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1 식품첨가물용식물유래항균물질개발 김회경원광대학교식품영양학과 1. 서론 1.1. 연구배경 우리나라식품위생법에따르면 식중독이란식품섭취로인하여인체에유해한미생물또는유독물질에의하여발생하였거나발생한것으로판단되는감염성질환또는독소형질환 을말한다. 또세계보건기구 (WHO) 에서는 식품또는물의섭취에의해발생된또는발생된것으로추정되는감염성또는독소형질환 이라고정의하고있다 (WHO, 2006). 식중독을발생시키는대표적인원인중하나로는식품에식중독을일으키는병원성미생물의오염을들수있으며주로식품에오염된세균또는세균이생산한독소의섭취로인해발생하게된다. 우리나라의 2011년원인물질별식중독발생현황을보면원인불명의경우를제외하면주로식중독을일으키는미생물에의한발생건수가가장많다 (KFDA 2013). 주요원인균으로 pathogenic Escherichia coli 32건, Norovirus 31건, Salmonella 24건, Campylobacter jejuni 13건, Staphylococcus aureus 10건, Vibrio parahaemolyticus 9건등으로나타났다 (KFDA, 2013). 또한발생환자수로는 pathogenic Escherichia coli, Norovirus, Salmonella, Staphylococcus aureus 에의하여각각 2109명, 1524명, 1065명, 323명으로보고되었고, 발생건에비해환자수가높은결과를나타낸다. 대표적인식중독유발미생물로는그람음성인 Campylobacter spp., Salmonella spp., 식품첨가물용식물유래항균물질개발 489

2 E. coli O157:H7 등이있으며그람양성인 S. aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes 등이있다. 이중 S. Typhimurium, E. coli O157:H7, S. aureus, B. cereus, L. monocytogenes 에대하여연구를진행하였다. B. cereus는주로곡류및전분제품에서발견되는미생물로그람양성의간균이며호기성또는통성혐기성으로포자를생성한다 (Francis, 1993). 또한 B. cereus는독소를생성하여구토또는수양성설사를유발하는식중독균이다 (Lund and Granum, 1996). 또한 L. monocytogenes는사람과동물모두에감염될수있으며, 주로토양이나부유물등에서자라지만인체또는동물에감염시질병을일으킬수있다 (Orsi et al., 2011). 감염증상으로는인체에감염되면패혈증, 뇌염, 뇌수막염등의증상과임신한여성에게는자연유산을일으킬수있다. 또약한감기증상이거나무증상일수도있으며때때로장염과피부리스테리아증이나타날수도있다 (McLauchlin et al., 2004). Salmonella의감염은소고기, 가금류, 우유나계란등의오염된식품의섭취를통해장염을일으킨다. 그중에서 S. Typhimurium은다양한범위의숙주에높은감염능력을갖고있으며, 이는유아, 양, 송아지등에서장티푸스와같은증상, 패혈증, 장염등을일으킬수있다 (Das et al., 1990; Wray et al., 1990; Pepoff and Le Minor, 1997). 또한 E. coli O157:H7은 verotoxin을생산하며인체에감염시무혈성설사또는출혈성설사를동반하며독소로인한신장의손상및용혈성요독증후군 (haemolytic uremic syndrome ; HUS) 을수반하는증상을보이는것으로알려져있다 (Griffin and Tauxe, 1991). 이러한식중독균의오염을방지하기위하여식품첨가물을사용하거나, 식품에항균물질로서항균성이있는식물추출물을첨가하거나에센셜오일, 유기산등을첨가하는방법을사용하고있다. (Burt, 2004; Delaquis and Mazza, 1995; Dorman and Deans, 2000). 오늘날병원성미생물의항생제에대한내성증가와식품첨가물의사용에대한부정적인인식으로인하여합성물질보다는천연물질을선호하는경향을보이고있다 (Kim et al., 1995; Choi, 1986; Oh et al., 1998). 그러나천연물유래추출물을실제식품첨가물로이용하기위해서는관능적측면과약한항균력등에대한보강이필요할것으로보이며, 현재까지천연항균제를이용하여상품화된제품은미미한실정이다 (Cha et al., 2008). 이에따라본연구에서는관능적측면과약한항균력을보완하기위해소량의추출물을이용하여항균효과를갖도록하고자두가지의추출물을조합하여항균시너지를극대화할수있도록하고자한다. 항균물질에관련된연구중국내자생식물의에탄올추출물중 S. aureus에항균효과가높았던것으로는황련, 단삼, 오배자등이있으며, 그외에도작약, 창포, 오디, 고삼, 관중에서효과가있다는연구결과가있다 (Cha et al., 2008). 그외에 Han et al. (2001) 와 Do et al 년기초연구과제총서

3 (1996) 의연구에서는관중추출물이식중독균인 L. monocytogenes 5종 (ATCC 19111, ATCC 19112, ATCC 19113, ATCC 19114, ATCC 15313) 과충치를유발하는 Streptococcus mutans OMZ176에대하여항균효과를갖는다는결과가있다. 또한고삼추출물은 S. mutans에대하여우수한항균효과를가지며, S. sobrinus, A. viscosus, S. aureus에서도항균능을나타내었다 (Park et al., 2010; Baek et al., 2000; Lee et al., 2000). Ji et al. (2007) 에의한연구결과에서는항생제에내성을갖는 Methicillin-Resistant S. aureus에대하여황련, 호장근, 세신등에서높은항균력을보였으며, Son et al. (2001) 에서는 E. coli와 S. aureus에대하여정향, 황백, 황련에서항균효과가있다는연구결과가있다. 또한 Park et al. (1995) 에서황백추출물을첨가하였을때, S. mutans에대하여생육을억제한다는연구결과를확인하였다. Lim and Moon (2006) 에서는포도근의열수추출액및약침액이항산화효과를갖는다는연구결과는있으나항균효과에관하여서는연구가부족한실정이다. 본연구는식물추출물을선정하기위한사전연구로그람양성균인 S. mutans에대한 120가지식물추출물및표준화시료의항균효과를탐색한결과항균활성을갖는 8가지추출물로고삼, 관중, 적근대, 비트, 포도근, 희첨, 황련, 황백추출물을선정하였다. 그후각추출물에대한식중독균으로 B. cereus, E. coli O157:H7, L. monocytogenes, S. aureus, S. Typhimurium 에대한항균활성을탐색하고각식중독균을저해할수있는최소저해농도를확인하고, 또한항균시너지를발생하는천연물조합을규명하여식품의살균제나포장재에첨가하여항균성을갖도록한다면식품의식중독균을억제하는데도움이될것이라고전망된다 연구의목적및필요성 국내 외식중독발생현황 식중독발생건수나환자수는미국이나우리나라에서꾸준히증가하는추세이다 [Fig. 1]. 우리나라의식중독발생현황을살펴보면, 2009년의식중독발생건수는 228건, 식중독환자수는 5,999명이었으며 2010년에는전년도에비해 1.2배증가하였으며식중독이가장빈번하게발생된시설은음식점과학교급식소가차지하고있다. 식품첨가물용식물유래항균물질개발 491

4 Figure 1. 한국, 미국, 일본의식중독발생현황 ( ) ( 식품의약품안전청, 2012) 식중독의 90% 이상은식품의식중독균에의한오염으로인하여발생되기때문에식품제조또는가공중오염이발생하였을가능성이높다. 식중독발생의원인물질중에서국내에서가장빈번하게식중독을유발하는미생물은살모넬라, 병원성대장균, 장염비브리오, 황색포도상구균, 바실러스세레우스등임 [Fig. 2]. Figure 2. 최근 10년동안국내에서발생한식중독발생원인물질현황 ( 식품의약품안전청, 2012) 년기초연구과제총서

5 식품안전성향상을위한항균물질개발의필요 식품안전성을위하여항균기술및물질의이용은반드시필요하다. 식품의보존성연장을위한기술이나항균물질을사용함으로써식품의안전성을급격하게향상시킬수있으며현재다양한식품살균기술및항균물질들이개발되는실정이다. 하지만, 소비자들의합성첨가물사용에대한부정적인식이만연해있다. 합성첨가물을사용하지않은식품에대하여 [ 녹색식품인증제 ] 를추진하려는식약청의시도가지난 2010년에있었으며추후에도이러한사회적인분위기는지속될것으로예상된다. 식약청조사결과설문대상소비자의 92% 합성첨가물을사용하지않은식품에대한인증제도인녹색식품인증제의도입을원하고있으며, 응답자의 76% 는그러한녹색식품을가격이더높아도구매할의사가있다고하였다. 또한웰빙식품을선호하는사회적분위기에서더이상합성첨가물의사용은소비자들의선택을받기어려워진것이사실이다기존의식품첨가물기능을대체할수있는천연물질의사용이시급하다. 가공식품에서식품첨가물의사용을완전히배제할수없기때문에대체물질의개발이시급한실정이며또한, 식품첨가물의경제성도중요하기때문에대량으로생산이가능하여식품의가격책정에크게영향을미치지않는물질의개발이필요할것이다. 2. 연구방법 2.1. Streptococcus mutans 에대한항균성탐색 식물추출물준비 116종의추출물은원광대학교의천연물신약표준화소재은행에서분양받아사용하였으며, 13 가지천연물은구입 ( 자몽종자추출물 ) 하거나직접추출 ( 황련, 황백, 희첨, 관중, 호장근, 포도근, 선학초, 고삼, 오배자, 현호색, 곽향, 상백피 ) 하였다. 129종의추출물은 20% dimethyl sulfoxide(dmso) 에용해시켜 well diffusion assay로 screening하였다. 식품첨가물용식물유래항균물질개발 493

6 사용균주및배양조건 S. mutans 균주는한국생명공학연구원생명자원센터에서분양받은 KCTC 3065를 Brain haert infusion (BHI) broth에 37 에서 48시간동안배양하여이용하였다 Well diffusion test 에의한천연물 screening BHIA에 S. mutans 농도를 106 CFU/ml로맞추어 pour spreading 한뒤적절히마른 plate에직경 5mm biopsy punch를이용하여 well을만든후 20mg/ml로희석한식물추출물을 50μl 씩분주하고추출물이증발하는것을막기위하여 parafilm으로감싸 37 C에서 48h 배양한뒤 inhibition zone의유무를확인하여항균활성을측정하였다 식중독균에대한항균성측정 식물추출물준비 실험에이용할식물추출물의선정은 S. mutans에대한선행연구에서효과가있었던황련과황백을포함하여다른연구논문에서항균효과가있는식물추출물을선정하였다. 8가지의천연물은익산시신용동의소재의한약국과대형마켓에서황련 (Coptis chinensis Franch), 황백 (Phellodendron amurense), 희첨 (Siegesbeckia glabrescens Makino), 관중 (Dryopteris crassirhizoma), 고삼 (Sophora flavescens Aiton), 포도근 (root of Vitis vinifera) 과적근대 (Beta vulgaris var. cicla), 비트 (Beta vulgaris) 를구입하였다. 구입한 8종의시료를 GR급 ethyl alcohol (SK chemicals., Korea) 을용매로하여 8510R-DTH sonicator(bransonic Ultrasonics Co., Danbury, CT, USA) 로 45 C 에서 15분동안 sonication 후 2시간정치를 1일 10회반복하여 3일동안추출하여감압농축기 (EYELA., TOKYO, Japan) 로농축하였다. 농축후동결건조한 8종의추출물은 20% dimethyl sulfoxide(dmso; sigma aldrich co., USA) 에용해시켜각농도별로희석하여준비하였다 년기초연구과제총서

7 사용균주및배양조건 S. Typhimurium, E. coli O157:H , S. aureus ATCC 13565, ATCC 23235, KCTC 1621 균주는 tryptic soy broth(tsb; BD/Bacto, Sparks, USA) 에 37 C에서, B. cereus 038-2, C1, F4810는 30 C에서 24시간동안배양하였고, L. monocytogenes LCDC 81861, Scott A, V7는 brain heart infusion(bhi; BD/BBL, Sparks, USA) broth를이용하여 37 C에서 24시간배양하였다 식물추출물의항균성측정 TSA와 BHIA에각균주 (105 CFU/ml) 를 spread plating하고 30분건조시켰다. Plate에 8가지의추출물을 20mg/ml로희석하여 80μl 씩흡수시킨 paper disc (Ø 10mm, Toyo Roshi Kaisah, Ltd., Japan) 를멸균된핀셋으로고정시켰다. 각각 37 C와 30 C에서에서 24h 배양한뒤 inhibition zone의유무를확인하고 inhibition zone은 CD-20CP caliper (Mitutoyo Co., Kawasaki, Japan) 로직경을측정하여항균활성을측정하였다 MIC 및 MLC 측정 항균성측정후 B. cereus 038-2, C1, F4810, S. Typhimurium, E. coli O157:H , S. aureus ATCC 13565, ATCC 23235, KCTC 1621, L. monocytogenes LCDC 81861, Scott A, V7에대한식물추출물의 minimum inhibition concentration(mic) 를추출하였다. MIC는추출물의농도를 20mg/ml부터시작하여 1/2씩농도를희석하여대략적인 MIC 값의범위를설정하였다. 추출물의농도는 mg/ml - 2mg/ml로 8단계의농도를설정하여 96 well plate에각농도별추출물을 100µl 씩분주하고, 균주액은 105 CFU/ml로희석하여 100µl 씩접종하여 24시간배양한뒤육안으로관찰하여혼탁하게변하지않은최저농도를 MIC 값으로설정하였다. 그후혼탁하게변하지않은 well의 suspension을각각 TSA 또는 BHIA에 streaking 하여 S. aureus와 L. monocytogenes는 37 C에서, B. cereus는 30 C에서 24시간동안배양하여배지상에서미생물이자라지않은식물추출물의농도를 minimum lethal concentration(mlc) 로설정하였다. 식품첨가물용식물유래항균물질개발 495

8 식물추출물의항균시너지효과 B. cereus, S. aureus, L. monocytogenes 균주들중가장낮은농도에서 MIC를갖는 strain을선별하여해당균주에대하여항균효과가나타났던식물추출물들의항균시너지조합을확인하기위하여 checkerboard test는다음과같이실험하였다. 식물추출물들을각각의 MIC 값에대하여 1/32 MIC - 4 MIC에해당되는농도로희석하여준비하였다. 균주에따라항균효과가확인된추출물들을각각두가지씩조합하여 96 well plate에가로방향으로는한가지추출물을높은농도의 MIC에서낮은농도로각 well당 50µl 씩분주하고, 조합할추출물은세로방향으로높은농도로부터낮은농도의 MIC 순으로 50µl 씩추출물을분주하여섞는다. 그후각균주농도는 100µl를취하였을때농도가 105 CFU/ml가되도록희석하여추출물이조합된 well plate에각각 100µl 씩분주하여섞고 well plate를 parafilm으로감싸준뒤 S. aureus와 L. monocytogenes는 37 C, B. cereus는 30 C에각각 24시간동안배양하였다. 그뒤혼탁한 well 을제외한투명한 well을육안으로판별하여각각추출물의농도를확인하고다음의공식에따라계산하여항균시너지효과를판별하였다. Fractional Inhibition Concentration (FIC) index = MICA in combination MICA alone + MICB in combination MICB alone The interpretation of the FICI (Isenberg, 1992) FICI 0.5 Synergism 0.5 < FICI < 1.0 Partial synergism 1.0 < FICI 4 Indifference FICI > 4 Antagonism 통계분석 모든실험은 3회이상반복하였고, SAS (Statistical Analysis System, Ver. 9.2) 의 general linear model을이용하여통계처리하였다. 식물추출물의식중독균에대한 inhibition zone의유의적차이는 Fisher's least significant difference (LSD) test로판정하였다 년기초연구과제총서

9 3. 결과및고찰 3.1. S. mutans 에대한식물추출물의항균성탐색 S. mutans에대하여 129종의식물추출물을이용하여 screening한결과는 Table 1에나타내었다. 황련추출물과황련표준화시료2, 황백추출물, 황백표준화시료2, 희첨추출물, 자몽종자추출물에대하여항균성을갖는것으로확인되었다. 식품첨가물용식물유래항균물질개발 497

10 Plant extract Table 1. Antimicrobial activity of plant extracts against S. mutans a A. a. Plant extract A. a. Plant extract A. a. Plant extract A. a. Plant extract A. a. 갈근추출물 - 목단피추출물 - 상백피표준화시료 2 - 원지표준화시료 1 - 초두구표준화시료 2 - 갈근표준화시료 1 - 목단피표준화시료 1 - 상심자추출물 - 원지표준화시료 2 - 치자추출물 - 갈근표준화시료 2 - 목단피표준화시료 2 - 상심자표준화시료 1 - 육종용추출물 - 택사추출물 - 건강추출물 - 백두옹추출물 - 선학초추출물 - 육종용표준화시료 2 - 택사표준화시료 2 - 건지황추출물 - 백두옹표준화시료 1 - 속단표준화시료 1 - 음양곽표준화시료 2 - 파극천표준화시료 2 - 결명자추출물 - 백두옹표준화시료 2 - 속단표준화시료 2 - 익모초추출물 - 판람근추출물 - 계혈등추출물 - 백선피추출물 - 승마추출물 - 일당귀추출물 - 판람근표준화시료 1 - 계혈등표준화시료 2 - 백선피표준화시료 2 - 애엽추출물 - 자근표준화시료 1 - 판람근표준화시료 2 - 고삼추출물 - 백작약추출물 - 연교표준화시료 2 - 자근표준화시료 2 - 포도근추출물 - 고삼 표준화시료 2 - 백작약표준화시료 1 - 영실추출물 - 자몽종자추출물 + 하고초추출물 - 곽향추출물 - 백작약표준화시료 2 - 영실표준화시료 1 - 적하수오추출물 - 향부자추출물 - 관중추출물 - 백지추출물 - 영실표준화시료 2 - 적하수오표준화시료 1 - 현삼추출물 - 괴화추출물 - 보골지표준화시료 2 - 오매추출물 - 적하수오표준화시료 2 - 현호색추출물 - 괴화표준화시료 1 - 복분자추출물 - 오미자추출물 - 지구자표준화시료 2 - 호장근추출물 - 구기자표준화시료 1 - 복분자표준화시료 2 - 오미자표준화시료 1 - 지모추출물 - 홍화표준화시료 1 - 구기자표준화시료 2 - 빈랑자추출물 - 오미자표준화시료 2 - 지모표준화시료 2 - 홍화표준화시료 2 - 금은화추출물 - 사상자추출물 - 오배자추출물 - 지실추출물 - 황금추출물 - 금은화표준화시료 1 - 사상자표준화시료 2 - 오배자표준화시료 1 - 진피 ( 귤 ) 추출물 - 황금표준화시료 1 - 금은화표준화시료 2 - 산수유추출물 - 오배자표준화시료 2 - 진피 ( 귤 ) 표준화시료 2 - 황금표준화시료 2 - 단삼추출물 - 산수유표준화시료 1 - 오수유추출물 - 질려자표준화시료 2 - 황련추출물 + 단삼표준화시료 2 - 산수유표준화시료 2 - 오수유표준화시료 2 - 차전자추출물 - 황련표준화시료 2 + 대황추출물 - 산초표준화시료 2 - 오약표준화시료 2 - 천궁추출물 - 황백추출물 + 대황표준화시료 2 - 상기생추출물 - 용담추출물 - 천궁표준화시료 2 - 황백표준화시료 2 + 두충추출물 - 상륙추출물 - 용담표준화시료 1 - 천련자추출물 - 후박표준화시료 2 - 모과추출물 - 상백피추출물 - 용담표준화시료 2 - 천련자표준화시료 2 - 희첨추출물 + 모과표준화시료 2 - 상백피표준화시료 1 - 원지추출물 - 천마추출물 - a A. a. : Antimicrobial activity 년기초연구과제총서

11 Table 2. Antimicrobial effects (inhibition zone diameter) of the plant extracts against foodborne pathogen tested (unit : mm) Plant extract Foodborne pathogens C. chinensis P. amurense B. vulgari s var. cicla B. vulgaris S. glabrescens D. crassirhizoma S. flavescens V. vinifera S. Typhimurium d A 2 c 0.00 A a 0.00 A a 0.00 A a 0.00 A d 0.00 A d 0.00 A d 0.00 A B. cereus d 0.00 C c 0.00 C a 0.00 C a 0.00 C a 0.00 C bc 4.54 A b 3.60 AB a 2.51 B B. cereus C1 d 0.00 C c 0.00 C a 0.00 C a 0.00 C a 0.00 C b 6.55 A c 2.50 B ab 2.14 BC B. cereus 4810 d 0.00 D c 0.00 D a 0.00 D a 0.00 D a 0.00 D b 7.08 A bc 2.99 B ab 2.09 C E. coli O157:H d 0.00 A c 0.00 A a 0.00 A a 0.00 A a 0.00 A d 0.00 A d 0.00 A d 0.00 A S. aureus ATCC b A b 5.67 B a 0.00 C a 0.00 C a 0.00 C bc 5.23 B d 0.91 C cd 0.6 C S. aureus ATCC a A a B a 0.00 E a 0.00 E a 0.00 E bc 4.38 C bc 2.89 D bc 1.37 E S. aureus KCTC 1621 c 8.94 A b 4.96 B a 0.00 D a 0.00 D a 0.00 D c 2.87 C c 2.37 C ab 1.81 C L. monocytogenes LCDC d 0.00 D c 0.00 D a 0.00 D a 0.00 D a 0.00 D a A a 6.5 B ab 1.57 C L. monocytogenes Scott A d 0.00 D c 0.00 D a 0.00 D a 0.00 D a 0.00 D a A a 6.85 B ab 2.09 C L. monocytogenes V7 d 0.00 D c 0.00 D a 0.00 D a 0.00 D a 0.00 D a A a 6.19 B ab 1.87 C 1 Values in the same row that are followed by the same letter are not significantly different (α = 0.05). 2 Within the same foodborne pathogen, values in the same column that are followed by the same letter are not significantly different (α = 0.05). 식품첨가물용식물유래항균물질개발 499

12 3.2. 식중독균에대한식물추출물의항균성탐색 실험에사용한 5종의식중독균에황련, 황백, 적근대, 비트, 희첨, 관중, 고삼, 포도근의에탄올추출물을 20mg/ml의농도로용해시켜항균성을탐색한결과 S. Typhimurium과 E. coli O157:H7은 8가지추출물모두에의해영향을받지않았다. B. cereus 균주에대해서는관중, 고삼, 포도근추출물에서항균효과가나타났으며, L. monocytogenes 균주에대해서도관중, 고삼, 포도근추출물이항균효과를보였다. S. aureus 균주에대해서는황련, 황백, 관중, 고삼, 포도근추출물에서항균효과를확인하였다. 항균효과를보였던추출물의식중독미생물에대한 inhibition zone의지름 (mm) 은 Table 2에나타냈다. S. aureus strain에대한추출물의균주저해효과가가장컸던추출물은황련과황백으로 S. aureus ATCC 23235에대하여 inhibition zone의지름이황련, 황백추출물각각 21.01mm, 17.78mm로나타났고 S. aureus strain의차이로는 S. aureus ATCC 23235에대하여유의적차이를보였으며다른추출물과비교하였을때황련의 inhibition zone의직경이가장큰것으로나타났다. 그다음으로황백추출물의 inhibition zone의지름이큰것으로나타났으나, 황련추출물이유의적으로항균효과가가장높은것으로나타났다. Yu et al. (2010) 에서도 S. aureus CCARM 3708 균주에대하여황련, 소목, 오배자, 대황등의추출물에서생육저지환이형성되었고, 특히황련의메탄올추출물이 22mm로우수한항균성을나타냈다는연구결과가있다. 또, Son et al. (2001) 의연구에서도황백과황련추출물을 S. aureus에적용하였을때강한항균력을가진다는결과를나타내었다. Cai et al. (2002) 의연구에서는에탄올과열수로각각추출한추출물중 S. aureus ATCC 25923과 E. coli O157:H7 ATCC 43888에대하여건강, 시호, 황백, 고삼, 황련등에서에탄올과열수추출물에관계없이모두항균활성을나타냈다는연구결과가있으나, 본연구에서는황련과황백추출물모두에서 E. coli O157:H7에대하여항균활성을발견하지못하였다. B. cereus에대하여항균성을보였던추출물의 inhibition zone은 (1) 은 038-2, (2) 는 C1, (3) 은 F4810 순서로 Figure 1에나타내었다. S. aureus의 inhibition zone은 Figure 2에 (1) ATCC 13565, (2) ATCC 23235, (3) KCTC 1621 순서로나타내었다. 또한 L. monocytogenes 는 Figure 3에 (1) LCDC 81861, (2) Scott A, (3) V7 순서로나타내었다. 관중추출물에서의항균활성은 S. arueus strain KCTC 1621이 2.87mm로가장작은 inhibition zone 직경을갖는것으로나타났다. L. monocytogenes LCDC 81861, Scott A, V7의관중추출물에대한 inhibition zone 직경은각각 12.44mm, 11.42mm, 12.10mm로 strain에따라유의적차이가없었다. L. monocytogenes는관중추출물에의하여저해가가장높게일어났다 년기초연구과제총서

13 또한고삼추출물에서도 L. monocytogenes LCDC 81861, Scott A, V7에대하여각각 6.50mm, 6.85mm, 6.19mm로세 strain 간의유의적차이가없었다. 관중추출물의 inhibition zone 직경과비교하였을때관중추출물의항균활성이유의적으로높은것으로나타났고, 포도근추출물보다는유의적으로높은항균활성을갖는것으로나타났다. B. cereus에대한관중, 고삼, 포도근추출물의항균활성으로는 B. cereus F4810 strain에대하여관중과고삼, 포도근추출물의 inhibition zone의직경이유의적차이를보여관중, 고삼, 포도근순으로항균활성이높은것을확인할수있으며관중추출물에서는 strain간유의적차이를보이지않았다. S. aureus strain KCTC 1621에대하여관중, 고삼, 포도근추출물간의유의적차이는보이지않았으며 ATCC 13565와 ATCC 23235에대한포도근추출물은항균활성이나타나지않은다른추출물과비교하였을때유의적으로차이가없어항균성이낮은것으로나타났다. Han et al. (2001) 에서는 L. monocytogenes에대한관중의헥산분획물이뛰어난항균효과를보였으며, B. cereus와 S. aureus의균증식을억제한다는연구결과가있다. 관중의항균활성을나타내는물질은 Do et al. (1996) 에서 flavaspidic acid PB와 flavaspidic acid AB 두가지가있는데, S. mutans에대하여 flavaspidic acid PB는 20µg/disk 농도에서 inhibition zone의직경은 14.0mm, flavaspidic acid AB는 13.0mm로나타났으나본연구에서는다른종의미생물로비교가불가능할것으로생각된다. Lee et al. (2001) 의연구에서는고삼의에틸아세테이트추출물에서 S. Typhimurium과 S. aureus에대한항균활성을측정하였으나, S. aureus의항균활성은낮은것으로보고하였다. 식품첨가물용식물유래항균물질개발 501

14 (1) (2) (3) Figure 3. Inhibition zone of plant extracts effective in inactivating (F : D. crassirhizoma, G : S. flavescens, H : V. vinifera) against growth of B. cereus 년기초연구과제총서

15 (1) (2) (3) Figure 4. Inhibition zone of plant extracts effective in inactivating (A : C. chinensis, B : P. amurense, F : D. crassirhizoma, G : S. flavescens, H : V. vinifera) against growth of S. aureus 식품첨가물용식물유래항균물질개발 503

16 (1) (2) (3) Figure 5. Inhibition zone of plant extracts effective in inactivating (F : D. crassirhizoma, G : S. flavescens, H : V. vinifera) against growth of L. monocytogenes 년기초연구과제총서

17 3.3. 식중독균에대한식물추출물의 MIC 및 MLC 항균성이나타나지않은적근대, 비트, 희첨추출물을제외한나머지다섯가지추출물에대한 MIC 및 MLC를측정하였다. B. cereus, S. aureus, L. monocytogenes에대한식물추출물의 MIC 및 MLC는 Table 3에나타내었다. 황련, 황백을포함한다섯가지식물추출물의 S. aureus 에대한 MIC 및 MLC를측정하였고, 관중, 고삼, 포도근추출물의 MIC 및 MLC는 B. cereus와 L. monocytogenes에대하여측정하였다. B. cereus는 strain 038-2, C1, F4810에대하여각각관중의 MIC가 0.25, , 0.25 mg/ml로나타나 strain C1에서가장낮은값을얻었다. 또한 MLC는세가지 strain 모두 2mg/ml보다높은값으로관찰되었다. 고삼추출물도세가지 strain에대하여각각 0.125, , 0.125로 C1 strain에서가장낮은 MIC값을나타냈고, MLC 값은 2mg/ml 이상으로 strain에따라더낮은농도에서 MLC 값을갖기도하였으나비슷한수준으로 2mg/ml 이상으로나타났다. 포도근추출물은각각 0.125, 0.125, 0.25mg/ml의 MIC 값을갖는것으로나타났다. S. aureus의 strain ATCC 13565, ATCC 23235, KCTC 1621을사용하였다. 황련추출물의 MIC는위의균주에대하여각각 0.5, 0.125, 0.5 mg/ml로 ATCC 23235에대하여낮은농도의 MIC를확인하였다. 황백추출물로각각 1, 0.25, 1mg/ml로 ATCC 23235에서가장낮은 MIC값을갖는것으로나타났다. Disc assay에서는황련과황백추출물의 inhibition zone 지름이 ATCC 23235에대하여 21.01mm / 17.78mm로큰것으로나타났으나 MIC값은 inhibition zone의지름은큰것에비하여높은값으로나타났다. 또한관중추출물의 MIC는각각 0.25, 0.25, 0.5 mg/ml이었고, 고삼추출물은세가지 strain 모두 0.125mg/ml로나타났다. 포도근추출물의 MIC는세가지 strain에대하여각각 0.25, 0.125, 0.5mg/ml로나타났다. 식품첨가물용식물유래항균물질개발 505

18 Table 3. MIC and MLC of the plant extracts against foodborne pathogens (unit : mg/ml) foodborne pathogens Types of extract B. cereus B. cereus C1 B. cereus F4810 S. aureus ATCC S. aureus ATCC S. aureus KCTC 1621 a L. m. LCDC L. m. L. m. V7 Scott A C. chinensis MIC MLC P. amurense MIC MLC < < D. crassirhizoma MIC MLC 2< 2< < S. flavescens MIC MLC 2< 2< < V. vinifera MIC < 2< 2< MLC 2< 2< 2< < < - 1 2< - 1 2< - 1 2< - 2 a L. m. (Listeria monocytogenes) 년기초연구과제총서

19 L. monocytogenes strain LCDC 81861, Scott A, V7을이용하였으며관중과고삼추출물에서세가지 strain 모두 0.125mg/ml로같은 MIC값을갖는것으로나타났으며포도근추출물에서는세가지 strain 모두 2mg/ml 이하의농도에서는효과를보이지않는것으로나타났다. Han et al. (2001) 에서는관중에탄올추출물에대하여배지에 500ppm의관중추출물을첨가하여 L. monocytogenes ATCC 19113, ATCC 19112, ATCC 19113, ATCC 19114, ATCC 15313을배양시킨결과 72시간까지균증식을완전히억제된다는결과를나타냈다. 또한관중의헥산분획물이 B. cereus 균주에대하여 50ppm의분획물을첨가하였을때와 S. aureus의경우 25ppm을첨가하였을때균의증식을완전히억제시킨다는연구결과를나타냈다. 식품첨가물용식물유래항균물질개발 507

20 Table 4. Synergistic antimicrobial effects of plant extracts combined on inhibiting growth of S. aureus ATCC plant extract alone MIC (mg/ml) in combination C. chinensis P. amurense C. chinensis D. crassirhizoma C. chinensis S. flavescens C. chinensis V. vinifera P. amurense D. crassirhizoma P. amurense S. flavescens P. amurense V. vinifera D. crassirhizoma S. flavescens D. crassirhizoma V. vinifera S. flavescens V. vinifera FIC a FICI b Outcome c 2.00 indifference 0.50 synergy 2.50 indifference 1.50 indifference 0.50 synergy 2.50 indifference 1.50 indifference 3.00 indifference 2.50 indifference 3.00 indifference a Fractional inhibiting concentration (FIC): MIC in combination / MIC alone b Fractional inhibiting concentration index (FICI): Sum of FICs of two plant extracts. c The FICI was interpreted as described by Isenberg (1992): synergy (FIC 0.5), partial synergy (FICI > 0.5 but < 1.0), indifference (FICI 1.0 but 4.0), antagonism (FICI > 4.0) 년기초연구과제총서

21 3.4. 식중독균에대한식물추출물의항균시너지효과 S. aureus strain 중 ATCC 항균시너지에대한식물추출물조합의항균시너지효과는 FICI로판명하였으며그결과는 Table 4에나타내었다. S. aureus ATCC 23235의 checkerboard test 결과황련과황백의조합에서는 FICI가 2.0으로시너지효과는 indifference 로나타났다. 황련과고삼, 황련과포도근의조합에서도 FICI가 사이로나타나각각의추출물은 indifference한결과로시너지효과를갖지않는것으로나타났다. 황련과관중추출물의조합에서는각추출물간영향을나타내어각각추출물의조합을했을경우 FICI 값이 0.25로나타났고, 두추출물간의합이 0.5로나타나황련과관중추출물의조합은 S. aureus ATCC 23235에대하여항균시너지효과를갖는것으로나타났다. 황백추출물과관중추출물에서도마찬가지로두추출물간에영향을주어 0.5로나타났으며황련과관중추출물의조합과마찬가지로항균시너지효과를갖는것으로나타났다. 그외의황백과고삼, 황백과포도근의조합에서는각각 2.5와 1.5로두추출물간영향이미치지않는것으로나타났다. 또한관중과의조합에서관중과고삼, 관중과포도근추출물의조합에서도두추출물간의시너지효과는없었으며, 고삼과포도근추출물의조합에서도두추출물간의영향은없는것으로나타났다. 관중, 고삼, 포도근추출물조합의 B. cereus C1에대한항균시너지효과는 Table 5에나타내었다. 관중과고삼추출물에서는오히려각각추출물이혼합되었을때서로저해하는효과를보였으며 FICI 값이 4로나타나두추출물간의효과는상극으로나타났다. 그외의관중과고삼, 고삼과포도근추출물의조합에서모두 FICI 값이 2로 indifference로시너지효과를갖지않는것으로나타났다. L. monocytogenes V9 균주에대한고삼과포도근추출물조합의항균시너지효과는 Table 6 에나타내었다. L. monocytogenes V9 균주에대한고삼과포도근조합에서 FICI가 4로나타나두물질간의혼합은오히려조합하는경우항균효과를억제시키는것으로나타났다. Kamatou et al. (2006) 에서는 Salvia chamelaeagnea와 Leonotis leonurus의두가지추출물이 B. cereus, S. aureus, E. coli, Klebsiella pneumoniae 4가지균주에대하여각각의추출물에서모두항균효과를가진다는결과를나타내었다. 특히 S. chamelaeagnea 추출물은그람양성균인 B. cereus와 S. aureus에대하여뛰어난항균효과를가진다고보고하였고, 각추출물을개별적으로이용하는것보다는두가지추출물을조합한것에서더높은효과가있다고발표하였다. 항생물질의항균시너지효과에대한연구결과로는 Lee et al. (1997) 의연구에서 Vancomycin-resistant enterococci 균주에대하여 vancomycin, penicillin, gentamicin의조합에서두가지또는세가지의항생제의조합에서일부시너지항균효과를가지며특정균주에서 식품첨가물용식물유래항균물질개발 509

22 는어떠한항생제조합에서도시너지효과를거의나타내지않는다는결과를나타내었다. 식물추출물의항균시너지를적용한연구로는 Jun et al. (2013) 에서 B. cereus 5 strain의혼합물에대하여식물추출물인홍지네고사리 (Dryopteris erythrosora) 뿌리추출물농도 mg/ml와좀보리사초 (Carex pumila) 뿌리추출물농도 mg/ml의조합에서 FICI 값이 0.75로 partial synergy를갖는다는결과가있다. 또한 Gutierrez et al. (2005) 의연구에서는오레가노 (300ppm) 와타임 (600ppm) 에센셜오일이각각적용시켰을때가장효과가높았으며두추출물간조합에서 B. cereus와 P. aeruginosa에대하여첨가제로서의항균효과가높았다는결과를보였다. 또한오레가노와마조람, 타임과세이지의조합에서도각각 E. coli와 L. monocytogenes 에대한효과를기대할수있을것이라는연구결과를나타내었다. 이러한결과로저해시키고자하는미생물에대하여항균효과를가지는단일추출물을두가지이상의추출물조합하였을때모두항균시너지효과를가지지는않으며, 오히려두가지이상의추출물조합에서 antagonism을나타내기도하는것으로보인다. Table 5. Synergistic antimicrobial effects of plant extracts combined on inhibiting growth of B. cereus C1 plant extract alone MIC (mg/ml) in combination D. crassirhizoma S. flavescens D. crassirhizoma V. vinifera S. flavescens V. vinifera FIC a FICI b Outcome c 4.00 antagonism 2.00 indifference 2.00 indifference a Fractional inhibiting concentration (FIC): MIC in combination / MIC alone b Fractional inhibiting concentration index (FICI): Sum of FICs of two plant extracts. c The FICI was interpreted as described by Isenberg (1992): synergy (FIC 0.5), partial synergy (FICI > 0.5 but < 1.0), indifference (FICI 1.0 but 4.0), antagonism (FICI > 4.0) 년기초연구과제총서

23 Table 6. Synergistic antimicrobial effects of plant extracts combined on inhibiting growth of L. monocytogenes V7 plant extract alone MIC (mg/ml) in combination S. flavescens V. vinifera FIC a FICI b Outcome c 4.00 antagonism a Fractional inhibiting concentration (FIC): MIC in combination / MIC alone b Fractional inhibiting concentration index (FICI): Sum of FICs of two plant extracts. c The FICI was interpreted as described by Isenberg (1992): synergy (FIC 0.5), partial synergy (FICI > 0.5 but < 1.0), indifference (FICI 1.0 but 4.0), antagonism (FICI > 4.0). 식품첨가물용식물유래항균물질개발 511

24 4. 결론 8가지식물황련, 황백, 적근대, 비트, 희첨, 관중, 고삼, 포도근을에탄올로추출하여식중독미생물중그람양성인 B. cereus, S. aureus, L. monocytogenes와그람음성균인 S. Typhimurium, E. coli O157:H7에대한항균활성을측정하였다. 그결과 8가지추출물은그람음성균인 S. Typhiumurium과 E. coli O157:H7에대해서항균활성을나타내지않았다. S. aureus에대해서는황련, 황백, 관중, 고삼, 포도근이항균활성을갖는것으로나타났고 B. cereus와 L. monocytogenes 에대해서는관중, 고삼, 포도근추출물이항균활성을보였다. S. aureus에대한결과로는황련과황백이 strain ATCC 23235에대하여각각 0.125mg/ml 과 0.25mg/ml로가장낮은 MIC를나타내었고 MLC는 mg/ml을나타내었다. 관중의 B. cereus C1에대한 MIC와 MLC는각각 0.062mg/ml와 2< mg/ml로나타났으며 S. aureus와 L. monocytogenes에대한 MIC는모두 0.125mg/ml로나타났다. 고삼에서의낮은 MIC 값을갖는균주는 B. cereus C1이 mg/ml로나타났다. 포도근에서의 MIC는 B. cereus 038-2, C1에서 0.125mg/ml이었으며 S. aureus ATCC 23235에서 0.125mg/ml로낮은 MIC 값을보였으나, L. monocytogenes에서는모두 2mg/ml 이상에서 MIC 값을갖는것으로나타났다. MIC 값이가장낮은균주인 B. cereus C1과 S. aureus ATCC 23235, L. monocytogenes V7의 MIC 값에따른두가지추출물의조합으로항균시너지효과를검정하였다. 그결과 S. aurues 균주에대하여황련과관중의조합과황백과관중의조합에서시너지를갖는다는결과를확인하였다. 그러나 B. cereus 균주에대한관중과고삼의조합과, L. monocytogenes에대한고삼과포도근조합에서는오히려 antagonism이일어난다는결과를확인하였다. 결론적으로 S. aureus에대하여황련과, 황백, 관중, 고삼, 포도근추출물에서항균효과를가지며 20mg/ml 농도에서황련과황백추출물에대하여우수한항균효과를가진다. 또한 B. cereus 와 L. monocytogenes 균주에대해서는관중, 고삼, 포도근추출물이항균효과를가지는것으로나타났다. 가장낮은 MIC를나타낸것으로황련과황백, 관중추출물에서 S. aureus ATCC 23235가각각 0.125mg/ml, 0.25mg/ml, 0.125mg/ml로가장낮은 MIC를나타내었으며추출물의항균시너지조합으로황련추출물 mg/ml과관중추출물 mg/ml의농도로각추출물을동량으로혼합하였을때 synergy를나타내었고, 황백 mg/ml, 관중 mg/ml 농도를혼합하였을때도마찬가지로 synergy를가지는것으로나타났다. 따라서황련과관중, 황백과관중추출물의조합으로 S. aureus의억제에효과를가질것으로전망된다 년기초연구과제총서

25 참고문헌 Alocilja EC, and Radke SM Market analysis of biosensors for food safety. Biosens Bioelectron 18: Baek SH, Kang KU, Choi EY Antimicrobial effects of the methanolic extract of Sophora flavescens Ait.. Journal of the Natural Science 18: Burt S Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods-a review. Int J Food Microbiol 94: Cai H, Choi SI, Lee YM, Heo T Antimicrobial effects of herbal medicine extracts on Staphylococcus arueus and Escherichia coli O157:H7. Korean Soc Biotechnol Bioeng J 17: Cha JY, Ha SE, Sim SM, Park JK, Chung YO, Kim HJ, Park NB Antimicrobial effect of ethanol extracts of Korea endemic herb plants. J Life Sci 18: Choi YT Antimicrobial activities on some natural herbs. J Kor Pharmaceut Sci 17: Das MS, Roy DK, Dash S Occurrence of Salmonellae in the slaughtered pigs, goat meat, meat handlers and slaughter house workers. J Comm Dis 22: Delaquis PJ, Mazza G Antimicrobial properties of isothiocyanates and their role in food preservation. Food Technol 49: Dorman H, Deans S Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. J Appl Microbiol 88: Do DS, Min BS, Bae KH Isolation of the antibacterial constituents from Crassirhizomae Rhizoma and evaluation of activity. J Pharm Sci (C.N.U.) 40: Francis AD Bacillus cereus and related species. Clin Microbiol Rev 4: Griffin PM, Tauxe RV The epidemiology of infections caused by Escherichia coli O157:H7, other enterohemorrhagic E. coli and the associated hemolytic uremic syndrome. Epidemiol Rev 13: Gutierrez J, Barry-Ryan C, Bourke P The antimicrobial efficacy of plant essential oil combinations and interactions with food ingredients. Int J Food Microbiol 124: 식품첨가물용식물유래항균물질개발 513

26 Han J, Lee J, Baek N, Shim D Isolation and antimicrobial action of growth inhibitory substance on food-borne microorganism from Dryopteris crassirhizoma Nakai. Korean J Food Sci Technol 33: Isenberg HD Synergism testing: broth microdilution checkerboard and broth macrodilution methods. Clinical Microbiology Procedures Handbook. American Society for Microbiology, Washington, DC, pp Ji Y, Lee J, Lee I Antimicrobial effect of medicinal plants against methicillin-resistant Staphylococcus arueus (MRSA). J Life Sci 17: Jun H, Kim J, Bang J, Kim H, Beuchat LR, Ryu JH Combined effects of plant extracts in inhibiting the growth of Bacillus cereus in reconstituted infant rice cereal. Int J Food Microbiol 160: Kamatou GPP, Viljoen AM, van Vuuren SF, van Zyl RL In vitro evidence of antimicrobial synergy between Salvia chamelaeagnea and Leonotis leonurus. S Afr J Bot 72: Kim JM, Marshall MR, Cornell JA, Preston III JF, Wei CI Antibacterial activity of carvacrol, citral, and geraniol against Salmonella typhimurium in culture medium and on fish cubes. J Food Sci 60: Korea Food and Drug Administration System of Korea foodborne disease statistics. &yr=2011&opt=3&chart=&mode=chart (accessed Mar 2013). Lee H, Lee K, Park NK, Jeong S Antibacterial effects of Sophora flavescens on Streptococcus mutans. J Korean Soc Food Sci Nutr 13: Lee HO, Park NK, Jeong SI Isolation of Antimicrobial Compounds from the Ethyl Acetate Extract of Sophora flavescens. The Pharmaceutical Society of Korea Bimonthly 45: Lee WG, Lee SM, Kwak YS Synergistic effects of Vancomycin, Penicillin, and Gentamicin against Vancomycin-Resistant Enterococci. J Korean Soc Chemother 15: Lim SC, Moon JY Antioxidant effects of the Root of Vitis labrusca water and aqua-acupuncture solution. Kor J Ori Med Physiol Pathol 20: 년기초연구과제총서

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