), SPRR1B (Spr1), THBS1, THBS2, THBS4, 및 TNFAIP2 (B94), RON, c-met, CD64, DLL4, PLGF, CTLA4, 포스파티딜세린, ROBO4, CD80, CD22, CD40, CD23, CD28, CD55, CD38, CD70, CD74, CD30, CD138, CD56, CD33, CD2, CD137, DR4, DR5, RANKL, VEGFR2, PDGFR, VEGFR1, MTSP1, MSP, EPHB2, EPHA1, EPHA2, EpCAM, PGE2, NKG2D, LPA, SIP, APRIL, BCMA, MAPG, FLT3, PDGFR 알파, PDGFR 베타, ROR1, PSMA, PSCA, SCD1, 및 CD59. [0523] [0524] [0525] [0526] D. 약제학적조성물본발명은또한본발명의항체 ( 본원에기술된 DVD-Ig 포함 ), 또는이의항원-결합부분및약제학적으로허용되는담체를포함하는약제학적조성물을제공한다. 본발명의항체를포함하는약제학적조성물은장애를진단하거나, 검출하거나모니터링하거나, 장애또는이의하나이상의증상을예방하거나, 치료하거나, 유지하거나완화시키고 / 시키거나조사하는데사용된다. 구체적인양태에서, 조성물은본발명의하나이상의양태를포함한다. 다른양태에서, 약제학적조성물은, IL-1β 활성이유해한장애를치료하기위한, 본발명의하나이상의항체및본발명의항체이외의하나이상의예방학적또는치료학적제제를포함한다. 하나의양태에서, 예방제또는치료제는장애또는이의하나이상의증상의예방, 치료, 유지, 또는완화에사용되어왔거나현재사용중이거나유용한것으로공지되어있다. 이들양태에따라서, 조성물은담체, 희석제또는부형제를추가로포함할수있다. 본발명의항체및항체부위는대상체에게투여하기에적합한약제학적조성물내로혼입시킬수있다. 전형적으로, 약제학적조성물은본발명의항체또는항체부위및약제학적으로허용되는담체를포함한다. 본원에사용된것으로서, " 약제학적으로허용되는담체 " 는생리학적으로혼화성인특정의및모든용매, 분산매질, 피복제, 항세균제및항진균제, 등장성제제, 흡수지연제등을포함한다. 약제학적으로허용되는담체의예는물, 염수, 인산염완충된염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올등, 및이들의조합중하나이상을포함한다. 많은경우에, 등장성제제, 예를들면, 당, 만니톨, 소르비톨과같은다가알코올, 또는염화나트륨을조성물속에포함하는것이바람직할것이다. 약제학적으로허용되는담체는항체또는항체일부의저장수명또는유효성을향상시키는습윤제또는유화제, 방부제또는완충제와같은보조물질의소량을추가로포함할수있다. 각종전달시스템이공지되어있으며본발명의하나이상의항체또는, 본발명의하나이상의항체와, 장애또는이의하나이상의증상을예방하거나, 유지하거나, 치료하거나완화시키는데유용한예방제또는치료제, 예를들면, 리포좀내캡슐화, 미세입자, 마이크로캡슐, 항체또는항체단편을발현시킬수있는재조합체세포, 수용체-매개된세포내이입 [ 참조 : 예를들면, Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262: (1987)], 레트로바이러스또는다른벡터의일부로서핵산의작제물의조합물을투여하는데사용될수있다. 본발명의예방제또는치료제의투여방법은비경구투여 ( 예를들면, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내및피하 ), 경막외투여,

142 종양내투여, 및점막투여 ( 예를들면, 비강및경구경로 ) 를포함하나, 이에한정되지않는다. 또한, 폐투여는예를들면, 흡입기또는분무기, 및에어로졸화제를사용한제형을사용함으로써수행할수있다 ( 참조 : 예를들면, 이의각각의전문이본원에참조로인용된미국특허공보제6,019,968호 ; 제5,985,320호 ; 제5,985,309호 ; 제5,934,272호 ; 제5,874,064호 ; 제5,855,913호및제5,290,540호 ; 및 PCT 공보제WO 92/19244 호, 제WO 97/32572호, 제WO 97/44013호, 제WO 98/31346호, 및제WO 99/66903호 ). 하나의양태에서, 본발명의항체또는항체부위, 본발명의조합치료요법, 또는조성물은 Alkermes AIR 폐약물전달기술 [ 알케르메스, 인코포레이티드 (Alkermes, Inc.), 매사츄세츠주캠브릿지 ] 을사용하여투여된다. 특이적인양태에서, 본발명의예방제또는치료제는근육내, 정맥내, 종양내, 경구적으로, 비강내, 폐또는피하로투여된다. 예방제또는치료제는어떠한편리한경로, 예를들면, 주입또는거환주입에의해, 상피또는점막피부라이닝 ( 예를들면, 경구점막, 직장, 및장점막등 ) 에의해투여될수있으며다른생물학적활성제와함께투여될수있다. 투여는전신계또는국소일수있다. [0527] [0528] 하나의양태에서, 시험관내에서종양세포로의항체-커플링된탄소나노튜브 (CNT) 의특이적인결합에이은근- 적외선 (NIR) 광을사용한이들의고특이적인제거 (ablation) 를사용하여종양세포를표적화할수있다. 예를들면, 바이오티닐화된극성지질을사용하여안정하고, 생적합성이며, 무세포독성인 CNT 분산액을제조할수있으며이후이를하나이상의종양항원 ( 예를들면, CD22) 에대해 1개또는 2개의상이한신경돌기아비딘-유도체화된 DVD-Ig에부착시킨다 [ 참조 : Chakravarty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105: (2008)]. 구체적인양태에서, 본발명의예방제또는치료제를치료가요구되는부위에국소투여하는것이바람직할수있으며 ; 이는예를들면국소주입에의해, 주사에의해, 또는이식체의수단에의해달성할수있으나이에한 정되지않으며, 상기이식체는시알라스틱막, 중합체, 섬유매트릭스 ( 예를들면, Tissuel ), 또는콜라겐매트릭스와같은막및매트릭스를포함하는다공성또는비-다공성물질이다. 하나의양태에서, 본발명의길항제의하나이상의항체의유효량은대상체에대해영향받은부위에국소투여되어장애또는이의증상을예방하고 / 하거나치료하고 / 하거나유지하고 / 하거나완화시킨다. 다른양태에서, 본발명의하나이상의항체의유효량은본발명의항체이외의하나이상의치료요법제의유효량과함께대상체의영향받은부위에국소투여하여장애또는하나이상의이의증상을예방하고 / 하거나, 치료하고 / 하거나, 유지하고 / 하거나완화시킨다. [0529] [0530] 다른양태에서, 예방제또는치료제는조절된방출또는지연된방출시스템으로전달될수있다. 하나의양태에서, 펌프는조절되거나지연된방출을달성하기위해사용될수있다 [ 참조 : Langer, supra; Sefton, M.V., CRC Crit. Rev. Biomed. Eng., 14: (1987); Buchwald et al., Surgery, 88: (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321: (1989)]. 다른양태에서, 중합체물질을사용하여본발명의치료요법제의조절되거나지연된방출을달성할수있다 [ 참조 : 예를들면, Goodson, J.M., Chapter 6, In Medical Applications of Controlled Release, Vol. II, Applications and Evaluation, (Langer and Wise, eds.) (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1984) pp ; Langer and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. Phys., C23(1): (1983); 또한 Levy et al., Science, 228: (1985); During et al., Ann. Neurol., 25: (1989); Howard et al., J. Neurosurg., 71: (1989) 참조 ; 미국특허공보제 5,679,377호 ; 미국특허공보제5,916,597호 ; 미국특허공보제 5,912,015호 ; 미국특허공보제5,989,463호 ; 미국특허공보제5,128,326호 ; PCT 공보제WO 99/15154호 ; 및 PCT 공보제WO 99/20253호 ]. 지연된방출제형에사용된중합체의예는폴리 (2-하이드록시에틸메타크릴레이트 ), 폴리 ( 메틸메타크릴레이트 ), 폴리 ( 아크릴산 ), 폴리 ( 에틸렌-공-비닐아세테이트 ), 폴리 ( 메타크릴산 ), 폴리글리콜라이드 (PLG), 다무수물 (polyanhydride), 폴리 (N-비닐피롤리돈 ), 폴리 ( 비닐알코올 ), 폴리아크릴아미드, 폴리 ( 에틸렌글리콜 ), 폴리락타이드 (PLA), 폴리 ( 락타이드-공-글리콜라이드 )(PLGA), 및폴리오르토에스테르를포함하나, 이에한정되지않는다. 예시적인양태에서, 서방성제형에사용된중합체는불활성의유출가능한불순물을함유하지않고, 저장시안정하며, 멸균성이고생분해성이다. 여전히다른양태에서, 조절되거나지연된방출 ( 서방성 ) 시스템은예방표적또는치료표적에근접하여위치함으로써, 전신투여량의분획만을필요로할수있다 [ 참조 : 예를들면, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp (1984)]. 조절된방출시스템은문헌 [ 참조 : Langer (Science, 249: (1990)] 에의해고찰시논의된다. 당해분야의숙련가에게공지된어떠한기술도사용하여본발명의하나이상의치료제를포함하는서방성제형을생산할수있다 [ 참조 : 예를들면, 미국특허공보제4,526,938호, PCT 공보제WO 91/05548호, PCT 공보제WO 96/20698호 ; Ning et al., "Intratumoral radioimmunotherapy of a human colon cancer xenograft using a

143 sustained-release gel," Radiotherapy Oncol., 39: (1996); Song et al., "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA J. Pharm. Sci.Technol., 50: (1996); Cleek et al., "Biodegradable Polymeric Carriers for a bfgf Antibody for Cardiovascular Application," Proceed. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 24: (1997); 및 Lam et al., "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proceed. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater., 24: (1997), 이들각각은본원에이들의전문이참조로인용되어있다 ]. [0531] 구체적인양태에서, 본발명의조성물이예방제또는치료제를암호화하는핵산인경우, 핵산은이를적절한핵 산발현벡터의일부로서작제하고이를투여하여예를들면, 레트로바이러스벡터의사용 ( 참조 : 미국특허공 보제 4,980,286 호 ) 에의해, 또는직접적인주사에의해, 또는미세입자충격 [ 예를들면, 유전자총 ; Biolistic 제조원 : 듀퐁 (DuPont)] 의사용에의해, 또는지질또는세포-표면수용체또는형질감염제로피복시킴에의해, 또는이를핵으로도입되는것으로공지된호메오박스-유사펩타이드에연결시켜투여함으로써생체내에서투여되어이의암호화된예방제또는치료제의발현을촉진시킬수있다 [ 참조 : 예를들면, Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: (1991)]. 대안적으로, 핵산을세포내로도입시키고동종재조합에의해발현에대해숙주세포 DNA내에혼입시킬수있다. [0532] [0533] 본발명의약제학적조성물은의도된투여경로와상용성이되도록제형화된다. 투여경로의예는비경구, 예를들면, 정맥내, 피내, 피하, 경구, 비강내 ( 예를들면, 흡입 ), 경피 ( 예를들면, 국소 ), 경점막, 및직장투여를포함하나, 이에한정되지않는다. 구체적인양태에서, 조성물은사람에게정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비강내또는국소투여를위해채택된약제학적조성물로서통상의과정에따라제형화된다. 전형적으로, 정맥내투여를위한조성물은멸균등장성수성완충액속의용액이다. 경우에따라, 조성물은또한리그노캄네와같은국소마취제및가용화제를포함함으로써주사부위에서통증을덜어줄수있다. 본발명의조성물이국소투여되는경우, 조성물은연고제, 크림제, 경피패치, 로션제, 겔제, 샴푸, 분무제 (spray), 에어로졸, 액제, 유제또는당해분야의숙련가에게잘공지된다른형태로제형화될수있다 [ 참조 : 예를들면, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pennsylvania (1995)]. 분무가능하지않은국소용량형의경우, 국소적용과혼화성인담체또는하나이상의부형제를포함하고물보다바람직하게는더큰역학적점도를갖는점성내지반 -고체또는고체형이전형적으로사용된다. 적합한제형은액체, 현탁제, 유제, 크림제, 연고제, 산제, 도찰제 (liniment), 연고 (salve) 등을포함하며, 이들은경우에따라, 예를들면, 삼투압과같은각종특성에영향을미치는보조제 ( 예를들면, 방부제, 안정화제, 습윤제, 완충제또는염 ) 으로안정화되거나이와혼합된다. 다른적합한국소용량형은분무가능한에어로졸제제를포함하며, 여기서활성성분은바람직하게는고체또는액체 불활성담체와함께, 가압된휘발물 ( 예를들면, 가스성추진제, 예를들면, FREON ) 과의혼합물속에또는스퀴 즈병 (squeeze bottle) 속에포장된다. 보습제또는습윤제는또한필요한경우, 약제학적조성물및용량형에 첨가될수있다. 이러한추가의성분의예는당해분야에잘공지되어있다. [0534] [0535] 본발명의방법이조성물의비강내투여를포함하는경우, 당해조성물은에어로졸형, 분무제, 연무제 (mist), 또는점적제의형태로제형화될수있다. 특히, 본발명에따라사용하기위한예방제또는치료제는편리하게는가압된팩또는네불라이저 (nebulizer) 로부터의에어로졸분무표시의형태로, 적합한추진제 ( 예를들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소또는다른적합한가스 ) 를사용하여편리하게전달될수있다. 가압된에어로졸의경우, 용량단위는계량된양을전달하기위한밸브를제공함으로써측정할수있다. 흡입기또는취입기에서사용하기위한캅셀제및카트리지 ( 예를들면, 젤라틴으로구성된 ) 는화합물및, 락토즈또는전분과같은적합한분말혼합물을함유하여제형화될수있다. 본발명의방법이경구투여를포함하는경우, 조성물은정제, 캅셀제, 카쉐제 (cachet), 젤캅제 (gelcap), 액제, 현탁제등의형태로경구투여될수있다. 정제또는캅셀제는통상의수단에의해결합제 ( 예를들면, 예비젤라틴화된옥수수전분, 폴리비닐피롤리돈, 또는하이드록시프로필메틸셀룰로즈 ); 충전제 ( 예를들면, 락토즈, 미세결정성셀룰로즈, 또는인산수소칼슘 ); 윤활제 ( 예를들면, 스테아르산마그네슘, 활석, 또는실리카 ); 붕해제 ( 예를들면, 감자전분또는나트륨전분글리콜레이트 ); 또는습윤제 ( 예를들면, 나트륨라우릴설페이트 ) 와같은약제학적으로허용되는부형제를사용하여제조할수있다. 정제는당해분야에잘공지된방법으로피복시킬수있다. 경구투여용액체제제는액제, 시럽제또는현탁제의형태를취할수있으나, 이에한정되지않거나, 이들은사용전에물또는다른적합한비히클과함께구성시키기위한무수생성물로서제공될수있다. 이러한액체제제는통상의수단에의해현탁화제 ( 예를들면, 소르비톨시럽, 셀룰로즈유도체, 또는수소

144 화된식용지방 ); 유화제 ( 예를들면, 레시틴또는아카시아 ); 비-수성비히클 ( 예를들면, 아몬드오일, 오일성에스테르, 에틸알코올, 또는분획화된야채오일 ); 및방부제 ( 예를들면, 메틸또는프로필-p-하이드록시벤조에이트또는소르브산 ) 과같은약제학적으로허용되는첨가제와함께제조할수있다. 제제는또한경우에따라완충제염, 풍미제, 착색제, 및감미제를함유할수있다. 경구투여용제제는예방제또는치료제 ( 들 ) 의서방출, 조절된방출, 또는지연된방출을위해적합하게제형화될수있다. [0536] [0537] [0538] [0539] [0540] [0541] [0542] 본발명의방법은예를들면, 에어로졸화제와함께제형화된조성물의, 예를들면, 흡입제또는네불라이저를사용함으로써, 폐투여를포함할수있다 ( 참조 : 예를들면, 미국특허공보제6,019,968호 ; 제5,985,320호 ; 제 5,985,309호 ; 제5,934,272호 ; 제5,874,064호 ; 제5,855,913호 ; 및제5,290,540호 ; 및 PCT 공보제WO 92/19244 호, 제WO 97/32572호, 제WO 97/44013호, 제WO 98/31346호, 및제WO 99/66903호, 이들각각은, 이들의전문이본원에참조로인용된다 ). 구체적인양태에서, 본발명의항체, 조합치료요법, 및 / 또는본발명의조성물은 Alkermes AIR 폐약물전달기술 ( 제조원 : 알케르메스인코포레이티드, 매사츄세츠주캠브릿지소재 ) 을사용하여투여된다. 본발명의방법은주사에의한 ( 예를들면, 거환주사또는연속주입에의해 ) 비경구투여용으로제형화된조성물의투여를포함할수있다. 주사용제형은단위용량형 ( 예를들면, 앰플또는다중-투여량용기속에 ) 속에첨가된방부제와함께제공될수있다. 조성물은오일성또는수성비히클 (vehicle) 속에현탁제, 액제또는유제와같은형태를취할수있으며, 현탁화제, 안정화제및 / 또는분산제와같은제형제를함유할수있다. 대안적으로, 활성성분은사용전에적절한비히클 ( 예를들어, 멸균주사용증류수 ) 로작제되기위해분말형일수있다. 본발명의방법은데포트제제 (depot preparation) 로제형화된조성물의투여를추가로포함한다. 이러한장기간작용하는제형은이식 ( 예를들면, 피하또는근육내 ) 에의해또는근육내주사에의해투여될수있다. 따라서, 예를들면, 조성물은적합한중합체성또는소수성물질 ( 예를들면, 허용되는오일중유제로서 ) 또는이온교환수지와함께또는난용성유도체 ( 예를들면, 난용성염으로서 ) 로서제형화될수있다. 본발명의방법은중성또는염형태로제형화된조성물의투여를포함한다. 약제학적으로허용되는염은염화수소산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산등으로부터기원한것들과같은음이온과함께형성된것들, 및나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아민에탄올, 히스티딘, 프로카인등으로부터기원한것들과같은양이온과함께형성된것들을포함한다. 일반적으로, 조성물의성분은단위용량형속에무수동결건조된분말로서또는물을함유하지않는농축물로서, 활성제제의양을나타내는앰플또는사쉐제 (sachet) 와같은밀폐적으로밀봉된용기속에단위용량형속에별도로또는함께혼합되어공급된다. 투여방식이주입인경우, 조성물은멸균약제학적등급수또는염수를함유하는주입병으로분산될수있다. 투여방식이주사에의한경우, 주사용멸균수또는염수의앰플을제공하여성분들이투여전에혼합되도록할수있다. 특히, 본발명은, 본발명의예방제또는치료제, 또는약제학적조성물중하나이상을제제의양을나타내는앰플또는사쉐제와같은밀폐적으로밀봉된용기속에패킹할수있다. 하나의양태에서, 본발명의예방제또는치료제, 또는약제학적조성물중하나이상은밀폐적으로밀봉된용기속에무수멸균되고동결건조된분말또는물을함유하지않는농축물로서공급되며대상체에게투여하기에적절한농도로재구성 ( 예를들면, 물또는염수를사용함 ) 될수있다. 바람직하게는, 본발명의예방제또는치료제또는약제학적조성물중하나이상은밀폐적으로밀봉된용기속에무수멸균동결건조된분말로서적어도 5 mg, 보다바람직하게는적어도 10 mg, 적어도 15 mg, 적어도 25 mg, 적어도 35 mg, 적어도 45 mg, 적어도 50 mg, 적어도 75 mg, 또는적어도 100 mg의단위용량에서제공된다. 본발명의동결건조된예방제또는치료제또는약제학적조성물은 2 와 8 의사이에서이의원래의용기속에저장되어야하며본발명의예방제, 치료제또는약제학적조성물은재구성된후 1주이내, 바람직하게는 5일내, 72시간내, 48시간내, 24시간내, 12시간내, 6시간내, 5시간내, 3 시간내, 또는 1시간내에서투여하여야한다. 대체양태에서, 본발명의예방제, 치료제또는약제학적조성물중하나이상은제제의양및농도를나타내는밀폐적으로밀봉된용기내액체형태로공급된다. 바람직하게는, 투여된조성물의액체형은밀폐적으로밀봉된용기속에적어도 0.25 mg/ml, 보다바람직하게는적어도 0.5 mg/ml, 적어도 1 mg/ml, 적어도 2.5 mg/ml, 적어도 5 mg/ml, 적어도 8 mg/ml, 적어도 10 mg/ml, 적어도 15 mg/kg, 적어도 25 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml 또는적어도 100 mg/ml으로공급된다. 액체형은이의원래의용기속에 2 와 8 사이에서저장되어야한다. 본발명의항체및항체부위는비경구투여에적합한약제학적조성물내로혼입될수있다. 바람직하게는, 항

145 체또는항체부위는 0.1 내지 250 mg/ml의항체를함유하는주사가능한용액으로제조될것이다. 주사가능한용액은플린트 (flint) 또는호박색바이알, 앰플또는예비-충전된주사기의형태로액체또는동결건조된용량형으로구성될수있다. 완충액은 ph 5.0 내지 7.0( 최적으로 ph 6.0) 에서 L-히스티딘 (1 내지 50 mm), 최적으로 5 내지 10mM일수있다. 다른적합한완충액은석신산나트륨, 시트르산나트륨, 인산나트륨또는인산칼륨을포함하나이에한정되지않는다. 염화나트륨은 0 내지 300 mm( 액체용량형의경우최적으로 150 mm) 의농도에서용액의독성을개질시키는데사용될수있다. 동결보호제는동결건조된용량형을위해, 기본적으로 0 내지 10% 수크로즈 ( 최적으로 0.5 내지 1.0%) 를포함할수있다. 다른적합한동결보호제는트레할로즈및락토즈를포함한다. 증량제가동결건조된용량형을위해, 원칙적으로 1 내지 10% 만니톨 ( 최적으로 2 내지 4%) 로포함될수있다. 다른적합한증량제는글리신, 아르기닌을포함하며, 기본적으로 1 내지 50 mm L-메티오닌 ( 임의로 5 내지 10 mm) 로포함될수있다. 다른적합한증량제는글리신, 아르기닌을포함하며, 0 내지 0.05% 폴리소르베이트-80( 최적으로 내지 0.01%) 으로포함될수있다. 추가의표면활성제는폴리소르베이트 20 및 BRIJ 표면활성제를포함하나이에한정되지않는다. 비경구투여용의주사가능한용액으로서제조된본발명의항체또는항체부위를포함하는약제학적조성물은치료학적단백질 ( 예를들면, 항체 ) 의흡수또는분산을증가시키는데사용된것들과같은보조제로서유용한제제를추가로포함할수있다. 특히유용한보조제는하이알루로니다제 ( 예를들면, Hylenex 재조합체사람하이알루로니다제 ) 이다. 주사가능한용액중하이알루로니다제의첨가는비경구투여, 특히피하투여후사람생이용성을개선시킨다. 이는통증및불편없이보다큰주사부위용적 ( 즉, 1 ml 초과 ), 및주사부위반응의최소의발생을허용한다 ( 참조 : PCT 공보제WO 2004/078140호및 US 공보제2006/104968호 ). [0543] [0544] [0545] [0546] 본발명의조성물은다양한형태로존재할수있다. 이들은예를들면, 액체, 반-고체및고체용량형, 예를들면, 액체용액 ( 예를들면, 주사가능하고주입가능한용액 ), 분산제또는현탁제, 정제, 환제, 산제, 리포좀및좌제를포함한다. 바람직한형태는의도된투여방식및치료학적적용에의존한다. 대표적인바람직한조성물은다른항체를사용한사람의수동적면역화에사용된것들과유사한조성물과같은주사가능하거나주입가능한용액의형태이다. 바람직한투여방식은비경구 ( 예를들면, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내 ) 이다. 예시적인양태에서, 항체는정맥내주입또는주사로투여된다. 다른바람직한양태에서, 항체는근육내또는피하주사로투여된다. 치료학적조성물은전형적으로제조및저장조건하에서멸균성이고안정하여야만한다. 조성물은액제, 미세유제, 분산제, 리포좀, 또는고약물농도에적합한다른주문된구조로제형화될수있다. 멸균주사가능한액제는활성화합물 ( 즉, 항체또는항체부위 ) 를, 필요에따라, 위에서나열한성분들중하나또는조합과함께적절한용매속에요구되는양으로혼입시킨후여과된멸균을수행함으로써제조할수있다. 일반적으로, 분산제는활성화합물을, 염기성분산매질및상기나열된것들로부터의필요한다른성분들을함유하는멸균비히클내로혼입시켜제조한다. 멸균성의주사가능한액제의제조를위한멸균성의, 동결건조된분말의경우에, 바람직한제조방법은앞서멸균-여과된이의용액으로부터활성성분의분말과어떠한추가의바람직한성분의분말을생성하는진공건조및분무-건조이다. 용액의적절한유동성은예를들면, 레시틴과같은피복제의사용에의해, 분산제의경우에요구되는입자크기의유지에의해및표면활성제의사용에의해유지될수있다. 주사가능한조성물의연장된흡수는조성물속에서흡수를지연시키는제제, 예를들면, 모노스테아레이트염및젤라틴을포함시킴으로써수행될수있다. 본발명의결합단백질은, 당해분야에공지된각종방법으로투여할수있으며, 많은치료학적적용에도불구하고, 바람직한투여방식 / 유형은피하주사, 정맥내주사또는주입이다. 당해분야의숙련가에의해익숙해질것인바와같이, 투여경로및 / 또는방식은바람직한결과에따라변할것이다. 특정양태에서, 활성화합물은신속한방출, 예를들면, 이식체, 경피패취, 및미세캡슐화된전달시스템을포함하는조절된방출제형에대해화합물을보호할담체를사용하여제조할수있다. 생분해가능하고, 생적합성인중합체, 예를들면, 에틸렌비닐아세테이트, 다무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및폴리락트산이사용될수있다. 이러한제형의많은제조방법들이특허되어있거나일반적으로당해분야의숙련가에게공지되어있다 [ 참조 : 예를들면, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, (J.R. Robinson, ed.) (Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]. 특정양태에서, 본발명의항체또는항체부위는예를들면, 불활성희석제또는동화가능한식용담체와함께경구투여될수있다. 화합물 ( 및필요한경우, 다른성분 ) 은또한경질또는연질쉘젤라틴캅셀속에봉입되거나, 정제로압착되거나대상체식이내로직접혼입될수있다. 경구치료학적투여의경우, 화합물은부형제와함께혼입될수있으며섭취가능한정제, 볼내정제, 트로키제, 캅셀제, 엘릭서르제, 현탁제, 시럽제, 웨이

146 퍼제 (wafer) 등의형태로사용될수있다. 본발명의화합물을비경구투여외의방법으로투여하기위해, 화 합물을이의불활성화를방지하는물질로피복시키거나, 화합물을이러한물질과함께공 - 투여하는것이필수적 일수있다. [0547] [0548] [0549] [0550] [0551] 보충적인활성화합물은또한조성물내로혼입시킬수있다. 특정양태에서, 본발명의항체또는항체부위는, IL-1β 활성이유해한장애를치료하는데유용한하나이상의추가의치료제와함께공제형화되고 / 되거나공투여된다. 예를들면, 본발명의항-사람 IL-1β 항체또는항체부위는다른표적 ( 예를들면, 다른사이토킨과결합하거나세포표면분자와결합하는항체 ) 와함께공제형화되고 / 되거나공투여될수있다. 또한, 본발명의하나이상의항체는앞서의치료제중 2개이상과함께사용될수있다. 이러한조합치료요법은투여된치료제의보다적은용량을유리하게이용할수있으므로, 각종단독치료요법과관련된가능한독성또는합병증을피할수있다. 특정양태에서, IL-1β에대한항체또는이의단편은당해분야에공지된반감기연장비히클에연결된다. 이러한비히클은 Fc 도메인, 폴리에틸렌글리콜및덱스트란을포함하나, 이에한정되지않는다. 이러한비히클은예를들면, 미국출원번호제09/428,082호 ( 현재미국특허공보제6,660,843호 ) 에기술되어있으며이는본원에의해어떠한목적을위해서도참조로인용되어있다. 구체적인양태에서, 본발명의항체또는본발명의다른예방제또는치료제를암호화하는뉴클레오타이드서열을포함하는핵산서열을투여하여유전자치료요법에의한장애또는이의하나이상의증상을치료하거나, 예방하거나, 유지하거나완화시킨다. 유전자치료요법은발현된또는발현가능한핵산을대상체에게투여함으로써수행된치료요법을말한다. 본발명의당해양태에서, 핵산은이들의암호화된항체또는, 예방또는치료효과를매개하는본발명의예방제또는치료제를생산한다. 당해분야에서이용가능한유전자치료요법을위한방법들중어느것도본발명에따라서사용될수있다. 유전자치료요법의방법의일반적인고찰에대해서는, 문헌 [ 참조 : Goldspiel et al., Clinical Pharm., 12: (1993); Wu et al., "Delivery systems for gene therapy," Biotherapy, 3: (1991); Tolstoshev, P., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32: (1993); Mulligan, R.C., Science, 260: (1993); 및 Morgan and Anderson, "Human Gene Therapy," Ann. Rev. Biochem., 62: (1993); Robinson, C., Trends Biotechnol., 11:155 (1993)] 을참조한다. 사용될수있는재조합체 DNA 기술의분야에일반적으로공지된방법은문헌 [ 참조 : Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, New York (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, New York (1990)] 에기술되어있다. 유전자치료요법의각종방법의상세한설명은본원에참조로인용된미국공보제2005/ A1호에기재되어있다. IL-1 계열구성원 (IL-1β 및 IL-1α) 는면역및염증성분들을포함하는각종장애와관련된병리학에서중요한역할을담당한다. 본원에기술된 IL-1 결합단백질은이러한장애를치료하기위해개인에게투여될수있다. 하나의양태에서, 대상체에게본원에기술된 IL-1 결합단백질을투여함을포함하는본발명의방법에의해치료될수있는장애는당뇨병 ; 포도막염 ; 신경병증성통증 ; 골관절염성통증 ; 염증성통증 ; 류마티스관절염 ; 골관절염 ; 소아만성관절염 ; 패혈성관절염 ; 라임관절염 (Lyme arthritis); 건선관절염 ; 반응성관절염 ; 척추관절병 ; 전신홍반루푸스 (SLE); 크론병 ; 궤양성대장염 ; 염증성장질환 ; 자가면역당뇨병 ; 인슐린의존성진성당뇨병 ; 갑상샘염 ; 천식 ; 알레르기질환 ; 건선 ; 피부염 ; 피부경화증 ; 이식대숙주질환 ; 장기이식거부 ; 장기이식과관련된급성면역질환 ; 장기이식과관련된만성면역질환, 사르코이드증 ; 죽상경화증 ; 파종성혈관내응고 (DIC);; 가와사키병 ; 그레이브병 ; 콩팥증후군 ; 만성피로증후군 ; 베게너육아종증 ; 헤노흐-쉔라인자반증 ; 신장의미세혈관염 ;; 만성활성간염 ;; 자가면역포도막염 ; 패혈쇼크 ; 독성쇼크증후군 ; 패혈증증후군 ; 악액질 ; 전염병 ; 기생충질환 ; 급성횡단성척수염 ; 헌팅턴무도병 ; 파킨슨병 ; 알츠하이머병 ; 뇌졸중 ; 원발성담즙성간경변 ; 용혈성빈혈 ; 악성종양 ; 심부전 ; 심근경색 ; 애디슨병 ; 산발성다분비선결핍유형 I; 다분비선결핍유형 II ( 슈미트증후군 ); 급성호흡곤란증후군 (ARDS); 탈모증 ; 원형탈모증 ; 혈청반응음성인관절병증 ; 관절병증 ; 라이터질환 ; 건선관절병증 ; 궤양성대장염관절병증 ; 장병원성윤활막염 ; 클라미디아 ; 예르시니아및살모넬라관련관절병증 ; 척추관절병증 ; 아테롬성질환 / 동맥경화 ; 아토피성알레르기 ; 자가면역수포성질환 ; 보통천포창 ; 낙엽상천포창 ; 유사천포창 ; 선형 IgA 질환 ; 자가면역성용혈성빈혈 ; 쿰즈양성용혈성빈혈 ; 후천성악성빈혈 ; 소아악성빈혈 ; 근육통성뇌염 / 로얄프리질환 (Royal Free disease); 만성피부점막칸디다증 ; 거대세포동맥염 (GCA); 원발성경화간염 ; 잠복성자가면역간염 ; 후천성면역결핍증 (AIDS); 후천성면역결핍관련질환 ; B형간염 ; C형간염 ; 일반적인다양한면역결핍증 ( 보통의가변성저감마글로불린혈증 ); 확장성심근병증 ; 여성불임증 ; 난소기능상실 ; 조기폐경 ; 섬유성폐질환 ; 잠복성섬유

147 화폐포염 ; 사후염증성간질성폐질환 ; 간질성폐렴 ; 간질성폐질환과관련된결합조직질환 ; 혼합된결합조직질환관련폐질환 ; 전신경화증관련된간질성폐질환 ; 류마티스관절염관련간질성폐질환 ; 전신홍반루푸스관련폐질환 ; 피부근육염 / 다발근육염관련폐질환 ; 쇼그렌질환관련폐질환 ; 강직성척추염관련폐질환 ; 혈관염성확산폐질환 ; 헤모시덴린증관련폐질환 ; 약물유발간질성폐질환 ; 섬유증 ; 방사선섬유증 ; 폐쇄세기관지염 ; 만성호산구성폐렴 ; 림프구침윤성폐질환 ; 감염후간질성폐질환 ; 통풍성관절염 ; 자가면역간염 ; 제1형자가면역간염 ( 전형적자가면역또는루포이드간염 ); 제2형자가면역간염 ( 항-LKM 항체간염 ); 자가면역매개된저혈당증 ; 흑색극세포증을동반한타입 B의인슐린내성 ; 부갑상샘저하증 ; 골관절염 ; 원발성경화담관염 ; 건선 1형 ; 건선 2형 ; 특발성백혈구감소증 ; 자가면역중성구감소증 ; 신장질환 NOS; 사구체신장염 ; 신장의미세혈관염 ; 라임질환 ; 원반모양홍반루푸스 ; 특발성남성불임 ; 질소산화물-관련남성불임 ; 정자자가면역 ; 다발성경화증 (1차진행성, 2차진행성, 재발완화성을포함한모든하위유형 ); 교감안염 ; 결합조직질환에부수적인폐고혈압 ; 굿패스춰증후군 ; 결절성다발의폐발현 ; 급성류마티스열 ; 류마티스척추염 ; 스틸병 ; 전신경화증 ; 쇼그렌증후군 ; 타카야스병 / 동맥염 ; 자가면역저혈소판증 (AITP); 특발성저혈소판증 ; 자가면역갑상선질환 ; 갑상선기능항진증 ; 갑상선종의자가면역갑상선기능저하증 ( 하시모토병 ); 위축성자가면역갑상선기능저하증 ; 원발성점액수종 ; 수정체성포도막염 ; 원발성혈관염 ; 백반증 ; 급성간질환 ; 만성간질환 ; 알코올성간경변 ; 알코올유발간손상 ; 쓸개즙정체 ; 특이한간질환 ; 약물유발간염 ; 비알콜성지방간염 ; 알레르기 ; 그룹 B 스트렙토코커스 (GBS) 감염 ; 정신장애 ( 예를들어, 우울증및정신분열증 ); Th2 유형및 Th1 유형매개질환 ; 급성및만성통증 ( 통증의상이한형태들 ); 암 ( 예를들어, 폐, 유방, 위, 방광, 결장, 췌장, 난소, 전립선, 및직장암 ); 조혈성악성종양 ; 백혈병 ; 림프종 ; 무베타지방단백혈증 ; 말단청색증 ; 급성및만성기생성또는감염성과정 ; 급성백혈병 ; 급성림프모구백혈병 (ALL); T-세포 ALL; FAB ALL; 급성골수성백혈병 (AML); 급성또는만성세균감염 ; 급성췌장염 ; 급성신부전 ; 아데노암종 ; 심방이소성박동 ; AIDS 치매병변군 ; 알코올유도간염 ; 알레르기성결막염 ; 알레르기성접촉피부염 ; 알레르기성비염 ; 동종이식거부 ; 알파-l-안티트립신결핍증 ; 근육위축가쪽경화증 ; 빈혈 ; 협심증 ; 전각세포변성 ; 항-CD3 치료요법 ; 항인지질증후군 ; 항-수용체과민성반응 ; 대동맥및말초동맥류 ; 대동맥박리 ; 동맥고혈압 ; 동맥경화 ; 동정맥루 ; 운동실조증 ; 심방세동 ( 지속성또는발작성 ); 심방조동 ; 심방심실블록 ; B 세포림프종 ; 뼈이식거부 ; 골수이식 (BMT) 거부 ; 번들브랜치블록 ; 버킷림프종 ; 화상 ; 심장성부정맥 ; 심장마비증후군 ; 심장종양 ; 심근병증 ; 심폐바이패스염증반응 ; 연골이식거부 ; 소뇌피질변성 ; 소뇌장애 ; 혼란성또는다초점성심방빈맥 ; 화학치료요법관련장애 ; 만성골수구성백혈병 (CML); 만성알코올중독 ; 만성염증성병리 ; 만성림프성백혈병 (CLL); 만성폐쇄성폐질환 (COPD); 만성살리실산의중독 ; 결장직장암종 ; 울혈성심부전 ; 결막염 ; 접촉성피부염 ; 폐심장증 ; 관상동맥질환 ; 크로이츠펠트-야콥병 ; 배양물음성패혈증 ; 낭성섬유증 ; 사이토킨치료요법관련장애 ; 권투선수치매 ; 탈수초병 ; 뎅기열출혈성발열 ; 피부염 ; 피부과병태 ; 진성당뇨병 ; 당뇨병성동맥경화질환 ; 광범위레비소체병 ; 확대울혈성심근병증 ; 기저신경절의장애 ; 중년의다운증후군 ; CNS 도파민수용체를차단하는약물에의해유도된약물-유발운동장애 ; 약물민감도 ; 습진 ; 뇌척수염 ; 심내막염 ; 내분비병증 ; 후두개염 ; 엡슈타인-바바이러스감염 ; 지단홍통증 ; 추체외로및소뇌장애 ; 가족성적혈구포식성림프조직구증 ; 태아가슴샘임플란트제거 ; 프리드리히운동실조증 ; 기능성말초동맥장애 ; 진균성패혈증 ; 가스괴저, 위궤양 ; 사구체신염 ; 모든장기또는조직의이식거부 ; 그람음성패혈증 ; 그람양성패혈증 ; 세포내유기체로인한육아종 ; 모발세포백혈병 ; 할레르보르덴-스파츠병 ; 하시모토의갑상샘염 ; 건초열 ; 심장이식거부 ; 혈색소침착증 ; 혈액투석 ; 용혈성요독성증후군 / 혈전용해성혈소판감소성자반증 ; 뇌출혈 ; A형간염 ; His 번들부정맥 ; HIV 감염 /HIV 신경병증 ; 호지킨병 ; 운동과다장애 ; 과민성반응 ; 과민성폐렴 ; 고혈압 ; 운동과다장애 ; 시상하부-뇌하수체-부신축평가 ; 특발성애디슨병 ; 특발성폐의섬유증 (IPF); 항체매개된세포독성 ; 무력증 ; 유아척추근육위축 ; 대동맥의염증 ; 인플루엔자 a; 이온화방사선노출 ; 홍채섬모체염 / 포도막염 / 시각신경염 ; 허혈-재관류손상 ; 허혈성뇌졸중 ; 소아류마티스관절염 ; 소아척추근육위축 ; 카포시육종 ; 신장이식거부 ; 레지오넬라 ; 리슈만편모충증 ; 나병 ; 피질척수계의병변 ; 지방부종 ; 간이식거부 ; 림프부종 ; 말라리아 ; 악성림프종 ; 악성조직구증 ; 악성흑색종 ; 수막염 ; 수막구균혈증 ; 대사증후군편두통두통 ; 특발성편두통두통 ; 미토콘드리아성멀티시스템장애 ; 혼합된결합조직질환 ; 단클론성감마글로불린병증 ; 다중골수종 ; 다중시스템변성, 중증근육무력증 ; 마이코박테리움아비움인트라셀룰라에 ; 마이코박테리움결핵 ; 골수형성이상증후군 ; 심근경색 ; 심근허혈성장애 ; 코인두암종 ; 신생아만성폐질환 ; 신염 ; 콩팥증 ; 신경변성질환 ; 신경성 I 근육위축 ; 호중구감소증발열 ; 비-호지킨림프종 ; 복부대동맥및이의분지의폐색 ; 폐색성동맥장애 ; OKT3 치료요법 ; 고환염 / 부고환염 ; 고환염 / 정관절제술반전시술 ; 병원처방 ; 골다공증 ; 췌장이식거부 ; 췌장암종 ; 악성종양의신생물딸림증후군 / 고칼슘혈증 ; 부갑상샘이식거부 ; 골반염증성질환 ; 다년생비염 ; 심낭질환 ; 말초죽상경화성질환 ; 말초혈관장애 ; 복막염 ; 악성빈혈 ;

148 주폐포자충폐렴 ; 폐렴, POEMS 증후군 ( 다발신경병, 오가노메갈리, 내분비병증, 단클론감마글로불린증, 및피부변화증후군 ), 후재관류증후군 ; 후펌프증후군 ; 후-MI 심장절개증후군 ; 자간전증 ; 진행성핵상마비 ; 원발성폐고혈압 ; 방사선치료요법 ; 레이노드현상 ; 레이노드질환 ; 레프섬 (Refsum) 질환 ; 일반적인협소한 QRS 빈맥 ; 신장혈관고혈압 ; 재관류손상 ; 제한심근병증 ; 육종 ; 노인무도병 ; 레비소체의노인치매 ; 혈청반응음성관절병증 ; 쇼크 (shock); 낫세포빈혈 ; 피부동종이식거부 ; 피부변화증후군 ; 작은창자이식거부 ; 고형종양 ; 특정부정맥 ; 척추운동장애 ; 척수소뇌변성 ; 연쇄구군근육염 ; 소뇌의구조병변 ; 아급성경화성번뇌염 ; 실신 ; 심혈관계매독 ; 전신아나필락시스 ; 전신염증성반응증후군 ; 전신발병소아류마티스관절염 ; 모세혈관확장증 ; 폐쇄혈전혈관염 ; 혈소판감소 ; 독성 ; 이식 ; 외상 / 출혈 ; 유형 III 과민성반응 ; 유형 IV 과민증 ; 불안정협심증 ; 요독증 ; 요로성패혈증 ; 두드러기 ; 판막심장질환 ; 정맥류 ; 혈관염 ; 정맥질환 ; 정맥혈전증 ; 심실세동 ; 바이러스및진균감염 ; 바이러스성뇌염 / 무균수막염 ; 바이러스-관련식혈세포성증후군 ; 베르닉케- 코르사코프증후군 ; 윌슨병 ; 모든장기또는조직의이종이식거부 ; 급성관상동맥증후군 ; 급성특발성의다발신경염 ; 급성염증탈수초다발성신경병증 ; 급성허혈 ; 성인스틸병 ; 원형탈모증 ; 아나필락시스 ; 항인지질항체증후군 ; 재생불량성빈혈 ; 동맥경화 ; 아토피성습진 ; 아토피성피부염 ; 자가면역피부염 ; 스트렙토코커스감염과관련된자가면역장애 ; 자가면역창자병증 ; 자가면역청력손실 ; 자가면역림프구증식증후군 (ALPS); 자가면역심근염 ; 자가면역조기폐경 ; 눈꺼풀염 ; 기관지확장증 ; 수포성유사천포창 ; 심혈관질환 ; 파국적항인지질증후군 ; 복강질환 ; 자궁경부척추증 ; 만성허혈 ; 반흔성유사천포창 ; 다발성경화증에대한위험을갖는임상적으로분리된증후군 (CIS); 결막염 ; 어린시절발병정신장애 ; 누낭염 ; 피부근육염 ; 당뇨병성망막증 ; 디스크이탈증 ; 디스크탈출증 ; 약물유발면역용혈성빈혈 ; 심내막염 ; 자궁내막증 ; 안구내염 ; 상공막염 ; 다형홍반 ; 주요다형홍반 ; 임신성유사천포창 ; 귈라인-바레증후군 (GBS); 건초열 ; 휴즈증후군 ; 특발성파킨슨병 ; 특발성간질성폐렴 ; IgE로인한알레르기 ; 면역용혈성빈혈 ; 봉입체근염 ; 감염성눈염증성질환 ; 염증성탈수초질환 ; 염증성심장질환 ; 염증성신장질환 ; 홍채염 ; 각막염 ; 건조각막결막염 ; 쿠쓰마울질환또는쿠쓰마울-마이어질환 ; 랜드리마비 ; 랑게르한스세포조직구증 ; 그물울혈반 ; 황반변성 ; 현미경적다발성혈관염 ; 모부스베흐테레프 ; 운동신경세포장애 ; 점막유사천포창 ; 다발성장기부전 ; 중증근육무력증 ; 골수혈성이상증후군 ; 심근염 ; 신경근장애 ; 신경병증 ; 비-A 비-B 형간염 ; 시각신경염 ; 골용해 ; 소수관절 JRA; 말초동맥폐색성질환 (PAOD); 말초혈관장애 (PVD); 말초동맥 ; 질환 (PAD); 정맥염 ; 결절다발동맥염 ( 또는결절동맥주위염 ); 다발연골열 ; 류마티스성다발성근육통 ; 백모증 ; 다관절 JRA; 다내분비선결핍증후근 ; 다발근육염 ; 류마티스성다발성근육통 (PMR); 후-펌프증후군 ; 원발성파킨슨증 ; 2차파킨슨증 ; 전립샘염 ; 순수적혈구세포무형성 ; 원발성부신기능부전 ; 재발성시각신경척수염 ; 재협착 ; 류마티스심장질환 ; SAPHO ( 윤활막염 ; 여드름 ; 농포증 ; 뼈과다증및골염 ); 2차아밀로이드증 ; 쇼크폐 ; 골막염 ; 좌골신경통 ; 2차부신기능부전 ; 실리콘관련된결합조직질환 ; 스네돈-윌킨슨피부병 ; 강직척추염, 스티븐스-존슨증후군 (SJS); 전신염증성반응증후군 ; 측두동맥염 ; 톡소플라스믹망막염 ; 독성표피괴사용해 ; 횡척수염 ; TRAPS ( 종양괴사인자수용체타입 1 (TNFR) 관련정기증후군 ); 흑색가시세포증을동반한타입 B의인슐린저항성 ; 제1형알레르기반응 ; 제 II형당뇨병 ; 두드러기 ; 보통간질성폐렴 (UIP); 봄철결막염 ; 바이러스성망막염 ; 보그트-코야나기-하라다증후군 (VKH 증후군 ); 습윤황반변성 ; 상처치유 ; 예르시니아및살모넬라관련관절병증을포함하나, 이에한정되지않는다. [0552] [0553] [0554] [0555] 본발명의결합단백질은자가면역질환, 특히염증, 류마티스관절염 (RA), 골관절염, 건선, 다발경화증 (MS), 및다른자가면역질환으로고생하는사람을치료하는데사용될수있다. 본발명의항체또는항체부위는또한자가면역질환및염증질환의치료에유용한하나이상의추가의치료제와함께투여될수있다. 하나의양태에서, 본발명의조성물및방법으로치료되거나진단될수있는질환은유방, 결장, 직장, 폐, 인두중앙부, 하인두, 식도, 위, 췌장, 간, 방광및담즙관, 소장, 뇨관 ( 신장, 방광및요로상피포함 ), 여성생식관 ( 경부, 자궁및난소, 및또한융모막암종및임신영양막병포함 ), 남성생식관 ( 전립샘, 정낭, 고환, 및정자세포종양 ), 내분비샘 ( 갑상샘, 부신, 및뇌하수체포함 ), 및피부의암종, 및또한혈관종, 흑색종, 육종 ( 골및연조직으로부터발생한것들및또한카포시육종 (Kaposi's sarcoma) 포함 ), 뇌, 신경, 눈및수막의종양 ( 별아교세포종, 신경아교종, 아교모세포종, 망막모세포종, 신경종, 신경모세포종, 슈반세포종, 및수막종포함 ), 백혈병, 및림프종 ( 호지킨및비-호지킨림프종둘다 ) 과같은조혈성악성종양으로부터기원한고형종양을포함하나, 이에한정되지않는다. 다른양태에서, 본발명의항체또는이의항원결합부분은종양으로부터의전이를예방하거나암을치료하는데사용된다. 이러한치료는항체또는이의항원결합부분을단독으로또는다른치료제또는방사선치료요

149 법및 / 또는화학요법제와같은치료와함께투여함을포함할수있다. [0556] [0557] [0558] [0559] [0560] [0561] 본발명의항체, 또는이의항원결합부분은항신생물제, 방사선치료요법, 화학치료요법, 예를들면, DNA 알킬화제, 시스플라틴, 카르보플라틴, 항-투불린제, 파클리탁셀, 도세탁셀, 탁솔, 독소루비신, 겜시타빈, 겜자르, 안트라사이클린, 아드리아마이신, 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제, 5-플루오로우라실 ((5- FU), 류코보린, 이리노테칸, 수용체타이로신키나제억제제 ( 예를들면, 에를로티니브, 게피니티브 ), COX-2 억제제 ( 예를들면, 셀레콕시브 ), 키나제억제제, 및 sirna를포함하나이에한정되지않는제제와조합될수있다. 본발명의결합단백질은또한각종질환의치료시유용한하나이상의추가의치료제와함께투여될수있다. 본발명의항체, 또는이의항원결합부분은이러한질환을치료하기위해단독으로또는함께사용될수있다. 본발명의항체또는이의항원결합부분은단독으로또는추가의제제, 예를들면, 치료제와함께사용될수있으며, 상기추가의제제는이의의도된목적을위해당해분야의숙련가에의해선택된다. 예를들면, 추가의제제는본발명의항체에의해치료되는질환또는병태를치료하는데유용한것으로당해분야에인지된치료제일수있다. 추가의제제는또한치요학적조성물에대해유리한기여를부여하는제제, 예를들면, 조성물의점도에영향을미치는제제일수있다. 본발명내에포함될조합물은이의의도된목적에유용한조합물임이또한이해되어야한다. 하기설정된제제는나열의목적이며이로제한함을의도하지는않는다. 본발명의일부인조합물은, 본발명의항체및하기목록으로부터선택된적어도하나의추가의제제일수있다. 조합이, 형성된조성물이이의의도된기능을수행할수있도록하는경우, 조합은또한하나이상의추가의제제, 예를들면, 2개또는 3개의제제를포함할수있다. 바람직한조합은이부프로펜과같은약물을포함하는 NSAIDS로또한언급된비-스테로이드성소염약물이다. 다른바람직한조합물은프레드니솔론을포함하는코르티코스테로이드이며 ; 스테로이드사용의익히공지된부작용은, 본발명의항-IL-1β 항체와함께환자를치료하는경우요구되는스테로이드투여량을줄임으로써감소시키거나심지어제거할수있다. 본발명의항체또는항체부위가조합될수있는류마티스관절염용치료제의비-제한적예는다음을포함하나, 이에한정되지않는다 : 사이토킨억제성소염약물 (CSAID); 다른사람사이토킨또는성장인자, 예를들면, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL- 16, IL-18, IL-21, 인터페론, EMAP-II, GM-CSF, FGF, 및 PDGF에대한항체또는상기한것의길항제. 본발명의항체, 또는이의항원결합부분은 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA 또는, CD154(gp39 또는 CD40L) 를포함하는이들의리간드와같은세포표면분자에대한항체와조합될수있다. 치료제의바람직한조합물은자가면역및후속적인염증캐스케이드 (cascade) 에서상이한시점에서방해할수있으며 ; 바람직한예는키메라성, 사람화되거나사람 TNF 항체, D2E7, (PCT 공보제WO 97/29131호 ), CA2 (Remicade TM ), CDP 571, 및가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, 이의유도체, (p75tnfr1gg (Enbrel TM ) 또는 p55tnfr1gg ( 레네르셉트 ) 와같은 TNF 길항제, 및또한 TNFα 전환효소 (TACE) 억제제를포함하며 ; 유사하게 IL- 1 억제제 ( 인터루킨-1-전환효소억제제, IL-1RA 등 ) 는동일한이유로효과적일수있다. 다른바람직한조합물은인터루킨 11을포함한다. 여전히다른바람직한조합물은, IL-1β 기능과평행하거나, 의존하거나이와함께작용할수있는자가면역반응의다른주요작용인자이다. 여전히다른바람직한조합물은비-고갈성항- CD4 억제제이다. 여전히다른바람직한조합물은항체, 가용성수용체또는길항성리간드를포함하는공-자극경로 CD80 (B7.1) 또는 CD86 (B7.2) 의길항제를포함한다. [0562] 본발명의항체, 또는이의항원결합부분은또한메토트렉세이트, 6-MP, 아자티오프린설파살라진, 메살라진, 올살라진, 클로로퀴닌 / 하이드록시클로로퀸, 페니실라민, 아우로티오말레이트 ( 근육내및경구 ), 아자티오프린, 콜히친, 코르티코스테로이드 ( 경구, 흡입및국소주사 ), 베타-2 아드레노수용체작용제 ( 살부타몰, 테르부탈린, 살메테랄 ), 크산틴 ( 테오필린, 아미노필린 ), 크로모글리케이트, 네도크로밀, 케토티펜, 이프라트로피움및옥시트로피움, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예를들면, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예를들면, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제억제제, 아데노신작용제, 항혈전제, 상보체억제제, 아드레날린성제제, 전염증성사이토킨, 예를들면, TNF-α 또는 IL-1( 예를들면, IRAK, NIK, IKK, p38, 또는 MAP 키나제억제제 ) 에의한시그날링을방해하는제제, IL-1β 전환효소억제제, TNFα 전환효소 (TACE) 억제제, T-세포시그날링억제제, 예를들면, 키나제억제제, 메탈로프로테이나제억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토푸린, 안지오텐신전환효소억제제, 가용성사이토킨수용체및이의

150 유도체 ( 예를들면, 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체및유도체 p75tnfrigg (Enbrel TM 및 p55tnfrigg ( 레네르셉트 )), sil-1ri, sil-1rii, sil-6r), 소염성사이토킨 ( 예를들면, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ), 셀레콕시브, 엽산, 하이드록시클로로퀸설페이트, 로페콕시브, 에타네르셉트, 인플릭시마브, 나프록센, 발데콕시브, 설파살라진, 메틸프레드니솔론, 멜록시캄, 메틸프레드니솔론아세테이트, 금나트륨티오말레이트, 아스피린, 트리암시놀론아세토나이드, 프로폭시펜납실레이트 /apap, 폴레이트, 나부메톤, 디클로페낙, 피록시캄, 에토돌락, 디클로페낙나트륨, 옥사프로진, 옥시코돈 hcl, 하이드로코돈비타르트레이트 /apap, 디클로페낙나트륨 / 미소프로스톨, 펜타닐, 아나킨라, 사람재조합체, 트라마돌 hcl, 살살레이트, 술린닥, 시아노코발라민 /fa/ 피리독신, 아세트아미노펜, 알렌드로네이트나트륨, 프레드니솔론, 모르핀설페이트, 리도카인하이드로클로라이드, 인도메타신, 글루코사민설프 / 콘드로이틴, 아미트립틸린 hcl, 설파디아진, 옥시코돈 hcl/ 아세트아미노펜, 올로파타딘 hcl, 미소프로스톨, 나프록센나트륨, 오메프라졸, 사이클로포스파미드, 리툭시마브, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18 BP, 항-IL-18, 항-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, 로플루미라스트, IC-485, CDC-801, 및메소프람을포함한다. 바람직한조합물은메토트렉세이트또는루플루노마이드를포함하며, 중간또는심각한류마티스관절염의경우에는사이클로스포린을포함한다. [0563] 류마티스관절염 (RA) 을치료하기위한결합단백질과함께또한사용될수있는비-제한적인추가의제제는다음을포함하나, 이에한정되지않는다 : 비-스테로이드성소염약물 ( 들 ) (NSAID); 사이토킨억제성소염약물 ( 들 )(CSAID); CDP-571/BAY [ 사람화된항-TNFα 항체 ; 제조원 : 셀테크 (Celltech)/ 바이엘 (Bayer)]; ca2/ 인플릭시마브 [ 키메라항-TNFa 항체 ; 제조원 : 센토코르 ); 75 kdtnfr-igg/ 에타네르셉트 (75 kd TNF 수용체- IgG 융합단백질 ; 제조원 : 임뮤넥스 ; 참조 : 예를들면, Moreland et al. (Abstract No. 813), Arthritis Rheum., 37: S295 (1994); Baumgartner et al., J. Invest. Med., 44(3): 235A (March 1996)]; 55 kdtnf-igg [55 kd TNF 수용체-IgG 융합단백질 ; 제조원 ; 호프만-라로슈 (Hoffmann-LaRoche)]; IDEC-CE9.1/SB [ 비-고갈영장류화된항-CD4 항체 ; 제조원 : 이이디이씨 (IDEC)/ 스미쓰클라인 (SmithKline); 참조 : 예를들면, Kaine et al. (Abstract No. 195), Arthritis Rheum., 38: S185 (1995)]; DAB 486-IL-2 및 / 또는 DAB 389-IL-2[IL-2 융합단백질 ; 제조원 : 세라젠 ; 참조 : 예를들면, Sewell et al., Arthritis Rheum., 36(9): (September 1993)]; 항-Tac ( 사람화된항-IL-2Rα; 제조원 : 프로테인디자인랩스 (Protein Design Labs)/ 로슈 ]; IL-4 ( 소염사이토킨 ; 제조원 : 디엔에이엑스 (DNAX)/ 쉐링 ); IL-10 (SCH 52000; 재조합체 IL-10, 소염사이토킨 ; 제조원 : 디엔에이엑스 / 쉐링 ); IL-4; IL-10 및 / 또는 IL-4 작용제 ( 예를들면, 작용제항체 ); IL-1RA[IL-1 수용체길항제 ; 제조원 ; 시네르젠 (Synergen)/ 암젠 (Amgen)]; 아나킨라 (Kineret / 제조원 : 암젠 ); TNF-bp/s-TNF [ 가용성 TNF 결합단백질 ; 참조 : 예를들면, Evans et al. (Abstract No. 1540), Arthritis Rheum.,39(9)( 보충판 ): S284 (1996)); Kapadia et al., Amer. J. Physiol. - Heart 및 Circulatory Physiology, 268: H517-H525 (1995)]; RP73401[ 포스포디에스테라제제IV형억제제 ; 참조 : 예를들면, Chikanza et al. (Abstract No. 1527), Arthritis Rheum., 39(9)( 보충판 ): S282 (1996)]; MK-966[COX-2 억제제 ; 참조 : 예를들면, Erich et al. (Abstract Nos. 328 및 329), Arthritis Rheum., 39(9)(supplement): S81 (1996)]; 일로프로스트 [ 참조 : 예를들면, Scholz, P. (Abstract No. 336), Arthritis Rheum., 39(9) ( 보충판 ): S82 (1996)]; 메토트렉세이트 ; 탈리도마이드 [ 참조 : 예를들면, Lee et al. (Abstract No. 1524), Arthritis Rheum., 39(9) ( 보충판 ): S282 (1996)] 및탈리도마이드-관련약물 ( 예를들면, 셀젠 ); 레플루노미드 [ 소염및사이토킨억제제 ; 참조 : 예를들면, Finnegan et al. (Abstract No. 627), Arthritis Rheum., 39(9)( 보충판 ): S131 (1996)); Thoss et al., Inflamm. Res., 45: (1996)]; 트라넥삼산 ( 플라스미노겐활성화억제제 ; 참조 : 예를들면, Ronday et al. (Abstract No. 1541), Arthritis Rheum., 39(9)( 보충판 ): S284 (1996)]; T-614 [ 사이토킨억제제 ; 참조 : 예를들면, Hara et al. (Abstract No. 1526), Arthritis Rheum., 39(9)( 보충판 ): S282 (1996)]; 프로스타글란딘 E1 [ 참조 : 예를들면, Moriuchi et al. (Abstract No. 1528), Arthritis Rheum., 39(9)( 보충판 ): S282 (1996)]; 테니답 [ 비-스테로이드성소염약물 ; 참조 : 예를들면, Guttadauria, M. (Abstract No. 1516), Arthritis Rheum., 39(9)( 보충판 ): S280 (1996)]; 나프록센 [ 비-스테로이드성소염약물 ; 참조 : 예를들면, Fiebich et al., Neuro Report, 7: (1996)]; 멜록시캄 ( 비-스테로이드성소염약물 ); 이부프로펜 ( 비-스테로이드성소염약물 ); 피록시캄 ( 비-스테로이드성소염약물 ); 디클로페낙 ( 비-스테로이드성소염약물 ); 인도메타신 ( 비-스테로이드성소염약물 ); 설파살라진 [ 참조 : 예를들면, Farr et al. (Abstract No. 1519), Arthritis Rheum., 39(9)( 보충판 ): S281 (1996)]; 아자티오프린 [ 참조 : 예를들면, Hickey et al. (Abstract No. 1521), Arthritis Rheum., 39(9)( 보충판 ): S281 (1996)]; ICE 억제제 ( 효소인터루킨-1β 전환효소억제제 ); zap-70 및 / 또는 lck 억제제 ( 타이로신키나제 zap-70 또는 lck의억제제 ); VEGF 억제제및 / 또는 VEGF-R 억제제 ( 혈관내피세포성장인자또는혈관내피세포성장인자수용체의억제제 ; 혈관형성억제제 ); 코르티코스테로이드소염약물 ( 예를들면, SB203580); TNF-컨버타제억제제 ; 항-IL-12 항체 ;

151 항-IL-18 항체 ; 인터루킨-11[ 참조 : 예를들면, Keith Jr. et al. (Abstract No. 1613), Arthritis Rheum., 39(9)( 보충판 ): S296 (1996)]; 인터루킨-13[ 참조 : 예를들면, Bessis et al. (Abstract No. 1681), Arthritis Rheum., 39(9)( 보충판 ): S308 (1996)]; 인터루킨-17 억제제 [ 참조 : 예를들면, Lotz et al. (Abstract No. 559), Arthritis Rheum., 39(9)( 보충판 ): S120 (1996)]; 금 ; 페니실라민 ; 클로로퀸 ; 클로람부실 ; 하이드록시클로로퀸 ; 사이클로스포린 ; 사이클로포스파미드 ; 총림프구조사 ; 항-흉선샘글로불린 ; 항-CD4 항체 ; CD5-독소 ; 경구-투여된펩타이드및콜라겐 ; 로벤자리트이나트륨 ; 사이토킨조절제 (CRAs) HP228 및 HP466[ 제조원 : 호프텐파마슈티칼스, 인크.(Houghten Pharmaceuticals, Inc.)]; ICAM-1 안티센스포스포로티오에이트올리고-데옥시뉴클레오타이드 [ISIS 2302; 제조원 : 아이시스파마슈티칼스, 인크.(Isis Pharmaceuticals, Inc.)]; 가용성상보체수용체 1 [TP10; 제조원 : 티셀사이언스, 인크.(T Cell Sciences, Inc.)]; 프레드니손 ; 오르고테인 ; 글리코사미노글리칸폴리설페이트 ; 미노사이클린 ; 항-IL2R 항체 ; 해양및식물지질 [ 어류및식물종자지방산 ; 참조 : 예를들면, DeLuca et al., Rheum. Dis. Clin. North Am., 21: (1995)]; 아우라노핀 ; 페닐부타존 ; 메클로페남산 ; 플루페남산 ; 정맥내면역글로불린 ; 질레우톤 ; 아자리빈 ; 마이코페놀산 (RS-61443); 타크롤리무스 (FK-506); 시롤리무스 ( 라파마이신 ); 아미프릴로즈 ( 테라펙틴 ); 클라드리빈 (2-클로로데옥시아데노신); 메토트렉세이트 ; bcl-2 억제제 [ 참조 : Bruncko et al., J. Med. Chem., 50(4), (2007)]; 항바이러스및면역조절제. [0564] [0565] [0566] 하나의양태에서, 결합단백질또는이의항원-결합부분은류마티스관절염 (RA) 의치료를위한다음제제들중하나와함께투여된다 : KDR의소분자억제제, Tie-2의소분자억제제 ; 메토트렉세이트 ; 프레드니손 ; 셀렉콕시브 ; 엽산 ; 하이드록시클로로퀸설페이트 ; 로페콕시브 ; 에타네르셉트 ; 인플릭시마브 ; 레플루노미드 ; 나프록센 ; 발데콕시브 ; 설파살라진 ; 메틸프레드니솔론 ; 이부프로펜 ; 멜록시캄 ; 메틸프레드니솔론아세테이트 ; 금나트륨티오말레이트 ; 아스피린 ; 아자티오프린 ; 트리암시놀론아세토니드 ; 프로폭시펜납실레이트 /apap; 폴레이트 ; 나부메톤 ; 디클로페낙 ; 피록시캄 ; 에토돌락 ; 디클로페낙나트륨 ; 옥사프로진 ; 옥시코돈 hcl; 하이드로코돈비타르트레이트 /apap; 디클로페낙나트륨 / 미소프로스톨 ; 펜타닐 ; 아나킨라, 사람재조합체 ; 트라마돌 hcl; 살살레이트 ; 술린닥 ; 시아노코발라민 /fa/ 피리독신 ; 아세트아미노펜 ; 알렌드로네이트나트륨 ; 프레드니솔론 ; 모르핀설페이트 ; 리도카인하이드로클로라이드 ; 인도메타신 ; 글루코사민설페이트 / 콘드로이틴 ; 사이클로스포린 ; 아미트립틸린 hcl; 설파디아진 ; 옥시코돈 hcl/ 아세트아미노펜 ; 올로파타딘 hcl; 미소프로스톨 ; 나프록센나트륨 ; 오메프라졸 ; 미코페놀레이트모페틸 ; 사이클로포스파미드 ; 리툭시마브 ; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL- 18 BP; IL-12/23; 항-IL 18; 항-IL 15; BIRB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548; VX-740; 로플루밀라스트 ; IC- 485; CDC-801; 및메소프람. 본발명의결합단백질이조합될수있는염증성창자병용치료제의비-제한적예는다음을포함할수있다 : 부데노시드 ; 상피성장인자 ; 코르티코스테로이드 ; 사이클로스포린, 설파살라진 ; 아미노살리실레이트 ; 6-머캅토푸린 ; 아자티오프린 ; 메트로니다졸 ; 리폭시게나제억제제 ; 메살라민 ; 올살라진 ; 발살라지드 ; 항산화제 ; 트롬복산억제제 ; IL-1 수용체길항제 ; 항-IL-1β mab; 항-IL-6 mab; 성장인자 ; 엘라스타제억제제 ; 피리디닐-이미다졸화합물 ; 다른사람사이토킨또는성장인자의항체또는길항제, 예를들면, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, 및 PDGF. 본발명의항체, 또는이의항원결합부분은세포표면분자, 예를들면, CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 또는이들의리간드와조합될수있다. 본발명의항체, 또는이의항원결합부분은또한메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예를들면, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예를들면, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제억제제, 아데노신작용제, 항혈전제, 상보체억제제, 아드레날린제, 전염증성사이토킨, 예를들면, TNFα 또는 IL-1에의한시그날링을방해하는아드레날린제 ( 예를들면, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제억제제 ), IL-1β 전환효소억제제, TNFα 전환효소억제제, T-세포시그날링억제제, 예를들면, 키나제억제제, 메탈로프로테이나제억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토푸린, 안지오텐신전환효소억제제, 가용성사이토킨수용체및이의유도체 ( 예를들면, 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sil-1ri, sil-1rii, sil-6r) 및소염사이토킨 ( 예를들면, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFb) 및 bcl-2 억제제와같은제제와조합될수있다. 결합단백질이조합될수있는크론병용치료제의예는다음을포함한다 : TNF 길항제, 예를들면, 항-TNF 항체, 아달리무마브 (PCT 공보제WO 97/29131호 ; HUMIRA, CA2(REMICADE), CDP 571, TNFR-Ig 작제물, (p75tnfrigg (ENBREL ) 및 p55tnfrigg (Lenercept TM ) 억제제및 PDE4 억제제. 본발명의항체, 또는이의항원결합부분은코르티코스테로이드, 예를들면, 부데노시드및덱사메타손과조합될수있다. 본발명의결합단백질또는이의항원결합부분은또한설파살라진, 5-아미노살리실산및올살라진, 및 IL-1과같은전염증성사이토킨의합

152 성또는작용을방해하는제제, 예를들면, IL-1 전환효소억제제및 IL-1ra와조합될수있다. 본발명의항체또는이의항원결합부분은또한 T 세포시그날링억제제, 예를들면, 타이로신키나제억제제 6-머캅토푸린과함께사용될수있다. 본발명의결합단백질, 또는이의항원결합부분은 IL-11과조합될수있다. 본발명의결합단백질, 또는이의항원결합부분은메살라민, 프레드니손, 아자티오프린, 머캅토푸린, 인플릭시마브, 메틸프레드니솔론나트륨석시네이트, 디페녹실레이트 / 아트롭설페이트, 로페라미드하이드로클로라이드, 메토트렉세이트, 오메프라졸, 폴레이트, 시프로플록사신 / 덱스트로즈-물, 하이드로코돈비타르트레이트 /apap, 테트라사이클린하이드로클로라이드, 플루오시노나이드, 메트로니다졸, 티메로살 / 붕산, 콜레스티라민 / 수크로즈, 시크로플록사신하이드로클로라이드, 효스시아민설페이트, 메페리딘하이드로클로라이드, 메다졸람하이드로클로라이드, 옥시코돈 hcl/ 아세트아미노펜, 프로메타진하이드로클로라이드, 인산나트륨, 설파메톡사졸 / 트리메토프림, 셀레콕시브, 폴리카르보필, 프로폭시펜납실레이트, 하이드로코르티손, 다가비타민, 발살라지드이나트륨, 인산코데인 /apap, 콜레세벨람 hcl, 시아노코발라민, 엽산, 레보플록사신, 메틸프레드니솔론, 나탈리주마브및인터페론-감마와조합될수있다. [0567] [0568] [0569] [0570] [0571] 본발명의결합단백질이조합될수있는다발경화증 (MS) 용치료제의비-제한적예는다음을포함한다 : 코르티코스테로이드, 프레드니솔론 ; 메틸프레드니솔론 ; 아자티오프린 ; 사이클로포스파미드 ; 사이클로스포린 ; 메토트렉세이트 ; 4-아미노피리딘 ; 티자니딘 ; 인터페론-β1a(Avonex; 제조원 : 바이오젠 ); 인터페론-β1b( 베타세론 ; 제조원 : 키론 / 베를렉스 ); 인터페론 α-n3)( 제조원 : 인터페론사이언시즈 / 후지모토 ), 인터페론-α[ 제조원 : 알파와쎄만 (Alfa Wassermann)/ 존슨앤드존슨 ), 인터페론 β1a-if ( 제조원 : 세로노 / 인할레써라퓨틱스 ), Peg인터페론 2 β( 제조원 : 엔존 / 쉐링-플라우 ), 공중합체 1[Cop-1; 코팍손 ; 제조원 : 테바파마슈티칼인더스트리즈, 인크.(Teva Pharmaceutical Industries, Inc.]; 하이퍼바릭산소 ; 정맥내면역글로불린 ; 클라브리빈 ; 다른사람사이토킨또는성장인자에대한항체또는이의길항제및이들의수용체, 예를들면, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL- 7, IL-8, IL-23, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, 및 PDGF. 본발명의결합단백질은 CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90와같은세포표면분자또는이들의리간드에대한항체와조합될수있다. 본발명의결합단백질은메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예를들면, 이부프로펜, 코르티코스테로이드예를들면, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제억제제, 아덴소신작용제, 항혈전제, 상보체억제제, 아드레날린제, 전염증성사이토킨예를들면, TNFα 또는 IL-1 ( 예를들면, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제억제제 ) 에의한시그날링을방해하는제제, IL-1β 전환효소억제제, TACE 억제제, T-세포시그날링억제제, 예를들면, 키나제억제제, 메탈로프로테이나제억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토푸린, 안지오텐신전환효소억제제, 가용성사이토킨수용체및이의유도체 ( 예를들면, 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sil- 1RI, sil-1rii, sil-6r), 소염사이토킨 ( 예를들면, IL-4, IL-10, IL-13 및 TGFβ) 및 bcl-2 억제제. 본발명의결합단백질이조합될수있는다발경화증용치료제의예는인터페론-β, 예를들면, IFNβ1a 및 IFN β1b; 코팍신 ; 코르티코스테로이드 ; 카스파제억제제, 예를들면, 카스파제-1의억제제 ; IL-1 억제제 ; TNF 억제제 ; 및 CD40 리간드및 CD80에대한항체를포함할수있다. 본발명의결합단백질은또한알렘투주마브, 드로나비놀, 유니메드, 다클리주마브, 미톡산트론, 크살리프로덴하이드로클로라이드, 팜프리딘, 글라티라머아세테이트, 나탈리주마브, 신나비돌, α-임뉴노킨 NNSO3, ABR , AnergiX.MS, 케모킨수용체길항제, BBR-2778, 칼라구알린, CPI-1189, LEM ( 리포좀-봉입된미톡산트론 ), THC.CBD ( 칸나비노이드작용제 ) MBP-8298, 메소프람 (PDE4 억제제 ), MNA-715, 항-IL-6 수용체항체, 뉴로박스, 피르페니돈알로트랍 1258 (RDP-1258), stnf-r1, 탈람파넬, 테리플루노마이드, TGF-베타2, 티플리모티드, VLA-4 길항제 ( 예를들면, TR-14035, VLA4 Ultrahaler, 안테그란-ELAN/ 제조원 : 바이오젠 ), 인터페론감마길항제, IL-4 작용제와같은제제와조합될수있다. 본발명의결합단백질이조합될수있는협심증용치료제의비-제한적예는다음을포함할수있다 : 아스피린, 니트로글리세린, 이소소르바이드모노니트레이트, 메토프롤롤석시네이트, 아테놀롤, 메토프롤롤타르트레이트, 암로디핀베실레이트, 딜티아젬하이드로클로라이드, 이소소르바이드디니트레이트, 클로피도그렐비설페이트, 니페디핀, 아토르바스타틴칼슘, 염화칼륨, 푸로세미드, 심바스틴, 베라파밀 hcl, 디곡신, 프로프라놀롤하이드로클로라이드, 카르베딜롤, 리시노프릴, 스피로놀락톤, 하이드로클로로티아지드, 에날라프릴말레이트, 나돌롤, 라미프릴, 에녹사파린나트륨, 헤파린나트륨, 발사르단소탈롤하이드로클로라이드, 페노피브레이트, 에제티미베, 부메타니드, 로사르탄칼륨, 이시노프릴 / 하이드로클로로티아지드, 펠로디핀, 캅토프릴, 비소프롤롤푸마레이트. 본발명의결합단백질이조합될수있는강직성척추염용치료제의비-제한적예는다음을포함한다 : 이부프로

153 펜, 디클로페낙및미소프로스톨, 나프록센, 멜록시캄, 인도메타신, 디클로페낙, 셀레콕시브, 로페콕시브, 설파 살라진, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 미노사이클린, 프레드니손, 에타네르셉트, 인플릭시마브. [0572] [0573] [0574] [0575] [0576] [0577] 본발명의결합단백질이조합될수있는천식용치료제의비-제한적예는다음을포함한다 : 알부테롤, 살메테롤 / 플루티카손, 몬테루카스트나트륨, 플루티카손프로피오네이트, 부데소니드, 프레드니손, 살메테롤크시나포에이트, 레브알부테롤 hcl, 알부테롤설페이트 / 이프라트로피움, 프레드니솔론인산나트륨, 트리암시놀론아세토니드, 베클로메타손디프로피오네이트, 이프라트로피움브로마이드, 아지트로마이신, 피르부테롤아세테이트, 프레드니솔론, 무수테오필린, 메틸프레드니솔론나트륨석시네이트, 클라리트로마이신, 자피를루카스트, 포르모테롤푸마레이트, 인플루엔자바이러스백신, 메틸프레드니솔론, 아목실린삼수화물, 플루니솔라이드, 알레르기주사제, 크로몰린나트륨, 펙소페나딘하이드로클로라이드, 플루니솔라이드 / 멘톨, 아목시실린 / 클라불라네이트, 레보플록사신, 흡입기보조장치, 구아이페네신, 덱사메타손인산나트륨, 목시플록사신 hcl, 독소사이클린하이클레이트, 구아이페네신 /d-메토르판, p-에페드린 /cod/ 클로르페니르, 가티플록사신, 세티리진하이드로클로라이드, 모메타손푸로에이트, 살메테롤크시나포에이트, 벤조나테이트, 세팔렉신, pe/ 하이드로코돈 / 클로르페니르, 세티리진 hcl/ 슈도에페드, 페닐에프린 /cod/ 프로메타진, 코데인 / 프로메타진, 세프프로질, 덱사메타손, 구아이페네신 / 슈도에페드린, 클로르페니라민 / 하이드로코돈, 네도크로밀나트륨, 테르부탈린설페이트, 에피네프린, 메틸프레드니솔론, 메타프로테레놀설페이트. 본발명의결합단백질이조합될수있는 COPD용치료제의비-제한적예는다음을포함한다 : 알부테롤설페이트 / 이프라트로피움, 이프라트로피움브로마이드, 살메테롤 / 플루티카손, 알부테롤, 살메테롤크시나포에이트, 플루티카손프로피오네이트, 프레드니손, 무수테오필린, 메틸프레드니솔론나트륨석시네이트, 몬테루카스트나트륨, 부데소니드, 포르모테롤푸마레이트, 트리암시놀론아세토니드, 레보플록사신, 구아이페네신, 아지트로마이신, 베클로메타손디프로피오네이트, 레발부테롤 hcl, 플루니솔라이드, 세프트리악손나트륨, 아목실린삼수화물, 가티플록사신, 자피를루카스트, 아목시실린 / 클라불라네이트, 플루니솔라이드 / 멘톨, 클로르페니라민 / 하이드로코돈, 메타프로테레놀설페이트, 메틸프레드니솔론, 모메타손푸로에이트, p-에페드린 /cod/ 클로르페니르, 피르부테롤아세테이트, p-에페드린 / 로라타딘, 테르부탈린설페이트, 티오프로피움브로마이드, (R,R)-포르모테롤, TgAAT, 실로밀라스트, 로플루밀라스트. 본발명의결합단백질이조합될수있는 HCV용치료제의비-제한적예는다음을포함한다 : 인터페론-알파-2a, 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파 con1, 인터페론-알파-n1, 페길화된인터페론-알파-2a, 페길화된인터페론-알파-2b, 리바비린, Peg인터페론 alfa-2b + 리바비린, 우르소데옥시콜산, 글리실릭산, 티말파신, 막사민, VX-497 및다음표적과의개입을통해 HCV를치료하는데사용된특정화합물 : HCV 폴리머라제, HCV 프로테아제, HCV 헬리카제, HCV IRES( 내부리보소옴도입부위 ). 본발명의결합단백질이조합될수있는특발성폐섬유증용치료제의비-제한적예는다음을포함한다 : 프레드니손, 아자티오프린, 알부테롤, 콜히친, 알부테롤설페이트, 디곡신, 감마인터페론, 메틸프레드니솔론 sod succ, 로라제팜, 푸로세미드, 리시노프릴, 니트로글리세린, 스피로놀락톤, 사이클로포스파미드, 이프라트로피움브로마이드, 악티노마이신 d, 알테플라제, 플루티카손프로피오네이트, 레보플록사신, 메타프로테레놀설페이트, 모르핀설페이트, 옥시코돈 hcl, 염화칼륨, 트리암시놀론아세토니드, 타크롤리무스무수물, 칼슘, 인터페론-알파, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트모페틸, 인터페론-감마-1β. 본발명의결합단백질이조합될수있는심근경색용치료제의비-제한적예는다음을포함한다 : 아스피린, 니트로글리세린, 메토프롤롤타르트레이트, 에녹사파린나트륨, 헤파린나트륨, 클로피도그렐비설페이트, 카르베딜롤, 아테놀롤, 모르핀설페이트, 메토프롤롤석시네이트, 와르파린나트륨, 리시노프릴, 이소소르바이드모노니트레이트, 디곡신, 푸로세미드, 심바스타틴, 라미프릴, 테넥테플라제, 에날라프릴, 토르세미드, 레타바제, 로사르탄칼륨, 퀴나프릴 hcl/mag carb, 부메타니드, 알테플라제, 에날라프릴라트, 아미오다론하이드로클로라이드, 티로피반 hcl m-수화물, 딜티아젬하이드로클로라이드, 캅토프릴, 이르베사르탄, 발사르탄, 프로프라놀롤하이드로클로라이드, 포시노프릴나트륨, 리도카인하이드로클로라이드, 에프티피바타이드, 세파졸린나트륨, 아트로핀설페이트, 아미노카프로인산, 스피로놀락톤, 인터페론, 소탈롤하이드로클로라이드, 염화칼륨, 도쿠세이트나트륨, 도부타민 hcl, 알프라졸람, 프라바스타틴나트륨, 아토르바스타틴칼슘, 미다졸람하이드로클로라이드, 메페리딘하이드로클로라이드, 이소소르바이드디니트레이트, 에피네프린, 도파민하이드로클로라이드, 비발리루딘, 로수바스타틴, 에제티미베 / 심바스틴, 아바시미베, 카리포라이드. 본발명의결합단백질이조합될수있는건선용치료제의비-제한적예는다음을포함한다 : KDR의소분자억제제, Tie-2의소분자억제제, 칼시포트리엔, 클로베타졸프로피오네이트, 트리암시놀론아세토니드, 할로베타

154 졸프로피오네이트, 타자로텐, 메토트렉세이트, 플루오시노나이드, 증강된베타메타손디프로프, 플루오시놀론아세토니드, 악시트레틴, 타르샴푸, 베타메타손발러레이트, 모메타손푸로에이트, 케토코나졸, 프라목신 / 플루오시놀론, 하이드로코르티손발러레이트, 플루란드레놀리드, 우레아, 베타메타손, 클로베타졸프로피오네이트 / 에몰, 플루티카손프로피오네이트, 아지트로마이신, 하이드로코르티손, 습윤화제형, 엽산, 데소니드, 피메크롤리무스, 코울타르 (coal tar), 디플로라손디아세테이트, 에타네르셉트폴레이트, 락트산, 메톡살렌, hc/ 비스무쓰서브갈 /znox/resor, 메틸프레드니솔론아세테이트, 프레드니손, 선스크린, 할시노나이드, 살리실산, 안트랄린, 클로코르톨론피발레이트, 석탄추출물, 코울타르 / 살리실산, 코울타르 / 살리실산 / 황, 데속시메타손, 디아제팜, 연화제, 플루오시노나이드 / 연화제, 광오일 / 카스터오일 /na lact, 광오일 / 땅콩오일, 석유 / 이소프로필미리스테이트, 소랄렌, 살리실산, 비누 / 트리브롬살란, 티메로살 / 붕산, 셀레콕시브, 인플릭시마브, 사이클로스포린, 알레파셉트, 에팔리주마브, 타크롤리무스, 피메크롤리무스, PUVA, UVB, 설파살라진. [0578] [0579] [0580] [0581] 본발명의결합단백질이조합될수있는건선관절염의치료제의비-제한적예는다음을포함한다 : 메토트렉세이트, 에타네르셉트, 로페콕시브, 셀레콕시브, 엽산, 설파살라진, 나프록센, 레플루노마이드, 메틸프레드니솔론아세테이트, 인도메타신, 하이드록시클로로퀸설페이트, 프레드니손, 술린닥, 증강된베타메타손디프로프, 인플릭시마브, 메토트렉세이트, 폴레이트, 트리암시놀론아세토니드, 디클로페낙, 디메틸설폭사이드, 피록시캄, 디클로페낙나트륨, 케토프로펜, 멜록시캄, 메틸프레드니솔론, 나부메톤, 톨메틴나트륨, 칼시포트리엔, 사이클로스포린, 디클로페낙나트륨 / 미소프로스톨, 플루오시노나이드, 글루코사민설페이트, 금나트륨티오말레이트, 하이드로코돈비타르트레이트 /apap, 이부프로펜, 리세드로네이트나트륨, 설파디아진, 티오구아닌, 발데콕시브, 알레파셉트, 에팔리주마브및 bcl-2 억제제. 본발명의결합단백질이조합될수있는재협착용치료제의비-제한적예는다음을포함한다 : 시롤리무스, 파클리탁셀, 에베롤리무스, 타크롤리무스, 조타롤리무스, 아세트아미노펜. 본발명의결합단백질이조합될수있는좌골신경통용치료제의비-제한적예는다음을포함한다 : 하이드로코돈비타르트레이트 /apap, 로페콕시브, 사이클로벤자프린 hcl, 메틸프레드니솔론, 나프록센, 이부프로펜, 옥시코돈 hcl/ 아세트아미노펜, 셀레콕시브, 발데콕시브, 메틸프레드니솔론아세테이트, 프레드니손, 코데인포스페이트 /apap, 트라마돌 hcl/ 아세트아미노펜, 메탁살론, 멜록시캄, 메토카르바몰, 리도카인하이드로클로라이드, 디클로페낙나트륨, 가바펜틴, 덱사메타손, 카르이소프로돌, 케토롤락트로메타민, 인도메타신, 아세트아미노펜, 디아제팜, 나부메톤, 옥시코돈 hcl, 티자니딘 hcl, 디클로페낙나트륨 / 미소프로스톨, 프로폭시펜납실레이트 /apap, asa/ 옥시코드 / 옥시코돈 ter, 이부프로펜 / 하이드로코돈 bit, 트라마돌 hcl, 에토돌락, 프로폭시펜 hcl, 아미트리프틸린 hcl, 카르이소프로돌 / 코데인 phos/asa, 모르핀설페이트, 다가비타민, 나프록센나트륨, 오르페나드린시트레이트, 테마제팜. 본발명의결합단백질이조합될수있는 SLE( 루푸스 ) 용치료제의예는다음을포함한다 : NSAIDS, 예를들면, 디클로페낙, 나프록센, 이부프로펜, 피록시캄, 인도메타신 ; COX2 억제제, 예를들면, 셀레콕시브, 로페콕시브, 발데콕시브 ; 항-말라리아, 예를들면, 하이드록시클로로퀸 ; 스테로이드, 예를들면, 프레드니손, 프레드니솔론, 부데노시드, 덱사메타손 ; 세포독소, 예를들면, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 마이코페놀레이트모페틸, 메토트렉세이트 ; PDE4의억제제또는푸린합성억제제, 예를들면셀셉트. 본발명의결합단백질은또한설파살라진, 5-아미노살리실산, 올살라진, 이무란및, IL-1과같은전염증성사이토킨의합성, 생산또는작용을방해하는제제, 예를들면, IL-1β 전환효소억제제및 IL-1ra와같은카스파제억제제와조합될수있다. 본발명의결합단백질은또한 T 세포시그날링억제제, 예를들면, 타이로신키나제억제제 ; 또는 T 세포활성화분자를표적화하는분자, 예를들면, CTLA-4-IgG 또는항-B7 계열항체, 항-PD-1 계열항체와함께사용될수있다. 본발명의결합단백질은 IL-11 또는항-사이토킨항체, 예를들면, 포노톨리주마브 ( 항-IFNg 항체 ), 또는항-수용체수용체항체, 예를들면, 항-IL-6 수용체항체및, B-세포표면분자에대한항체와조합될수있다. 본발명의항체또는이의항원결합부분은또한, LJP 394 ( 아베티무스 ), B-세포를고갈시키거나불활성화시키는제제, 예를들면, 리툭시마브 ( 항-CD20 항체 ), 림포스타트-B ( 항-BlyS 항체 ), TNF 길항제, 예를들면, 항-TNF 항체, 아달리무마브 (PCT 공보제WO 97/29131호 ; HUMIRA, CA2 (REMICADE, CDP 571, TNFR-Ig 작제물, (p75tnfrigg (ENBREL 및 p55tnfrigg (Lenercept ) 및 bcl-2 억제제와함께사용될수있는데, 이는유전자삽입마우스에서 bcl-2 과발현이루푸스유사표현형을유발하는것으로입증되었기때문이며 ( 참조 : Marquina et al., J. Immunol., 172(11): (2004)), 이에따라억제는치료학적효과를갖는것으로기대된다. [0582] 본발명의약제학적조성물은본발명의항체또는항체부위의 " 치료학적유효량 " 또는 " 예방학적유효량 ) 을 포함할수있다. " 치료학적유효량 " 은바람직한치료학적결과를달성하기위해, 필수적인용량에서및필수적

155 인기간동안, 효과적인양을말한다. 항체또는항체부위의치료학적유효량은당해분야의숙련가에의해결정될수있으며개인의질환상태, 연령, 성별, 및체중, 및개인에서바람직한반응을유발하는항체또는항체부위의능력에의해결정될수있다. 치료학적유효량은또한, 항체, 또는항체부위의어떠한독성또는유해한효과보다치료학적으로유리한효과가더큰것이다. " 예방학적유효량 " 은바람직한예방학적결과를달성하는데필수적인용량에서필수적인기간에서효과적인양을말한다. 전형적으로, 예방학적유효량은대상체에서질환의조기단계이전에또는조기단계에사용되므로, 예방학적유효량은치료학적유효량미만일것이다. [0583] [0584] 용량요법 (dosage regimen) 은최적의바람직한반응 ( 예를들면, 치료학적또는예방학적반응 ) 을제공하기위해조절될수있다. 예를들면, 단일거환제가투여될수있으며, 수개의나누어진투여량이시간에걸쳐투여될수있거나투여량은치료학적상황의긴급성에의해나타나는바와같이비례적으로감소되거나증가될수있다. 투여의용이성및용량의균일성을위해비경구조성물을용량단위형으로제형화하는것이특히유리할수있다. 본원에사용된용량단위형은치료되는포유동물대상체에대한통합된용량으로적합한물리적으로별개인단위를말하며 ; 각각의단위는요구되는약제학적담체와함께바람직한치료학적효과를생산하도록계산된활성화합물의예정된양을함유한다. 본발명의용량단위형에대한명세는 (a) 활성화합물의독특한특성및달성될특수치료학적또는예방학적효과, 및 (b) 개인에서민감성의치료를위한이러한활성화합물을화합하는당해분야에서고유한제한에의해서및의존하여직접해석된다. 용량값은완화될상태의유형및중증도에따라변할수있음을주목하여야한다. 어떠한특수대상체의경우, 특이적인용량요법을개인필요성및, 조성물을투여하거나이의투여를관리하는사람의전문적인판단에따라시간에따라조절되어야하며, 본원에설정된용량범위는단지예시적인것이고청구된조성물의영역또는실시를한정하는것으로의도되지않는다. [0585] [0586] [0587] [0588] [0589] 진단제본원의교시내용은또한진단적용을제공한다. 이는또한하기에설명된다. 본발명의 IL-1β에결합하는항체를각종양식중어느것에서사용하여생체내, 시험관내또는생체외 ( 즉, 살아있는개인으로부터수득되어, 과정에적용된후개인에게다시제공된세포또는조직내 ) 에서 IL-1β를검출하기위한각종양식중어느것에서사용될수있다. 본발명의 DVD-Ig는 IL-1β는각종의진단및검출검사양식으로 IL-1β의에피토프및또한다른항원또는에피토프에결합할수있는추가의이점들을제공한다. I. 검사방법본교시내용은또한본원에기술된것으로서, 적어도하나의항-IL-1β 결합단백질또는, DVD-Ig를포함하는, 이의항원결합부분을사용하여시험시료에서 IL-1β, 또는이의단편 (" 분석물 ") 의존재, 양또는농도를측정하는방법을제공한다. 당해분야에공지된것으로서어떠한적합한검사도당해방법에서사용될수있다. 예는샌드위치면역검사 [ 예를들면, 방사선동위원소검출 ( 방사면역검사 (RIA)) 를포함하는, 단클론 / 다클론및 / 또는 DVD-Ig 샌드위치면역검사또는이의어떠한변이체 ( 예를들면, 단클론 /DVD-Ig, DVD-Ig/ 다클론등 )], 및효소검출 [ 효소면역검사 (EIA) 또는효소-연결된면역흡착성검사 (ELISA)( 예를들면, 콴티킨 (Quantikine) ELISA 검사, 제조원 : 알앤드디시스템스 (R&D Systems), 미네소타주미니아폴리스소재 )], 경쟁적억제면역검사 ( 예를들면, 전방및역방 ), 형광성분광면역검사 (FPIA), 효소증대된면역검사기술 (EMIT), 생물발광성공명에너지전달 (BRET), 및균질한화학발광검사등을포함하나, 이에한정되지않는다. SELDI-계면역검사에서, 목적한분석물 ( 또는이의단편 ) 에특이적으로결합하는포획시약은예비-활성화된단백질칩배열과같은질량분광계프로브의표면에부착된다. 이후에, 분석물 ( 또는이의단편 ) 은바이오칩위에특이적으로포획되며, 포획된분석물 ( 또는이의단편 ) 은질량분광계로검출한다. 대안적으로, 분석물 ( 또는이의단편 ) 은포획시약으로부터용출시키고전통적인 MALDI ( 매트릭스-보조된레이저탈착 / 이온화 ) 또는 SELDI를사용하여용출시킬수있다. 화학발광성미세입자면역검사, 특히 ARCHITECT 자동분석기 ( 제조원 : 애보트래보러토리즈, 일리노이주애보트파크소재 ) 를사용하는것은예시적인면역검사의예이다. 뇨, 혈액, 혈청및혈장, 및다른체액을수집하고, 취급하며가공하기위한당해분야에잘-공지된방법은예를들면, 본원에기술된항-IL-1β결합단백질이면역진단시약및 / 또는분석물면여검사키트로서사용되는경우, 본교시내용의실시예서사용된다. 시험시료는목적한분석물, 예를들면, 항체, 항원, 합텐, 호르몬, 약물, 효소, 수용체, 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 올리고뉴클레오타이드및 / 또는폴리뉴클레오타이드외에추

156 가의모이어티를포함할수있다. 예를들면, 시료는대상체로부터수득한전혈시료일수있다. 시험시료, 특히, 전혈이본원에기술된바와같은면역검사전에, 예를들면, 예비처리시약을사용하여처리되는것이필수적이거나바람직할수있다. 예비처리가필수적이지않는경우에도 ( 예를들면, 대부분의뇨시료 ), 예비처리가임의로 ( 예를들면, 상업적인플랫폼 (platform) 에서요법의일부로서 ) 수행될수있다. [0590] 예비처리시약은본발명의면역검사및키트와함께사용하기에적절한어떠한시약일수있다. 예비처리는임의로 (a) 하나이상의용매 ( 예를들면, 메탄올및에틸렌글리콜 ) 및임의로, 염, (b) 하나이상의용매및염, 임의로세제, (c) 세제, 또는 (d) 세제및염을포함한다. 예비처리시약은당해분야에공지되어있으며, 이러한예비처리는문헌 [ 참조 : 예를들면, Yatscoff et al., "Abbott TDx Monoclonal Antibody Assay Evaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood," Clin. Chem., 36: (1990); 및 Wallemacq et al., "Evaluation of the New AxSYM Cyclosporine Assay: Comparison with TDx Monoclonal Whole Blood and EMIT Cyclosporins Assays," Clin. Chem., 45: (1999)] 에기술된바와같이, 및 / 또는시판되는것 으로서, 예를들면, Abbott TDx, AxSYM 및 ARCHITECT 분석기 ( 제조원 : 애보트래보러토리즈, 일리노이주애보트파크소재 ) 에서검사에사용된바와같이사용될수있다. 또한, 예비처리는애보트의미국특허공보제 5,135,875호 ; 유럽공보제EP 호 ; PCT 공보제WO 2008/082984호 ; 및 US 공보제2008/ 호 ( 이의전문이예비처리에관한이의교시를위해참조로인용됨 ) 에기술된바와같이수행될수있다. 예비처리시약은불균질제제또는균질제제일수있다. [0591] [0592] [0593] [0594] [0595] 균질한예비처리시약을사용하는경우, 예비처리시약은시료내에존재하는분석물결합단백질 ( 예를들면, 분석물또는이의단편에결합할수있는단백질 ) 을침전시킨다. 이러한예비처리단계는침전된분석물결합단백질로부터샘플에예비처리제제를첨가함에의해형성된혼합물의상층액을분리함으로써어떠한분석물결합단백질을제거함을포함한다. 이러한검사에서, 어떠한결합단백질도함유하지않는혼합물의상층액이항체포획단계로직접진행되는검사에사용된다. 균질한예비처리시약을사용하면, 이러한분리단계는존재하지않는다. 시험시료및예비처리시약의전체혼합물을분석물 ( 또는이의단편 ), 예를들면, 표지된항-분석물항체 ( 또는항원적으로반응성인이의단편 ) 에대한표지된특이적인결합파트너와접촉시킨다. 이러한검사에사용된예비처리시약은전형적으로예비처리된시험시료혼합물속에서제1의특이적인결합파트너에의한포획전또는동안에희석된다. 이러한희석에도불구하고, 예비처리시약의특정양은포획동안시험시료혼합물속에여전히존재 ( 또는잔존 ) 한다. 본발명에따라서, 예시적인표지된특이적인결합파트너는 DVD-Ig( 또는이의단편, 변이체, 또는변이체의단편 ) 일수있다. 균질항양식에서, 시험시료를대상체로부터수득한후, 제1 혼합물을제조한다. 혼합물은분석물 ( 또는이의단편 ) 및제1의특이적인결합파트너에대해평가된시험시료를함유하며, 여기서시험시료에함유된제1의특이적인결합파트너및어떠한분석물도제1의특이적인결합파트너-분석물복합체를형성한다. 바람직하게는, 제1의특이적인결합파트너는항-분석물항체또는이의단편이다. 제1의특이적인결합파트너는본원에기술된바와같은 DVD-Ig( 또는이의단편, 변이체, 또는변이체의단편 ) 일수있다. 시험시료및제1의특이적인결합파트너가첨가되어혼합물을형성하는순서는중요하지않다. 바람직하게는, 제1의특이적인결합파트너는고체상에고정된다. 면역검사 ( 제1의특이적인결합파트너및, 임의로, 제2의특이적인결합파트너에대한것 ) 에사용된고체상은자기입자, 비드, 시험튜브, 미세역가플레이트, 큐베트 (cuvette), 막, 스캐폴딩분자 (scaffolding molecule), 필름, 여과지, 디스크및칩과같은, 그러나이에한정되지않는, 당해분야에공지된어떠한고체상일수있다. 제1의특이적인결합파트너-분석물복합체를함유하는혼합물이형성된후, 어떠한결합되지않는분석물을복합체로부터당해분야에공지된어떠한기술을사용하여제거한다. 예를들면, 결합되지않은분석물을세척에의해제거할수있다. 그러나, 바람직하게는, 제1의특이적인결합파트너는시험시료에존재하는과량의어떠한분석물에존재함으로써, 시험시료속에존재하는모든분석물이제1의특이적인결합파트너에의해결합되도록한다. 어떠한결합되지않은분석물도제거한후, 제2의특이적인결합파트너를혼합물에가하여제1의특이적인결합파트너-분석물-제2의특이적인결합파트너복합체를형성시킨다. 제2의특이적인결합파트너는바람직하게는제1의특이적인결합파트너에의해결합된분석물상의에피토프와는상이한분석물상의에피토프에결합하는항-분석물이다. 더우기, 또한바람직하게는, 제2의특이적인결합파트너는위에서기술한바와같은검출가능한표지로표지되거나이를함유한다. 제2의특이적인결합파트너는본원에기술된바와같은 DVD

157 Ig( 또는이의단편, 변이체, 또는변이체의단편 ) 일수있다. [0596] 당해분야에공지된어떠한적합한검출가능한표지도사용될수있다. 예를들면, 검출가능한표지는방사활 성표지 ( 예를들면, 3 H, 125 I, 35 S, 14 C, 32 P, 및 33 P), 효소표지 ( 예를들면, 서양고추냉이퍼옥시다제, 알카린퍼옥시다제, 글루코즈-6-포스페이트데하이드로게나제등 ), 화학발광성표지 ( 예를들면, 아크리디늄에스테르, 티오에스테르또는설폰아미드 ; 루미놀, 이소루미놀, 페난트리디늄에스테르등 ), 형광성표지 ( 예를들면, 플루오레세인 ( 예를들면, 5-플루오레세인, 6-카복시플루오레세인, 3',6-카복시플루오레세인, 5(6)-카복시플루오레세인, 6-헥사클로로-플루오레세인, 6-테트라클로로플루오레세인, 플루오레세인이소티오시아네이트등 )), 로다민, 피코빌리단백질, R-피코에리트린, 양자점 (quantum dot)( 예를들면, 아황산아연-포획된카드늄셀레나이드 ), 써모메트릭표지 (thermometric label), 또는이미노-폴리머라제쇄반응표지일수있다. 표지의도입, 표지화과정및표지의검출은문헌 [ 참조 : Polak and Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 2nd ed., Springer Verlag, N.Y. (1997), and in Haugland, Handbook of Fluorescent Probes 및 Research Chemicals (1996), 이는오레간주의유젠에소재하는몰레큘러프로브스, 인크. 에서발표한결합된핸드북및카탈로그이다 ]. 형광성표지는 FPIA( 참조 : 예를들면, 미국특허공보제5,593,896호 ; 제 5,573,904호 ; 제5,496,925호 ; 제5,359,093호, 및제5,352,803호 ) 에서사용될있다. 아크리디늄화합물은동종또는이종화학발광성검사에서검출가능한표지로사용될수있다 [ 참조 : 예를들면, Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 16: (2006); Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 14: (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. Chem. Lett., 14: (2004); 및 Adamczyk et al., Org. Lett., 5: (2003)]. [0597] [0598] [0599] [0600] 예시적인아크리디늄화합물은아크리디늄-9-카복스아미드이다. 아크리디늄 9-카복스아미드를제조하는방법은문헌 [ 참조 : Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin., 6: (1991); Adamczyk et al., J. Org. Chem., 63: (1998); Adamczyk et al., Tetrahedron, 55: (1999); Adamczyk et al., Org. Lett., 1: (1999); Adamczyk et al., Bioconjugate Chem., 11: (2000); Adamczyk and Mattingly, In Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; (Dyke, K.V., ed.) (CRC Press: Boca Raton, 2002) pp ; Adamczyk et al., Org. Lett., 5: (2003); 및미국특허공보제 5,468,646호, 제5,543,524호및제5,783,699호 ] 에기술되어있다. 다른바람직한아크리디늄화합물은아크리디늄-9-카복실레이트아릴에스테르이다. 아크리디늄-9-카복실레이트아릴에스테르의예는 10-메틸-9-( 페녹시카보닐 ) 아크리디늄플루오로설포네이트 [ 미시간주안아르보에소재하는카이만케미칼 (Cayman Chemical) 에서시판 ] 이다. 아크리디늄 9-카복실레이트아릴에스테르를제조하는방법은문헌 [ 참조 : McCapra et al., Photochem. Photobiol., 4: (1965); Razavi et al., Luminescence, 15: (2000); Razavi et al., Luminescence, 15: (2000); 및미국특허공보제 5,241,070] 에기술되어있다. 아크리디늄- 9-카복실레이트아릴에스테르및이의용도에관한추가의세부사항은 US 공보제2008/ 호에설정되어있다. 화학발광성검사 ( 예를들면, 상기기술된바와같은아크리디늄또는다른화학발광성제제사용 ) 은문헌 [ 참조 : Adamczyk et al., Anal. Chim. Acta, 579(1): (2006)] 에기술된방법에따라수행될수있다. 비록어떠한적합한검사양식도사용될수있다고해도, 미세플레이트화학발광계 [Mithras LB-940, 제조원 ; 베르톨드테크놀로지스유에스에이, 엘엘씨 (Berthold Technologies USA., LLC), 테네시주옥크릿지소재 ] 는소용적의다수의시료의검사를신속하게할수있다. 시험시료및특이적인결합파트너 ( 들 ) 이첨가되어화학발광성검사용혼합물을형성하는순서는중요하지않다. 제1의특이적인결합파트너가아크리디늄화합물과같은화학발광성제제로검출가능하게표지되는경우, 검출가능하게표지된제1의특이적인결합파트너-분석물복합체가형성된다. 달리는, 제2의특이적인결합파트너가사용되고제2의특이적인결합파트너가아크리디늄화합물과같은화학발광성제제로검출가능하게표지되는경우, 검출가능하게표지제1의특이적인결합파트너-분석물-제2의특이적인결합파트너복합체가형성된다. 어떠한결합되지않은특이적인결합파트너도, 표지되거나표지되지않은것에상관없이, 세척과같은, 당해분야에공지된어떠한기술을사용하여혼합물로부터제거할수있다. 과산화수소는혼합물속에서반응계내에서생성될수있거나상술한아크리디늄화합물의첨가전, 첨가와동시, 또는첨가후에혼합물 ( 예를들면, 과산화수소를함유하는것으로공지된하나이상의완충액또는다른용액인과산화수소의공급원 ) 에제공되거나공급될수있다. 과산화수소는반응계내에서당해분야의숙련가에게명백할수있는것과같은다수의방법으로반응계내에서생성될수있다

158 [0601] [0602] [0603] [0604] [0605] 시료에적어도하나의염기성용액을동시에또는연속적으로첨가시, 분석물의존재의지표인, 검출가능한시그날, 즉, 화학발광성시그날이생성된다. 염기성용액은적어도하나의염기를함유하며 ph가 10 이상, 바람직하게는, 12 이상이다. 염기성용액의예는수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화알루미늄, 수산화마그네슘, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 수산화칼슘, 탄산칼슘, 및중탄산칼슘을포함하나, 이에한정되지않는다. 시료에첨가된염기성용액의양은염기성용액의농도에의존한다. 사용된염기성용액의농도를기반으로하여, 당해분야의숙련가는시료에첨가될염기성용액의양을용이하게측정할수있다. 생성되는화학발광성시그날은당해분야의숙련가에게공지된통상의기술을사용하여검출할수있다. 생성된시그날의강도를기반으로하여, 시료속의분석물의양을정량화할수있다. 구체적으로, 시료중의분석물의양은생성된시그날의강도에비례한다. 존재하는분석물의양은분석물에대한표준곡선에대해생성된광의양을비교하거나참조표준물에대해비교함으로써정량화할수있다. 표준곡선은질량분광기, 중량분석법및, 당해분야에공지된다른기술들에의해분석물의공지된농도의용액또는일련희석물을사용하여생성할수있다. 상기에화학발광성제제로서아크리딘화합물의용도가강조되어기술되어있지만, 당해분야의숙련가는다른화학발광성제제의사용에대한당해설명을용이하게채택할것이다. 분석면역검사는일반적으로샌드위치방식과같지만이에한정되지않는, 당해분야에공지된어떠한양식을사용하여수행할수있다. 구체적으로, 하나의면역검사양식에서, 적어도 2개의항체를사용하여시료속에서사람분석물과같은분석물, 또는이의단편을분리하고정량화한다. 보다구체적으로, 적어도 2개의항체가 " 샌드위치 " 로언급되는, 면역복합체를형성하는분석물 ( 또는이의단편 ) 상의상이한에피토프에결합한다. 일반적으로, 면역검사에서, 하나이상의항체를사용하여시험시료속에서분석물 ( 또는이의단편 ) 을포획할수있으며 ( 이들항체는흔히 " 포획 " 항체또는 " 포획 " 항체들로언급된다 ) 하나이상의항체를사용하여샌드위치에검출가능한 ( 즉, 정량가능한 ) 표지를결합시킬수있다 ( 이들항체는흔히 " 검출항체 ", " 검출항체들 ", " 접합체 ", 또는 " 접합체들 " 로언급된다 ). 따라서, 샌드위치면역검사양식과관련하여, 본원에기술된 DVD-Ig ( 또는단편, 변이체, 또는이의변이체의단편 ) 는포획항체, 검출항체, 또는이들둘다로사용될수있다. 예를들면, 분석물 ( 또는이의단편 ) 상에서제1의에피토프에결합할수있는도메인을갖는하나의 DVD-Ig를포획항체로사용할수있고 / 있거나분석물 ( 또는이의단편 ) 상에서제2의에피토프에결합할수있는도메인을갖는다른 DVD-Ig를검출항체로사용할수있다. 이와관련하여, 분석물 ( 또는이의단편 ) 상에서제1의에피토프에결합할수있는제1의도메인및분석물 ( 또는이의단편 ) 상에서제2의에피토프에결합할수있는제2의도메인을갖는 DVD-Ig를포획항체및 / 또는검출항체로서사용할수있다. 대안적으로, 제1의분석물 ( 또는이의단편 ) 상에서에피토프에결합할수있는제1의도메인및제2의분석물 ( 또는이의단편 ) 상에서에피토프에결합할수있는제2의도메인을갖는하나의 DVD-Ig를 2개이상의분석물을검출하고, 임의로정량화하기위한포획항체및 / 또는검출항체로서사용할수있다. 분석물이하나이상의형태, 예를들면, 등가또는이가일수있는, 단량체형태및이합체 / 다합체형태로시료속에존재할수있는경우, 단량체형태에단지노출된에피토프에결합할수있는도메인을갖는하나의 DVD-Ig 및이합체 / 다합체형태의상이한부분에에피토프에결합할수있는도메인을갖는다른 DVD-Ig를포획항체및 / 또는검출항체로사용함으로써제공된분석물의상이한형태의검출, 및임의의정량화를가능하도록한다. 또한, 하나의 DVD-Ig내에서및 / 또는 DVD-Ig들사이에서차등적인친화성을갖는 DVD-Ig를사용하여항원항체결합력장점을제공할수있다. 본원에기술된바와같은면역검사와관련하여, 이는일반적으로 DVD-Ig의구조내에서하나이상의링커를혼입시키기위해도움이되거나요구될수있다. 존재하는경우, 최적으로링커는내부도메인에의한에피토프의결합및또한외부도메인에의한다른에피토프의결합이가능하도록충분한길이및구조적가요성 (flexibility) 이있어야한다. 이와관련하여, DVD-Ig는 2개의상이한분석물에결합할수있으며, 하나의분석물은다른것보다더크고, 바람직하게는보다큰분석물은외부도메인에의해결합된다. 일반적으로말해서, IL-1β 단백질 ( 또는이의단편 ) 에대해시험되는 ( 예를들면, 함유하는것으로추측된 ) 시료는하나이상의포획항체 ( 또는항체 ) 및적어도하나의검출항체 ( 이는제2의검출항체또는제3의검출항체또는심지어연속적으로번호매겨진항체, 예를들면, 다수의항체를포함하는포획및 / 또는검출항체의경우 ) 를동시에또는순차적으로및어떠한순서로도접촉시킬수있다. 예를들면, 시험시료는우선적어도하나의포획항체와접촉시킨후 ( 순차적으로 ) 적어도하나의검출항체와접촉시킬수있다. 대안적으로, 시험시료를우선적어도하나의검출항체와접촉시킨후 ( 순차적으로 ) 적어도하나의포획항체와접촉시킬수있다. 여전히다른대안에서, 시험시료는포획항체및검출항체와동시에접촉시킬수있다. 샌드위치검사양식에서, IL-1β( 또는이의단편 ) 을함유하는것으로추정된시료를우선적어도하나의제1의포획결합단백질 ( 예를들면, IL-1β항체 ) 와제1의결합단백질 /IL-1β 복합체를형성하도록하는조건하에서

159 접촉시킨다. 하나이상의포획결합단백질을사용하는경우, 2개이상의포획결합단백질을포함하는제1의포획결합단백질 /IL-1β 복합체가형성된다. 샌드위치검사에서, 결합단백질, 즉, 바람직하게는, 적어도하나의포획결합단백질을시험시료속에서예측된 IL-1β 분석물 ( 또는이의단편 ) 의최대양의몰과량으로사용한다. 예를들면, 약 5μg내지약 1 mg의항체 /ml의완충액 ( 예를들면, 미세입자피복완충액 ) 을사용할수있다. [0606] [0607] [0608] [0609] 단지하나의항체에의한결합이요구되기때문에소분석물을측정하는데흔히사용되는, 경쟁적억제면역검사는순차적이고전통적인양식을포함한다. 순차적인경쟁적억제면역검사에서, IL-1β에대한포획결합단백질은미세역가플레이트의웰 (well) 또는다른고체지지체위에피복된다. IL-1β를함유하는시료를웰에가하는경우, IL-1β는포획결합단백질에결합한다. 세척한후, 공지된양의표지된 ( 예를들면, 바이오틴또는서양고추냉이퍼옥시다제 (HRP)) IL-1β를웰에가한다. 효소표지에대한기질은시그날을생성하는데필수적이다. HRP에대한적합한기질의예는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 이다. 세척후에, 표지된분석물에의해생성된시그날을측정하며이는시료속의 IL-1β의양에역으로비례한다. 전통적인경쟁적억제면역검사에서, IL-1β에대한결합단백질은고체지지체 ( 예를들면, 미세역가플레이트의웰 ) 에피복된다. 그러나, 순차적인경쟁적억제면역검사와는달리, 시료및표지된 IL-1β는동시에웰에가해진다. 시료속의어떠한 IL-1β도표지된 IL-1β와포획결합단백질에대한결합에대해경쟁한다. 세척후, 표지된 IL-1β에의해생성된시그날을측정하며시료속의 IL-1β의양에역으로비례한다. 임의로, 시험시료를적어도하나의포획결합단백질 ( 예를들면, 제1의포획항체 ) 와접촉시키기전에, 적어도하나의포획결합단백질을고체지지체에결합시킬수있으며, 이는시험시료로부터제1의결합단백질 /IL- 1β( 또는이의단편 ) 복합체의분리를촉진한다. 포획결합단백질이결합된기질은시료로부터포획항체-분석물복합체의분리를촉진하는어떠한적합한고체지지체또는고체상일수있다. 예는미세역가플레이트와같은플레이트, 시험튜브, 다공성겔 ( 예를들면, 실리카겔, 아가로즈, 덱스트란, 또는젤라틴 ), 중합체성필름 ( 예를들면, 폴리아클리아미드 ), 비드 ( 예를들면, 폴리스티렌비드또는자기비드 ), 여과기 / 막의스트립 ( 예를들면, 니트로셀룰로즈또는나일론 ), 미세입자 [ 예를들면, 라텍스입자, 자기화가능한미세입자 ( 예를들면, 산화철또는산화크롬코어 (core) 및단독- 또는헤테로-중합체피복물을갖고반경이약 1 내지 10 마이크론인미세입자 ) 를포함한다. 기질은항원에결합하기에적합한표면친화성및검출항체에의한접근을허용하는충분한다공성을포함할수있다. 비록수화된상태의젤라틴성물질이사용될수있다고해도, 미세다공성물질이일반적으로바람직하다. 이러한다공성지질은바람직하게는, 두께가약 0.01 내지약 0.5 mm, 바람직하게는약 0.1 mm인쉬이트 (sheet) 형태이다. 공극크기가약간씩변할수있지만, 바람직하게공극크기는약 내지약 15 마이크론, 보다바람직하게는약 0.15 내지약 15 마이크론이다. 이러한기질의표면은기질에대한항체의공유연결을유발하는화학공정에의해활성화될수있다. 일반적으로, 기질에대한항원또는항체의소수성힘을통한흡수에의한비가역적인결합이생성되고 ; 대안적으로, 화학적커플링제또는다른수단을사용하여항체를기질에공유결합적으로결합시킬수있으며, 단이러한결합은항체가분석물에결합하는능력을방해하지않는다. 대안적으로, 항체는스트렙타비딘 ( 예를들면, DYNAL 자기비드, 제조원 : 인비트로겐, 캘리포니아주칼스바드소재 ) 또는바이오틴 [ 예를들면, 파워-BindTM- SA-MP 스트렙타비딘-피복된미세입자 ( 제조원 : 세라다인, 인디아나주인디아나폴리스소재 )] 또는항-종-특이적인단클론항체로미리피복된미세입자와결합시킬수있다. 필요한경우, 기질은유도체화시켜항체상의각종기능성그룹과의반응성을허용하도록유도체화할수있다. 이러한유도체화는특정의커플링제제의사용을필요로하며, 이러한커플링제의예는말레산무수물, N-하이드록시석신아미드, 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 ) 카보디이미드를포함하나, 이에한정되지않는다. 목적하는, 하나이상의포획시약, 예를들면, 이들각각이분석물 ( 들 ) 에대해특이적인항체 ( 또는이의단편 ) 를상이한물리적또는다룰수있는위치 [ 예를들면, 바이오칩구조내 ( 참조 : 예를들면, 미국특허공보제 6,225,047호 ; PCT 공보제WO 99/51773호 ; 미국특허공보제6,329,209호 ; PCT 공보제WO 00/56934호 ; 및미국특허공보제 5,242,828호 ] 에서고체상에부착시킬수있다. 포획시약이고체지지체로서질량분광기프로브에부착되는경우, 프로브에결합된분석물의양은레이저탈착이온화질량분광법으로검출할수있다. 대안적으로, 단일컬럼을상이한비드로패킹할수있으며, 당해비드는하나이상의포획시약으로유도체화됨으로써, 단일위치에서분석물을포획한다 [ 참조 : 항체- 유도체화된, 비드-계기술, 예를들면, 루미넥스 (Luminex)( 텍사스주오스틴소재 ) 의 xmap 기술 ]. 분석물 ( 또는이의단편 ) 에대해분석될시험시료를적어도하나의포획항체 ( 예를들면, 제1의포획항체 ) 와접촉시킨후, 혼합물을항온처리하여제1의항체 ( 또는다수항체 )-분석물 ( 또는이의단편 ) 복합체의형성을허용한다. 항온처리는, 약 4.5 내지약 10.0의 ph에서, 약 2 내지약 45 의온도에서, 및적어도약 1 분내

160 지약 18 시간, 바람직하게는약 1 내지약 24 분, 가장바람직하게는약 4 내지약 18분동안의기간동안수행할수있다. 본원에기술된면역검사는 1 단계 ( 시험시료, 적어도하나의포획항체및적어도하나의검출항체가모두반응용기에순차적으로또는동시에첨가됨을의미 ) 로또는 1회이상의단계, 예를들면, 2 단계, 3 단계등으로수행될수있다. [0610] [0611] [0612] [0613] [0614] ( 제1 또는다수의 ) 포획항체 / 분석물 ( 또는이의단편 ) 복합체의형성후, 복합체를이후에적어도하나의검출항체와 ( 제1 또는다수의 ) 포획항체 / 분석물 ( 또는이의단편 )/ 제2 검출항체복합체 ) 의형성을허용하는조건하에서접촉시킨다. 실제로, 다수의항체가포획및 / 또는검출에사용되는, " 제2" 의항체 ( 예를들면, 제2 검출항체 ) 로서명확성에대해포획하는동안, 적어도하나의검출항체는면역검사에사용된제2, 제3, 제4 등의항체일수있다. 포획항체 / 분석물 ( 또는이의단편 ) 복합체를하나이상의검출항체와접촉시키는경우, ( 제1 또는다수의 ) 포획항체 / 분석물 ( 또는이의단편 )/( 다수의 ) 검출항체복합체가형성된다. 포획항체 ( 예를들면, 제1의포획항체 ) 를사용하는경우와같이, 적어도하나의 ( 예를들면, 제2 및어떠한순차적인 ) 검출항체를포획항체 / 분석물 ( 또는이의단편 ) 복합체와접촉시키는경우, 상기한바와유사한조건들하의배양기간은 ( 제1 또는다수의 ) 포획항체 / 분석물 ( 또는이의단편 )/( 제2 또는다수의 ) 검출항체복합체의형성에필요하다. 바람직하게는, 적어도하나의검출항체는검출가능한표지를함유한다. 검출가능한표지는적어도하나의검출항체 ( 예를들면, 제2 검출항체 ) 에 ( 제1 또는다수의 ) 포획항체 / 분석물 ( 또는이의단편 )/( 제2 또는다수의 ) 검출항체복합체의형성전에, 동시에, 또는후에결합될수있다. 당해분야에공지된어떠한검출가능한표지도사용될수있다 [Polak and Van Noorden (1997) and Haugland (1996) 참조문헌을포함하는, 상기논의참조 ). 검출가능한표지는항체에직접또는커플링제를통해결합될수있다. 사용될수있는커플링제의예는 EDAC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 ) 카르보디이미드, 하이드로클로라이드 ) 이며, 이는미주리주세인트루이스소재의시그마-알드리히 (Sigma-Aldrich) 로부터시판된다. 사용될수있는다른커플링제는당해분야에공지되어있다. 항체에검출가능한표지를결합시키는방법은당해분야에공지되어있다. 또한, CPSP-아크리디늄에스테르 ( 즉, 9-[N-토실-N-(3-카복실프로필 )]-10-(3-설포프로필) 아크리디늄카복사미드 ) 또는 SPSP-아크리디늄에스테르 ( 즉, N10-(3-설포프로필 )-N-(3-설포프로필)-아크리디늄-9- 카복사미드 ) 에대한검출가능한표지의커플링을촉진시키는말단그룹을이미함유하는많은검출가능한표지는시판되거나합성될수있다. ( 제1 또는다수의 ) 포획항체 / 분석물 /( 제2 또는다수의 ) 검출항체복합체는표지의정량화전에시험시료의나머지로부터분리될수있지만분리해야만하는것은아니다. 예를들면, 적어도하나의포획항체 ( 예를들면, 제1의포획항체 ) 가웰또는비드와같은고체지지체에결합된경우, 분리는고체지지체와의접촉으로부터 ( 시험시료의 ) 유액을제거함으로써달성할수있다. 대안적으로, 적어도제1 포획항체가고체지지체에결합된경우, 이를분석물-함유시료및적어도하나의제2 검출항체와동시에접촉시켜제1 ( 다수의 ) 항체 / 분석물 / 제2 ( 다수의 ) 항체복합체를형성시킨후, 고체지지체와접촉시켜유액 ( 시험시료 ) 을제거한다. 적어도하나의제1의포획항체가고체지지체에결합하지않은경우, ( 제1 또는다수의 ) 포획항체 / 분석물 /( 제2 또는다수의 ) 검출항체복합체를표지의양의정량화하기위해시험시료로부터제거하여야하는것은아니다. 표지된포획항체 / 분석물 / 검출항체복합체 ( 예를들면, 제1의포획항체 / 분석물 / 제2 검출항체복합체 ) 가형성된후, 복합체내표지의양을당해분야에공지된기술을사용하여정량화한다. 예를들면, 효소표지를사용하는경우, 표지된복합체를색상의개발과같은정량화가능한반응을제공하는표지에대한기질과반응시킨다. 표지가방사활성표지인경우, 표지는적절한수단, 예를들면, 신틸레이션계수기를사용하여정량화한다. 표지가형광성표지인경우, 표지는단색광 ( 이는 " 여기파장 (excitation wavelength)" 으로공지되어있다 ) 으로표지를자극시킴으로써정량화하고자극에대한반응시표지에의해방사되는다른색상 ( 이는 " 방사파장 " 으로공지되어있다 ) 을검출함으로써정량화한다. 표지가화학발광성표지인경우, 표지는가시적으로또는광도계, x-선필름, 고속사진필름, CCD 카메라등을사용하여방사된광을검출시킴으로써정량화한다. 복합체내표지의양이정량화되면, 시험시료내분석물또는이의단편의농도는공지된농도의분석물또는이의단편의일련희석물을사용하여생성된표준곡선을사용하는것과같이, 적절한수단으로측정한다. 분석물또는이의단편의일련희석물을사용하는것외에, 표준곡선을분광광도계에의해및당해분야에공지된다른기술에의해중량분석으로생성시킬수있다. ARCHITECT 분석기를사용하는화학발광성미세입자검사에서, 접합체희석물 ph는약 6.0 +/- 0.2일수있으며, 미세입자피복완충액은약실온 ( 예를들면, 약 17 내지약 27 ) 에서유지되어야하고, 미세입자피복완충액 ph는약 6.5 +/- 0.2이어야하고, 미세입자희석물 ph는약 7.8 +/- 0.2이어야한다. 고체는바람직

161 하게는약 0.2% 미만, 예를들면, 약 0.15% 미만, 약 0.14% 미만, 약 0.13% 미만, 약 0.12% 미만, 또는약 0.11% 미만, 예를들면, 약 0.10% 미만이다. [0615] [0616] [0617] [0618] [0619] FPIA는경쟁적결합면역검사원리를기반으로한다. 형광적으로표지된화합물은, 선형적으로편광화된광으로여기되는경우, 이의회전율에역으로비례하는편광도를갖는형광성을방사할것이다. 형광적으로표지된트레이서-항체복합체가선형으로편광화된광으로여기되는경우, 형광단은광이흡수된시간과광이방사된시간사이에서의회전으로부터구속된다. " 유리 " 트레이서화합물 ( 즉, 항체에결합하지않은화합물 ) 이선형으로편광된광에의해여기되는경우, 이의회전은경쟁적결합면역검사에서생산된상응하는트레이서-항체접합체보다훨씬더빠르다. FPIA는특별한취급및폐기가요구되는방사활성물질이없는만큼 RIA보다유리하다. 또한, FPIA는용이하고신속하게수행될수있는균질한검사가다. 상기측면에서, 시험시료속에서분석물 ( 또는이의단편 ) 의존재, 양, 또는농도를측정하는방법이제공된다. 당해방법은 (i) (i') 항체, 분석물에결합할수있는항체의단편, 분석물에결합할수있는항체의변이체, 분석물에결합할수있는항체의변이체의단편, 및분석물에결합할수있는 DVD-Ig( 또는이의단편, 변이체, 또는변이체의단편 ), 및 (ii') 적어도하나의검출가능한표지를사용하고, (ii) 대조군또는캘리브레이터내에서분석물 ( 또는이의단편 ) 의존재, 양또는농도의직접적또는간접적인지표로서생성된시그날에대해시험시료속에서분석물 ( 또는이의단편 ) 의존재, 양또는농도의직접적인또는간접적인지표로서의검출가능한표지에의해생성된시그날을비교함을포함하는검사에의해분석물 ( 또는이의단편 ) 에대해시험시료를검사함을포함한다. 캘리브레이터는임의로일련의캘리브레이터의부분이며, 여기서캘리브레이터각각은분석물의농도에의해다른캘리브레이터와는상이하다. 당해방법은 (i) 항체, 분석물에결합할수있는항체의단편, 분석물에결합할수있는항체의변이체, 분석물에결합할수있는항체의변이체의단편, 및분석물에결합할수있는 DVD-Ig( 또는이의단편, 변이체, 또는변이체의단편 ) 를접촉시켜제1의특이적인결합파트너 / 분석물 ( 또는이의단편 ) 복합체를형성시키고, (ii) 제1의특이적인결합파트너 / 분석물 ( 또는이의단편 ) 복합체를검출가능하게표지된항-분석물항체, 분석물에결합할수있는항-분석물항체의검출가능하게표지된단편, 분석물에결합할수있는항-분석물항체의검출가능하게표지된변이체, 분석물에결합할수있는항-분석물항체의변이체의검출가능하게표지된단편, 및검출가능하게표지된 DVD-Ig( 또는이의단편, 변이체, 또는변이체의단편 ) 으로이루어진그룹으로부터선택되는분석물 ( 또는이의단편 ) 에대한적어도하나의제2의특이적인결합파트너를접촉시켜서제1의특이적인결합파트너 / 분석물 ( 또는이의단편 )/ 제2의특이적인결합파트너복합체를형성시키는단계, 및 (iii) (ii) 에서형성된제1의특이적인결합파트너 / 분석물 ( 또는이의단편 )/ 제2의특이적인결합파트너복합체속의검출가능한표지에의해생성된시그날을검출하거나측정함으로써시험시료내분석물의존재, 양또는농도를측정하는단계를포함할수있다. 본원에기술된바와같은분석물 ( 또는이의단편 ) 에대한적어도하나의제1의특이적인결합파트너및 / 또는분석물 ( 또는이의단편 ) 에대한적어도하나의제2의특이적인결합파트너가 DVD-Ig ( 또는이의단편, 변이체, 또는변이체의단편 ) 인방법이바람직할수있다. 대안적으로, 당해방법은시험시료를항체, 분석물에결합할수있는항체의단편, 분석물에결합할수있는항체의변이체, 분석물에결합할수있는항체의변이체의단편, 및 DVD-Ig( 또는이의단편, 변이체, 또는변이체의단편 ) 로이루어진그룹으로부터선택되는 IL-1β 분석물 ( 또는이의단편 ) 에대한적어도하나의제1의특이적인결합파트너와동시에또는순차적으로어떠한순서로접촉시키고, 시험시료를, 적어도하나의제1의특이적인결합파트너에대한결합에대해분석물 ( 또는이의단편 ) 과경쟁할수있고제1의특이적인결합파트너에결합할수있는분석물의검출가능하게표지분석물, 제1의특이적인결합파트너에결합할수있는분석물의검출가능하게표지된단편, 제1의특이적인결합파트너에결합할수있는분석물의검출가능하게표지된변이체, 및제1의특이적인결합파트너에결합할수있는분석물의변이체의검출가능하게표지된단편으로이루어진그룹으로부터선택되는, 적어도하나의제2의특이적인결합파트너와접촉시킴을포함한다. 시험시료속에존재하는어떠한 IL-1β( 또는이의단편 ) 및적어도하나의제2의특이적인결합파트너는서로경쟁하여제1의특이적인결합파트너 / 분석물 ( 또는이의단편 ) 복합체및제1의특이적인결합파트너 / 제2의특이적인결합파트너복합체를각각형성한다. 당해방법은 (ii) 에서형성된제1의특이적인결합파트너 / 제2의특이적인결합파트너복합체에서검출가능한표지에의해생성된시그날을검출하거나측정함으로써시험시료속의분석물의존재, 양또는농도를측정함을추가로포함하며, 여기서형성된제1의특이적인결합파트너 / 제2의특이적인결합파트너복합체에서검출가능한표지에의해생성된시그날은시험시료속의분석물의양또는농도에역으로비례한다. 상기방법은, 시험시료가수득된환자의치료학적 / 예방학적치료의효능을진단하거나, 예후하거나, 평가함을

162 추가로포함할수있다. 당해방법이, 시험시료가수득된환자의치료학적 / 예방학적치료의효능을평가함을추가로포함하는경우, 당해방법은효능을개선시키기위해요구되는환자의치료학적 / 예방학적치료를변형시킴을임의로추가로포함한다. 당해방법은자동화된시스템또는반-자동화된시스템에서사용하기위해조정할수있다. [0620] [0621] [0622] [0623] [0624] [0625] [0626] 검사방법 ( 및이를위한키트 ) 과관련하여, 문헌에기술된바와같은항-분석물의생산을위한방법또는상업적으로이용가능한항-분석물항체를사용하는것이가능할수있다. 각종항체의시판공급원은산타크루즈바이로테크놀로지인크.(Santa Cruz Biotechnology Inc.( 캘리포니아주산타크루즈 ), 겐웨이바이오테크, 인크.(GenWay Biotech, Inc.)( 캘리포니아주샌디에고소재 ), 및알앤드디시스템즈 (R&D System)(RDS; 미네소타주미네아폴리스소재 ) 를포함하나, 이에한정되지않는다. 일반적으로, 예정된수준은, 예를들면, 질환또는질환의위험을검출하기위한분석물또는이의단편에대해시험시료를검사할때수득된결과를평가하기위해이에대해기준으로사용될수있다. 일반적으로, 이러한비교시, 예정된수준은특수검사를충분한횟수및적절한조건하에수행함으로써분석물존재, 양또는농도와질환, 장애또는병태의특수단계또는종점또는, 특수임상지표의연결또는연합이이루어질수있도록수행함으로써수득된다. 전형적으로, 예정된수준은참조대상체 ( 또는대상체들의집단 ) 의검사으로수득된다. 측정된분석물은이의단편, 이의분해생성물및 / 또는이의효소적분해생성물을포함할수있다. 특히, 질환진행및 / 또는치료를모니터링하기위해사용되는바와같은예정된수준과관련하여, 분석물또는이의단편의양또는농도는 " 변하지않거나 ", " 양호하거나 "( 또는 " 양호하게변경되거나 "), 또는 " 양호하지않은 "( 또는 " 양호하지않게변경된 ") 일수있다. " 상승된 " 또는 " 증가된 " 은, 전형적인또는정상의수준또는범위 ( 예를들면, 예정된수준 ) 보다높거나, 다른참조수준또는범위 ( 예를들면, 조기또는기본시료 ) 보다높은시험시료속에서의농도또는양을말한다. 용어 " 저하된 " 또는 " 감소된 " 은전형적인또는정상수준또는범위 ( 예를들면, 예정된수준 ) 보다낮거나, 다른참조수준또는범위 ( 예를들면, 조기또는기본시료 ) 보다낮은시험시료속에서의농도또는양을말한다. 용어 " 변경된 " 은전형적이거나정상인수준또는범위 ( 예를들면, 예정된수준 ) 보다, 또는다른참조수준또는범위 ( 예를들면, 조기또는기본시료 ) 보다변경된 ( 증가또는감소된 ) 시료속에서의양또는농도를말한다. 분석물에대한전형적이거나정상인수준또는범위는표준실시에따라정의된다. 일부예에서분석물의수준은매우낮을것이므로, 소위변경된수준또는변경은, 전형적인또는정상수준또는범위, 또는실험적오차또는시료변이에의해설명될수없는참조수준또는범위와비교하여어떠한전체적인변화가존재하는경우발생되는것으로고려될수있다. 따라서, 특수시료속에서측정된수준은소위정상대상체로부터의유사한시료속에서측정된수준또는수준의범위와비교될것이다. 이와관련하여, " 정상대상체 " 는예를들면, 검출가능한질환이없는개인이며, " 정상 "( 때때로 " 대조군 " 으로명명됨 ) 환자또는집단은예를들면, 각각검출가능한질환을나타내지않는것 ( 들 ) 이다. 또한, 분석물이사람집단의대부분에서고수준으로통상적으로발견되지않는것을고려하여, " 정상대조군 " 은, 실질적인검출가능한증가또는상승된분석물의양또는농도가없는개인으로고려될수있으며, " 정상 "( 때때로 " 대조군 " 으로명명됨 ) 환자또는집단은분석물의실질적으로검출가능한증가되거나상승된양또는농도를나타내지않는것 ( 들 ) 이다. " 명확하게정상인대상체 " 는, 분석물이아직평가되지않거나현재평가중인것이다. 분석물의수준은, 분석물이정상적으로검출가능하지않지만 ( 예를들어, 정상수준은 0이거나정상집단의약 25 내지약 75 퍼센트의범위내이다 ), 시험시료속에서검출되는경우, 및또한분석물이시험시료속에서정상수준보다높게존재하는경우 " 상승된 " 으로일컬어진다. 따라서, 특히, 교시내용은특수질환, 장애또는병태를갖거나, 가질위험이있는대상체에대해스크리닝하는방법을제공한다. 검사방법은또한다른마커등의검사를포함할수있다. 따라서, 본원에기술된방법은, 대상체가제공된질환, 장애또는병태를가지거나이것으로발전될위험이있는지를측정하기위해사용될수있다. 구체적으로, 이러한방법은 : (a) 대상체로부터의시험시료속에서 IL-1β( 또는이의단편 ) 의농도또는양을측정하는단계 ( 예를들면, 본원에기술된방법, 또는당해분야에공지된방법을사용 ); 및 (b) 단계 (a) 에서측정된 IL-1β( 또는이의단편 ) 의농도또는양을예정된수준과비교하는단계를포함할수있으며, 여기서단계 (a) 에서측정된분석물의농도또는양이예정된수준과관련하여양호한경우, 대상체는제공된질환, 장애또는병태를가지지않거나위험에있지않은것으로측정된다. 그러나, 단계 (a) 에서측정된 IL-1β의농도또는양이예정된수준과관련하여양호하지않은경우, 대상체는제공된질환, 장애또는병태를가지거나위험이있는것으로측정된다

163 [0627] [0628] [0629] [0630] [0631] [0632] [0633] [0634] [0635] 또한, 대상체에서질환의진행을모니터링하는방법이본원에제공된다. 최적으로, 당해방법은 : (a) 대상체로부터의시험시료속에서 IL-1β의양또는농도를측정하는단계 ; (b) 대상체로부터의말기시험시료속에서 IL-1β의양또는농도를측정하는단계 ; 및 (c) 단계 (b) 에서측정된분석물의농도또는양을단계 (a) 에서측정된 IL-1β의농도또는양과비교하는단계를포함하며, 여기서단계 (b) 에서측정된농도또는양이변화하지않거나단계 (a) 에서측정된 IL-1β의농도또는양과비교하여양호한경우, 대상체에서질환은지속되거나, 진행되거나악화되는것으로측정된다. 비교에의해, 단계 (b) 에서측정된 IL-1β의농도또는양이단계 (a) 에서측정된 IL-1β의농도또는양과비교시양호한경우, 대상체에서질환은중지되거나, 회복되거나개선된것으로측정된다. 임의로, 당해방법은단계 (b) 에서측정된 IL-1β 분석물의농도또는양을, 예를들면, 예정된수준과비교함을추가로포함한다. 또한, 임의로, 당해방법은, 당해비교가단계 (b) 에서측정된분석물의농도또는양이예를들면, 예정된수준과관련하여양호하지않게변경되는지를나타내는경우대상체를하나이상의약제학적조성물로일정한기간동안치료함을포함한다. 여전히또한, 당해방법은하나이상의약제학적조성물을사용한치료를제공받은대상체에서치료를모니터링하기위해사용될수있다. 구체적으로, 이러한방법은대상체에게하나이상의약제학적조성물을투여하기전에대상체로부터제1의시험시료를제공함을포함한다. 다음에, 대상체로부터의제1의시험시료에서 IL- 1β의농도또는양을측정한다 ( 예를들면, 본원에기술되거나당해분야에공지된방법을사용함 ). IL-1β의농도또는양을측정한후, 임의로 IL-1β의농도또는양을예정된수준과비교한다. 제1의시험시료속에서측정된 IL-1β의농도또는양이예정된수준보다낮은경우, 대상체를하나이상의약제학적조성물로치료하지않는다. 그러나, 제1의시험시료속에서측정된 IL-1β의농도또는양이예정된수준보다높은경우, 대상체는하나이상의약제학적조성물로일정기간동안치료된다. 대상체가하나이상의약제학적조성물로치료되는기간은당해분야의숙련가에의해결정될수있다 ( 예를들면, 당해기간은약 7일내지약 2년, 바람직하게는약 14일내지약 1년일수있다 ). 하나이상의약제학적조성물을사용한치료기간동안, 제2 및후속적인시험시료를이후에대상체로부터수득한다. 시험시료의수및상기시험시료가대상체로부터수득되는시기는중요하지않다. 예를들면, 제2 시험시료는대상체에게하나이상의약제학적조성물을최초투여한후 7일째에수득할수있었으며, 제3의시험시료는, 대상체가하나이상의약제학적조성물을최초투여받은후 2주째에수득할수있었고, 제4의시험시료는, 대상체가하나이상의약제학적조성물의최초투여후 3주째에수득할수있었으며, 제5의시험시료는, 대상체가하나이상의약제학적조성물을최초투여받은후 4주째에수득할수있었다. 각각의제2 또는후속적인시험시료를대상체로부터수득한후, 제2 또는후속적인시험시료속에서측정된 IL-1β 분석물의농도또는양을측정한다 ( 예를들면, 본원에기술되거나당해분야에공지된방법을사용함 ). 제2 및후속적인시험시료의각각에서측정된 IL-1β의농도또는양은제1 시험시료 ( 예를들면, 예정된수준에대해원래임의로비교된시험시료 ) 속에서측정된분석물의농도또는양과비교한다. 단계 (c) 에서측정된 IL-1β의농도또는양은, 단계 (a) 에서측정된분석물의농도또는양과비교하여양호한경우, 대상체에서질환은중지되거나, 회복되거나개선된것으로측정되며, 대상체는단계 (b) 의약제학적조성물중하나를지속적으로투여받아야한다. 그러나, 단계 (c) 에서측정된양또는농도가변하지않거나단계 (a) 에서측정된것으로서분석물의농도또는양과비교하여양호하지않은경우, 대상체에서질환은지속되거나, 진행되거나악화된것으로측정되며, 대상체는단계 (b) 에서대상체에게투여된하나이상의약제학적조성물의보다높은농도를사용하여치료되어야하거나대상체는단계 (b) 에서대상체에게투여된하나이상의약제학적조성물과는상이한하나이상의약제학적조성물로치료되어야한다. 구체적으로, 대상체는, 대상체가대상체의분석물수준을감소시키거나저하시키기위해이미제공받은하나이상의약제학적조성물과는상이한하나이상의약제학적조성물로치료될수있다. 일반적으로, 반복시험이수행될수있는 ( 예를들면, 질환진행및 / 또는치료에대한반응을모니터링하는 ) 검사를위해, 제2 또는후속적인시험시료를제1의시험시료가대상체로부터수득된후기간동안수득한다. 구체적으로, 대상체로부터의제2 시험시료는, 제1 시험시료가대상체로부터수득된후수분, 수시간, 수일, 수주또는수년동안수득될수있다. 예를들면, 제2 시험시료는, 대상체로부터제1의시험시료가수득된후, 대상체로부터약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 30분, 약 45분, 약 60분, 약 2시간, 약 3시간, 약 4 시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약

164 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18 시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23 시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 11주, 약 12주, 약 13주, 약 14주, 약 15주, 약 16주, 약 17주, 약 18주, 약 19주, 약 20주, 약 21주, 약 22주, 약 23주, 약 24주, 약 25주, 약 26주, 약 27주, 약 28주, 약 29주, 약 30주, 약 31주, 약 32주, 약 33주, 약 34주, 약 35주, 약 36주, 약 37주, 약 38주, 약 39주, 약 40주, 약 41주, 약 42주, 약 43주, 약 44주, 약 45주, 약 46주, 약 47주, 약 48주, 약 49주, 약 50주, 약 51주, 약 52주, 약 1.5년, 약 2년, 약 2.5년, 약 3.0년, 약 3.5년, 약 4.0년, 약 4.5년, 약 5.0년, 약 5.5. 년, 약 6.0년, 약 6.5년, 약 7.0년, 약 7.5년, 약 8.0년, 약 8.5년, 약 9.0년, 약 9.5년또는약 10.0년의기간에수득될수있다. [0636] [0637] [0638] [0639] [0640] 질환진행을모니터하는데사용된경우, 상기검사를사용하여급성상태로고생하는대상체에서질환의진행을모니터할수있다. 중환자상태로또한공지된급성상태는예를들면, 심혈관계또는분비계를포함하는급성의, 생명을위협하는질환또는다른위독한의학상태를말하다. 전형적으로, 중환자상태는병원을기반으로하는셋팅 ( 응급실, 중환자실, 외상센터, 또는다른응급환자셋팅 ) 에서급성의의학적중재또는긴급의료원또는다른분야를기반으로하는의료인에의한투여를필요로하는상태를말한다. 중환자상태의경우, 반복된모니터링은일반적으로보다짧은기간, 즉, 수분, 수시간또는수일 ( 예를들면, 약 1분, 약 5분, 약 10 분, 약 15분, 약 30분, 약 45분, 약 60분, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일또는약 7일 ) 내에수행되며, 초기검사는마찬가지로일반적으로보다짧은기간, 예를들면, 질환또는병태의발병의약수분, 수시간또는수일내에수행된다. 검사는또한만성또는비-급성상태로고생하는대상체에서질환의진행을모니터링하는데사용될수있다. 비-중환자또는, 비-급성병태는, 예를들면, 심혈관계및 / 또는분비계를포함하는급성의, 생명을위협하는질환또는다른중환자의학병태이외의병태를말한다. 전형적으로, 비-급성상태는보다긴-기간또는만성기간의것을포함한다. 비-급성상태의경우, 반복된모니터링이일반적으로보다긴기간, 예를들면, 수시간, 수일, 수주, 수개월또는수년 ( 예를들면, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 11주, 약 12주, 약 13주, 약 14주, 약 15주, 약 16주, 약 17주, 약 18주, 약 19주, 약 20주, 약 21주, 약 22주, 약 23주, 약 24주, 약 25주, 약 26주, 약 27주, 약 28주, 약 29주, 약 30주, 약 31주, 약 32주, 약 33주, 약 34주, 약 35주, 약 36주, 약 37주, 약 38주, 약 39주, 약 40주, 약 41주, 약 42주, 약 43주, 약 44주, 약 45주, 약 46주, 약 47주, 약 48주, 약 49주, 약 50주, 약 51주, 약 52주, 약 1.5년, 약 2 년, 약 2.5년, 약 3.0년, 약 3.5년, 약 4.0년, 약 4.5년, 약 5.0년, 약 5.5. 년, 약 6.0년, 약 6.5년, 약 7.0년, 약 7.5년, 약 8.0년, 약 8.5년, 약 9.0년, 약 9.5년또는약 10.0년 ) 으로수행되며, 초기검사는마찬가지로일반적으로보다긴기간, 예를들면, 질환또는병태의발병의약수시간, 수일, 수개월또는수년내에수행된다. 또한, 상기검사는, 대상체로부터수득된제1의시험시료를사용하여수행될수있으며, 여기서제1의시험시료는뇨, 혈청또는혈장과같은하나의공급원으로부터수득된다. 임의로, 상기검사는이후에대상체로부터수득된제2의시험시료를사용하여반복할수있으며, 여기서제2의시험시료는다른공급원으로부터수득된다. 예를들면, 제1의시험시료가뇨로부터수득된경우, 제2의시험시료를혈청또는혈장으로부터수득할수있다. 제1의시험시료및제2의시험시료를사용하는검사으로부터수득된결과를비교할수있다. 비교는대상체에서질환또는병태의상을평가하는데사용될수있다. 또한, 본교시내용은또한제공된질환, 장애또는병태에걸리기쉽거나이로고생하는대상체가치료로부터유리할지를측정하는방법에관한것이다. 특히, 본교시내용은동반진단방법및생성물을분석하는것에관한것이다. 따라서, 본원에기술된 " 대상체에서질환의치료를모니터링하는 " 방법은임의로또한치료요법에대해후보물을선택하거나확인함을포함할수있다. 따라서, 특수양태에서, 본교시내용은, 제공된질환, 장애또는병태를가지거나, 이러한위험에있는대상체가치료요법에대한후보물인지를측정하는방법을제공한다. 일반적으로, 대상체는제공된질환, 장애또는병태의일부증상을경험하거나실제로제공된질환, 장애또는병태를가지거나가질위험이있는대상체, 및 /

165 또는본원에기술된것으로서, 분석물의양호하지않은농도또는양, 또는이의단편을증명하는대상체이다. [0641] [0642] [0643] 당해방법은임의로, 본원에기술된바와같은검사를포함하며, 여기서 IL-1β는하나이상의약제학적조성물 ( 예를들면, 특히분석물을포함하는작용메커니즘과관련된약제를사용 ), 면역억제치료요법, 또는면역흡착치료요법을사용한치료전및후에평가하거나, 분석물을이러한치료후평가하고분석물의농도또는양을예정된수준에대해비교한다. 치료후관찰된 IL-1β의양의양호하지않은농도는추가의또는지속된치료를제공받는것으로부터유리하지않을것이며, 반면치료후관찰된분석물의양호한농도또는양은, 대상체가추가의또는지속된치료를제공받는것으로부터유리할것이라는것을확인해준다. 이러한확인은임상연구의관리, 및개선된환자보호의제공등을보조한다. 본원의특정양태들이본원에논의된바와같은제공된질환, 장애또는병태를평가하기위해사용된경우유리한반면, 검사및키트를사용하여다른질병, 질환및상태에서분석물을평가하기위해사용될수있음은두말할나위없다. 검사방법은또한다른표적등의검사를포함할수있다. 검사방법을또한사용하여제공된질환, 장애또는병태를완화시키는화합물을확인할수있다. 예를들면, 분석물을발현하는세포를후보물화합물과접촉시킬수있다. 화합물과접촉된세포내분석물의발현수준은본원에기술된검사방법을사용하여대조군세포내에서의것과비교할수있다. [0644] [0645] [0646] [0647] [0648] II. 키트시험시료속에서분석물 ( 또는이의단편 ) 의존재, 양또는농도에대해시험시료를검사하기위한키트가또한제공된다. 당해키트는시험시료를 IL-1β( 또는이의단편 ) 에대해검사하기위한적어도하나의성분및시험시료를분석물 ( 또는이의단편 ) 에대해검사하기위한지시사항을포함한다. 시험시료를분석물 ( 또는이의단편 ) 에대해검사하기위한적어도하나의성분은본원에기술되고고체상에임의로고정된, 항-IL-1β 결합단백질, 예를들면, 단클론항체또는 DVD-Ig( 또는이의단편, 변이체, 또는변이체의단편 ) 을포함할수있다. 키트는면역검사, 예를들면, 화학발광성미세입자면역검사에의해 IL-1β분석물에대해시험시료를검사하기위한적어도하나의성분, 및면역검사, 예를들면, 화학발광성미세입자면역검사에의해 IL-1β 분석물에대해시험시료를검사하기위한지시사항을포함한다. 예를들면, 당해키트는 L-1β에대한적어도하나의특이적인결합파트너, 예를들면, 항-IL-1β단클론 / 다클론항체 ( 또는 IL-1β에결합할수있는이의단편, 분석물에결합할수있는이의변이체, 또는분석물에결합할수있는변이체의단편 ) 또는항-IL-1βDVD-Ig ( 또는이의단편, 변이체, 또는변이체의단편 ) 를포함할수있으며, 이들중어느것도검출가능하게표지될수있다. 대안적으로또는추가로, 키트는시험시료속에서, 각각이고체지지체상에고정될수있는, 항-분석물단클론 / 다클론항체 ( 또는분석물에결합할수있는이의단편, 분석물에결합할수있는이의변이체, 또는분석물에결합할수있는변이체의단편 ) 또는항-분석물 DVD-Ig( 또는이의단편, 변이체, 또는변이체의단편 ) 에대한결합에대해시험시료속에서어떠한분석물과경쟁할수있는, IL-1β 분석물 ( 또는항-분석물, 단클론 / 다클론항체또는항-분석물 DVD-Ig( 또는이의단편, 변이체, 또는변이체의단편 ) 에결합할수있는이의단편 )) 을포함할수있다. 키트는교정기또는대조군, 예를들면, 분리되거나정제된분석물을포함할수있다. 키트는검사를수행하기위한적어도하나의용기 ( 예를들면, 제1의특이적인결합파트너로이미피복될수있는튜브, 미세역가플레이트또는스트립 ), 및 / 또는검사완충액또는세척완충액과같은완충액을포함할수있으며, 완충액중하나는농축용액, 검출가능한표지 ( 예를들면, 효소표지 ) 에대한기질용액, 또는정지용액으로제공될수있다. 바람직하게는, 키트는검사를수행하는데필수적인모든성분, 즉, 시약, 표준물, 완충액, 희석액등을포함한다. 지시사항은디스크, CD, DVD 등과같은컴퓨터-판독가능한형태또는종이형태일수있다. 항-IL-1β 결합단백질또는항-분석물 DVD-Ig와같은어떠한결합단백질, 또는트레이서도형광단, 방사활성모이어티, 효소, 바이오틴 / 아비딘표지, 발색단, 화학발광성표지등과같이, 본원에기술된바와같은, 검출가능한표지를혼입시킬수있거나, 키트는검출가능한표지화를수행하기위한시약을포함할수있다. 항체, 교정기및 / 또는대조군은별도의용기내에제공되거나적절한검사양식, 예를들면, 미세역가플레이트내로예비분산시킬수있다. 임의로, 키트는품질조절성분 ( 예를들면, 민감성패널, 교정기, 및양성대조군 ) 을포함한다. 품질조절시약의제조는당해분야에잘공지되어있으며각종면역진단제품을위한삽입쉬이트에기술되어있다. 민감성패널구성원은임의로검사수행특성을확립하기위해사용되며, 추가로면역검사키트시약의완전성, 및

166 검사의표준화의유용한지표이다. [0649] [0650] [0651] [0652] [0653] 키트는또한진단검사를수행하거나완충액, 염, 효소, 효소보조-인자, 효소기질, 검출시약등과같은품질조절평가를촉진하는데요구되는다른시약을임의로포함할수있다. 완충액및시험시료의분리및 / 또는처리를위한용액 ( 예를들면, 예비처리시약 ) 과같은다른성분을또한키트에포함시킬수있다. 키트는임의로하나이상의다른대조군을포함한다. 키트의성분중하나이상은동결건조시킬수있으며, 이경우키트는동결건조된성분의재구성에적합한시약을추가로포함할수있다. 키트의각종성분들이필요에따라적합한용기, 예를들면, 미세역가플레이트속에제공된다. 키트는또한시료를유지시키거나저장하기위한용기 ( 예를들면, 뇨시료용용기또는카트릿지 ) 를추가로포함할수있다. 경우에따라, 키트는또한반응용기, 혼합용기, 및시약또는시험시료의제조를촉진시키는다른성분을함유할수있다. 키트는또한시험시료를수득하는것을보조하기위한하나이상의장치, 예를들면, 주사기, 피펫, 포셉 (forcep), 계량스푼등을포함할수있다. 검출가능한표지가적어도하나의아크리디늄화합물인경우, 키트는적어도하나의아크리디늄-9-카복스아미드, 적어도하나의아크리디늄-9-카복실레이트아릴에스테르, 또는이의어떠한조합도포함할수있다. 검출가능한표지가적어도하나의아크리디늄화합물인경우, 키트는또한완충액, 용액, 및 / 또는적어도하나의염기성용액과같은과산화수소의공급원을포함할수있다. 목적하는경우, 키트는자기입자, 비드, 시험튜브, 미세역가플레이트, 큐베트, 막, 스캐폴딩분자, 필름, 여과지, 디스크또는칩과같은, 고체상을함유할수있다. III. 키트및방법의채택키트 ( 또는이의성분 ), 및또한본원에기술된바와같은면역검사와같은, 검사에의해시험시료속에서분석물의존재, 양또는농도를측정하는방법은예를들면, 미국특허공보제5,089,424호및제5,006,309호에기 술되고, 예를들면, 애보트래보러토리즈 ( 일리노이주애보트파크소재 ) 에의해 ARCHITECT 로서상업적으로시 판되는바와같은다양한자동화된및반 - 자동화된시스템 ( 고체상이미세입자를포함하는것들을포함 ) 에서사 용하기위해채택될수있다. [0654] 비-자동화된시스템 ( 예를들면, ELISA) 와비교한것으로서자동화된또는반-자동화된시스템사이의차이점들중일부는제1의특이적인결합파트너 [ 예를들면, 항-분석물, 단클론 / 다클론항체 ( 또는이의단편, 이의변이체, 또는이의변이체의단편 ) 또는항-분석물 DVD-Ig( 또는이의단편, 이의변이체, 또는이의변이체의단편 ) 가부착되고 ; 어떠한방식으로도, 샌드위치형성및분석물반응성은영향받을수있다 ], 및포획, 검출및 / 또는어떠한임의의세척단계의길이및시기를포함한다. ELISA와같은비-자동화된양식은시료및포획시약을사용한비교적보다긴항온처리시간 ( 예를들면, 약 2시간 ) 을필요로할수있는반면, 자동화되거나반- 자동화된양식 ( 예를들면, ARCHITECT, 제조원 : 애보트래보러토리즈 ) 은비교적짧은항온처리시간 ( 예를들면, ARCHITECT 의경우대략 18분 ) 을가질수있다. 유사하게, ELISA와같은비-자동화된양식은접합체시약과같은검출항체를비교적보다긴항온처리시간 ( 예를들면, 약 2시간 ) 동안항온처리할수있는반면, 자동화되거나반-자동화된양식 ( 예를들면, ARCHITECT ) 는비교적보다짧은항온처리시간 ( 예를들면, ARCHITECT 의경우대략 4분 ) 을가질수있다. [0655] 애보트래보러토리즈로부터이용가능한다른플랫포옴은 AxSYM, IMx ( 참조 : 예를들면, 미국특허공보제 5,294,404호 ), PRISM, EIA( 비드 ), 및 Quantum II, 및또한다른플랫포옴을포함하나, 이에한정되지않는다. 또한, 검사, 키트및키트성분은다른양식, 예를들면, 전기화학적또는다른수동 ((hand-held) 또는현장-현시 (point-of-care) 검사시스템에서다른양식으로사용될수있다. 본교시내용은예를들면, 샌드위치면역검사를수행하는시판되는애포트포인트오브케어 (Abbott Point of Care)(i-STAT, 제조원 : 애보트래보러토리즈 ) 전기화학적면역검사시스템에적용가능하다. 면역센서및 1회용시험장치에서이들의제조및작동방법은예를들면, 미국특허공보제5,063,081호, US 공개공보제2003/ 호, US 공개공보제 2004/ 호, US 공개공보제2005/ 호, 및 US 공개공보제2006/ 호에기술되어있다. [0656] 특히, I-STAT 시스템에대한분석물검사의채택과관련하여, 다음구조가바람직하다. 미세제작된규소칩을금전류작업전극및은-염화은참조전극의쌍으로제작한다. 작업전극들중하나위에, 고정된항-분석물, 단클론 / 다클론항체 ( 또는이의단편, 변이체, 또는변이체의단편 ) 또는항-분석물 DVD-Ig( 또는이의단편, 이

167 의변이체, 또는이의변이체의단편 ) 을지닌폴리스티렌비드 (0.2mm 직경 ) 를전극위에패턴화된폴리비닐알코올의중합체피복물에부착시킨다. 당해칩을면역검사에적합한유동성양식을지닌 I-STAT 카트릿지로조립한다. 카트릿지의시료-보유챔버의벽의부위에는, 각각검출가능하게표지된, 분석물에대한특이적인결합파트너, 예를들면, 항-분석물, 단클론 / 다클론항체 ( 또는이의단편, 이의변이체, 또는분석물에결합할수있는이의변이체의단편 ) 또는항-분석물 DVD-Ig( 또는이의단편, 이의변이체, 또는분석물에결합할수있는이의변이체의단편 ) 을포함하는층이존재한다. 카트릿지의유액주머니내에는 p-아미노페놀포스페이트를포함하는수성시약이있다. [0657] [0658] 작동시, 분석물을함유하는것으로추정된시료를시험카트릿지의보유체임버 (chamber) 에가하고, 카트릿지를 I-STAT 판독기내로삽입한다. 분석물에대한특이적인결합파트너를시료내로용해한후, 카트릿지내펌프성분은시료를칩을함유하는도관내로진행시킨다. 여기에서, 이는진동하여샌드위치의형성을촉진한다. 검사의끝에서두번째단계에서, 유액을주머니밖으로및도관내로진행시켜시료가칩에서폐기체임버내로세척제거되도록한다. 검사의최종단계에서, 알칼리성포스파타제표지는 p-아미노페놀포스페이트와반응시켜포스페이트그룹을절단시키고유리된 p-아미노페놀이작업전극에서전기화학적으로산화되도록한다. 측정된전류를기반으로하여, 판독자는내장형알고리즘및공장-측정된교정기곡선을이용하여시료속에서분석물의양을계산한다. 본원에기술된방법및키트가면역검사를수행하기위한다른시약및방법을필수적으로포함하는것은또한두말할나위없다. 예를들면, 당해분야에공지된바와같고 / 같거나용이하게제조되거나최적화되어사용될수있는, 예를들면, 세척용, 접합체희석액, 미세입자희석액및 / 또는교정기희석액으로서다양한완충액이포함된다. 예시적인접합체완충액은특정의키트 ( 일리노이주애보트파크에소재하는애보트래보러토리즈 ) 에사용되고 2-(N-모르폴리노 ) 에탄설폰산 (MES), 염, 단백질차단제, 항미생물제, 및세제를함유하는 ARCHITECT 접합체희석액이다. 예시적인교정기희석액은특정의키트 ( 제조원 : 애보트래보러토리즈, 일리노이주애보트 파크소재 ) 에사용되고 MES, 다른염, 단백질차단제, 및항미생물제를함유하는 ARCHITECT 사람교정기희석액이다. 또한, 미국출원번호제12/650,241호 (US 공개공보제2010/ 호 ; 또한 PCT 공보제WO 2010/078443호참조 ) 에기술된바와같이, 개선된시그날생성이, 예를들면, I-Stat 카트릿지양식에서, 시그날증폭인자로서시그날항체에연결된핵산서열을사용하여수득될수있다. [0659] [0660] 본원에기술된본발명의다른적합한변형및채택이명백하며본발명의영역또는본원에기재된양태에서벗어남이없이적합한등량체를사용하여이룰수있음은당해분야의숙련가에게용이하게명백할것이다. 지금까지, 본발명을상세히기술하였고다음실시예들을참조로보다명확하게이해될것이며, 이는본발명을설명할목적으로만포함되고본발명을한정하는것으로의도되지않는다. [0661] [0662] [0663] 실시예실시예 1: 클론 E26으로부터의친화성-성숙된사람화된 IL-1β항체의생성표 6은사람화된마우스 E26 항체 [ 제조원 : 글락소스미쓰클라인 (GlaxoSmithKline), PCT 공보제WO 95/01997 호 ] 의 VH 및 VL의아미노산서열을제공한다. 각각의 VH 및 VL 서열의개개 CDR의아미노산잔기는굵은글씨체로나타낸다

168 표 6 [0664] [0665] [0666] 친화성성숙된사람화된마우스 E26 항체를다음과같이수득하였다. 하나의경쇄라이브러리를다음잔기에서제한된돌연변이유발을함유하도록작제하였다 : CDRL1: 30, 31, 32; CDRL2: 50, 53, 55, 56; CDRL3: 92, 93, 94, 96, 및 97 ( 카밧번호매김 ). 2개의중쇄라이브러리를제조하여 31, 33, 50, 52a, 55, 56, 57, 58, 및 60( 카밧번호매김 ) 번잔기에서 CDRH1 및 CDRH2내에또는 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100a, 100b, 및 102번잔기에서 CDRH3내에제한된돌연변이유발을함유하도록하였다. 중쇄라이브러리는또한 23(A/S), 24(A/S), 62(T/S), 84(P/A), 88(G/A), 91(F/Y), 및 108(P/L) 잔기에서이원다양성을함유함으로써라이브러리선택동안골격배선-라이닝 (framework germ-lining) 이허용되도록하였다. 모든 3개의라이브러리는사이노몰구스 (cyno) IL-1β의농도를감소시킴으로써별도로선택하였다. 이후에, 모든돌연변이된 CDR 서열을 VH CDR에서만돌연변이를갖는하나의라이브러리내및모든 6개의 CDR내돌연변이를갖는다른라이브러리내로합하였다. 이들 2개의합해진라이브러리를보다엄격한선택조건에사람및 cyno IL-1β와함께, 개개항체를확인하고추가의특성화를위해 IgG 단백질로서발현시키기전에적용시켰다. 표 7은사람화된 E26으로부터기원한친화성성숙된 IL-1β항체의 VH 영역의아미노산서열의목록을제공한다. 각각의 VH 서열의개개 CDR의아미노산잔기는굵은글씨체로나타낸다

169 표 7 [0667]

170 [0668]

171 [0669]

172 [0670]

173 [0671] [0672] [0673] 표 8은 E26으로부터기원한친화성성숙된사람화된 IL-1β항체의 VL 영역의아미노산서열의목록을제공한다. 각각의 VL 서열의개개 CDR의아미노산잔기는굵은글씨체로나타낸다. 하기표 8에서친화성성숙된 VL 서열중일부에서관찰된 N-말단 D (Asp) 에서 G (Gly) 로의돌연변이는라이브러리작제동안수행된폴리머라제쇄반응 (PCR) 동안발생된의도되지않은돌연변이유발의대부분의유사한결과이었다. N-말단 G 잔기는, 이들영역이 IgG 분자의작제시사용된경우결과없이제거될수있었다

174 표 8 [0674] [0675]

175 [0676] [0677] 상기표에서사람화된 E26 으로부터의친화성성숙된 IL-1β 항체의 VH 및 VL 영역의개개 CDR 의서열을정렬하여 표 9 에서의것들과같은컨센서스 CDR 서열을제공할수있다

176 표 9 [0678] [0679] 표 10 에서서열은추가의특성화를위해 IgG 로전환시켰다. 클론 E26.13 을각각 E26.13 JM VH 및 E26.13 JM VL 로불리는가변중쇄및경쇄의 J- 영역내에서돌연변이시켜비 - 배선골격돌연변이를제거하였다. 개개의 CDR 의아미노산잔기를굵은글씨체로나타낸다

177 표 10 [0680]

178 [0681]

179 [0682]

180 [0683]

181 [0684]

182 [0685] [0686] [0687] [0688] 실시예 2: IL-1β항체의기능적특성화실시예 2.1: IL-1β 효소-결합된면역흡착검사프로토콜항-IL-1β mab가사람 IL-1β에결합하는지를측정하기위해, ELISA 플레이트 [Nunc, MaxiSorp, 제조원 : 로체스터 (Rochester), 뉴욕소재 ] 를 4 에서피어스피복물완충액속에희석된항-사람 Fc 항체와함께 2μg /ml[ 제조원 : 잭슨임뮤노리서치 (Jackson Immunoresearch), 펜실바이아주웨스트그로브소재 ] 에서밤새항온처리하였다. 플레이트를세척완충액 (0.05% 트윈 20을함유하는 PBS) 속에서 5회세척하고, 1시간동안 25 에서슈퍼블록차단완충액 (superblock blocking buffer)[ 제조원 : 써모사이언티픽 (Thermo scientific), No ] 의웰당 200 μl를사용하여차단하였다. 차단완충액은플레이트를탭핑 (tapping) 하여제거하고, 10% 슈퍼블록, 0.5% 트윈-20을함유하는 PBS 속에서 2 μg/ml의각각의항체를 100 μl/ 웰에서웰에가하고 25 에서 1시간동안항온처리하였다. 웰을 1X PBST 속에서 5회세척하고, 1 μg/ml의바이오티닐화된항원을 1:6의일련희석 (10% 슈프블록, 0.05% 트윈 20을함유하는 PBS 속에서μg내지 pg 범위에대해 ) 으로적정 (titrating) 하였다. 이후에, 항원의각각의희석물을플레이트에가하고 1시간동안 25 에서항온처리하였다. 1XPBST 속에서 5회세척하고, 폴리HRP 스트렙타비딘 (KPL No , 메릴랜드주게이터스부르크소재 ) 과함께 25 에서 1시간동안항온처리하였다. 상기웰을 1XPBST 속에서 5회세척하고, 100μl의 ULTRA-TMB ELISA[ 제조원 : 피어스, 일리노이주록포드소재 ) 를웰당가하였다. 발색 (color development) 후반응을 1N HCL로중지시키고 450 nm에서흡광도를측정하였다. 결과는표 11에나타내며, 수치는사람 IL-1β에대한항-IL-1β 항체의결합을나타낸다

183 표 11 [0689] [0690] [0691] 실시예 2.2: IL-1β 항체의중화효능본발명에서항-사람 IL-1β 항체의기능적활성을시험하기위해, 항체를 IL-1β 활성을억제하는항체의능력을측정하는 MRC-5 검사에서사용하였다. MRC-5 세포주는용량-의존적방식으로사람 IL-1β에대한반응시 IL-8을생산하는사람폐섬유모세포주이다. 당해세포주는또한사이노몰구스 IL-1β(cyno IL-1β) 에대한반응시 IL-8을생산한다. MRC-5 세포는원래 ATCC로부터수득하였으며 10% FBS 완전 MEM 속에서아배양 (subculturing) 하고 37 로 5% CO 2 항온처리기속에서성장시켰다. IL-1β에대한항체의중화효능을측정하 기위해, 항체 (50 μl) 를 96 웰플레이트 (1E-7 내지 1E-15 M의최종농도범위 ) 에가하고 50μl의사람또는 cyno IL-1β(50 pg/ml의최종농도 ) 와함께 1시간동안 37, 5% CO 2 에서예비-항온처리하였다. 이후에, 항원항체복합체 (100μl) 를 MRC-5 세포 (1E5/ml의농도에서 100μl의세포 / 웰로 24시간전에플레이팅함 ) 에가하였다. 검사플레이트를밤새 37 에서 5% CO 2 항온처리기속에서항온처리하였다. 항체효능은 IL-8 생산을억제하는이의능력으로측정하였다. 사람 IL-8 생산은화학발광성-계검사으로측정하였다. 표 12는사람및 cyno IL-1β에대한항체효능을요약한다. 표 12 [0692] [0693] [0694] 실시예 2.3: 표면플라스몬공명에의한 IL-1β 항체의친화성측정 BIACORE 검사 ( 제조원 : 비아코어, 인크, 뉴저지주피스카타웨이 ) 는온-속도및오프-속도상수의역학적측정으로항체의친화성을측정한다. 재조합체정제된사람 IL-1β 및사이노몰구스 IL-1β에대한항체의결합은표면플라스몬공명-계측정에의해 Biacore 3000 장치 (Biacore AB, 스웨덴웁살라소재 ) 로이동하는 HBS- EP(10 mm HEPES [ph 7.4], 150 mm NaCl, 3 mm EDTA, 및 0.005% 표면활성제 P20) 를사용하여 25 에서측정하였 다. 모든화학물질을 Biacore AB( 스웨덴웁살라소재 ) 로부터또는기타의경우본원에기술된바와같은상이한공급원으로부터수득하였다. 10 mm 아세트산나트륨 (ph 4.5) 중에희석된대략 5000 RU의염소항-마우스 IgG, (Fcg), 단편특이적인다클론항체 [ 제조원 : 피어스바이오테크놀로지인크.(Pierce Biotechnology Inc.), 일리노이주록포드소재 ] 를제조업자의설명서및공정에따라 25 μg/ml에서표준아민커플링키트를사용하여 CM5 연구등급바이오센서칩을따라직접고정시켰다. 바이오센서표면에서반응하지않은모이어티를에탄올아민으로차단시켰다. 플로우셀 (flowcell) 2 및 4에서변형된카복시메틸덱스트란표면을반응표면으로서사용하였다. 플로우셀 1 및 3에서염소항-마우스 IgG가없는변형되지않은카복시메틸덱스트란을참조표면으로사용하였다. 역학적분석을위해, 1:1 랑뮈르결합모델 (Langmuir binding model) 로부터기원한속도

184 방정식을 Biaevaluation 소프트웨어를사용하여모든 8개의주입의연합및해리상에대해동시에핏팅하였다 [ 세계핏트분석 (global fit analysis) 사용 ]. 정제된항체를염소항-사람 IgG 특이적인반응표면을따라포획에대해 HEPES-완충된염수속에서희석시켰다. 리간드로서포획될항체 (25 μg/ml) 를반응매트릭스위에 5 μl/ 분의유동속도 (flow rate) 에서주입하였다. 연합및해리속도상수, k on ( 단위 M -1 s -1 ) 및 k off ( 단위 s -1 ) 를 25 μl/ 분의연속된유동속도하에측정하였다. 속도상수는 10 내지 200 nm 범위의 10개의상이한항원농도에서역학적결합측정을수행함으로써유도하였다. 이후에, 항체와표적항원사이의반응의평형해리상수 ( 단위 M) 를다음식 : K D = k off /k on 에의해역학적속도상수로부터계산하였다. 결합을시간의함수로 기록하고역학적속도상수를계산한다. 당해검사에서, 10 6 M -1 s -1 와같이빠른온 - 속도및 10-6 오프 - 속도를측정할수있다. 표 13 은사람항 -IL-1β 항체에대한친화성측정을나타낸다. s -1 와같이느린 표 13 [0695] [0696] 실시예 3: IL-1α/β DVD-Ig TM 분자의생성 [0697] [0698] 실시예 3.1: IL-1α/β DVD-Ig DNA 작제물의작제항-IL-1α 항체 ("X3"; 참조 : PCT 공보제WO 95/14780호 ) 가변도메인을다수 IL-1β 항체가변도메인과 DVD- Ig 양식 [ 참조 : Wu et al., Nature Biotechnol., 25: (2007); PCT 공보제WO 2007/ A2호 ] 내로개입링커 DNA 서열을사용한오버랩핑 PCR 증폭에의해합하였다. X3은또한각각 X3 JM VH 및 X3 JM VL로명명되는가변중쇄및경쇄영역의 J-영역내에서돌연변이시켜, 비-배선골격돌연변이를제거하였다. 증폭된 PCR 생성물을 HEK293 세포내에서일시적인발현에적합한발현벡터내로서브클로닝 (subcloning) 하고개방판독프레임영역을 DVD-Ig 발현전에서열분석으로확인하였다. [0699] [0700] 실시예 3.2: IL-1α/β DVD-Ig 결합단백질의발현및생산 DNA 서열확인후, 모든 DVD-Ig DNA 작제물을이. 콜라이속에서증식시키고 DNA 를퀴아젠하이스피드맥시프 렙 (Qiagen Hispeed Maxi Prep)( 제품번호 12662, QIAGEN) 을사용하여정제하였다. DVD-Ig DNA 를로그상 (log phase) 293E 세포 (0.5 x10 6 /ml, 생존능 >95%) 내로 PEI 및 DNA를 0.2 μg/ml 중쇄 DNA 및 0.3 μg/ml 경쇄 DNA 와 2:1의비로혼합하여형질감염시켰다. DNA:PEI 복합체를실온에서 TC 후드 (hood) 속에서 15분동안형성시킨후 293E 세포에가하였다. 24 후, 0.5% TN1을 293E 세포에가하였다. 5일째에, 상층액을사람 IgG1 역가측정을위해수집하였다. 세포상층액을 7일째에수집하고 0.2 μm PES 여과기를통해여과하였다. 상층액을단백질 A 세파로즈친화성크로마토그래피를사용함으로써제조업자의설명서에따라정제하였다. 정제된 DVD- Ig를 0.1 M 글리신 (ph 2.99) 에의해컬럼으로부터용출제거하고 15 mm의히스티딘완충액 (ph 6.0) 내로즉시투석시켰다. 결합단백질을 A280에의해정량화하고질량분광계및 SEC로분석하였다

185 [0701] [0702] 실시예 3.3: IL-1α/β DVD-Ig 작제물의서열사람 IL-1β 및사람 IL-1α에결합할수있는 DVD-Ig 단백질의경쇄및중쇄의아미노산서열을측정하였다. IL-1α/β DVD-Ig 결합단백질의가변중쇄 (VH), 가변경쇄 (VL), 고정경쇄 (CL), 및고정중쇄 (CH) 영역의아미노산서열을하기표 14에나타낸다. 표 14에서, E26.13 및 E26.35 VL 영역에대한아미노산서열을 C-말단아르기닌 (R) 잔기의혼입에대해고려하여, 표 10에앞서나타낸바와같은서열번호 205 및서열번호 209 대신, 서열번호 238 및서열번호 239로지정한다. 당해 C-말단아르기닌잔기는당해분야의숙련가에의해 IgG 분자내 VL 및 CL 카파영역의연결부에서아미노산잔기가되도록가공된항체이며때때로 CL 영역내에또는, 하기표 14에서와같이 VL 영역내에포함되는것이당해분야의숙련가에의해이해된다. 표 14 [0703]

186 [0704]

187 [0705]

188 [0706]

189 [0707]

190 [0708]

191 [0709]

192 [0710]

193 [0711]

194 [0712]

195 [0713]

196 [0714]

197 [0715]

198 [0716] [0717] [0718] [0719] 실시예 4: IL-1α/β DVD-Ig 단백질의기능적특성화실시예 4.1: IL-1α/β 효소-결합된면역흡착성검사프로토콜 IL-1β/α DVD-Ig 결합단백질에의한 IL-1β 및 IL-1α결합을 ELISA( 상기기술된검사, 실시예 2.1) 로평가하였다. 결과는표 15에나타낸다. 표 15 [0720] [0721] 실시예 4.2: IL-1α/β 생검사및중화검사 [0722] MRC5 세포를웰당 1.5 내지 2 x 10 4 세포에서 100 μl 의용적으로플레이팅하고밤새 37, 5% CO 2 에서항온처 리하였다. DVD-Ig(4X 농축됨 ) 의 20 μg/ml의작업스톡 (working stock) 을완전 MEM 배지에서제조하였다. 8 점일련희석을마르쉬희석플레이트 (Marsh dilution plate) 내완전 MEM 속에서수행하였다 (5 μg/ml 내지 μg/ml). 65 μl/ 웰의각각의항체희석물을, 96 웰 v-바닥 (Costar No. 3894) 플레이트및 65 μl의 IL-1α 또는 IL-1β의 200 pg/ml 용액또는 IL-1α 또는 IL-1β 둘다의 50 pg/ml 용액을함유하는 65μL의혼

199 합용액에 4회가하였다. 대조군웰에 65 μl의 200 pg/ml의 IL-1α 또는 IL-1β 또는 50 pg/ml의혼합된 IL- 1α/β (4x 농축됨 ) 와 65 μl의 MEM 배지및, 130 μl의배지가들어있는배지대조군웰을제공하였다. 1시간항온처리후, 100 μl의 DVD-Ig/Ag 혼합물을 MRC5 세포에가하였다. 모든웰용적은 200 μl로동일하였다. 이후에, 모든플레이트시약을 1X 농축시켰다. 16 내지 20시간항온처리후, 웰내용물 (150 μl) 을 96-웰환저플레이트 (Costar No. 3799) 내로이전시키고 -20 의냉동실에두었다. 상층액을 hil-8 수준에대해사람 IL-8 ELISA 키트 ( 제조원 : 알앤드디시스템스, 미네소타주미네아폴리소소재 ) 또는 MSD hil-8( 화학발광성키트 ) 를사용하여시험하였다. 중화효능은 IL-1α, IL-1β, 또는 IL-1α/β 단독대조군값에대한억제퍼센트를계산함으로써측정하였다 ( 표 16). 표 16 [0723] [0724] [0725] 실시예 4.3: IL-1α/β DVD-Ig 분자의친화성측정 정제된재조합체사람 IL-1β 및 IL-1α 및사이노몰구스 IL-1β 및 IL-1α 에대한 IL-1α/β DVD-Ig 의결합을 실시예 2.3 에기술된바와같이표면플라스몬공명을사용하여측정하고결과를도 17 에나타낸다. 표 17 [0726] [0727] [0728] 참조문헌의혼입본발명은분자생물학및약물전달의분야에잘공지된이들의전체기술을참조로포함한다. 이들기술들은다음문헌에기재된기술들을포함하나, 이에한정되지않는다 : Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Ausubel, F. M. et al. eds., Short Protocols In Molecular Biology (4th Ed. 1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN X). Controlled Drug Bioavailability Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Giege et al., Chapter 1, In Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach, 2nd ed., (Ducruix and Giege eds.) (Oxford University Press, New York, 1999) pp. 1-16; Goodson, J.M., Chapter 6, In Medical Applications of Controlled Release, Vol. II, Applications and Evaluation, (Langer and Wise, eds.) (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1984), pp ; Hammerling et al., eds., "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas," In Research Monographs in Immunology, vol. 3 (J.L