한국인강직성척추염환자에서 HLA-B27 아형에관한연구 93 domain에서아미노산의치환을보이는 11개가보고되고있는데이러한 HLA-B27 아형의다양성은 exon 2, exon 3과 exon 4 부위에위치하고각아형간의차이는핵산염기서열의치환으로발생한다고한다 [3]. HLA

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량하 미
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1 대한임상병리학회지 : 제 19 권제 1 호 1999 Korean J Clin Pathol 1999; 19: 92-7 진단면역학 한국인강직성척추염환자에서 HLA-B27 아형에관한연구 황미원 조윤정 고려대학교의과대학임상병리학교실 HLA-B27 Subtypes in Korean Patients with Ankylosing Spondylitis - by Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primers (PCR-SSP) Method - MiWon Hwang, M.D., Yoon Jeong Cho, M.D. Department of Clinical Pathology, Korea University Medical College, Seoul, Korea Background : The class I major histocompatibility complex (MHC) antigen, HLA-B27 appears to be the major genetic susceptibility factor for ankylosing spondylitis (AS), anterior uveitis, and reactive arthritis, but the mechanism underlying the association remains unknown. HLA-B27 consists of eleven closely related alleles (B 2701-B 2711) which differ in a restricted number of nucleotide substitutions. The aim of this study was to investigate the frequency and the contribution of the HLA-B27 subtypes to AS. Methods : Forty-six patients (36 AS, 4 anterior uveitis, and 2 psoriatic arthritis, 2 reactive arthritis, 1 erythema nodosum, 1 rheumatic valvular disease) were analysed. The polymerase chain reaction with sequence-specific primers (PCR-SSP) method was used to define B27 allele subtypes. The primers were specifically designed for the discrimination of HLA-B 2701-B Results : Thirty-two out of forty-six patients were typed. Among them, 27 AS patients were typed. Only two subtypes were identified : 88.9% (24 out of 27) were typed as B 2705 and 11.1% (3 out of 27) were typed as B Other 5 non-as patients (4 anterior uveitis & 1 psoriatic arthritis) were also typed as B Conclusions : No difference in the distribution of HLA-B27 subtypes between patients and healthy controls could be found (Fisher s exact test : P= 0.867, P>0.05). Any specific B27 subtypes don t appear to contribute to AS susceptibility. (Korean J Clin Pathol 1999; 19: 92-7) Key words : HLA-B27 subtypes, Ankyosing spondylitis, PCR-SSP 서론 Human leukocyte antigen (HLA) 은장기이식, 수혈, 친자감별등에중요한역할을할뿐아니라여러종류의질환감수성을결정하는유전적요인으로잘알려져있다 [1]. 현재 HLA 관련질환의진단및연구목적으로시행하는검사중가장널리알려 접수 : 1998 년 8 월 4 일접수번호 : KJCP1195 수정본접수 : 1998 년 9 월 4 일교신저자 : 황미원우 서울시구로구구로동 80 고대구로병원임상병리과의국전화 : , 6211, Fax: 진것은 HLA-B27이며, HLA-B27의검사법에는혈청학적방법인미량림프구독성시험법과유세포분석기를이용하는방법, PAN-B27 유전자를이용한 polymerase chain reaction (PCR) 법등이있다. 그러나현재국내에서시행하고있는상기검사들은모두 B27 대립유전자혹은그산물의유무만을판정하는검사이므로 HLA-B27 아형을판별할수는없다. 최근 PCR-sequence specific primers (SSP), PCR-sequence specific oligonucleotide probes (SSOP) 등의방법을이용하여대립유전자의아형 (subtype) 판별이가능하게됨에따라 HLA-B27 아형에대한연구도시도되었다 [2, 3]. 지금까지밝혀진 HLA-B27 아형은 alpha-1과 alpha-2 92

2 한국인강직성척추염환자에서 HLA-B27 아형에관한연구 93 domain에서아미노산의치환을보이는 11개가보고되고있는데이러한 HLA-B27 아형의다양성은 exon 2, exon 3과 exon 4 부위에위치하고각아형간의차이는핵산염기서열의치환으로발생한다고한다 [3]. HLA B27 아형의기본형인 B 2705와비교하여볼때 B 2701은 74-81에서, B 2702는 77-81, B 2703은 59, B 2704와 B 2706의경우 77, 152, 211에서, B 2707은 97, , 131, B 2708은 77-83, B 2709의경우 116, B 2710은 152, B 2711은 77, 97, , 131 residue에서상이성을보이고, B 2706은 114와 116에서추가로변화를보인다 (Table 1)[4-9]. Gonzalez-Roces 등 [3] 은 HLA-B27의아형이인종에따라다른분포를보이며, 각아형별로도질환에대한감수성이다르게나타난다고하여 B 2701, B 2702, B 2704, B 2705, B 2707과 B 2710은강직성척추염환자와관련이있고 B 2706, B 2709 아형은이질환에방어적으로작용한다고보고하였다. 본연구는강직성척추염을가진한국인에서 PCR-SSP 법으로 HLA-B27 아형의빈도를밝혀내고 B27 아형간의구조적인차이가강직성척추염에대한질환감수성에기여를하는지알아보고자하였다. 대상및방법 1. 연구대상 1995년부터 1997년까지고려대학교안암병원에 HLA-B27 검사가의뢰된사람중혈청학적방법 ( 종근당, 한국 ) 으로 B27 양성개체로판명된강직성척추염을가진한국인 46명을대상으로하였다. 이들중 36명은강직성척추염환자였으며, 4명은전부포도막염, 2명은건선성관절염, 2명은반응성관절염환자였고, 결절성홍반, 류마티스성심장판막질환자가각각 1명씩이었다. 2. 연구방법 1) DNA 추출헤파린을처리한혈액에 Ficoll-Hypaque을사용하여분리한림프구에서 DNA 추출 kit (XTRAX, 미국 ) 를이용하여 DNA를추출하였다. DNA 추출방법은대체로동봉된지침서에따랐는데간단하게요약하면다음과같다. 미세원심분리관에 1,000 L XT RAX DNA 추출완충액과 50 L의검체를넣고원심분리 (10,0 00 g, 5 초 ) 후상청액 700 L를 60 heat block에서 1시간동안가온하고실온에 3분간둔후 1분간얼음에서식히고원심분리 (12,0 00 g, 1분 ) 한후새로운관에 500 L의상청액을옮겼다. 여기에 500 L isopropanol을가하여원심분리 (12,000 g, 10분 ) 후상청액을버리고 1 ml 70% ethanol을가해원심 (12,000 g, 10분 ) 하여 DNA를세척하고말린후 35 L의 Tris-EDTA 완충액 (ph 8.0) 을첨가하여남아있는 pellet을용해시켜유전자증폭에사용하였다. 2) 시발체 (primers) 12개로구성된 HLA-B27 SSP 시발체 (DYNAL사, 노르웨이 ) 를사용하였다. 본연구에사용된 PCR 시발체는 HLA-B27의 exon 2, 3, 4 부위중대립유전자간에다른염기서열을보이는부분 (Table 1) 을이용하여 HLA B 2701-B 2711을밝히기위해제작되었으며각각의시발체에는대립유전자 (allele) 와군 (group) 에특이한시발체 (Table 2) 와내부양성대조로사용되는인-성장호르몬유전자증폭을위한양성대조시발체쌍 (5 -primer, 5 GCC TTC CCA ATT CCC TTA 3, 3 -primer, 5 GTC CAT GTC CTT CCT GAA GCA 3 ) 이들어있다. 3) 유전자증폭 12개의 PCR 시험관에각각의시발체용액 (DYNAL사, 노르웨이 ) 을 5 L씩분주한후 PCR 용액 (10 PCR 완충액 500 Table 1. Polymorphic amino acid residues involved in formation of B27 Residues Subtypes B 2705 Y D D T L L R N Y H D S V A B Y N - A B N I A B 2703 H B S E G B S D Y - E G B S H N Y R - - B S N - - R G B H B E - B S S H N Y R - Abbreviations: Y, Tyrosine; D, Aspartic acid; T, Threonine; L, Leucine; R, Arginine; N, Asparagine; H, Histidine; S, Serine; V, Valine; A, Alanine; I, Isoleucine; G, Glycine

3 94 황미원 조윤정 Table 2. The first three 5 -end sequences of the 12 primers used in this study Primer No primer CTT GCT GCT GCT GCT GCT AAT AAT AAT AAT AGC AAT 3 primer GTC ATC ATG GTC GCT GGA CGC GTC CCT ATA GTA GTG L [Perkin-Elmer: 500 mm KCl, 15 mm MgCl2, 100 mm Tris-HCl ph 8.3, 0.01% w/v gelatin], 증류수 300 L, 글리세롤 [99.5%] 250 L, 10 mm datp 100 L, dctp 100 L, dgtp 100 L, dttp 100 L) 3 L와 1) 에서추출한 DNA 2 L, Taq DNA polymerase 0.4 units (Takara사, 일본 ) 를혼합하였다. 이혼합액을 DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer 사, 미국 ) 를이용하여 94 에서 2분간처리한후다음의온도조건에서유전자증폭을하였다 (94 에서 10초, 65 에서 60초조건에서 10회반복처리 : 94 에서 10초, 61 에서 50초, 72 에서 30초조건에서 20회반복처리 : 72 에서 5분간연장처리하였다 ). 4) 결과의확인 7 L의 PCR 산물에 bromphenol blue loading dye 1 L를섞어 0.5 X TBE 완충액 (0.9 M Tris-base, 0.9 M boric acid, ph mm EDTA, 950 ml 증류수 ) 과 2 % (w/v) agarose gel (FMC사, 미국 ) 을이용하여전기영동을실시하였으며 ethidium bromide DNA 염색을하여 UV transilluminator (Seolin scientific corp., 한국 ) 로증폭산물을확인하였다. Size marker는 100 bp ladder (Takara사, 일본 ) 를사용하였으며내부양성대조유전자의예상크기는 1,070 bp였고증폭된각시발체간의예상크기는 Table 3과같다. Table 3. Approximate size of polymerase chain reaction (PCR) products Primer No. Product size Amplified HLA-B27 alleles bp bp bp bp 2703, 2705, 2707, 2709, bp 2704, 2706, 2708, bp , bp bp , 2708, bp 2704, 2706, bp bp 2707, bp ) 결과의판정 PCR-SSP 검사에서 B27 아형의판정은 PCR 산물의전기영동후 agarose gel상에서나타나는 band의존재유무로결정하는데판정은 Table 4와같다. 결과 36 개의강직성척추염검체중 27 개에서아형판별이가능하였 Table 4. Interpretation table of HLA-B27 PCR-SSP subtyping B27 subtypes Primer No B B B B B B B B B B B

4 한국인강직성척추염환자에서 HLA-B27 아형에관한연구 95 Table 5. The frequency of B27 subtypes in Korean autoimmune patients (N=46) Positive primer No. B27 subtypes Total positive No. AS AUv Ps ReA Others 4, 6, 8 B , 6, 8, 9 B Undefined Abbreviations; ankylosing spondylitis, AUv; anterior uveitis, Ps; psoriatic arthritis, ReA; reactive arthritis, Others; erythema nodosum & rheumatic vavular disease M bp (Internal control) Table 6. Distribution of B27 alleles in Korean healthy and ankylosing spondylitis patients Normal Korean individuals (N=99)* Patients (N=27) subtypes N (%) N (%) Fig. 1. Amplification pattern of HLA B 2705 allele; lane 4, 6, 8 show expected bands M 1070 bp (Internal control) Fig. 2. Amplification pattern of HLA B 2704 allele; lane 5, 6, 8, 9 show expected bands. B B B B (8.1) 3 (11.1) B (87.9) 24 (88.9) B B (3) - B B B 2710 NT - B 2711 NT - *the HLA-B27 normal control study presented here was cited from Choi[12]. not tested. No statistical difference was found (Fisher s exact test, P= 0.867, P>0.05). 체에서는 DNA 증폭이전혀일어나지않았다 (Fig. 3). M bp (Internal control) 고찰 Fig. 3. No amplification patterns; no internal control and expected bands are seen. 다. 이중 24예는 B 2705 (Fig. 1), 3예는 B 2704였다 (Fig. 2). 강직성척추염을제외한 9예의다른질환자에서는모두 5예에서 B 2705가판별되었는데, 이중 4예는전부포도막염, 1예는건선성관절염이었다 (Table 5). B27 양성인건강한한국인을대상으로한최 [18] 의실험과본실험을비교하면 (Table 6) 빈도가아주낮게나온 B 2707을제외하면 B 2705와 B 2704의빈도가차이가없었다 (Fisher s exact test P=0.867, P >0.05). 아형을밝히는데실패한검체는모두 14예로서, 이중 8개의검체에서는일부시발체의증폭이일어나지않았고나머지 6개의검 HLA-B27은 1973년강직성척추염과밀접한연관관계가있다고보고 [10, 11] 된이래반응성관절염, 급성전부포도막염등의질병에도 HLA-B27의항원성펩타이드가병인적역할을하는것으로여겨져왔다 [12]. HLA-B27이이러한질병의병인으로작용하는기전은분자적유사성 (molecular mimicry) 과세균감염에대한면역반응설로설명하고있으나아직정확한발병기전은밝혀지지않고있는실정이다 [12, 13]. 최근에는 HLA-B27 분자 X-선결정구조및펩타이드 motif에대한연구가활발히진행되고있으며 HLA-B27 이외에도 transporter associated with antigen processing (TAP) 유전자, proteosome 유전자, T 세포수용체, 항원처리과정등과질병과의연관성에대한연구도활발하다 [12, 14, 15]. 현재까지밝혀진 HLA-B27 아형은총 11개로서 Gonzalez- Roces 등 [3] 에의하면아형의분포로민족적인차이를보이고또한강직성척추염등의질병감수성도차이를보인다고한다. 즉, B 2705는모든민족에서나타나고, B 2702는 Caucasian에서,

5 96 황미원 조윤정 B 2704, B 2706, B 2707은아시아인에서, B 2703은서아프리카인에서많이나타나며 B 2701, B 2708, B 2710, B 2711 은민족과의상관관계가보고된것이없다고한다. 또한 B 2702, B 2704, B 2705는강직성척추염등의자가면역질환발생과연관되어있는반면, B 2703, B 2706, B 2709 아형은연관성이없다고하였다. 반면, 사르디니아인 (Sardinian) 에서는 B 2709 가, 태국인에게서 B 2706이강직성척추염에방어적인요소로작용한다는보고도있다 [16, 17]. 국내에서는최 [18] 가 polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide probes (PCR- SSOP) 법을이용하여 B27 양성인정상한국인 99명을대상으로 HLA-B27 아형의빈도에대한연구를하여 3가지아형을형별하였는데일본인이나중국인에서 B 2704가주종을보이는아형인것과는달리한국인에서는 B 2705 (87.9%) 가가장높은비율로나타났고그다음이 B 2704 (9.1%), B 2707 (3%) 순서였다. 이는본연구에서나타난강직성척추염환자에서의 B 2705, 88.9%, B 2704, 11.1% 와비교할때거의같음을알수있었다 (Table 6). 또한, B 2705와 B 2704, 모두에서강직성척추염을관찰할수있어이두아형에서의강직성척추염에대한감수성차이는없다고하겠다. 비록최 [18] 나 Lee 등 [19] 의연구에서는 B 2701에서 B 2709까지아홉개의 B27 아형에대한검사를하였고저자는 B 2710과 B 2711을추가하여검사한차이가있으나그의의는동일하다고하겠다. 본연구에서는발견되지않았으나최 [18] 가 3% 로보고한 B 2707은그빈도가너무낮아한국인에게서 B 2707이 B27 관련질환에방어적인작용을한다고주장하기는어렵다고생각된다. Derhaag 등 [20] 에의하면급성전부포도막염과 HLA-B27 아형과의관계를 isoelectric-focusing (IEF) 법으로규명한결과각아형과의연관성이없다고하였다. 본연구에서는전부포도막염 4예가모두 B 2705로밝혀졌으나표본수가너무적은관계로전부포도막염과아형과의정확한연관성을밝히기는어려웠다. B 2708은세계적으로그빈도가낮으며 Bw6 에피토프 (epitope) 를가지는고로혈청학적검사시 B27 항혈청과 B7 항혈청및 Bw6 항혈청에양성을보이는경우, 또는유세포분석검사시 gray zone에반응하는경우 PCR 등을이용한 B27 대립유전자검사가요구된다고한다 [21-23]. 본연구에서는 B27 항혈청과 Bw4의에피토프에모두다양성을보인검체만을연구대상으로하였기때문에 B 2708이실험대상군에서제외되었다고할수있겠다. 본연구에서사용한 PCR-SSP 법은 B27 아형의염기서열차이를보이는부분에특이한 sequence specific primers (SSP) 를이용하여, B27 특이아형만을선택적으로증폭하여판정하는방법으로 HLA B27 아형판별을위해국내에서는처음으로사용한방법이다. PCR-SSP 법은 PCR 후전기영동만으로도쉽게결과를알수있기때문에최 [18] 가시행한 SSOP 법에비해훨씬검사절차가단순하고, 결과를얻기까지 3시간정도의적은시간이소요되는장점이있어본실험에사용하게되었다. 그러나총 36개의검 체중 9개의검체에서불규칙적인증폭이일어나거나 DNA 증폭자체가일어나지않아, 간단하고쉬운검사법일지라도 DNA를시험관에정확하게분주되게하고시발체와 DNA가잘섞이게하는등의기술적인문제를충분히검토하여 DNA 증폭자체가안일어나는오류가생기지않도록주의를기울여야할것이다. 또한시발체를합성하여사용한다면상업적인제품을사용했을때고려해야되는경제적인문제를배제할수있으므로증폭이안일어났을때재검을할수있어검사의정확도를높이는데기여할수있을것이다. 결론 HLA-B27 아형에대한 DNA형별법을확립하고한국인에게서 HLA-B27 아형간의구조적인차이가강직성척추염에대한감수성차이를보이는지밝혀내고자강직성척추염환자를대상으로 HLA-B27 아형에대한 PCR-SSP 법을시행하였다. 강직성척추염환자에서 HLA B 2705는 88.9% (24/27), B 2704는 11.1% (3/27) 로나타나정상한국인의 HLA-B27 아형빈도와통계학적으로차이를보이지않았다. 또한, B 2705와 B 2704 두아형모두에서강직성척추염을관찰할수있어두형별간에강직성척추염에대한감수성차이는없다고할수있겠다. 요약배경 : 강직성척추염, 전부포도막염, 반응성관절염등의자가면역질환에 HLA-B27의항원성펩타이드가병인적역할을하는것으로알려져왔으나아직정확한발병기전은밝혀지지않고있는실정이다. HLA-B27은현재까지핵산염기서열의치환을보이는 11개의아형이보고되고있다. 본연구에서는강직성척추염을가진한국인에게서 B27 아형을판별하고 B27 아형간의구조적차이가질환감수성에기여하는지알아보고자하였다. 방법 : 46명의자가면역질환자 ( 강직성척추염 36명, 전부포도막염 4명, 건선성관절염 2명, 반응성관절염 2명, 결절성홍반 1명, 류마티스성심장판막질환 1명 ) 를대상으로하였다. HLA- B27 아형을형별하기위하여 polymerase chain reaction-sequence specific primers (PCR-SSP) 법을사용하였다. 시발체는 HLA B 2701에서 B 2711까지를형별하기위해 HLA-B27의 exon 2, 3, 4부위중각아형간에다른염기서열을보이는부분을이용하여제작된시발체 kit (DYNAL사, 노르웨이 ) 를사용하였다. 결과 : 46예중아형판별이가능하였던예는 32예로서그중 27예가강직성척추염이었다. 이중 B 2705가 24예로 88.9%, B 2704가 3예로서 11.1% 였고, 다른 5예 ( 전부포도막염 4예, 건선성관절염 1예 ) 는모두 B 2705였다. 결론 : 강직성척추염과정상대조군간에 HLA-B27 아형의빈

6 한국인강직성척추염환자에서 HLA-B27 아형에관한연구 97 도차이가없었으며 (Fisher s exact test : P=0.867, P >0.05), 어떤특정한아형에따른 B27 관련질환의감수성차이는없었다. 참고문헌 1. Dausset J. The major histocompatibility complex in man. Science 1981; 213: Brown MA, Pile KD, Kennedy LG, Calin A, Darke C, Bell J, et al. HLA class I associations of ankylosing spondylitis in the white population in the United Kingdom. Ann Rheum Dis 1996; 55: Gonzalez-Roces S, Alvarez MV, Gonzalez S, Dieye A, Makni H, Woodfield DG, et al. HLA-B27 polymorphism and worldwide susceptibility to ankylosing spondylitis. Tissue Antigens 1997; 49: Choo SY, John TS, Orr HT, Hansen JA. Molecular analysis of the variant alloantigen HLA-B27d (B 2703) identifies a unique single amino acid substitution. Hum Immunol 1988; 21: Lopez de castro JA. HLA-B27 and HLA A2 subtypes: structure, evolution and function. Immunol Today. 1989; 10: Choo SY, Fan Lian, Hansen JA. A novel HLA-B27 allele maps B27 allo-specificity to the region around position in the alpha 1 domain. J Immunol 1991; 147: Del Porto P, D Amato M, Fiorillo MT, Tuosto L, Piccolella E, Sorrentino R. Identification of a novel HLA-B27 subtype by restriction analysis of a cytotoxic. J Immunol 1994; 153: Vilches C, de Pablo R, Kreisler M. Nucleotide sequence of HLA B Immunogenetics 1994; 39: Rudwaleit M, Bowness P, Wordsworth P. The nucleotide sequence of HLA B 2704 reveals a new amino acid substitution in exon 4 which is also present in HLA B Immunogenetics 1996; 43: Brewerton DA, Hart FD, Caffey M, Nicholls A, James DO, Sturrock RD. Ankylosing spondylitis and HLA-B27. Lancet 1973; 1: Schlosstein L, Terasaki PI, Bluestone R, Pearson C. High association of an HLA antigen, W27, with ankylosing spondylitis. N Engl J Med 1973; 288: Feltkamp TEW, Khan MA, Lopez de Castro JA. The pathogenic role of HLA-B27. Immunol Today 1996; 17: Baum H, Davies H, Peakman M. Molecular mimicry in MHC: hidden clues to autoimmunity? Immunol. Today 1996; 17: Madden DR, Gorga JC, Strominger JL, Wiley DC. The three-dimensional structure of HLA-B27 at 2.0 A resolution suggests a general mechanism for tight peptide binding to MHC. Cell 1992; 70: Madden DR, Gorga JC, Strominger JL, Wiley DC. The structure of HLA-B27 reveals nonamer self-peptides bound in an extended conformation. Nature 1991; 353: Lopez-Larrea C, Sujirachato K, Mehra NK, Chiewsilp P, Isarangkura D, Kanga U, et al. HLA-B27 subtypes in Asian patients with ankylosing spondylitis: evidence for new associations. Tissue Antigens 1995; 45: D Amato M, Fiorillo MT, Carcassi C, Mathieu A, Zuccarelli A, Bitti PP, et al. Relevance of residue 116 of HLA-B27 in determining susceptibility to ankylosing spondylitis. Eur J Immunol 1995; 25: 최웅철. 교잡반응에의한 HLA -B27 아형의구분. 가톨릭의대 1997 년하계박사학위논문. In press. 19. Lee SH, Min JK, Hong YS, Park SH, Cho CS, Kim HY. HLA-B27 subtypes in Korean patients with seronegative spondyloarthropathies. Korean J Med (I) 1997; 51: Derhaag PJFM, Wal LP, Linssen A, Feltkamp TEW. Acute anterior uveitis and HLA-B27 subtypes. Invest Ophthalmol Vis Sci 1988; 29: Fussell H, Thomas M, Street J, Darke C. Serological identification of a new HLA-B7 variant antigen-hla-b7qui. Eur J Immunogenetics 1994; 21: Hildebrand WH, Domena JD, Shen SY, Marsh SG, Bunce M, Guttridge MG, et al. The HLA-B7Qui antigen is encoded by a new subtype of HLA-B27 (B 2708). Tissue Antigens 1994; 44: Reynolds WM, Evans PR, Wilson PJ, Wong WM, Darke C, Smith JL. Automated routine HLA-B27 typing by flow cytometry. J Immunol Methods 1996; 197: 1-5.

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2016 대한진단검사의학회지제 28 권제 1 호 2008 Korean J Lab Med 2008;28:46-52 DOI 10.3343/kjlm.2008.28.1.46 원저 진단면역학 한국인강직성척추염환자의 HLA-B27 아형연구 박경선 강소영 이우인 경희대학교동서신의학병원진단검사의학과 HLA-B27 Subtypes in Korean Patients with Ankylosing