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1 산업적인 응용을 위한 새로운 효소원으로서 고온성 세균 (Extremophiles as a source of novel enzymes for industrial application) 권석태 성균관대학교 생명공학부 유전공학과 Tel , ; stkwon@yurim.skku.ac.kr 목 차 1. 내열성 효소의 중요성 2. 생육적온에 따른 고온균 및 초고온균의 분류 3. 고온균과 초고온균의 분리 및 입수 4. 고온균과 초고온균의 연구 방법과 연구방향 5. 산업적으로 유용한 효소원으로서의 고온성 세균 51. 전분 분해효소 : amylase, glucoamylase, pullulanase 52. Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTases) 53. Cellulose의 분해 : 자연계에 가장 풍부한 polymer 54. 자이란 분해 효소 (Xylandegrading enzyme) 55. 키틴 분해효소 (Chitindegrading enzyme) 56. 단백질 분해 효소 (Proteindegrading enzyme) 57. DNAprocessing enzymes 58. DNA ligase for LCR (ligase chain reaction) 59. 기타 다른 중요한 효소들 6. 참고문헌

2 1. 내열성 효소의 중요성 일반적으로 고온균(thermophile)이 생산하는 효소는 보통 중온균 (mesophile)이 생산하는 효소와 동일한 기능을 갖고 있으면서 중온균 효소들이 변성을 일으키는 고온과 같은 극한반응 조건에서 안정하게 효소반응을 수행하기 때문에 학문적으로나 산업적으로 모두 관심이 대상이 되고 있다. 특히, 이러한 관심은 주로 70 이상의 극한환경에서 생육적온을 갖는 고온균 (extreme thermophile)과 초고온균(hyperthermophile)은 그들 환경에 적응되어 있어서 그들이 생산하는 효소들도 극한 환경에서 작용을 한다는 점에 초점을 맞추고 있다. 중온성 미생물의 효소들은 고온에서 불가역적으로 활성을 잃어버리지만, 고온성 미생물로부터 분리 된 효소들은 고온에 상당히 안정할 뿐만 아니라, 계면활성제, 유기용매 등의 일반적인 단백질 변성제 존재 하에서도 상당히 안정된 활성을 보인다. 또, 소량의 효소로서 장기간 사용이 가능하며, 고온에서 반응시키므로 기질의 용해도가 낮은 물질의 용해도 증가, 물질 확산속도의 증가, 반응속도의 증가, 반응시간의 단축, 중온성 미생물에 대한 오염방지 등의 수 많은 장점을 갖고 있다. 따라서, 이러한 고온성 미생물 효소들은 기존의 중온성 효소를 이용한 산업적인 단점을 극복할 수 있을 뿐만 아니라, 학문적으로도 내열성의 원인 규명, 구조생물학 등의 재료로서 매우 중요하다. 본 원고에서는 extremophiles중에서 고온균과 초고온균에 대한 최근 연구동향과 내열성효소의 산업적인 응용에 대하여 언급하려고 한다. 2. 생육적온에 따른 고온균 및 초고온균의 분류 일반적으로 온도에 따라 미생물을 인위적으로 크게 3가지로 구분하고 있다. 1) 020 내외서 생육적온을 갖는 Psychrophile (저온균), 2) 3055 범위에서 생육 적온을 갖는 중온균 (Mesophile), 3) 55 이상에서 생육적온을 갖는 고온균 (Thermophile)으로 일반적으로 구분하고 있다 (Brock 1986). 최근에와서 고온균을 다시 세분하여, 5570 범위에서 생육적온을 갖는 Moderate thermophile, 7080 에서 생육적온을 갖는 Extreme thermophile, 그리고 에서 생육적온을 갖는 Hyperthermophile 등으로 구분하고 있다. 3. 고온균과 초고온균의 분리 및 입수 고온균이 처음 발견된 것은 1969년 Brock, T. D.에 의해서 미국 국립고원인 yellowstone의 온천에서 Thermus aquaticus YT1 균주가 분리되면서 그 후, 대 까지 T. thermophilus HB8, T. themophilus HB27, T. flavus AT62 (ATCC 33923), Thermus sp. X1 (ATCC 27975), Thermus sp. T351(ATCC 31674), T. caldophilus GK24, T. filiformis (ATCC 43280), Thermus sp. T2 (ATCC 43280), Thermomicrobium roseum (ATCC 27502) 등이 분리되었다. 이들 균주들은 7075 에서 생육적온을 갖고 85 까지 생육할 수 있다. 그 후, 1986년 Eubacteria로서 초고온균 Thermotoga가 Stetter and Huber에 의해 분리되었고, 이균은 80 에서 생육적온을 갖고 90 까지 생육 가능하다. 1992년 Huber et al. (University regensburg, Germany)에 의해 85 에서 생육적온을 갖고 95 까지 생육할 수 있는 Aquifex pyrophilus와 1998년에 Deckert et al.에 의해 Aquifex aeolicus가 각각 분리되었다. 이들은 Eubacteria로서 유일한 초고온균들이다. 그러나, 대부분의 초고온균들은 Archaea이다. 이들 초고온균은 주로 온천, 화산지대 및 바다밑 열수공 등에서 분리되어, 생육적온이 비등점 근처인 100 부근이다 의 최고의 생육온도를 갖는 Archaea 속은 Pyrobaculum, Pyrococcus, Methanopyrus (University regensburg, Germany) 등으로 60여 종류가 알려져 있으며 독일에서 가장 많이 분리되어, DSMZDeutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmBH에 기탁되어 있다 (Table 1 참조). 특허 균주 외에는 쉽게 분양받을 수 있으며, 특허균주도 연구용으로는 구입할 수 있다. 그 다음으로 미국 ATCC (American Type Culture Collection)에서 쉽게 구입할 수 있다. 그 외에 프랑스 해양연구소 (IFREMER)의 Dr. Anne Godfroy et al.등에 의해 Pyrococcus abyssi sp.를 비롯한 상당히 많은 초고온균이 분리되어 Pasteur 연구소에 기탁되어 있지만 외국인에게는 분양을 거의 하지 않고 있다.

3 4. 고온균과 초고온균의 연구 방법과 연구방향 비교적 Thermus 계통의 고온균은 일반적으로 균체배양과 확보가 쉽기 때문에 대부분 대량으로 배양하여 여러 가지 연구를 시도할 수 있다. 그러나 초고균은 생육환경이 극한 상태이며, 배양조건이 워낙 까다로워서 균체양 확보도 상당히 문제가 된다. 예를 들어 본 연구실에서는 Thermococcus, Aquifex 속 균을 배양시 100ml 병에 20ml씩 배지를 첨가하여 완전 산소를 제거한 후 36시간 이상 88 에서 생육시킨 결과 균체량은 일반 중온균의 1/10 이하의 수율이다. 따라서 초고온균의 연구에서 대량의 균체를 배양하여 단백질연구를 하는 것은 상당히 어렵다. 따라서 genome DNA를 분리하여 Cosmid library를 만들어서 필요한 유전자를 screening하여 cloning 하던가, 또는 아예 전체 genome의 염기서열을 결정하는 방향으로 연구를 진행시키고 있다. 현재 미생물 genome 전체 염기서열이 밝혀진 것이 2001년 5월 현재 55개 균주이며, 이들 대부분이 병원성 세균과 산업적으로 유용한 균주들이다. 이중에서 고온균 및 초고온균이 11개균주가 완료되었다 (Table 2. 참조). 이는 초고온균이 산업적으로 너무나 중요하기 때문에 대부분 기업에 의해 염기서열이 완성되었으며 특허출원되어 있는 상태이다. 따라서 우리나라도 유전자원 확보 차원에서 심해 열수공 부근에서 생육하고 있는 초고온균들을 분리할 필요성이 대두되며, 우리가 분리한 초호열균을 이용하여 서둘러 genome 연구를 시도해야 한다고 생각한다. 일단 genome 염기서열이 완료되면 산업적으로 유용한 유전자들을 PCR로 증폭하여 대장균 유래의 발현 벡터에 삽입하여 대량발현이 가능하다. 또 이렇게 대장균에서 대량발현된 재조합 내열성 효소는 균체를 파쇄시킨 후, 효소의 내열성을 이용하여 80 30분정도 열처리하므로서 대장균 유래의 단백질들을 변성시킨다. 그리고 원심분리하여 침전물을 제거한 후 상등액을 회수하므로서 대장균 유래의 단백질을 90% 이상 제거할 수 있다는 장점을 갖고 있기 때문에 상당히 매력적이며, 산업적으로 원가절감 효과가 상당히 크다. 5. 산업적으로 유용한 효소원으로서의 고온성 세균 51. 전분 분해효소 : amylase, glucoamylase, pullulanase 전분의 화학구조는 많은 수의 glucose가 glycoside 결합으로 된 다당체이지만, 그 형태상 α 1,4glucosidic bond로 구성된 직쇄의 amylose (1525%)와 α 1,6glucosidic linkage로 연결된 amylopectin (7585%)으로 나눌 수 있다. 전분의 이러한 복잡성 때문에 많은 수의 효소가 분해에 필요하며, 크게 α amylase와 같은 endoacting enzymes과 β amylase, glucoamylase, α glucosidase와 같은 exoacting enzymes로 대별된다. 또한 pullulan과 amylopection내에 있는 α 1,6glycosidic bond를 분해할 수 있는 효소를 pullulanases라고 부른다. 기질 특이성을 기초로 하여 pullulanase를 2 group로 분류한다. type I은 pullulan과 branched oligosaccharides 내에 있는 α 1,6linkages를 특이적으로 가수분해하며, pullulanase type II 혹은 amylopullulanes는 pullulan의 α 1,6linkages와 다른 oligosaccharides와 polysaccharides의 α 1,4linkages를 절단한다. 지금까지 100 이상에서 안정하고 활성을 나타내는 내열성 효소의 부족 때문에 다양한 단계를 거쳐 전분의 glucose 또는 fructose로의 전환이 수행되었고 그런 과정에서 염 농도가 높아져서 값비싼 이온 교환수지를 이용해야만 했다. 최근 100 이상에서 안정하고 고활성을 나타내는 amylase, glucoamylase, pullulanase가 초호열균으로부터 분리되어 전분 생분해과정에 이용할 수 있는 매력적인 후보들로 떠오르고 있다 (Table 3). 내열성 α amylase는 Pyrococcus woesei (Koch et al. 1991), Pyrococcus furiosus (Laderman et al. 1993a, b)에서 분리되었고, 이들 내열성 효소들의 최적활성 온도는 100 였다. 특히 pyrococcal extracellular α amylase는 금속이온 존재하에 130 에서 조차 활성을 보이고 있다 (Dong et al. 1997). 그 외에도 Sulfolobus, Desulfurococcus, Thermococcus, Staphylothermus 등에서 α amylase 활성이 확인되었다 (Canganella et al. 1994). 내열성 glucoamylase는 Clostridium thermosaccharolyticum (Specka et al. 1991)에서 분리되었으며, 최적온도가 70 이다. 또 최근에 Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571에서도 분리되었다. 내열성 pullulanases type II경우 Thermococcus, Staphylothermus, Staphylothermus marinus, Desulfurococcus mucosus, Thermococcus aggregans에서 분리되었다 (Table 3 참조). 이들 효소의 최적온도는 calcium ion과 기질이 없는 상태에서 조차 를 보였다. P. woesei 및 P. furiosus 유래의 pullulanses의 유전자들이 대장균에 cloning되어 발현되었으며, 특히 P. woesei의 recombinant pullulanase는 최적 온도가 100 였고, 110 에서 반감기가 7분이였다 (Rudiger et al. 1995). 그 외 내열성 pullulanase type I으로

4 Thermus caldophilus GK24에서 분리되었으며, 최적온도는 75 이며, 95 까지 안정했다 (Kim et al. 1996). 52. Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTases) CGTase는 무작위적으로 polysaccharides내에 있는α 1,4linkages를 공격하여 intramolecular transglycosylation reaction에 의해 전분을 환상으로 전환시킨다. 포도당 수에 따라 α cyclodextrin (Glucose 6개), β cyclodextrin (Glucose 7개), γ cyclodextrin (Glucose 8개)으로 부르고 있으며, 이 cyclodextrin은 환상내부에 큰 구멍을 갖고 있기 때문에 여기에 여러 가지 물질을 포입하여 복합체를 형성할 수 있기 때문에 식품공업에 유용하다. Cyclodextrin 생산공정은 첫 단계로 내열성 효소로 전분을 액화시킨 후, 두 번째 단계로 Baciilus sp.를 이용하여 낮은 온도에서 처리하는 공정으로 이루어졌다. 그러나, 내열성 CGTase의 발견은 액화와 cyclization을 105 에서 한 단계에서 처리할 수 있다. 내열성 CGTase는 Thermoanaerobacter sp. (Norman and Jorgensen 1992)와 Thermoanaerobacterium thermosulfurogenes (Wind et al. 1995)에서 발견되었다. 53. Cellulose의 분해 : 자연계에 가장 풍부한 polymer Cellulose는 식물 biomass의 40% 이상을 차지하고 있으며, glucose의 β 1.4glycosidic bonds로 직선으로 연결된 polymer 이다. Cellulose는 endoglucanase, exoglucanase (cellobihydrolase), β glucosidase 등의 적어도 세가지 효소들의 연속적인 작용에 의해 glocose로 분해할 수 있다. Cellulase (EC )의 동의어는 β 1.4Dglucan glucanhydrolase, endoβ 1,4glucanase 혹은 carboxymethylcellulases이다. Cellulase는 Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Basidiomycetes 속 등에서 생산되고 있지만, 현재 상업적인 관심으로 Trichoderma sp.에서 생산되는 cellulase이다 (Teeri et al., 1998). 그러나, cellulose에 대해 활성을 보이는 내열성 cellulase가 가장 큰 관심거리이며, 다양한 고온균들로부터 몇 가지 cellulose 분해 효소 유전자들이 클로닝되었고, 효소의 특성이 밝혀졌다 (Table 4. 참조). Thermotoga maritima MSB8 (Bronnenmeier et al. 1995)에서 95 에서 활성을 나타내는 cellulase와 Thermotoga neapolitana에서 cellulase A (29kDa, 95 )와 cellulase B (30kDa, 106 )를 각각 정제하였고, 이 2유전자들 모두 cloning되었다 (Bok et al. 1998). 고온 혐기성세균인 Caldocellum saccharolyticum의 genome에서는 cellulase와 hemicellulase genes들이 cluster로 함께 존재하였다 (Teo et al. 1995). 최근 β glucans과 cellulose의 β 1.4bonds 분해할 수 있는 내열성 endoglucanase가 archaea Pyrococcus furiosus에서 분리되어 그 유전자가 대장균에 클로닝되어 특성이 밝혀졌다. 이 재조합 endoglucanase는 기질로서 cellopentaose와 cellohexaose에 특이적인 활성을 보였다 (Bauer et al. 1999). 사실 내열성 β glucosidase는 Sulfolobus solfatarricus MT4, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus shibatae (Grogan 1991), Pyrococcus furiosus에서 발견되었고, 또 Pyrococcus furiosus β glucosidase는 매우 안정하여 최적온도가 이며 100 에서 반감기가 3.5일이었다 (Kengen et al. 1993). 54. 자이란 분해 효소 (Xylandegrading enzyme) Xylan은 자연계에서 고정된 탄소의 주요 저장소인 식물 세포벽의 주요 중합체인 hemicellulose로 구성된 heterogeneous molecule이다. Heteropolymer의 주요 사슬은 β 1,4glycosidic bonds에 의해 연결된 xylose 잔기로 구성된다. Xylose 잔기의 거의 절반은 acetyl, arabinosyl 그리고 glucuronosyl groups의 O2 또는 O3 위치에서 치환된다. Xylan의 완전한 분해는 몇 가지 효소의 작용이 요구된다 (Sunna and Antranikian 1997 참조). Endoβ 1,4xylanase (EC ), 또는 β 1,4xylan xylanohydrolase는 xylans에서 β 1,4xylosydic linkages를 가수분해하고, 반면에 β 1,4xylosidase, β xylosidase, β 1,4xylan xylohydrolase, xylobiase, exoβ 1,4xylosidase (EC ) 등은 비환원성 말단으로부터 xylose 잔기를 제거함으로써 β 1,4 xylans과 xylobiose를 가수분해한다. α arabinofuranosidase와 arabinosidase (EC )는 α Larabinosides의 비환원성 말단 α Larabinofuranoside 잔기를 가수분해 한다. 이 효소는 또한 1,3 또는 1,5 linkages를 포함하는α Larabinofuranosides, α Larabinans에서도 활성을 갖는다. Glucuronoarabinoxylan endoβ 1,4xylanase, feraxan endoxylanase, glucuronoarabinoxylan β 1,4xylanohydrolase(EC )은 glucuronoarabinoxylans에서 β 1,4xylosyl linkages를 공격한다. 이 효소는 또한 곡물의 세포벽으로부터 arabinoxylans를 feruloylated 시키는 높은 활성을 갖고 있다. Acetylxylanesterase(EC )은 xylan에서 acetyl groups을 제거한다. Bacteria와 eukarya의 xylanases는 biotechnological application 분야에서 넓은 범위의 잠재성을 가지고 있다. 이것들은 벌써 산업적으로 생산하고 있으며 가금류의 사료첨가물에도 이용되고 (Annison 1992) 반죽하기 좋으면서 양질의 빵을 생산하기 위해 밀가루에도 이용된다. 최근에는 내열성 xylanases의 주된

5 관심이 종이의 효소를 이용한 표백화에 있다 (Viikari et al. 1994). 일년동안 미국에서는 chlorine과 chlorin 유도물질이 톤 보다 더 많이 펄프 표백에 이용되고 있다. 이 과정에 의해서 배출되는 chlorinated lignin 유도물질들은 펄프와 종이 산업에 의해 야기되는 심각한 환경오염 문제가 되고 있다 (McDonough 1992). 최근 연구는 펄프로부터 잔여 lignin의 제거을 위해 chlorine 표백의 대안으로써 효소처리의 가능성을 증명하였다 (Viikari et al. 1994). Xylanase로 처리한 펄프는 다른 구성물의 손실없이 xylan과 잔여 lignin을 방출한다. 높은 온도에서 xylanase 처리는 세포벽 구조를 파괴시켰고, 따라서 그 다음 표백단계에서 lignin 제거을 용이하게 했다. 이 중요하고 잠재력 있는 시장을 위해 xylanase는 몇 가지 기준을 만족시켜야만 할 것이다. (1) Cellulose fibres의 가수분해를 피하는 cellulolytic activity가 결여되어야만 한다. (2) 이것들의 molecular mass는 펄프 fibres에 확산시키기에 충분히 작아야한다. (3) 높은 온도, alkaline ph에서 안정적이며 활성을 갖아야 한다. (4) 적은 비용을 들여 높은 효소 생산을 할 수 있어야 한다. 상업적인 공급자로부터 공급되어 현재 이용되고 있는 xylanases는 단지 이 기준의 일부분만 충족하고 있다. 적당한 thermophilic microorganisms로부터 분리해 낸 xylanase는 70 보다 높은 온도에서는 빠르게 변성된다. 상업적으로 시행되고 있는 nonchlorine 표백처리 단계의 몇 가지는 이 온도보다 높은 온도에서 잘 수행되고 있으며, 결과적으로 펄프는 이 효소를 처리하기 전에 차갑게 해야하고 다음 과정에서 다시 열을 가해 주어야 한다 (Chen et al. 1997). Thermostable xylanases 지금까지 단 몇몇의 extreme thermophilic microorganisms는 xylan에서 성장할 수 있고, thermoactive한 xylanolytic enzyme을 분비할 수 있다 (Table 4 참조). Thermotogales와 Dictyoglomus thermophilum Rt46B.1의 구성성분들은 높은 온도에서 안정하고 활성을 가지는 xylanases를 생산해 왔다 (Gibbs et al. 1995; Sunna and Antranikian 1997a). 대부분 thermostable endoxylanases는 Thermotoga sp. strain FjSS3B.1 (Simpson et al. 1991), T. maritima (Winterhalter and Liebl 1995), T. neapolitana (Bok et al. 1994) 그리고 Thermotoga thermarum (Sunna et al 1996b)로부터 분리하였다. 이런 효소들은 80 와 105 사이에서 활성을 가지며, 주로 cellassociated해 있거나 아마도 대부분은 toga내에 있을 것이다 (Ruttersmith et al. 1992; Schumann et al. 1991; Sunna et al. 1996a; Winterhalter and Liebl 1995). Xylanases 유전자들은 이미 cloning과 염기서열 분석이 되었다. T. maritima로부터 분리해낸 thermostable xylanases 유전자는 대장균에서 cloning되고, 발현 되었다. 상업적으로 이용되고 있는 T. maritima 재조합 xylanase와 펄프효소(Yang and Eriksson 1992)의 비교 data는 thermostable xylanase가 펄프와 종이 산업에서의 가치가 있을 수 있다는 것을 지적하고 있다 (Chen et al. 1997). 55. 키틴 분해효소 (Chitindegrading enzyme) 키틴은 Nacetylglucosamine 잔기들로 이루어진 직선형의 β 1,4 중합체이며, 지구상에서 셀룰로오스 다음으로 풍부한 biopolymer이다. 특히, 해양 환경에서 키틴은 무수히 많이 생산되어지며, 키틴 분해 효소들의 작용을 받는다. 키틴은 대부분의 곰팡이와 무척추생물들에 있어 구조를 형성하는 주요 구성 성분이며, 토양 세균과 해양 세균들에 있어서는 영양분으로서 작용한다. 키틴 분해는 세포내에서 작용하는 키틴 가수분해 효소인 chitinase A (EC )와 세포외에서 작용하는 키틴 올리고머 가수분해 효소인 chitintinase B, Nacetyl D glycosaminidase (chitobiase, EC )에 의해 진행되는 것으로 알려져 있다. Endochitinase와 exochitinase들은 3개의 glycosyl hydrolase family (families 18, 19, 20)들을 구성된다. 진핵생물과 세균, 바이러스들로부터의 chitinase, endoβ NacetylD glucosaminidase (EC ), dinacetylchitobiase들은 family 18에 속한다. NacetylDglucosamine oligomeric product는 이것의 C1 anomer 구조를 가진다. Family 19는 오직 진핵생물과 세균들로부터의 chitinase들만을 포함하는데, family 18과 대비되는 점은 그 산물이 anomer 구조로 전환되어진다는 것이다. Family 20은 β hexosaminidase와 chitobiase들을 포함한다. Chitobiase는 오직 작은 NacetylDglucosamine oligomer들 (5량체까지)을 분해하며, 여기서 나온 NacetylDglucosamine 단량체들은 그들의 C1 anomer 구조를 가진다. 키틴를 이용한 kitosan 제조 등의 기능성 원료 물질로 만드는이용되고 있다 (CohenKupiec and Chet 1998; Kas 1997). 비록 많은 키틴 가수분해 효소들이 분리되어져 왔고 그들의 유전자들이 클로닝되어지고 특성들이 밝혀져 왔을지라도, 오직 소수의 내열성 키틴 가수분해 효소들만이 알려져 있다. 이들 효소들은 고온성 세균 B. licheniformis X7u (Takayanagi et al. 1991), Bacillus sp. BG11 (Bharat and Hoondal 1998), Streptomyces thermoviolaceus OPC520 (Tsujibo et al. 1995)들로부터 분리되었다. Extreme thermophilic anaerobic archaeon Thermococcus chitonophagus는 키틴을 가수분해하는 것으로 보고되고 있다 (Huber et al. 1995). 이것은 chitinase와 Nacetylglucosa minidase들을 생산하는 것으로 밝혀진 첫 번째 extremophilic archaeon이다.

6 56. 단백질 분해 효소 (Proteindegrading enzyme) Protease들은 단백질들의 아미노산이나 펩타이드들로의 전환에 관여한다. 그들은 그들의 촉매 부위의 성질에 따라 다음 그룹들로 분류되어져 왔다: serine protease, cysteine protease, aspartic protease, metalloprotease (Table 5). 전세계적으로 상업적 규모로 생산되어지는 단백질 분해 효소들의 양은 다른 생물공학적으로 이용되는 효소들의 양에 비해 아주 많다. Serine alkaline protease들은 세정을 위한 가정용 세제들에 첨가물로서 사용되어지는데, 여기서 그들은 세제나 알카리 조건들에 의한 변성에 견뎌내야만 한다. 높은 케라틴 분해 및 엘라스틴 분해 활성들을 보이는 protease들은 가죽 산업에 있어 soaking에 사용되어진다. Protease들은 또한 그들의 역반응을 이용하여 펩타이드 합성을 위한 촉매제로서 사용되어진다. 극단적인 조건들 (높은 온도, 극단적인 ph) 하에서 반응들을 촉매할 수 있는 protease들의 개발은 산업적 응용들을 위해 유용할 것이다 (Ladenstein and Antranikian 1998). 다양한 내열성 protease들이 Desulfurococcus, Sulfolobus, Staphylothermus, Thermococcus, Pyrobaculum, Pyrococcus 속들에 속하는 초고온성 고세균들에서 분리되어져 왔다. Extremophile들로부터의 대부분의 protease들은 serine type에 속하며, 고온이나 심지어 세제나 변성제들의 고농도 존재 하에서도 안정한 것으로 밝혀져 왔다. 내열성 serine protease는 초고온성 고세균 Desulfurococcus strain Tok 12 S 1 의 균체를 제거한 상층액으로부터 분리되었다 (Cowan et al. 1987). 최근에 cellassociated serine protease가 Desulfurococcus strain SY로부터 특성이 밝혀졌는데, 95 에서 4.3시간의 반감기를 보였다 (Hanzawa et al. 1996). Staphylothermus marinus로부터의 구형 serine protease는 극단적인 내열성을 가지는 것으로 밝혀졌다. Tetrabrachion이라 불리는 실 같은 당단백질 복합체의 줄기에 결합되어 있는 이 효소는 135 에서 10분 후에도 남은 활성을 가진다 (Mayr et al. 1996). 몇몇 Thermococcus 종들로부터의 세포외 serine protease들의 특성들이 분석되어져 왔다 (Klingeberg et al. 1991). T. stetteri로부터의 이 세포외 효소는 68 kda의 분자량을 가지며, 100 에서 2.5시간의 반감기를 가지는 것과 1% SDS 존재 하에서 활성의 70%를 보유하는 것에서 보여지듯이 지극히 안정하고 화학 변성에 잘 견딘다 (Klingeberg et al. 1995). Aereolysin이라 불리는 subtilisinlike serine protease를 암호화하는 유전자가 Pyrobaculum aerophilum으로부터 클로닝되어졌으며, 그 단백질은 subtilisintype protease들의 구조에 있어 모델이 되었다 (Volkl et al. 1995). 다중의 단백질 분해 활성들이 P. furiosus에서 관찰되어져 왔다. Pyrolysin이라 불리는 P. furiosus의 cellenvelopeassociated serine protease는 105 에서 20분의 반감기를 가질 정도로 아주 안정한 것으로 밝혀졌다 (Eggen et al. 1990). Pyrolysin 유전자는 클로닝되어 그 염기서열이 결정되었는데, 이 효소는 subtilisinlike serine protease였다 (Voorhorst et al. 1996). Protease들은 또한 고온 호산성 고세균 S. solfataricus (Burlini et al. 1992)와 S. acidocaldarius (Fusek et al. 1990; Lin and Tang 1990)들로부터 특성이 밝혀져 왔다. Serine protease들과 함께 다른 type의 효소들도 extremophile들에서 확인되어져 왔다: Pyrococcus sp. KOD1으로부터의 thiol protease (Fujiwara et al. 1996; Morikawa et al. 1994), P. furiosus로부터의 propylpeptidase와 새로운 type의 protease (Blumentals et al. 1992; Halio et al. 1996; Harwood et al. 1997; Robinson et al. 1995). 내열성 serine protease는 또한 extreme thermophilic bacterium Thermus aquaticus YT1 (Kwon et al. 1988), Thermus sp. X1 (Choi JJ, Kwon ST 2000), Fervidobacterium pennavorans에서 확인되었다. 흥미롭게도 Fervidobacterium pennavoran 효소는 털을 구성하는 케라틴을 가수분해하여 아미노산과 펩타이드들을 형성하는 것이 가능하다. 그 효소는 80 와 ph 10.0에서 최적으로 작용한다 (Friedrich and Antranikian 1996). 57. DNAprocessing enzymes DNA polymerase (EC )들은 모든 생명체에 존재하는 세포 정보의 복제에 있어 핵심 효소이다. 그들은 Mg 2 이온의 존재 하에서 프라이머 가닥의 신장될 3 OH 말단에 deoxyribonucleoside 5'triphosphate의 첨가를 촉매하여 두 번째 가닥에 상보적인 염기쌍들을 형성한다. 100개 이상의 DNA polymerase 유전자들이 고온성 세균 및 고세균들을 포함한 다양한 생명체들로부터 클로닝되어 그 염기서열들이 밝혀져 왔다. 내열성 DNA polymerase들은 DNA 증폭, 염기서열 결정 또는 표지 등과 같은 다양한 분자 생물학적 응용들에서 중요한 역할을 수행한다 (Table 6). 지난 10년 동안에 분자 생물학에 있어 가장 중요한 진전들 중에 하나는 PCR의 개발이다 ( Saiki et al. 1988). 초기의 PCR에서는 E. coli DNA polymerase I의 Klenow fragment를 사용하였는데, 이것은 열에 약해서 denaturation과 primer hybridization 단계 후에 매 사이클마다 새로이 첨가해 주어야만 했다. PCR에 있어 내열성 DNA polymerase들의 도입은 PCR의 자동화를 용이하게 했다. Taq polymerase라 불리는 Thermus aquaticus로부터의 DNA polymerase I은 특성이 밝혀진 첫 번째 내열성 DNA polymerase이며 (Chien et al. 1976), 이후 Thermus속으로부터 많은 DNA polymerase들이 연구되어져 왔다: Tfl Pol. (Kaledin et al. 1981), Tth Pol. (Ruttimann et al. 1985), Tca Pol. (Park et al. 1993), Tfi Pol. (Jung et al. 1997), Top Pol. (Kim et al. 1998), Tx1 Pol. (Choi et al. 2001,

7 특허출원중) 등이 PCR에 적용되었다. Taq polymerase는 5 3 exonuclease activity는 가지지만, 3 5 exonuclease activity는 확인되지 않는다 (Longley et al. 1990). 3'5' exonuclease activity의 부재로 인해 이 효소는 잘못된 결합을 제거하는 것이 불가능하고, 이 결과로 baseinsertion fidelity가 낮다. Highfidelity DNA polymerase들의 사용은 클로닝되어지고, 염기서열이 결정되어지며, 발현될 PCR 산물들의 증폭 에러 증가를 줄이는 데 있어 필수불가결하다. 3 5 exonuclease dependent proofreading activity를 가지는 몇몇 내열성 DNA polymerase들이 밝혀져 왔으며, 이들 효소들의 에러율 (합성된 염기당 잘못 결합된 뉴클레오타이드의 수)이 결정되어져 왔다. T. maritima로부터의 내열성 DNA polymerase (Bost et al. 1994)와 3 5 exonuclease activity를 가지는 것으로 보고Aquifex aeolicus 로부터의 Aae Pol. (Chang et al. 2001)은 되었다. P. woesei 로부터의 Pwo Pol. (Frey and Suppmann 1995), P. furiosus로부터의 Pfu Pol. (Lundberg et al. 1991), Pyrococcus strain GBD로부터의 Deep Vent Pol. (Perler et al. 1996) 또는 T. litoralis로부터의 Vent Pol. (Cariello et al. 1991)과 같은 고세균의 proofreading polymerase들은 Taq polymerase에 비해 10배 정도까지 낮은 에러율을 가진다. Thermococcus sp. strain 9 N7로부터의 9 N7 DNA polymerase는 T. litoralis DNA polymerase에 비해 5배 높은 3 5 exonuclease activity를 가진다 (Southworth et al. 1996). 그러나, Taq polymerase는 이들 DNA polymerase들의 낮은 신장율 때문에 이들에 의해 대체되지 않았다. 높은 fidelity를 가지는 DNA polymerase들은 그들의 잠재적인 강한 exonuclease activity 때문에 긴 DNA 단편들의 증폭을 위해 반드시 적당한 것은 아니다 (Barnes 1994). Pyrococcus sp. strain KOD1으로부터의 재조합 KOD1 DNA polymerase는 낮은 에러율 (Pfu의 에러율과 유사)과 높은 진행성 (뉴클레오타이드 중합의 지속성), 높은 신장율을 보이는 것으로 보고되어져 왔는데, 결과적으로 6 kb까지의 목적 DNA 서열들의 매우 빠르고 정확한 증폭이 가능하다 (Takagi et al. 1997). Polymerase와 exonuclease의 미묘한 경쟁을 최적화하기 위하여, 9 N7 DNA polymerase의 exomotif 1은 exonuclease activity의 전체적인 제거 없이 단지 활성 수준을 낮추기 위한 시도로 돌연변이화되었다 (Southworth et al. 1996). PCR의 수행에 있어 다른 문제는 thermal cycling 이전에 생기는 비특이적 주형들의 생성이다. Cycling temperature에 도달하기 전에 polymerase에 의한 신장을 막기 위해 몇몇 방법들이 개발되어져 왔다. DNA와 효소 사이에 기계적인 막으로서 왁스의 사용에 이어, 중온성 온도에서 neutralizing antibody에 의한 Taq polymerase의 억제 (Kellogg et al. 1994)나 고정화 효소의 열에 의한 활성화 (Nilsson et al. 1997)와 같은 더 세련된 방법들이 고안되었다. 최근에 PCR 기술은 Taq 또는 다른 nonproofreading DNA polymerase들에 3 5 exonuclease activity를 가지는 내열성 고세균의 proofreading DNA polymerase들의 적은 양을 첨가함에 의해 긴 증폭물 (2040 kb)의 낮은 에러 합성을 가능하게 하도록 향상되어져 왔다 (Barnes 1994; Cheng et al. 1994).?Hightemperature reverse transcription DNA 증폭 기술은 avian myeloblastosis virus (AMV) reverse transcriptase 또는 moloney murine leukemia virus (MMLV) reverse transcriptase를 이용하여 RNA의 cdna로의 전환에 있어 주형으로서 RNA를 사용하게 되었다 (Frohman et al. 1988; Kawasaki et al. 1988; Powell et al. 1987). 결과물로서 나오는 첫 번째 가닥 complementary DNA (cdna)는 cdna library들의 생성, 유전자 발현 정도의 수량화 또는 messenger RNA 가닥들의 3 또는 5 말단의 미지 염기서열 결정을 위해 사용되어질 수 있다. 후자의 응용은 종종 RACE (rapid amplification of cdna ends) "anchored" PCR (Loh et al. 1989) 또는 onesided" PCR (Ohara et al. 1989)로 언급된다. 중온성 바이러스의 reverse transcriptase들을 사용함에 있어 중요한 문제는 낮은 온도에서 안정한 secondary RNA structure들의 발생이다 (Kotewicz et al. 1988). Taq polymerase (Jones and Foulkes 1989; Tse and Forget 1990)와 Thermus thermophilus (Auer et al. 1995; Myers and Gelfand 1991; Ruttimann et al. 1985) 또는 T. caldophilus (Park et al. 1993)로부터의 DNA polymerase들과 같은 많은 내열성 DNA polymerase들은 Mg 2 대신에 Mn 2 의 존재 하에서 주형으로서 RNA를 이용할 수 있다. T. thermophilus로부터의 DNA polymerase는 Taq polymerase보다 coupled RTPCR에서 100배 더 효과적일 것으로 보고되었다 (Myers and Gelfand 1991). 비록 어떤 fidelity value들을 밝혀낼 수 없을 지라도 중온성 DNA polymeraes들의 경우 (Dong et al. 1993; ElDeiry et al. 1984)에서처럼 Mn 2 의 사용은 내열성 DNA polymerase들의 에러율을 증가시키고 fidelity를 감소시킬 가능성이 있다. Thermus filiformis로부터의 DNA polymerase는 RTPCR에서 Mg 2 를 사용하면서도, Mn 2 의 존재 하에서 T. thermophilus DNA polymerase에 의해 합성되어지는 것과 유사할 정도의 산물을 생성시키는 것으로 보고되고 있다 (Perler et al. 1996). DNA sequencing Sanger method (Sanger et al. 1977)에 의한 DNA sequencing은 지난 20년 동안에 수없이 많은 발전 과정을 거쳐왔다. 가장 중요한 공헌은 cycle sequencing

8 과정을 가능케 한 내열성 DNA polymerase들의 도입이었다. 이 방법은 주형 DNA를 재사용하여 sequencing product의 양을 증가시키기 위해 temperature denaturation, annealing, dideoxy DNA termination이 일어나는 extension이라는 일련의 과정을 반복적으로 사용하는 것이다. Sequencing product들의 이 PCR과 같은 증폭으로 인해 몇몇 문제들이 극복되어져 왔다. Cycle denaturation은 주형 DNA가 단지 몇 femtomoles만 필요하고, 분리된 primer annealing 단계가 필요치 않으며, 주형 내의 원하지 않는 2차 구조들이 고온 신장에 의해 해결된다. Cycle sequencing을 위해 사용되어진 첫 번째 효소는 T. aquaticus로부터의 내열성 DNA polymerase I이었다 (Gyllensten 1989; Innis et al. 1988). Longley 등 (1990)에 의해 설명되어진 것처럼, 그 효소는 sequencing fragment들을 분해시킬 수 있어 바람직하지 않은 5 3 exonuclease activity를 나타낸다. 이 효소 활성은 Nterminal을 결실시킨 변이체들의 구축에 의해 제거되어질 수 있다. 그들 중에 하나는 Nterminal의 289개 아미노산이 결실되어 있는 Stoffel fragment이다 (Lawyer et al. 1993). 2개의 다른 변이체들은 Nterminal에서 235개와 278개 아미노산이 결실되어 있다 (Barnes 1992, 1994). 이 결실은 polymerization fidelity에 있어서의 향상을 수반한다 (Barnes 1992). 또한, Tfi Pol.의 Nterminal을 결실시킨 5 3 Exo Tfi fragment도 보고되어졌다 (Choi et al. 2001). T7 polymerase를 이용한 conventional sequencing에 비해 단점들 중의 하나는 Taq polymerase에 의한 chainterminating dideoxynucleotide들의 DNA로의 비효과적인 도입이었다 (Innis et al. 1988). dntp binding site의 돌연변이 분석은 단지 단일 잔기가 selectivity를 위해 중요하다는 것을 밝혔다. Sequencing 효율면에 있어 하나의 결점은 반응생성물인 파이로포스페이트에 의한 dideoxynucleotide들를 제거시키는 pyrophosphorolysis 반응을 촉매하는 DNA polymerase들의 능력이다. 이 역반응은 Thermoplasma acidophilum으로부터의 내열성 pyrophosphatase를 첨가함에 의해 억제되어져 왔다 (Vander et al. 1997). 그러므로, 반응액내의 축적된 파이로포스페이트의 분해를 위해 내열성 pyrophosphatase를 첨가는 더 효과적인 종결 반응을 이끌게 된다. 이러한 내열성 pyrophosphatase는 최근에 Thermus속과 Aquifex속으로부터 많이 연구되어졌다 (Hoe et al. 2001). Bacillus stearothermophilus로부터의 Bst DNA polymerase (Mead et al. 1991) 또는 Thermus flavus로부터의 Tfl DNA polymerase 와 같은 몇몇 다른 세균의 내열성 polymerase들이 cycle sequencing에서의 사용을 위해 개발되어져 왔다 (Table 6). 내열성이 아주 뛰어난 DNA polymerase들은 초고온성 고세균들로부터 나왔으며, 그러므로 cycle reaction들에서의 적용을 위해 매우 적당하다. 위에서 언급된 Pol Ilike polymerase들과는 달리 이들 archaeal α like DNA polymerase들은 DNA sequencing에 불리한 강한 3 5 exonuclease activity를 나타낸다. 이 intrinsic proofreading activity의 결과로 dideoxynucleotide들의 도입은 거의 완벽하게 저해되어진다. 몇몇 α type polymerase들의 primary sequence를 비교함에 의해 3 5 exonucleolytic activity를 위한 active site들이 확인되었고, cycle sequencing 반응들에 적합한 polymerase들을 생산하는 sitespecific mutagenesis에 의해 변경되었다 (Kong et al. 1993; Perler et al. 1996; Southworth et al. 1996). 58. DNA ligase for LCR (ligase chain reaction) DNA ligase(ec )는 미생물, virus, 동물 등에 다양하게 존재하며, ATP 또는 NAD 의 high energy adenylate를 이용하여 DNA의 3?OH 말단과 5?P 말단 사이의 nick나 두 doublestranded DNA 단편들을 연결시키는 효소로서 DNA 복제, recombination, repair 및 molecular cloning에 필수적이다 (Coozzarelli et al. 1967). 최근, 내열성 DNA ligase를 이용한 ligation chain reaction (LCR) 기술이 소개되어, 내열성 DNA ligase는 유전자 조작 실험인 단순한 DNA ligation 반응에 사용될 뿐만 아니라, 유전자 변이에 의한 질병을 쉽게 확인할 수 있는 필수효소가 되었다. 따라서 내열성 DNA ligase를 이용한 LCR 기술은 내열성 DNA polymerase를 이용한 polymerization chain reaction (PCR) 기술과 함께 임상연구에 서로 보완될 수 있는 필수적인 실험기술이 되었다(Barany 1991). 이 LCR 기술은 어떤 유전자 염기서열의 변이에 의해 발생하는 유전병 (예, sickle β s globin)을 PCR 기술보다도 더욱 정확히 진단할 수 있다는 장점이 있다. 즉 변이가 일어난 부위를 기점으로 정상적인 DNA 염기서열에 상보적인 4개의 oligonucleotides를 각각 합성하여 primers로 이용한다. PCR과 유사한 방법으로 LCR은 94 1분간 변성과 65 1분간 annealing 및 ligation의 순서를 약 2530회 정도 반복한 후, 그 반응물을 10% polyacrylamide gel에서 쉽게 확인할 수 있다. 따라서 정상인의 DNA는 ligation되어 증폭이 일어나 분자량이 커지지만, 변이가 일어난 환자의 유전자, 즉, mismatch된 oilgonucleotide들은 ligation이 되지 않으므로 증폭되지 않는다 (Barany 1991). 내열성 DNA ligase에 관한 연구는 아직 Thermus thermophilus HB8 (Tth) DNA ligase와 Thermus scotoductus DNA ligase뿐이다. Tth DNA ligase는 Takahashi 등에 의해 T. thermophilus HB8로부터 처음으로 정제되어 생화학적인 특성이 일부 밝혀졌다 ( Takahashi et al. 1984). Tth DNA ligase는 E. coli DNA ligase와 마찬가지로 NAD 를 필요로 하지만, 상당히 열에 안정한 내열성 효소라는 것이 특징이다. Tth DNA ligase는 5565 사이의

9 최적반응조건에서 cohesive ligation 및 blunt ligation을 30분 이내에 완료시킨다 (Takahashi and Uchida 1986). Tth DNA ligase 유전자는 1991년에 Francis Barany 등과 Gail Lauer 등의 서로 다른 두 group에 의해 대장균에 cloning되어 그 DNA 염기서열이 동시에 보고되었으며 (Barany and Gelfand 1991; Lauer et al. 1991) T. scotoductus (Jonsson et al. 1994), Thermus filifirmis ( Kim and Kwon 1997), Rhodothermus marinus (Thorbjarnardottir et al. 1995) 등에서 내열성 DNA ligase 유전자가 cloning되었다. 특히 Thermus filifirmis DNA ligase 유전자의 경우 대장균에서 발현된 내열성 효소를 이용하여 처음으로 3차구조를 완전히 밝히는 데 성공하였다 (Lee et al. 2000). 그러나, Archaea의 DNA ligase는 현재까지 오직 Desulfurolobus ambivalens (Kletzin 1992)에서만 발견되었다. bacteral ligase와는 다른 점은 bacteriophase, eukaryotes 그리고 virus 처럼 ATPdependent라는 것이다. 59. 기타 다른 중요한 효소들 상기의 polymer의 분해와 DNAmodifying 효소외에도, 극한환경에서 서식하는 미생물에서 유래된 여러 효소들은 학문적인 관심과 산업적인 응용에서 그 역할이 기대된다 (Table 7). a) Glucose isomerase Glucose isomerase나 xylose isomerase는 Dfructose와 Dxylulose를 Dglucose와 Dxylose의 reversible isomerization을 촉매한다. 이 효소는 highfructose corn 시럽 생산에 이용되기 때문에 식품산업에 있어 큰 시장성을 지닌다. glucose와 fructose의 균형있는 융합은 sucrose보다 1.3배의 단맛을 낸다. glucose isomerase는 중온성 미생물에서 널리 분포한다. Highfructose 시럽의 제조를 위한 산업에 이용은 적합한 것을 개발하는 방향으로 향하게 되었다. Fructose 농도가 55%가 되기 위해서는 110 가까이에서 반응해야한다. 개발된 thermostable glucose isomerase는 mesophilic enzyme으로부터 engineering되었다. Thermus flavus AT62의 xylose isomerase (Xyl A) 유전자가 cloning 되고 DNA 여기서열이 결정되었다 (Park et al. 1997). Xyl A는 90, ph 7.0에서 최적 활성을 띄며 Mn, Co, Mg 같은 2가 양이온이 효소활성에 요구된다. Thermoanaerobacterium strain JW/SLYS 489의 xylose isomerase는 ph 6.4, 60 또는 ph 6.8, 80 에서 최적 활성을 나타낸다 (Liu et al. 1996). 다른 xylose isomerase처럼 이 효소도 thermal stability에 Mn, Co, Mg를 요구한다. Thermus strain JW/SLYS 489의 encoding된 xylose isomerase는 E. coli에서 cloning되고 발현되었으며 염기서열이 결정되었다. 다른 xylose isomerase의 sequence를 토대로 추론한 아미노산 sequence는 T. saccharolyticum B6ARI에서 유래된 것과 98 %의 homology를 보이고 있다. thermostable glucose isomerase는 Thermotoga maritima에서 purification되고 characterization 되었다 (Brown et al. 1993). 이 효소는 100 이상에서도 안정하고 115 에서 10분의 halflife를 지닌다. 흥미롭게도 Thertoga neapolitana (Vielle et al. 1995)에서 유래된 glucose isomerase는 6090 사이에서 thmoactive를 지니는 glucose isomerase보다 214배 높은 90 에서 촉매작용을 하는 것으로 알려졌다. b) Alcohol dehydrogenase Secondary alcohol의 oxidation을 촉매하는 alcohol dehydrogenase는 생명공학에서 중요하다. 이들 효소들을 많은 널리 분포되어 있지만 초고온균에서는 단지 일부 균에서 알려져 있다 ( Table 7 참조). 이들 초고온균중에서 Thermoanaerobacter ethanolicus 39E의 alcohol dehydrogenase는대장균에 클로닝되어서 발현되고 있다(Burdette et al. 1997). 또 Sulfolobus solfataricus (Rella et al. 1987), Thermococcus stetteri(ma et al. 1994)에서 연구되었고, Thermococcus stetteri alcohol dehydrogenase는85 에서 2시간, 98 에서 15분간의 반감기를 가지고 있다. c) β Galactosidase β Galactosidase (lactase, EC )는 β 1,4Dgalactosidic linkages를 가수분해하는 효소이며, 동시에 transgalactosylation 반응도 촉매한다. 즉, β Galactosidase는 lactose를 glucose와 galactose로 분해시킬 뿐 아니라, 반응조건에 따라 glucose에 galactose를 결합시켜 oligosaccharides를 생산할 수 있는 효소로서 저유당 제조 및 장내유용 미생물인 Bifidobacterium의 증식을 촉진시키는 기능성 올리고당 제조에 β galactosidase가 이용된다 (Tanaka et al. 1983). 그러나, 현재 공업적으로 사용되고 있는 효소들은 대부분 중온성 균으로부터 생산돤 것으로 유기용매 및 열에 불안정하며, 실활하기 쉽기 때문에

10 산업적으로 이용하기에는 많은 단점이 있다. 내열성 효소의 산업적인 응용의 몇 가지 예로서 1 우유속의 유당을 효과적으로 분해하기 위해서는 열에 상당히 안정한 내열성 β galactosidase를 고정화하여 우유의 저온살균 (pasteurization) 온도인 65 정도에서 유당을 신속하게 분해시킬 수 있다. 즉 37 유당분해 후, 65 살균의 두 단계를 거치지 않고, 유당분해와 살균을 65 에서 수행할 수 있으므로 한 단계로 줄이는 것이 가능하며 다량의 유당을 효과적으로 분해할 수 있으므로 원가절감 측면에서 상당히 경쟁력이 있다. 2 Galactose 전이반응에 의한 기능성 올리고당 제조시에도 중온성 균이 생산한 β galactosidase를 이용하기 보다는 내열성 β galactosidase를 이용한다면 기질인 lactose의 용해도를 상승시켜 전이당의 수율을 올릴 수 있고, 고온에서 반응하므로 반응속도가 빠르며 다른 잡균의 번식을 방지할 수 있다는 많은 장점을 갖고 있다. 이러한 내열성 효소의 장점 때문에 내열성 β galactosidase, β glycosidase에 대한 연구가 Thermus 균주 (Han et al. 2001; Cowan et al. 1984; Koyama et al. 1990) 및 Sulforobus (Pisani et al. 1990; Moracci et al. 1992) 등의 균주에서 다각적으로 연구가 진행되고 있다. d) Alkaline phosphatase Alkaline phosphatase (orthophosphoricmonoester phosphohydrolase, EC ,)는 phosphate monoester의 가수분해를 촉매하거나 transphosphorylation을 촉매하는 효소이다 (McComb et al. 1979). 이 효소는 미생물에서부터 포유류에 이르기까지 폭넓게 분포하는 아연효소로서 대부분 active site에 2개의 Zn 2 와 1개의 Mg 2 이 작용한다. Alkaline phosphatase는 배지 내에 phosphate가 결핍시 유도되고 phosphate에 의해 저해되는 효소로서 세포내의 그람음성균의 periplasmic space나 그람양성균인 경우에는 extracellular medium으로 분비된다. 여러 종들 중에서 가장 연구가 잘된 것은 E. coli의 APase로 BAP (bacterial alkaline phosphatase)이라고도 하며, phosphate (pho) regulon에 속하는 phoa 유전자 산물이다. 기존의 calf intestine alkaline phosphatase (CIP) 처리로는 5 이 함몰된 DNA 부위 (5 recessed termini)의 인산제거가 어려웠으나 내열성 Tca APase가 개발되면 높은 온도에서 반응시키므로써 DNA의 selfligation 방지를 할 수 있다. 이 효소는 상당히 안정하여 DNA 및 antibody의 nonradioactive labelling 등에 상당히 적합할 것으로 보인다. 고온균에서 보고된 것은 Thermus aquaticus YT1 (Yeh and Trela 1976; Smile et al. 1997), Thermus caldophilus GK24이며, 특히 Thermus caldophilus GK24 alkaline phosphatase의 경우 대장균에 클로닝되어 발현되고 있다 (Kim et al. 1997; Park et al. 1999). 6. 참고문헌 Annison G (1992) Commercial enzyme supplementation of wheatbased diets raises ideal glycanase activities and improves pparent metabolisable energy starch and pentosan digestibilities in broiler chockens. Anim Feed Sci Technol 38: Auer T, Landre PA, Myers TW (1995) Properties of the 5'3' exonuclease/ribonuclease H activity of Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry 34: Barany F (1991) Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase. Proc Natl Acad Sci USA 88: Barany F, Gelfand DH (1991) Cloning, overexpression and nucleotide sequence of a thermostable DNA ligaseencoding gene. Gene 109: 111 Barnes WM (1992) The fidelity of Taq polymerase catalyzing PCR is improved by an Nterminal deletion. Gene 112: 2935 Barnes WM (1994) PCR amplification of up to 35kb DNA fragments with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates. Proc Natl Acad

11 Sci USA 91: Bauer MW, Driskill LE, Callen W, Snead MA, Mathur EJ, Kelly RM (1999) An endoglucanase, EglA, from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus hydrolizes α 1,4 bonds in mixedlinkage (1 3), (1 4)β Dglucans and cellulose. J Bacteriol 181: Bertoldo C, Duffiner F, Jorgensen PL, Antranikian G (1999) Pullulanase type I from Fervidobacterium pennavorans Ven5: cloning, sequencing, expression of the gene and biochemical characterization of the recombinant enzyme. Appl Environ Microbiol Vol. 65 Bibel M, Brettl C, Gosslar U, Kreigshauser G, Liebl W (1998) Isolation and analysis of genes for amylolytic enzymes of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima. FEMS Microbiol Lett 158: 915 Bok JD, Goers SK, Eveleigh DE (1994) Cellulase and xylanase systems of Thermotoga neapolitana. ACS Symp Ser 566: 5465 Bok JD, Dinesh A, Yernool DA, Eveleigh D (1998) Purification, characterization and molecular analysis of thermostable cellulases Cel A and Cel B from Thermotoga neapolitana. Appl Environ Microbiol 64: Bost DA, Stoffel S, Landre P, Lawyer FC, Akers J, Abramson RD, Gelfand DH (1994) Enzymatic characterization of Thermotoga maritima DNA polymerase and a truncated form, Ultma DNA polymerase. FASEB J 8: A1395 Bronnenmeier K, Kern A, Liebl W, Staudenbauer WL (1995) Purification of Thermotoga maritima enzymes for the degradation of cellulose materials. Appl Environ Microbiol 61: Brock, T. D. (1986) Thermophiles (Brock, T. D., ed.) pp. 2728, John Wiley & Sons, Inc., New York Brown SH, Sjholm C, Kelly RM (1993) Purification and characterization of a highly thermostable glucose isomerase produced by the extremely thermophilic eubacterium Thermotoga maritima. Biotechnol Bioeng 41: Brown SH, Sjholm C, Kelly RM (1993) Purification and characterization of a highly thermostable glucose isomerase produced by the extremely thermophilic eubacterium Thermotoga maritima. Biotechnol Bioeng 41: Burdette D, Secundo F, Phillips R, Dong J, Scott R, Zeikus JG (1997) Biophysical and mutagenic analysis of Thermoanaerobacter ethanolicus 39E secondary alcohol deydrogenase and enzyme biochemical characterization. Biochem J 316: Burlini N, Magnani P, Villa A, Macchi F, Tortora P, Guerritore A (1992) A heatstable serine proteinase from the extreme thermophilic archaebacterium Sulfolobus solfataricus. Biochim Biophys Acta 1122: Canganella F, Andrade C, Antranikian G (1994) Characterization of amylolytic and pullulytic enzymes from thermophilic archaea and from a new

12 Fervidobacterium species. Appl Microbiol Biotechnol 42: Cannio R, Fiorentino G, Carpinelli P, Rossi M, Bartolucci S (1996) Cloning and overexpression in Escherichia coli of the genes encoding NADdependent alcohol deydrogenase from two Sulfolobus species. J Bacteriol 178: Cariello NF, Swenberg JA, Skopek TR (1991) Fidelity of Thermococcus litoralis DNA polymerase (Vent) in PCR determined by denaturating gradient gel electrophoresis. Nucleic Acids Res 19: Chang JR, Choi JJ, Kim HK, Kwon ST (2001) Purification and properties of Aquifex aeolicus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. FEMS Microbiology Letters 201: 7377 Chen CC, Adolphson R, Dean FDJ, Eriksson KEL, Adamas MWW, Westpheling J (1997) Release of lignin from kraft pulp by a hyperthermophilic xylanase from kraft pulp by a hyperthermophilic xylanase from Thermotoga Maritima. Enzyme Microbiol Technol 20: 3945 Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higushi R (1994) Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA. Proc Natl Acad Sci USA 91: Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976) Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol 127: Choi JJ, Kim HK, Kwon ST (2001) Purification and Characterization of the 5'3'exonuclease domaindeleted Thermus filiformis DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Biotechnology Letters: in press Choi JJ, Kwon ST (2000) Study on an optimal condition for production of a thermostable protease from Thermus sp. X1. Sungkyunkwan University J. of life science and Technology 6: Chung YC, Kobayashi T, Kanai H, Akiba T, Kudo T (1995) Purification and properties of extracellular amylase from the hyperthermophilic archeon Thermococcus profundus DT5432. Appl Environ Microbiol 61: Cline J, Braman JC, Hogrefe HH (1996) PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucleic Acids Res 24: CohenKupiec R, Chet I (1998) The molecular biology of chitin digestion. Curr Opin Biotechnol 9: Coleman JE, Gettins P (1983) Chapter. 5. Molecular properties and mechanism of alkaline phosphatase. In Metal Ions in Biology (spiro, T. G., ed) vol. 5, pp , John Wiley and Sons, New York. Coozzarelli NR, Melechen NE, Jovin TM and Kornberg A.(1967) Polynucleotide cellulase as a substrate for a polynucleotide ligase induced by phage T4, Biochem. Biophys. Res. Commun. 28:

13 Cowan DA, Daniel RM. Martin AM, Morgan HW (1984) Some properties of a β galactosidase from extreme thermophilic bacterium. Biotechnol. Bioeng. 26: Cowan DA, Smolenski KA, Daniel RM, Morgan HW (1987) An extremely thermostable extracellular proteinase from a strain of the archaebacterium Desulfurococcus growing at 88. Biochem J 247: Deckert G, Warren PV, Gaasterland T, Young WG, Lenox AL, Graham DE, Overbeek R, Snead MA, Keller M, Aujay M, Huber R, Feldman RA, Short JM, Olsen GJ and Swanson RV (1998) The complete genome of the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Nature 392, Dong G, Vieille C, Savchenko A, Zeikus JG (1997a) Cloning, sequencing and expression of the gene encoding extracellular α amylase from Pyrococcus furiosus and biochemical characterisation of the recombinant enzyme. Appl Environ Microbiol 63: Dong G, Vieille C, Zeikus JG (1997b) Cloning, sequencing and expression of the gene amylopullulanase from Pyrococcus furiosus and biochemical characterisation of the recombinant enzyme. Appl Environ Microbiol 63: Eggen HIL, Geerling A, Watts J, Vos WM de (1990) Characterization of pyrolysin, a hyperthermoactive serine protease from the archaeobacterium Pyrococcus furiosus. FEMS Microbiol Lett 71: 1720 Frey B, Suppmann B (1995) Demonstration of the Expand PCR System's greater fidelity and higher yields with a lacibased fidelity assay. Biochemica 2: 3435 Friedrich A, Antranikian G (1996) Keratin degradation by Fervidobacterium pennavorans, a novel thermophilic anaerobic species of the order Thermotogales. Appl Environ Microbiol 62: Fujiwara S, Okuyama S, Imanaka T (1996) The world of archaea: genome analysis, evolution and thermostable enzymes. Gene 179: Fukusumi S, Kamizono A, Horinouchi S, Beppu T (1988) Cloning and nucleotide sequence of a heat stable amylase gene from an anaerobic thermophile, Dictyoglomus thermophilum. Eur J Biochem 174: 1523 Fusek M, Lin XL, Tang J (1990) Enzymic properties of thermopsin. J Biol chem 265: Fusi P, Villa M, Burlini N, Tortora P, Guerritore A (1991) Intracellular proteases from the extremely thermophilic archaebacterium Sulfolobus solfataricus. Experientia 47: Gabelsberger J, Liebl W, Schleifer KH (1993) Cloning and characterization of β galactoside and β glucoside hydrolysing enzymes of Thermotoga maritima. FEMS Microbiol Lett 109:

14 Gibbs MD, Reeves RA, Bergquist PL (1995) Cloning, sequencing and expression of a xylanase gene from the extreme thermophile Dictyoglomus thermophilum Rt46B.1 and activity of the enzyme on fiberboundsubstrate. Appl Environ Microbiol 61: Grogan DW (1991) Evidence that β galactosidase of Sulfolobus solfataricus is only one of several activities of a thermostable β Dglycosidase. Appl Environ Microbiol 57: Gyllensten UB (1989) PCR and DNA sequencing. Biotechniques 7: Han KW, Yoo JS, Oh EJ, Choi JJ, Kim HK, Kwon ST (2001) Purification and characterization of a thermostable β glycosidase from Thermus caldophilus GK24. Biotechnology Letters 23: Haseltine C, Rolfsmeier M, Blum P (1996) The glucose effect and regulation of α amylase synthesis in the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus. J Bacteriol 178: Huber R, Wilharm T, Huber D, Tricone A, Burggraf S, Konig H, Rachel R, Rockinger I, Fricke H and Stetter KO (1992) Aquifex pyrophilus gen. nov. sp. nov., represents a novel group of marine hyperthermophilic hydrogenoxidizing bacteria. Syst. Appl. Microbiol. 15, Hjorleifsdottir S, Ritterbusch W, Petursdottir SK, Kristjansson JK (1997) Thermostabilities of DNA ligases and DNA polymerases from four genera of thermophilic eubacteria. Biotechnol Lett 19: Hoe HS, Kim HK, Kwon ST (2001) Expression in Escherichia coli. of the thermostable inorganic pyrophosphatase from Aquifex aeolicus and Purification and characterization of the recombinant enzyme. Protein Expression and Purification. in press Ikeda M, Clark SC (1998) Molecular cloning of extremely thermostable esterase gene from hyperthermophilic archeon Pyrococcus furiosus in Escherichia coli. Biotechnol Bioeng 57: Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA (1988) DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reactionamplified DNA. Proc Natl Acad Sci USA 85: Jones MD, Foulkes NS (1989) Reverse transcription of mrna by Thermus aquaticus DNA polymerase. Nucleic Acids Res 17: Jonsson ZO, ThorbjarnardIottir SH, Eggertsson G, Palsdottir A (1994) Sequence of the DNA ligasesencoding gene from Thermus scotoductus and conserved motifs in DNA ligases. Gene 151: Jorgensen S, Vorgias CE, Antranikian G (1997) Cloning, sequencing and expression of an extracellular α amylase from the hyperthermophilic archeon Pyrococcus furiosus in Escherichia coli and Bacillus subtilis. J Biol Chem 272:

15 Jung SE, Choi JJ, Kim HK, Kwon ST (1997) Cloning and analysis of DNA polymeraseencoding Gene from Thermus filiformis. Molecules and Cells 7(6): Kaledin AS, Sliusarenko AG, Gorodetskii SI (1981) Isolation and properties of DNA polymerase from the extreme thermophilic bacterium Thermus Flavus. Biokhimiia 46: Kas HS (1997) Chitosan: properties, preparations and application to microparticulate systans. J. Microencapsulation 14: Kengen SWM, Luesink EJ, Stams AJM, Zehnder AJB (1993) Purification and characterization of an extremely thermostable β glucosidase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus. Eur J Biochem 213: Kim CH, Nashiru O, Ko JH (1996) Purification and biochemical characterization of pullulanase type I from Thermus caldophilus GK24. FEMS Microbiol Lett 138: Kim HK, Kwon ST (1998) Cloning, Nucleotide sequence, and expression of the DNA ligaseencoding gene from Thermus filiformis. Molecules and Cells 8 (4): Kim JS, Koh S, Kim JJ, Kwon ST, Lee DS (1998) Top DNA polymerase from Thermus thermophilus HB27 : Gene cloning, sequence determination, and physicochemical properties. Molecules and Cells 8 (2): Kim YJ, Park TS, Kim HK, Kwon ST (1997) Purification and characterization of a thermostable alkaline phospahtase produced by Thermus caldophilus GK24. J. Biochem. Mol. Biol. 30: Kletzin A (1992) Molecular characterisation of a DNA ligase gene of the extremely thermophilic archaeon Desulfurolobus ambivalens shows close phylogenetic relationship to eukaryotic ligases. Nucleic Acids Res 20: Klingeberg M, Hashwa F, Antranikian G (1991) Properties of extremely thermostable proteases from anaerobic hyperthermophilic bacteria. Appl Microbiol Biotechnol 34: Klingeberg M, Galunsky B, Sjoholm C, Kasche V, Antranikian G (1995) Purification and properties of highly thermostable, SDS resistant and stereospecific proteinase from the extreme thermophilic archaeon Thermococcus stetteri. Appl Environ Microbiol 61: Koch R, Spreinat K, Lemke K, Antranikian G (1991) Purification and properties of a hyperthermoactive α amylase from the archaeobaterium Pyrococcus woesei. Arch Microbiol 155: Koch R, Canganella F, Hippe H, Jahnke KD, Antranikian G (1997) Purification and propeties of a thermostable pullulanase from a newly isolated thermophilic anaerobic bacterium Fervidobacterium pennavorans Ven5. Appl Environ Microbiol 63:

16 Kong H, Kucera RB, Jack WE (1993) Characterization of a DNA polymerase from the hyperthermophile archaea Thermococcus litoralis. Vent DNA polymerase, steady state kinetics, thermal stability, processivity, strand displacement, and exonuclease activities. J Biol Chem 268: Kotewicz ML, Sampson CM, D'Allessio JM, Gerard GF (1988) Isolation of cloned Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase lacking ribonuclease H activity. Nucleic Acids Res 16: Koyama Y, Okamoto S, Furukawa K (1990) Cloning of α and β galactosidase genes from an extreme thermophile, Thermus strain T2, and their expression in Thermus thermophilus HB27. Appl. Environ. Microbiol. 56: Kwak YS, Akeba T, Kudo T (1988) Purification and characterization from hyperthermophilic archaeon Thermococcus profundus, which hydrolyzes both α 1,4 and α 1,6 glucosidic linkages. J Ferment Bioeng 86: Kwon ST, Kim JS, Park JH, Kim HK, Lee DS (1997) Cloning and analysis of the DNA polymeraseencoding gene from Thermus caldophilus GK24. Molecules and Cells 7(2): Kwon ST, Kim JS, Park JH, Koh SH, Lee DS (1991) Enhanced expression in Escherichia coli of cloned Thermus aquaticus DNA polymerase gene by optimized distance between ShineDalgarno sequence and ATG codon. Molecules and Cells 1: Kwon ST, Terada I, Matsuzawa H, Ohta T. (1988) Nucleotide sequence of the gene for aquqlysin I(a thermophilic serine protease) of Thermus aquqticus YT1 and characteristics of the deduced primary structure of the enzyme. Eur. J. Biochem. 173: Laderman KA, Davis BR, Krutzsch HC, Lewis MS, Griko YV, Privalov PL, Anfinsen CB (1993a) The purification and characterization of an extremely thermostable α amylase from the hyperthermophilic archaebaterium Pyrococcus furiosus. J Biol Chem 268: Laderman KA, Davis BR, Krutzsch HC, Lewis MS, Griko YV, Privalov PL, Anfinsen CB (1993a) The purification and characterization of an extremely thermostable α amylase from the hyperthermophilic archaebaterium Pyrococcus furiosus. J Biol Chem 268: Laderman KA, Asada K, Uemori T, Mukai H, Taguchi Y, Kato I, Anfinsen CB (1993b) Alphaamylase from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furisus. Cloning and sequencing of the gene and expression in Escherichia coli. J Biol Chem 268: Landegren U, Kaiser R, Sanders J, Hood L (1988) A ligasemediated gene detection technique. Science 241: Lawyer FC, Stoffel S, Saiki RK, Chang SY, Landre PA, Abramson RD, Gelfand DH (1993) Highlevel expression, purification, and enzymatic characterization of fulllength Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3'exonuclease activity. PCR Methods Appl 2: Lauer G, Rudd EA, Mckay DL, Ally A, Ally D, Backman KC (1991) Cloning,nucleotide sequence, and engineered expression of Thermus thermophilus DNA ligase, a homolog of Escherichia coli DNA ligase. J. Bacteriol. 173:

17 Lawyer FC, Stoffel S, Saiki RK, Chang SY, Landre PA, Abramson RD, Gelfand DH (1993) Highlevel expression, purification, and enzymatic characterization of fulllength Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3'exonuclease activity. PCR Methods Appl 2: Lee JY, Kim HK, Chang C, Song HK, Moon J, Yang JK, Kim HK, Kwon ST, Suh SW (2000) Crystal structure of NAD dependent DNA ligase: modular architecture and functional implications. The EMBO Journal 19 (5): Liu SY, Wiegel J, Gherardini FC (1996) Purification and cloning of a thermostable xylose (glucose) isomerase with an acidic ph optimum from Thermoanaerobacterium strain JW/SLYS 489. J Bacteriol 178: Lundberg KS, Shoemaker DD, Adams MWW, Short JM, Sorge JA, Marthur EJ (1991) Highfidelity amplification using a thermostable polymerase isolated from Pyrococcus furiosus. Gene 108: 16 Ma K, Robb FT, Adams MWW (1994) Purification and characterization of NADP specific alcohol deydrogenase from the thermophilic archaeon Thermococcus hydrothermalis. Appl Environ Microbiol 60: Mayr J, Lupas A, Kellermann J, Eckerskorn C, Baumeister W, Peters J (1996) A hyperthermostable protease of the subtilisin family bound to the surface of the layer of the archaeon Staphylothermus marinus. Curr Biol 6: McDonough TJ (1992) A survey of mechanical pulp bleaching in Canada: singlestage hydrosulfite lines are the rule. Pulp Paper Can 93: 57 Mead DA, McClary JA. Luckey JA, Kostichka AJ, Witney FR, Smith LM (1991) Bst DNA polymerase permits rapid sequence analysis from nanogram amounts of template. Biotechniques 11: 7678 McComb, R. B., Bower, B. N. and Posen, S. (1979) Alkaline phoaphatase. Plenum, New York. Moracci M, Ciaramella M, R. N, Pearl LH, Sanderson I, Trincone A, Rosi M (1993) Thermostable β glycosidase from Sulfolobus solfataricus. Biocatalysis 11: Moracci M, Adriana La Volpe, Pulitzer JF, Rossi M, Ciaramella M. (1992) J. Bacteriol, 174: Morikawa M, Izawa Y, Rashid N, Hoaki T, Imanaka T (1994) Purification and characterization of a thermostable thiol protease from a newly isolated hyperthermophilic Pyrococcus sp. Appl Environ Microbiol 60: Myers TW, Gelfand DH (1991) Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry 30: Nilsson J, Bosnes M, Larsen F, Nygren PA, Uhlen M, Lundeberg J (1997) Heatmediated activation of affinityimmobilized Taq DNA polymerase.

18 Biotechniques 22: Norman BE, Jorgensen ST (1992) Thermoanaerobacter sp. CGTase: its properties and application. Depun Kagaku 39: Nucci R, Moracci M, Vaccaro C, Vespa N, Rossi M (1993) Exoglucosidase activity and substrate specificity of the β glucosidase isolated from the extreme thermophilic Sulfolobus solfataricus. Biotechnol Appl Biochem 17: Park BC, Koh S, Chang C, Suh SW, Lee DS, Byun SM (1997) Cloning and expression of the gene for xylose isomerase from Thermus Flavus AT62 in Escherichia coli. Appl Biochem Biotechnol 62: 1527 Park JH, Kim JS, Kwon St, Lee DS (1993) Purification and characterization of Thermus caldophilus GK24 DNA polymerase. Eur J Biochem 214: Park TS, Lee JH, Kim HK, Hoe HS, Kwon ST (1999) Nucleotide sequence of the gene for alkaline phosphatase of Thermus caldophilus GK24 and characteristics of the primary structure of the enzyme. FEMS Microbiology Letters, 180: Perler FB, Kumar S, Kong H (1996) Thermostable DNA polymerases. Adv Protein Chem 48: Pisani FM, Rella R, Raia C, Rozzo C, Nucci R, Cambacorta A, De Rosa M, Rossi M (1990) Eur. J. Biochem. 187: Reeve MA, Fuller CW (1995) A novel thermostable polymerase for DNA sequencing. Nature 376: Rella R, Raia CA, Pensa M, Pisani FM, Gambacorta A, Rosa M de, Rossi M (1987) A novel archeabacterial NAD dependent alcohol deydrogenase: purification and properties. J. Biochem (Tokyo) 167: Rudiger A, Jorgensen PL, Antranikian G (1995) Isolation and characterization of a heat stable pullulanase from the hyperthermophilic archeon Pyrococcus woesei after cloning and expression of its gene in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 61: Ruttersmith LD, Daniel RM (1991) Thermostable cellobiohydrolase from the thermophilic eubacterium Thermotoga sp. strain FjSS3B.1. Purification and properties. Biochem J 277: Ruttimann C, Cotoras M, Zaldivar J, Vicuna R (1985) DNA polymerases from the extremely thermophilic bacterium Thermus thermophilus HB. Eur J Biochem 149: 4146 Saiki RK, Gelfand DH, Stoffe S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA (1988) Primerdirected enzymatic amplification of DNA with thermostable DNA polymerase. Science 239: Saul DJ, Williams LC, Reeves RA, Gibbs MD, Bergquist PL (1995) Sequence and expression of a xylanase gene from the hyperthermophilic Thermotoga sp.

19 strain FjSS3B.1 and characterization of the recombinant enzyme and its activity on craft pulp. Appl Environ Microbiol 61: Schumann J, Wrba A, Jaenicke R, Stetter KO (1991) Topographical and enzymatic characterization of amylase from the extreme thermophilic eubacterium Thermotoga maritima. FEBS Lett 282: Simpson HD, Haufler UR, Daniel RM (1991) An extremely thermostable xylanase from the thermophilic eubacterium Thermotoga. Biochem J 277: Smile DH, Donohue M, Yeh MF, Kenkel T, Trela JM (1997) Repressible alkaline phosphatase from Thermus aquaticus. J. Biol. Chem. 252: Southworth MW, Kong H, Kucera RB, Ware J, Jannasch HW, Perler FB (1996) Cloning of thermostable DNA polymerases from hyperthermophilic marine Archaea with emphasis on Thermococcus sp. 9 degrees N7 and mutations affecting 3'5' exonuclease activity. Proc Natl Acad Sci USA 93: Sunna A, Antranikian G (1997a) Growth and production of xylanolytic enzymes by the extreme thermophilic anaerobic bacterium Thermotoga thermarum. Appl Mirobiol Biotechnol 45: Tabor S, Richardson CC (1995) A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA 92: Tachibana Y, Mendez LM, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T (1996) Cloning and expression of the α amylase gene from the hyperthermophilic archeon Pyrococcus sp. KOD1 and characterization of the enzyme. J Ferment Bioeng 82: Takagi M, Nishioka M, Kakihara H, Kitabayashi M, Inoue H, Kawakami B, Oka M, Imanaka T (1997) Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. strain KOD1 and its application to PCR. Appl Environ Microbiol 63: Takahashi M, Yamaguchi E, Uchida T (1984) Thermophilic DNA ligase. J. Biol. Chem. 259: Takahashi M, Uchida T (1986) Thermophilic HB8 DNA ligase: Effects of Polyethylene Glycols and Polyamines on BluntEnd Ligation of DNA. J. Biochem. 100: Thorbjarnardottir SH, Jonsson ZO, Andresson OS, Kristjansson JK, Eggertsson G, Palsdottir A (1995) Cloning and sequence analysis of the DNA ligaseencoding gene of Rhodothermus marinus, and overproduction, purification and characterization of two thermophilic DNA ligases. Gene 161: 16 Tanaka R, Takayama H, Morotomi M, Kuroshima T, Ueyama S, Matsumoto K, Kuroda A, Mutai M (1983) Bifidobact Microflora 2: 1724 Teeri TT, Koivula A, Linder M, Wohlfahrt G, Divne C, Jones TA (1998) Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose? Biochem Soc Trans 26: Teo VS, Saul DJ, Bergquist PL (1995) CelA, another gene coding for a multidomain cellulase from the extreme thermophile Caldocellum saccharolyticum.

20 Appl Microbiol Biotechnol 43: Thorbjarnardottir SH, Jonsson ZO, Andresson OS, Kristjansson JK, Eggertsson G, Palsdottir A (1995) Cloning and sequence analysis of the DNA ligaseencoding gene of Rhodothermus marinus, and overproduction, purification and characterization of two thermophilic DNA ligases. Gene 161: 16 Tse WT, Forget BG (1990) Reverse transcriptation and direct amplification of cellular transcripts by Taq polymerase. Gene 88: Vander HPB, Davis MC, Cunniff JJ, Ruan C, McArdle BF, Samols SB. Szasz J, Hu G, Hujer KM, Domke ST, Brummet SR, Moffett RB, Fuller CW (1997) Thermo Sequenase DNA polymerase and T. acidophilum pyrophosphatase: new thermostable enzymes for DNA sequencing. Biotechniques 22: Vieille C, Hess JM, Kelly RM, Zeikus JG (1995) xyla cloning and sequencing and biochemical characterization of xylose isomerase from Thermotoga neapolitana. Appl Environ Microbiol 61: Viikari L, Kantelinen A, Sundquist J, Linko M (1994) Xylanases in bleaching. From an idea to industry. FEMS Microbiol Lett 13: Volkl P, Markiewicz, Stetter KO, Miller JH (1995) The sequence of a subtilisintype protease (aerolysin) from the hyperthermophilic archaeon Pyrobaculum aerophilum reveals sites important to thermostability. Protein Sci 3: Voorhorst WGB, Eggen RIL, Luesink EJ, Vos WM de (1995) Characterization of the celb gene coding for β glucosidase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus and its expression and sitedirected mutation in Escherichia coli. J Bacteriol 177: Voorhorst WGB, Eggen RIL, Geerling ACM, Platteeuw C, Siezen RJ, Vos WM de (1996) Isolation and characterization of the hyperthermostable serine protease, pyrolysin, and its gene from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus. J Biol Chem 271: Wind R, Liebl W, Buitlaar R, Penninga D, Spreinat A, Dijkhuizen L, Bahl H (1995) Cyclodextrin formation by the thermostable α amylase of Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EM1 and reclassification of the enzyme as a cyclodextrin glycosyltransferase. Appl Environ Microbiol 61: Winterhalter C, Liebl W (1995) Two extremely themostable xylanases of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima MSB8. Appl Environ Microbiol 61: Yang JL, Eriksson KEL (1992) Use of hemicellulolytic enzymes as one stage in bleaching of kraft pulps. Holzforschung 46: Yeh MF, Trela JM (1976) Purification and characterization of repressible alkaline phosphatase from Thermus aquaticus. J. Biol. Chem. 251: Yoo J, Han KW, Kim HK, Kim MH, Kwon ST (2000) Purification and characterization of a thermostable β glycosidase from Thermus caldophilus GK24. J. Microbiol. Biotechnol. 10 (5):