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태훈 엽
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15 CR rimer 그림 1 OligoTM의 주화면 그림 2 CR의 정보표시 화면 ③ 특이성이 높을 것 건을 충족하는 primer는 대단히 효율이 높은 CR primer rimer와 주형 DNA가 만드는 두가닥 DNA의 안 가 될 수 있다. 정성(duplex stability)을 해석한다. 전술한 바와 같이 효 율이 높은 CR을 위해 primer 3 말단과 주형 DNA의 Ⅱ. CR rimer의 설계 안정된 결합이 필요하지만 반대로 너무 안정되면 primer 특이성이 낮아지기 때문에 primer 3 말단의 G가 너 무 낮은 것은 제외한다. CR을 실시하기 위해서는 primer가 반드시 필요하다. 그 런데 CR 관련 논문에는 primer의 염기서열은 기재되어 있으나 어떤 이유에 근거, 어떠한 방법론을 이용해서 염기 ④ Dimer와 hair pin 구조를 형성할 가능성이 없을 것 서열을 결정한 것인지에 관한 기재가 거의 없다. 본 고에서 3염기 이상 수소 결합이 연속하는 스템(stem)을 형성할 가 는 primer를 디자인 하는데 있어서 고려해야 하는 각종 요 능성이 있는 primer는 제외한다. 소에 대하여 간단히 설명하였다. 특히 염기서열의 특이성을 검토하기 위하여 종래부터 이용 ⑤ 3 측의 서열이 특이적일 것 >>16 하여 온 homology 검색이 primer에는 통용하기 어려운 주형 DNA 의 다른 부위와 3 측 7염기의 서열이 같은 점을 강조하고 대신 결합능(hybridizability)을 지표로 한 primer는 제외한다. 새로운 방법론을 소개한다. 이들 5가지 조건을 충촉하는 두 개의 primer를 자동적으 CR을 실제로 실시하는 경우 온도조건을 조절하는 로 선택한다. 또 실험에 필요한 최적 annealing 온도 등의 기계(thermal cycler), 효소, 완충액 등과 함께 필수불가 정보를 표시한다. 그림 2는 CR의 정보를 표시한 윈도우 결한 요소가 oligonucleotide primer로 목적이 되는 유전 이다. 증폭하는 위치, 최적 annealing 온도, primer의 길 자는 2종류의 CR primer 사이에서 증폭된다. 이, Tm 값, GC 함유량 등의 정보를 표시한다. 이상의 조 최근 oligonucleotide의 합성에 소요되는 비용이 낮아져

16 CR rimer 염기서열 설계 그 자체에 중점을 두지 않고 다수 합성하여, 1. CR rimer 설계에 필요한 인자 실험을 통해 증폭할 수 있는 pair를 찾는 경향이 있다. 그 러나 일회성의 실험이 아니고 계속해서 같은 CR을 해야 (1) 결합능 한다면 처음 단계의 설계에서 신중을 기해 안정적이고 재 rimer와 target 유전자 사이의 결합능력은 primer 디자 현성이 높으면서도 감도가 좋은 primer를 설계해야만 한 인에 가장 기본적인 요소의 하나이다. DNA와 DNA 특이 다고 생각한다. 적 결합은 nucleotide의 Adenine(A)과 Thymine(T), 필자들은 이전부터 oligonucleotide의 probe와 primer의 Guanine(G)과 Cytosine(C)의 특이적인 결합에 의한 것 염기서열을 어떻게 결정하면 좋은지를 중심으로 연구를 진 으로 전자는 2개의 수소결합, 후자는 3개의 수소결합이므 행해 왔다. 특히 염기서열의 특이성을 강조하려고 하면 후 로, 필연적으로 A와 T가 많은 primer의 결합능력은 G와 술하는 바와 같이 종래의 homology 검색은 별로 도움이 C가 많은 primer보다 약하다. 또 항원항체반응과 Biotin, 되지 않는 경우가 많다. 그래서 범용성이 높은 컴퓨터 프로 Avidin 결합의 경우는 특이성과 달라서, DNA의 경우 조 건에 따라 특이성이 저하하여 mismatch가 있어도 결합하 primer의 디자인에 필요한 다수의 요소를 가미하여 CR 는 수가 있다. 따라서 특이성을 유지하기 위해서는 그 나름 에 관해서는 비교적 만족할 수 있는 디자인 방법을 확립하 의 연구가 필요하다. 특히 CR의 경우에는 2종류의 였다. 본고에서는 CR primer의 염기서열을 결정할 때에 primer를 사용하기 때문에 제 1 primer가 특이적으로 고려해야만 하는 각종 인자에 대하여 개설하고자 한다. target 유전자에 결합하는 조건이 제 2 primer에 따라 값 값 값 그램(HYB simulator ) 값 을 개발하였다. 또한 probe와 TM 5, 6) 그림 1 Tm 예측식의 진보 38개의 oligonucleotide를 사용해서 종축에 Tm의 실측치, 횡축에 AT pair를 2, GC pair를 4 로 한 경우의 계산 (a), Tm= (%GC)-600/L (L:probe에 의 한 계산식) (b), Breslauer 등에 의한 nearest neighbor법에 의한 예측식 (c), Santa Lucia 등에 의한 최근의 nearest neighbor법에 의한 예측식 (d)에 의한 Tm 값을 표 시하였다. >>17

18 CR rimer 유전자의 수를 표시하는 것도 특이성 판정에 도움이 된다 primer 3 말단측의 짧은 부분의 염기를 이 빈도표에 맞추 (그림 3b). 또한 대상이 되는 database를 구분함으로써 어 보아 빈도가 적은 것을 선택하는 경우도 있다. 최근 어떤 것에 대해 특이성이 있는 지를 명확히 하는 것도 중요하다. CR 프로그램에는 이 기능이 부가되어 있는 경우가 많다. 또 primer의 염기서열 특이성을 향상시킬 간이의 수단이 다. CR의 과정에서 primer는 5 말단에서 3 말단 방향으 (3) 2차구조 로 DNA 합성이 진행되어 가는데 이 3 말단에 GC 함유량 CR에 사용하는 primer는 모든 염기가 목적하는 유전자 이 많거나 3 말단이 부분적으로 Tm값이 높으면 primer의 에 결합하는 것을 전제로 하나 primer 자신이 hair pin 구 3 부분이 target 유전자와 결합하는 것만으로 DNA 합성 조를 형성해 버리면 목적 유전자에 결합할 수 없거나 다른 이 시작되어 버린다. 즉 염기 서열의 특이성이 3 말단이 짧은 유전자와 결합해 버려 false positive의 원인이 되는 경우 부분 염기서열만으로 결정되므로 당연히 특이성이 저하된다. 가 있다. 다행히 CR 반응 중에는 열에 의한 변성 과정이 따라서 3 말단의 GC 함유량을 낮도록 설계한다. 더욱이 존재하여 그 과정에서 hair pin 구조는 해소되기 때문에 대상이 되는 유전자 database 중에서 5 mer와 6 mer의 hair pin이 그만큼 중요시되지 않는 경우가 많다. 그러나 짧은 염기서열의 빈도를 계산해서 빈도표를 작성해 두고 CR 반응액 중 primer 농도는 target유전자의 농도에 비 (a) Oligonucleotide의 부위 유전자 수 kcal/mol (b) Oligonucleotide의 부위 그림 3 각 primer의 특이성 표시 rimer 후보는 target 유전자의 각 부위(횡폭)에 같은 결합능( G)을 갖도록 제작하여 그 각각에 대해서 유전자 뱅크 중의 전유전자에 대한 결합능력을 HYB simulator로 계산하였다. (a) target 유전자에 대한 G와 cross hybrization한 유전자 중 최대의 G와의 차이를 종축에 나타냈다. 이 값이 큰 만큼 특이성은 높아진 다. (b) target유전자에 대한 G에서 5 kcal/ml 약해진 경우와 cross hybrization할 가능성이 있는 유전자 중의 유전자를 종축에 나타냈다. 이 값이 클수록 특이성은 감소한다. >>19

19 CR rimer Oligonucleotide의 부위 Oligonucleotide의 부위 그림 4 각 rimer의 hair pin 구조와 dimer 형성의 가능성 rimer 후보를 target 유전자의 각 부위(횡축)에서 같은 결합능력(ΔG)이 되도록 제작하여 각각에 대해 hair pin 구조를 만드는 에너지(Kcal/mol) (a)와 dimer를 만드 는 에너지(Kcal/mol) (b)를 HYB simulator로 계산하여 종축에 표시하였다. 마이너스치가 크게 되는 만큼(아래쪽을 향하는 만큼) hair pin과 dimer를 만들기 쉬워진 하면 압도적으로 많기 때문에 primer의 hair pin은 CR 으로 존재하고 primer 쪽이 표적 유전자에 비해 작은 분자 감도를 저하시키는 원인이 된다. 이기 때문에 표적유전자가 hair pin을 형성하기에 앞서 Oligonucleotide 자체의 hair pin 구조를 형성할 가능성은 primer가 hybridizatoin할 가능성이 훨씬 높다. 따라서 표 일반적으로 kcal/mol로 계산된다. 그림 4(a)에 target 유 적 유전자의 hair pin은 그다지 문제가 되지 않는 경우가 많다. 전 자 의 각 부 위 에 서 일 정 Tm이 되 도 록 추 출 한 >>20 oligonucleotide의 hair pin 구조를 나타냈으나 primer에 (4) rimer의 상호작용 따라 hair pin 구조의 제작 가능성이 크게 다르다는 것을 CR 반응액 중의 primer의 농도는 표적 유전자의 농도와 알 수 있다. 한편 표적유전자 자체도 hair pin 구조를 형성 비교하여 압도적으로 많기 때문에 primer간에 서로 시킬 가능성이 있다. 특히 한가닥 DNA나 cdna가 주형인 hybridize하기 쉬운 구조를 갖고 있으면 이른바 primer 경우 이들 DNA에 primer가 hybridize하는 것보다도 앞 dimer를 형성하여 target 유전자와의 hybridization이 대 에 DNA 자체가 hair pin 구조를 형성해 버리면 primer가 폭 억제된다. 이 primer dimer에는 sense간, antisense간 hybridization할 수 없다. rimer가 먼저 hybridization 및 sense와 antisense간의 3종류가 있다. 한편 sense간과 하면 그 중간부위에 있는 hair pin 구조는 DNA 합성 과정에서 antisense간에서는 hybridize하지 않는 것으로 착각할 수 해소되기 때문에 문제가 되지는 않는다. 그래서 적어도 primer 있는데, 예를 들어 5 -AGCT-3 은 반대방향(3 -TCGA-5 ) 가 hybridizatoin하는 위치는 hair pin 구조를 만들기 어 에 상보성이 있으므로 충분히 dimer를 형성한다. 이들 dimer 려운 부분이 이상적이다. 그러나 실제로는 primer가 대량 의 형성 가능성은 계산으로 쉽게 예상할 수 있다(그림 4b).

37 CR용 주형 DNA의 조제 5) Taniguchi. K., Wakasugi, F., ongsuwanna, Y., 12) Wada, C., Shinoya, S., Fujino, Y., Rokuhiro, H., Urasawa, T., Ukae, S., Chiba, S., Urasawa, S. : Akahoshi, T., Uchida, T., Ohtani, H. : Blood, Epidemiol. Infect., 1 0 9, 303~312 (1992) 8 3, (1994) 6) Jiang, X., Wang, J., Graham, D. Y., Estes, M. K. : J. Clin. Microbiol., 3 0, 2529~2534 (1992) 7) Frickhofen, N., Young, N. S.: J. Virol. Methods, 3 5, 65~72 (1991) 8) Kondo, I. et al.단백질 핵산 효소, 3 5, 3041~3047 (1990) 9) Narita, M., Matsuzono, Y., Shibata, M., Togashi, T. : Acta ediatr., 8 1, 997~1001 (1992) 10) Yatani, K. et al. : 세포진단을 배우는 사람을 위하 여, pp , 의학서원 (1990) 13) 동경대학 의과학연구소 제암 연구부편 : 신 세포공학 실험 protocol, pp, 16-19, 슈우쥰사 (1983) 14) Kondo, H., Sugano. K., Fukayama. N., Kyogoku, A., Nose, H., Shimada, K., Ohkura, H., Ohtsu, A., Yoshida, S., Shimosato, Y. : Cancer, (1994) 15) Fukayama, N., et al : 임상병리. 4 1, (1993) 16) Davis, L. G., Dibner. M. D., Battey. J. F. : Basic Methods in Molecular Biology, pp Elsevier, New York (1986) 11) Tskeda, S., Ichii, S., Nakamura, Y. : Human Mutation, 2, (1993) 빠른CR, 믿을수있는 CR!! TaKaRa Gradient Thermal Cycler Dice <DICE 특장점> 1. Compact & Stylish Body Control anel & Display 일체형으로 각도조절이 가능한 wing-panel 방식으로 설치장소에 구애받지 않습니다. 2. 간단조작 op-up Menu 방식 입력으로 그래픽적인 표시화면에서 간편하게 rograming 할 수 있습니다. 3. 다기능 & 고성능 Annealing 온도의 검토가 가능한 Gradient 기능, Touch Down CR 등 다기능 고성능을 실현 4. 간단한 보수 C와의 접속으로 software 의 update 와 data의 backup이 가능하며 CR history 및 error history가 자동으로 보존됩니다. >>38

54 The Best CR Enzymes

56 HO OH 5 HO 3 3 OH A A 3 5 HO OH HO OH OH HO OH HO HO OH OH HO

58 5 CGCGGATCC 3 5 CGGGATCC 3 5 C G C G GATCC 3 CR 3 CTTAAGGC 5 5 CGCGGATCC 3 GCGCCTAGG GAATTCCG 3 CTTAAGGC 5 CGCG GCGCCTAGp 5 3 pgatcc G G CTTAAp 3 5 paattccg GGC G CCTAG AATTC G Vector

60 OH C G A T C A T C A T C A T OH C G A T C A T C A T C A T HO C G A T A C G A T A C G A T A C G A T A HO HO C G A T A C G A T A C G A T A C G A T A HO G T A G T A G T A G T A HO C G A T U A C G A T U A C G A T U A C G A T U A HO

61 OH HO T OH OH T T HO HO A HO T A

63 5 µ l 20~50 l µ 10 l µ µ µ

64 5 3 GGATCC CCTAGG GATATC CTATAG GGATCC5 CCTAGG3 GGATCA 5 CCTAGG 3 5 GATATC 5 3 CTATAG 3 GATATC 5 5 CTTTAG GGATCAATC CCTAGTTAG GCGGCCGC CGCCGGCC CAGCTG GTCGAC GCGGCCGC 5 CGCCGGCC 3 GCGGCCCC5 CGCCGGCC3 GATCTG 5 5 CTAGAC 3 3 GATCTG 5 5 CTGGAC GCGGCCCCTG CGCCGGGGAC 5 3

94 ö Real Time Thermal Cycler

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122 A B1 B0 B C D EF G H I J K L M N O Q R S Case 1 N N T T Case 2 Case 3 Case 4 N N T T N N T T N N T T (bp) 2 k

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126 m/m +/+ m/+ m/+ m/m

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143 TaKaRa CR Thermal Cycler M T3000 T3000 Sample block Sample Block for 0.5 ml 54-well Sample Block for 1.5 ml 30-well Sample Block for CR Tube late Sample Block for Slide Glass(in situ CR)

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146 x x y y

147 5 AAAAAA TTTTTT 5 3 AAAAAA TTTTTT 5 3 AAAAAA TTTTTT 3 TTTTTT 3 AAAAAA TTTTTT 5 3 AAAAAA TTTTTT 5 3 AAAAAA TTTTTT

148 AAAAAAAA AAAAAAAA

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150 CRWITH-TAQANDRIMERSAMLIFIEDASECIFICDNAFRAGMENT CRWITHREVERSETRANSCRITASEDETECTEDANR--NAFRAGMENT CRWITHDEGE-NE-RATERI-MERSGIVESMEANEWCDNAFRAGMENT ******* * * **********

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152 A A B C C A B C A' C'

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155 AAAAAA

156 5' 5'

157 mrna AAAAAA GS2 GS1 Adaptor GS2 GS1 Adaptor GS2 GS1 Adaptor

158 Mlu I Spe I 5 - CUA CUA CUA CUA GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG 3 UDG cloning site Sal I Mlu I Spe I 5 - CUA CUA CUA CUA GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC 3 UDG cloning site Sal I Mlu I Spe I GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC 3 Sal I

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163 10 11 N T1 T2 N T

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실험 Set Up Guide 실험주제 Real Time PCR 실험원리 Quantitative Real-Time PCR (qrt-pcr) 은 1992년에도입되어생명공학에응용되기시작하였이기술은잘알려져있는 PCR기법을개량한것이다. PCR은핵산의효소증폭을이용하며, 극히적은양

실험 Set Up Guide 실험주제 Real Time PCR 실험원리 Quantitative Real-Time PCR (qrt-pcr) 은 1992년에도입되어생명공학에응용되기시작하였이기술은잘알려져있는 PCR기법을개량한것이다. PCR은핵산의효소증폭을이용하며, 극히적은양의시료를대량으로증폭할수있다는장점과그과정이간단하여 Cloning, Sequencing 등의기본기술로응용되었다.